專利名稱：一種重組耐熱醛縮酶基因工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組耐熱醛縮酶基因工程菌，及其在發(fā)酵制備耐熱醛縮酶中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
醇醛縮合反應(yīng)(Aldol condensations)可以形成新的C-C化學(xué)鍵，增長(zhǎng)碳鏈，是一類重要的有機(jī)合成反應(yīng)。在有機(jī)合成中，此反應(yīng)需要低溫誘導(dǎo)(_70°C)，且需要大量的有機(jī)溶劑參與，對(duì)環(huán)境和安全造成潛在的危害。生物酶催化的不對(duì)稱醇醛縮合反應(yīng)可以在中性PH值和室溫條件下進(jìn)行，其替代有機(jī)反應(yīng)的應(yīng)用越來(lái)越得到研究者的關(guān)注。醛縮酶 (Aldolase)作為該反應(yīng)的關(guān)鍵酶，可以小分子化合物為底物，不對(duì)稱合成復(fù)雜的大分子。同時(shí)，生物酶具有高度區(qū)域選擇的特性，能夠容易避開(kāi)對(duì)碳水化合物中的活潑的羥基的保護(hù)， 更為突出的特性是在催化C-C鍵合成的同時(shí)醛縮酶可以引入新的手性中心。醛縮酶是生物代謝途徑中關(guān)鍵酶，其中一類醛縮酶(DERA)，可以乙醛為底物，連續(xù)催化醇醛縮合反應(yīng)。此醛縮酶可以用于2，4，6_三脫氧己糖化合物的合成，該化合物是多種他汀類藥物合成的關(guān)鍵中間體。醛縮酶催化的縮合反應(yīng)具有很強(qiáng)的綠色屬性，對(duì)傳統(tǒng)化學(xué)工藝的綠色化學(xué)改造有著重要意義，具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，生物酶催化工藝的應(yīng)用得到全世界政府和研究者的普遍關(guān)注，但是現(xiàn)階段缺乏高效的商品生物酶制劑限制了該工業(yè)的發(fā)展。這種狀況主要體現(xiàn)在兩方面高效的生物酶和經(jīng)濟(jì)可行的酶制劑生產(chǎn)工藝。另外，生物酶在有機(jī)催化反應(yīng)中最突出的缺點(diǎn)是其穩(wěn)定性較差，即對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性較低，易變性失活。研究工作已證明，大量來(lái)源于嗜熱微生物的生物酶蛋白顯示出較高的熱穩(wěn)定性，對(duì)有機(jī)溶劑具有較高的耐受力。大腸桿菌 (E. coli)是目前最常用的宿主細(xì)胞，大量的生物蛋白質(zhì)已通過(guò)基因工程手段在其細(xì)胞內(nèi)得到異源過(guò)量表達(dá)。由于大腸桿菌的生理特性，大部分重組蛋白總是在其細(xì)胞質(zhì)或周質(zhì)間合成，其總生產(chǎn)速率與菌體密度密切相關(guān)。因此，高細(xì)胞密度培養(yǎng)技術(shù)有利于提高目的蛋白的表達(dá)量和生產(chǎn)速率，已在重組蛋白的生產(chǎn)工藝中得到廣泛應(yīng)用。目前，國(guó)外已有關(guān)于不同醛縮酶基因的發(fā)現(xiàn)，以及在藥物合成中應(yīng)用的報(bào)道。美國(guó)科學(xué)家Wong C. H.等人主要集中于醛縮酶(DERA)的研究，包括基因序列、蛋白質(zhì)定向進(jìn)化等方面，還未涉及到來(lái)源于嗜熱微生物醛縮酶(DERA)的研究。在國(guó)內(nèi)，還沒(méi)有關(guān)于耐熱醛縮酶(DERA)的研究報(bào)道，只有極少數(shù)研究者或機(jī)構(gòu)進(jìn)行其它醛縮酶的研究。另外，中國(guó)專利檢索目錄關(guān)于各種醛縮酶的研究，申請(qǐng)者幾乎全是國(guó)外研究機(jī)構(gòu)。因此，利用我國(guó)豐富的環(huán)境資源自主開(kāi)發(fā)新型的耐熱醛縮酶具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是構(gòu)建一種耐熱醛縮酶的基因工程菌株，并優(yōu)化其高密度培養(yǎng)生產(chǎn)方法，提高酶蛋白的生產(chǎn)速率，降低其生產(chǎn)成本。為達(dá)到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
—種重組耐熱醛縮酶基因工程菌，由如下方法獲得構(gòu)建含有醛縮酶基因(Dera) 序列的重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆，獲得重組耐熱醛縮酶基因工程菌。具體的，所述醛縮酶基因(Dera)序列如下ATGTCCGAAAGCTTCTTCTGTCGCTTCGGCGTGTCTGAAATCGCGTCCCGTATCGACCACGCCGTTCTG AAACCGTGGAGCTCCGTTTCTGAACTGGAAAAAGCAATCCGTGAGCTGGAGGAACTGAACCTGCGTTGCCTGATCAT CAGCCCAACTCATCTGCGTCTGGCTCGCGAAAAAACTAATAAATGTCTGGGCGTTGTGGTAGGTTTCCCATTTGGTT ATTCTACTATCGAGGCGAAAATCAAGGAACTGGAAGATTCTATCGCACTGGGTGCTCAGGAAATCGACTACGTGGCC AACACTCAGCTGCTGCTGGCAGGCCGTACCGAAGAATACCTGAACGAAATTCGCGCTGCGATCACCATTTGCCGTGA CTCCGGCGTTAAATGCAAGGTAATCATTGAGGCTCCGGCGCTGCCGCGTAACCTGCTGGTTGAAATCGTAGAGAAAA TTGCAATGATGGATCCGCACCCAGATTACATTAAAACCAGCACCGGTTACGGTCCGCGTCCGACCTATGTTGAGGAT GTTTACCTGATCGATCAAACCCTGCGTCGTATCGGCAAGCGCGACGAAATCGGTATCAAAGCGGCTGGTGGCATTCG CGAAGGCCTGCAGGCAGCTGCGATGCTGCTGGCGGGTGCCGACGTTATCGGTACCTCTACCCCGCGCCAGGTGATTG AAACCTATAAAGAACTGTGCCGTATTTAA。具體的，所述基因工程菌由如下方法獲得對(duì)醛縮酶基因(Dera)進(jìn)行修飾(添加雙限制性酶切位點(diǎn))，獲得帶有雙限制性酶切位點(diǎn)的目的序列，將該目的序列連接到表達(dá)載體中，獲得重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆，獲得重組耐熱醛縮酶基因工程菌；所述目的序列如下，下劃線部分為酶切位點(diǎn)OCbaI和BioI) TCTAGAATGTCCGAAAGCTTCTTCTGTCGCTTCGGCGTGTCTGAAATCGCGTCCCGTATCGACCACGCC GTTCTGAAACCGTGGAGCTCCGTTTCTGAACTGGAAAAAGCAATCCGTGAGCTGGAGGAACTGAACCTGCGTTGCCT GATCATCAGCCCAACTCATCTGCGTCTGGCTCGCGAAAAAACTAATAAATGTCTGGGCGTTGTGGTAGGTTTCCCAT TTGGTTATTCTACTATCGAGGCGAAAATCAAGGAACTGGAAGATTCTATCGCACTGGGTGCTCAGGAAATCGACTAC GTGGCCAACACTCAGCTGCTGCTGGCAGGCCGTACCGAAGAATACCTGAACGAAATTCGCGCTGCGATCACCATTTG CCGTGACTCCGGCGTTAAATGCAAGGTAATCATTGAGGCTCCGGCGCTGCCGCGTAACCTGCTGGTTGAAATCGTAG AGAAAATTGCAATGATGGATCCGCACCCAGATTACATTAAAACCAGCACCGGTTACGGTCCGCGTCCGACCTATGTT GAGGATGTTTACCTGATCGATCAAACCCTGCGTCGTATCGGCAAGCGCGACGAAATCGGTATCAAAGCGGCTGGTGG CATTCGCGAAGGCCTGCAGGCAGCTGCGATGCTGCTGGCGGGTGCCGACGTTATCGGTACCTCTACCCCGCGCCAGG TGATTGAAACCTATAAAGAACTGTGCCGTTTTAACTCGAG。優(yōu)選的，所述表達(dá)載體為pET303/CT-His，所述宿主細(xì)胞為感受態(tài)大腸桿菌 BL21(DE3)細(xì)胞。本發(fā)明還涉及所述的基因工程菌在發(fā)酵制備耐熱醛縮酶中的應(yīng)用。具體的，所述應(yīng)用為將所述基因工程菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在37 45°C、 pH7. 0 8. 0、溶氧彡30%、搖床轉(zhuǎn)速200rpm 1000rpm(其依據(jù)培養(yǎng)過(guò)程的溶解氧水平自動(dòng)調(diào)節(jié)，獲得高細(xì)胞密度的培養(yǎng)菌液)條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)10 26h，獲得所述耐熱醛縮酶。本發(fā)明中，耐熱醛縮酶的表達(dá)由T7啟動(dòng)子控制，需添加誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)。所述發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中可添加IPTG或乳糖作為誘導(dǎo)劑，添加量為IPTG 10 100 μ mol/g菌體干重，乳糖0. 2 10g/g菌體干重。當(dāng)微生物生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的中期時(shí)，一次性添加誘導(dǎo)劑 IPTG，其添加標(biāo)準(zhǔn)為10 100 μ mol/g菌體干重。更進(jìn)一步，為了降低嗜熱醛縮酶制劑規(guī)?；苽涞纳a(chǎn)成本，可用乳糖替代IPTG作為誘導(dǎo)劑。乳糖與補(bǔ)料培養(yǎng)基混合，隨補(bǔ)料過(guò)程添加，其添加標(biāo)準(zhǔn)為0. 2 1. Og/g菌體干重(以預(yù)測(cè)最終的菌體干重為基準(zhǔn)進(jìn)行計(jì)算)。本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基選擇國(guó)內(nèi)一種工業(yè)副產(chǎn)物——酵母抽提物作為氮源，并通過(guò) Plackett-Burman設(shè)計(jì)和相應(yīng)面方法進(jìn)行組分的選擇和優(yōu)化。這種培養(yǎng)基成本較低，有利于規(guī)模化制備的工業(yè)應(yīng)用。所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成如下葡萄糖(Glucose) 20.0 60. Og/L,酵母抽提物(Yeast extract) 15. 0 40. Og/L, K2HPO4 5· 0 20. Og/L, ΚΗ2Ρ043· 0 15. 0g/L, MgSO4 · 7Η201· 0 4. 0g/L, EDTA-Na2 0. 01 0. lg/L,氨芐青霉素 (Ampicillin) 0. 1 2. OmM，痕量鹽溶液(Trace element solution) 2. 0 10. 0mL/L，溶劑為水；所述痕量鹽溶液組成如下=CoCl2 · 6H201. 3g/L，MnCl2 · 4H206. 2g/L，CuC12 · 2H200. 6g/ L，H3BO3L 2g/L, Na2MoO4 · 2H201. lg/L, Zn (II) acetate · 2H205. 2g/L, Fe (III) citrate40. 2g/ L，溶劑為水。所述發(fā)酵工藝采用分批補(bǔ)料方式，于發(fā)酵過(guò)程中添加補(bǔ)料培養(yǎng)基，補(bǔ)料速度依據(jù)公式⑴計(jì)算

權(quán)利要求
1.一種重組耐熱醛縮酶基因工程菌，由如下方法獲得構(gòu)建含有醛縮酶基因(Dera)序列的重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆，獲得重組耐熱醛縮酶基因工程菌。
2.如權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述醛縮酶基因(Dera)序列如下 ATGTCCGAAAGCTTCTTCTGTCGCTTCGGCGTGTCTGAAATCGCGTCCCGTATCGACCAC GCCGTTCTGAAACCGTGGAGCTCCGTTTCTGAACTGGAAAAAGCAATCCGTGAGCTGGA GGAACTGAACCTGCGTTGCCTGATCATCAGCCCAACTCATCTGCGTCTGGCTCGCGAAAA AACTAATAAATGTCTGGGCGTTGTGGTAGGTTTCCCATTTGGTTATTCTACTATCGAGGCG AAAATCAAGGAACTGGAAGATTCTATCGCACTGGGTGCTCAGGAAATCGACTACGTGGC CAACACTCAGCTGCTGCTGGCAGGCCGTACCGAAGAATACCTGAACGAAATTCGCGCTG CGATCACCATTTGCCGTGACTCCGGCGTTAAATGCAAGGTAATCATTGAGGCTCCGGCGC TGCCGCGTAACCTGCTGGTTGAAATCGTAGAGAAAATTGCAATGATGGATCCGCACCCAG ATTACATTAAAACCAGCACCGGTTACGGTCCGCGTCCGACCTATGTTGAGGATGTTTACCT GATCGATCAAACCCTGCGTCGTATCGGCAAGCGCGACGAAATCGGTATCAAAGCGGCTGG TGGCATTCGCGAAGGCCTGCAGGCAGCTGCGATGCTGCTGGCGGGTGCCGACGTACG GTACCTCTACCCCGCGCCAGGTGATTGAAACCTATAAAGAACTGTGCCGTATTTAA。
3.如權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌由如下方法獲得對(duì)醛縮酶基因(Dera)進(jìn)行修飾，獲得帶有雙限制性酶切位點(diǎn)的目的序列，將該目的序列連接到表達(dá)載體中，獲得重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆，獲得重組耐熱醛縮酶基因工程菌；所述目的序列如下，下劃線部分為酶切位點(diǎn)TCTAGAATGTCCGAAAGCTTCTTCTGTCGCTTCGGCGTGTCTGAAATCGCGTCCCGTATCGACCACGCCGTTCTGAAACCGTGGAGCTCCGTTTCTGAACTGGAAAAAGCAATCCGTGAGCTGGAGGAACTGAACCTGCGTTGCCTGATCATCAGCCCAACTCATCTGCGTCTGGCTCGCGAAAAAACTAATAAATGTCTGGGCGTTGTGGTAGGTTTCCCATTTGGTTATTCTACTATCGAGGCGAAAATCAAGGAACTGGAAGATTCTATCGCACTGGGTGCTCAGGAAATCGACTACGTGGCCAACACTCAGCTGCTGCTGGCAGGCCGTACCGAAGAATACCTGAACGAAATTCGCGCTGCGATCACCATTTGCCGTGACTCCGGCGTTAAATGCAAGGTAATCATTGAGGCTCCGGCGCTGCCGCGTAACCTGCTGGTTGAAATCGTAGAGAAAATTGCAATGATGGATCCGCACCCAGATTACATTAAAACCAGCACCGGTTACGGTCCGCGTCCGACCTATGTTGAGGATGTTTACCTGATCGATCAAACCCTGCGTCGTATCGGCAAGCGCGACGAAATCGGTATCAAAGCGGCTGGTGGCATTCGCGAAGGCCTGCAGGCAGCTGCGATGCTGCTGGCGGGTGCCGACGTTATCGGTACCTCTACCCCGCGCCAGGTGATTGAAACCTATAAAGAACTGTGCCGTATTTAACTCGAG0
4.如權(quán)利要求3所述的基因工程菌，其特征在于所述表達(dá)載體為pET303/CT-His，所述宿主細(xì)胞為感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE!3)細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求1 4之一所述的基因工程菌在發(fā)酵制備耐熱醛縮酶中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為將所述基因工程菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37 45°C、pH7. 0 8. 0、溶氧> 30%、轉(zhuǎn)速200rpm IOOOrpm條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)10 ，獲得所述耐熱醛縮酶。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中添加IPTG或乳糖作為誘導(dǎo)劑，添加量為=IPTG 10 lOOymol/g菌體干重，乳糖0. 2 10g/g菌體干重。
8.如權(quán)利要求6或7所述的應(yīng)用，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成如下葡萄糖 20. 0 60. Og/L,酵母抽提物 15. 0 40. 0g/L, K2HP045. 0 20. 0g/L, KH2P043. 0 15. Og/ L，MgSO4 ·7Η20 1· 0 4· 0g/L, EDTA-Na2O. 01 0. lg/L，氨芐青霉素 0. 1 2. OmM，痕量鹽溶液2. 0 10. 0mL/L，溶劑為水；所述痕量鹽溶液組成如下=CoCl2 ·6Η20 1. 3g/L，MnCl2 ·4Η20 6. 2g/L, CuC12 · 2Η20 0. 6g/L, H3BO3L 2g/L, Na2MoO4 · 2H20 1. lg/L, Zn (II) acetate · 2H20 5. 2g/L, Fe(III)Citrate 40. 2g/L，溶劑為水。
9.如權(quán)利要求6或7所述的應(yīng)用，其特征在于所述發(fā)酵采用分批補(bǔ)料方式，于發(fā)酵過(guò)程中添加補(bǔ)料培養(yǎng)基，補(bǔ)料速度依據(jù)公式(1)計(jì)算
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)8 IOh后，添加補(bǔ)料培養(yǎng)基， 繼續(xù)培養(yǎng)4 Mi后，添加誘導(dǎo)劑IPTG或乳糖，添加量為IPTG 10 lOOymol/g菌體干重， 乳糖0.2 10g/g菌體干重。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種耐熱醛縮酶的基因工程菌株及其構(gòu)建方法，并優(yōu)化其高密度培養(yǎng)生產(chǎn)方法，所述重組耐熱醛縮酶基因工程菌，由如下方法獲得構(gòu)建含有醛縮酶基因(Dera)序列的重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆，獲得重組耐熱醛縮酶基因工程菌；采用本發(fā)明方法，可提高酶蛋白的生產(chǎn)速率，降低其生產(chǎn)成本，為耐熱醛縮酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102329764SQ201010131009
公開(kāi)日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2010年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月23日
發(fā)明者李誠(chéng)璐, 王秋巖, 裴曉林, 謝開(kāi)林, 謝恬, 黃黎鋒 申請(qǐng)人:杭州師范大學(xué)