專利名稱：用于降解s-三嗪和二嗪的酶及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及降解S-三嗪如莠去津(atrazine)以及二嗪的多肽。還提供了編碼這些多肽的多核苷酸。本發(fā)明還涉及這些多核苷酸與多肽在S-三嗪和二嗪的生物整治中的用途。
背景技術(shù)：
有效的化學(xué)蟲害防治劑如三嗪除草劑的使用促進(jìn)了目前集約耕作(intensive farming)的實(shí)踐。例如，莠去津(6-氯-N2-乙基-N4-異丙基-1，3，5-三嗪-2，4-二胺)是高效的出芽前和出芽后三嗪除草劑，自從1958年首次引入以來其廣泛用于控制闊葉雜草物種 CTomlin，2006)。環(huán)境相關(guān)濃度的莠去津與脊椎動(dòng)物物種的內(nèi)分泌功能失調(diào)(例如非洲爪蟾 (Xenopus laevis)的雄性征消失(demasculination))有因果聯(lián)系(Hayes et al.，2002， 2003和2006)，并且據(jù)認(rèn)為莠去津可能是致癌的(Huff, 2002 ；Huff and Sass，2007)。此外， 由于它們的廣泛特異性，莠去津及相關(guān)三嗪除草劑具有通過其對非靶標(biāo)光合物種的毒性作用而引起環(huán)境破壞的潛力。莠去津在環(huán)境中是移動(dòng)且持久的。莠去津的環(huán)境半衰期估計(jì)為4-57周之間 (Belluck et al.，1991)，并且在幾個(gè)國家的地表水和地下水中均檢測到莠去津(Thurman and Meyer, 1996 ；van der Meer, 2006 ；Gavrilescu,2005)。原核生物中進(jìn)化了幾個(gè)允許分解代謝三嗪殺蟲劑作為碳源和氮源的基因/ 酶系統(tǒng)。這些途徑中經(jīng)最徹底表征的是由源自最初從假單胞菌(Pseudomonas sp.) ADP (Mandelbaum et al.，1995 ；de Souza et al.，1995)分離的可傳遞 pADPl 質(zhì)粒 (Martinez et al. ,2001)的atzABCDEF基因所編碼的。莠去津和西瑪津(6-氯-N2，N4-二乙基-1，3，5-三嗪-2，4_ 二胺)(de Souza et al.，1996)接連被 atzA、atzB 及 atzC編碼的酰胺水解酶家族的酶脫氯和脫烷基而產(chǎn)生氰尿酸(de Souza et al. , 1996 ；Boundy-Mills et al.，1997 ；Sadowsky et al. , 1998)，其然后被該途徑中剩余的由 atzD、atzE 禾口 atzF 編碼的水解酶礦化為氨和二氧化碳(Fruchey et al. ,2003 ；Cheng et al. ,2005 ；Shapir et al. ,2005a)。AtzAB⑶EF莠去津降解分解代謝途徑的AtzA酶經(jīng)常由TrzN三嗪降解酶 (Sajjaphan et al.，2004)取代，其與 AtzA 具有重疊的活性(Shapir et al.，2005b)，盡管僅有25.4%的同一性。TrzN是鋅依賴性酰胺水解酶家族酶(Siapir et al. ,2006), 負(fù)責(zé)來自三嗪化合物的氯化物、氟化物、S-甲基、S(O)-甲基和氰基基團(tuán)的水解置換 (displacement) (Shapir et al·，2005b)。這意味著 TrzN 廣泛地靴向 s_ 三嗪，而 AtzA 僅可以用于將鹵化S-三嗪解毒。TrzN靶向氯-S-三嗪(例如莠去津、撲滅津和西瑪津)、甲氧基-S-三嗪(例如莠去通、西瑪通(simeton)和撲滅通)和甲硫基_s_三嗪(例如莠滅凈(ametryn)、撲草凈和西草凈)除草劑。TrzN也被報(bào)道具有與AtzA可比的催化常數(shù)2. lsec—1，相較于AtzA的SsecT1)，但具有低得多的對莠去津的Km (20 μ M相較于AtzA的100 μ M) (Shapir et al. , 2006) 因此AtzA具有3. 3xl04的對莠去津的K。at/Km，而TrzN具有IxlO5的對莠去津的K。at/Km為，證明 TrzN是比AtzA催化效率更高的酶。然而，與AtzA不同，TrzN已被證實(shí)難以在異源宿主如大腸桿菌中大量表達(dá)。當(dāng) TrzN與分子伴侶GroEL共表達(dá)時(shí)從大腸桿菌獲得的最高產(chǎn)量低于IOmg. mL—1 (Siapir et al.，2006)，在沒有分子伴侶時(shí)最高產(chǎn)量僅 560 μ g. ml/1 (Shapir et al.，2005b)。生物整治是改善潛在損害性殺蟲劑殘留的環(huán)境影響的新興方法(Alcalde et al.，2007)。一種成功的生物整治策略是酶生物整治，其中使用分離的或半純化的酶以極大地降低其毒性的方式來分解或修飾毒性殺蟲劑(Parales et al. ,2002 ；Sutherland et al.，2004)。酶生物整治比使用活微生物具有很多優(yōu)勢；存在GM生物體或完整DNA向環(huán)境的釋放，所用的酶通?？焖?僅需要數(shù)小時(shí)的應(yīng)用時(shí)間)并在應(yīng)用后具有有限的、可預(yù)期的持久性(Alcalde et al. ,2007) 然而，對生物整治所用的酶的要求有些嚴(yán)格，其要求高催化活性、低Km、不依賴于擴(kuò)散性輔因子、以及對環(huán)境條件(PH、溫度、鹽濃度等)的范圍而言通常是強(qiáng)健的蛋白。酶還必須在通常的發(fā)酵生物體如大腸桿菌中以高可溶性活性蛋白的形式表達(dá)，對于這一點(diǎn)， TrzN不合格。盡管莠去津潛在的大量環(huán)境痕跡令人憂慮，但是其在農(nóng)業(yè)中的持續(xù)使用仍然是期望的。因此，需要用于消除或減少莠去津和其他S-三嗪以及二嗪對環(huán)境的潛在破壞的其他方法。發(fā)明概述本發(fā)明人已鑒定出編碼具有增強(qiáng)性質(zhì)的TrZN或其變體的多核苷酸。在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼水解S-三嗪和/或二嗪的多肽的分離和/或外源多核苷酸，其中所述多肽與包含SEQ ID NO :1所提供的氨基酸序列的多肽具有至少40% 的同一性，并且i)當(dāng)在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，比在相同條件下培養(yǎng)的包含含SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 4所提供的核苷酸序列的外源多核苷酸的同基因細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生更多的多肽，和/或ii)所述多肽具有的S-三嗪和/或二嗪水解活性大于包含SEQ ID NO=I所提供的氨基酸序列的多肽。在優(yōu)選實(shí)施方案中，比在相同條件下培養(yǎng)的包含含SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 4 所提供的核苷酸序列的外源多核苷酸的同基因細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生更多的可溶性生物學(xué)活性形式的多肽。在另外的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽在對應(yīng)于SEQ ID NO 1的氨基酸編號(hào)159的位置處包含蘇氨酸或纈氨酸。在另一實(shí)施方案中，所述多核苷酸還編碼包含以下的多肽i)對應(yīng)于SEQ ID NO 1的氨基酸編號(hào)38的位置處的天冬酰胺； 和ii)對應(yīng)于SEQ ID NO 1的氨基酸編號(hào)131的位置處的脯氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、酪氨酸或異亮氨酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4所提供的核苷酸序列，并具有一個(gè)或多個(gè)以下核苷酸取代或者對應(yīng)于其核苷酸位置處的取代T5C、 C39A、C76A、C84A、T87C、C101A、T108A、T108A、G112A、A127G、C135T、A157T、C165T、G168A、 C180T、C189T、A200T、C207T、G210A、G225T、A228G、C229T、T240C、A250C、C268A、G270A、Α271Τ、Τ273Α、C279T、A296G,A302G、A303G、A314G、C315A、T317C、T320C、A326C、A333G、T336C、C346T、G357A,A367G、C372T、C375A、C381T、T384C、C391A、C391G、C391T、T392C、Τ392Α、T392G、G393C、T399C、C410T、C411A、C411T、A414G、A418C、T423C,Τ426Α,Α432Τ、C438T、C449G、C454T、T466C,T468C,T471C,C474T、G475A、C476T、A481G、C483T、G489A、G489T、T498C,Τ531Α、A537G、A540G,A545G,T546G,G548A,T555C、T555C、C564T、G567A、G567A、G568A、G569A、G573C、T579C、Α584Τ、G589A、A600G、T618C、T618C、T627C、C628G、G630A、C633T、G637A、T639C、T639C、A654G、G660A、G660T、T663C、C675A、G681T、C686T、C690A、C696T、G705A、A723G、C727G、T728C、T728G、G729C、G736A、G737C、G737A、G737T、T738G、T738C、T738C、G745A、G753C、G768A、Τ774Α、C807A、Τ840Α、A843G、Α852Τ、A855G、C867T、T879C、G880A、G880T、G880C、C881T、G882T、C885T、G897A、T900C、Τ906Α、A928G、
A938T、T941C、C957A、T959A、C972T、T978A、C981T、C993T、C999T、C1003A、C1003T、T1011C、 G1048A、G1048T、G1048C、A1049T、A1049G、G1053A、A1059G、A1086G、G1094A、T1101C、T1101G、 C1128T、A1152G、G1176T、C1186A、C1186T、T1196C、C1203T、G1221A、C1223T、C1236T、G1248T、 G1270A、C1278T、T1286A、T1305C、G1309A、C1321T、A1326G、C1329T、C1329T、C1332T、C1344A、 C1351A 和 G1353T。在一實(shí)施方案中，所述多核苷酸編碼包含SEQ ID NO :1所提供的氨基酸序列的多肽，并具有一個(gè)或多個(gè)以下氨基酸取代或者對應(yīng)于其氨基酸位置處的取代I2T、F13L、 L26M、D28E、A34D、D38N、S43G、M53L、Y67F、S84R、L90M、T91S、D99G、K101R、D105E、D105G、 V106A、Ι107Τ、Ε109Α、I123V、L131P、L131N、L131T、L131D、L131V、L131G、L131C、L131S、 L131Q、L131H、L131Y、L131I、Τ137Ι、S140R、T150S、F156L、Α159Τ、A159V、S161G、Μ163Ι、 F177L、D182E、D182G、R183H、G190D、G190S、Y195F、Ε197Κ、Ρ210Α、V213I、Μ227Ι、Μ227Ι、 A229V、D230E、L243P、L243G、G246A、G246S、G246D、G246E、G246K、G246V、D249N、Α294Τ、 A294S、A294L、I310V、Y313F、L314P、V320E、L335M、D350N、D350Y、D350F、D350R、D350H、 R365H、L396M、V399A、A408V、V424I、V429D、V437I 和 L451M。在另一實(shí)施方案中，所述多核苷酸編碼包含SEQ ID NO :1所提供的氨基酸序列的多肽，并具有一個(gè)或多個(gè)以下氨基酸處的取代或者對應(yīng)于其氨基酸位置處的取代Μ82、 W85、L86、Μ92、L131、Μ163、L172、C211、Υ215、Η238、Ε241、L243、Μ247、Η274、Ρ299、D300、 M303、W305、T325和 S329。在另一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多核苷酸在對應(yīng)于SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 4的核苷酸編號(hào)468的位置處包含胞嘧啶。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核苷酸編碼多肽，其包含i)對應(yīng)于SEQ ID NO=I的氨基酸編號(hào)67的位置處的苯丙氨酸；和/或ii)對應(yīng)于SEQ ID NO=I的氨基酸編號(hào)91的位置處的絲氨酸，和/或iii)對應(yīng)于SEQ ID NO=I的氨基酸編號(hào)131的位置處的脯氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、酪氨酸或異亮氨酸；和 /或iv)對應(yīng)于SEQ ID NO=I的氨基酸編號(hào)159的位置處的蘇氨酸或纈氨酸；和/或ν)對應(yīng)于SEQ ID NO=I的氨基酸編號(hào)161的位置處的甘氨酸；和/或vi)對應(yīng)于SEQ ID NO=I的氨基酸編號(hào)210的位置處的丙氨酸；和/或
vii)對應(yīng)于SEQ ID NO :1的氨基酸編號(hào)243的位置處的脯氨酸或甘氨酸；和/或viii)對應(yīng)于SEQ ID NO 1的氨基酸編號(hào)M6的位置處的天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、賴氨酸、纈氨酸或丙氨酸；和/或ix)對應(yīng)于SEQ ID NO 1的氨基酸編號(hào)四4的位置處的蘇氨酸、絲氨酸或亮氨酸； 和/或χ)對應(yīng)于SEQ ID NO 1的氨基酸編號(hào)335的位置處的甲硫氨酸；和/或xi)對應(yīng)于SEQ ID NO 1的氨基酸編號(hào)350的位置處的酪氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、精氨酸或組氨酸；和/或xii) i)至xi)的任一種的生物學(xué)活性片段。在另一實(shí)施方案中，所述多核苷酸編碼包含SEQ ID NO :1所提供的氨基酸序列的多肽，并具有以下氨基酸取代或取代組之一，或者對應(yīng)于其氨基酸位置處的一或多個(gè)取代i)Y313Fii)Y67Fiii)A159Viv)A159V、L243Pν) D350Yvi)G190D、M227Ivii)A159Tviii)A408Vix)L26M、S161Gx)F13L、A34D、G246A、D350Yxi)T137I、S140Rxii)L335Mxiii)P210Axiv)A294Txv) 1123Vxvi)Y67F、V437Ixvii)M163I、D249Nxviii)T137Ixix) G246Sxx) L90Mxxi)A159V、L243P、L451Mxxii) T150S、A159V、A229V、D230E、L243Pxxiii)Y67F、L335Mxxiv)Y67F、K101R、A294Txxv) L335Mxxvi) V106A、S161G、F177L、L335Mxxvii)S43G、I107T、A159V、D350Y
xxviii)M53L、T137I、S140R、D182G、G190S、D350Yxxix) A159V、L335M、D350Yxxx)D28E>A294T>D350Nxxxi)P210A、V424Ixxxii)A159V、G190Dxxxiii)P210A、A294T、R365H、D350Yxxxiv)I123V、S161G、A294Txxxv)Y67F、A159V、D350Yxxxvi)T91S、A159V、A294Txxxvii)Y67F、A159V、L243Pxxxviii)A159V、P210Axxxix)A159V、I310V、L335M、L396M、L243Pxl) I2T、D105E、A159V、E197K、M227I、L243P、L335Mxli)A159V、L335Mxlii)S84R、D105G、A159Vxliii)Y67F、A294Txliv)A159V、D182E、L335M、D350Yxlv)Y67F、A159V、L243Pxlvi)D38N、A159Vxlvii)A159V、M163I、Y195F、D350Yxlviii)F156L、P210A、D350Yxlix)Y67F、D350Y1)A159V、D350Yli) Y67F、D99G、A159V、V213I、L243P、L335Mlii)E109A、A159V、L314P、V320E、V399A、V429Dliii)A159V、L335Mliv) Y67F、A159V、L335M、D350Ylv)D38N、L131P、A159Vlvi) T91S、L131P、A159V、A294T、R365H、L396M、D350Ylvii)R183H、P210A、D350Ylviii)Y67F、A159V、D350Y
lix)A159V、P210A、A294T、D350Nlx)Y67F、A159V、D350Nlxi) A159V、L335M、D350Ylxii)P210A、A294T、D350Ylxiii)T91S、A159V、A294Tlxiv)P210A、A294T、L335M 或lxv)Y67F、L335M。在另一實(shí)施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4所提供的核苷酸序列，并具有以下核苷酸取代或取代組之一或者對應(yīng)于其核苷酸位置處的一或多個(gè)取
代
i)T468C
ii)T468C、A938T
iii)A200T、G210A、T468C
iv) T468C、C476T、G753C
ν) T468C、C476T、T728C
vi)T468C、1048T
vii) T384C、T468C、G569A、G681T
viii)T468C、G475A
ix) C279T、T468C、C1223T、C1329T
x) C76A、T468C、A481G
xi) C39A、C101A、T468C、T639C、G737C、G1048T
xii) C410T、A418C、T468C、A600G
xiii)T468C、G705A、C1003A
xiv)T468C、G573C
xv) T468C、C474T、C628G、C1278T
xvi) T399C、T468C、G880A、T900C
xvii)T468C、C1236T
xviii)T87C、A367G、T468C
xix) T468C、G1176T
xx)C135T、T468C、C1344A
xxi)T468C,A852T
xxii)T468C、T738C
xxiii)C454T、T468C
xxiv)A200T、T468C、G1309A
xxv)T468C、G489T、G745A
xxvi)C410T、T468C
xxvii)T468C,G736A
xxviii)G225T、C268A、A414G、T468C、T627C、C1321T
xxix) A432T、T468C、T471C、C476T、T728C、G1053A、C1351A
xxx)A303G、C449G、T468C、C476T、C686T、C690A、T728C、C1128T
xxxi) A200T、G210A、C372T、T468C、A654G、C1003A
xxxii) C180T、A200T、A302G、C375A、T399C、C41 IT、T468C、A540G、G880A、T900C
xxxiii) C229T、T468C、G705A、C1003A
xxxiv) T317C、T468C、A481G、T531A、G753C、T906A、T978A、C1003A、A1326G
xxxv) A127G、T320C、T468C、C476T、G753C、G1048T
xxxvi) A157T、C410T、A418C、T468C、A545G、G568A、A600G、C628G、G630A、G1048T、C1332T
xxxvii)T468C、C476T、A723G、C1003A、G1048T、C1329Txxxviii)C84A、T399C、T468C、C483T、G880A、T900C、G1048Axxxix)T468C、T498C、C628G、C885T、A1086G、G1270Axl)T384C、T468C、C476T、G569A、G753C、A1152Gxli) T336C、T468C、C476T、A537G、C564Txlii) A228G、T240C、T468C、C628G、G880A、G1048T、G1094Axliii) T273A、A367G、C381T、T399C、T468C、A481G、G880A、T900Cxliv)A200T、C207T、G210A、T468C、C476T、G1048T、A1059Gxlv)A271T、A333G、T399C、T468C、C476T、A843G、G880A、T900C、C1236Txlvi)A200T、G210A、C346T、T468C、C476T、T579C、T728C、C1278Txlvii) C438T、T468C、C476T、A855Gxlviii)G168A、T426A、T468C、C476T、C628G、C1203T、T1305Cxlix) T468C、C476T、T663C、C1236T1) T384C、T468C、C476T、T728C、A928G、C1003A、Cl 186Ali)T5C、C315A、T468C、C476T、G589A、G681T、T728C、G897A、C1003Alii) C279T、T468C、C476T、C1003Aliii) A250C、A314G、T468C、C476Tliv) A200T、G210A、T468C、T555C、G880A、T900Clv)T468C、C476T、T546G、C696T、C1003A、G1048Tlvi)A200T、G210A、T468C、C476T、T728C、TllOlGlvii)G112A、C165T、T468C、C476T、T618C、G753C、C999T、TllOlC
lviii)T423C、T468C、C476T、G489A、A584T、G753C、G1048Tlix)T466C、T468C、C474T、C628G、G1048Tlx)T108A、A200T、G210A、G357A、T468C、G1048T、A1059G、C1278Tlxi) T468C、C476T、G567A、G753C、G1048Tlxii) A200T、G210A、A296G、T468C、C476T、G637A、T728C、C1003Alxiii)C189T、A326C、T468C、C476T、T941C、T959A、A1059G、C1186T、T1196C、 G1248T、T1286Alxiv)T468C、C476T、C1003Alxv)A200T、G210A、C279T、T468C、C476T、T879C、C1003A、G1048Tlxvi)G112A、C165T、T392C、T468C、C476T、T618C、G660A、C675A、G753C、C807A、 C993T、C999T、T1101C、T1305Clxvii)A271T、T392C、T468C、C476T、G753C、G880A、G1048T、G1094A、C1186A、G1221Alxviii)A228G、T240C、T468C、G548A、C628G、G1048T、C1332Tlxix)T108A、A200T、G210A、T423C、T468C、C476T、G567A、G1048Tlxx)T384C、T468C、C476T、C628G、C867T、G880A、T900C、C981T、G1048A、A1326Glxxi)A200T、C207T、G210A、T468C、C476T、T840A、T900C、G1048Alxxii)T468C、C476T、C633T、G660T、A723G、C1003A、G1048T、C1329Tlxxiii)A228G、T240C、G270A、T468C、C628G、880A、G1048T
lxxiv)A271T、A333G、T399C、T468C、C476T、A843G、G880A、T900C、C1003T、C1236Tlxxv)A228G、T240C、T468C、C628G、G880A、C957A、C1003A 或lxxvi) A200T、G210A、C411A、T468C、T555C、T639C、A654G、G768A、T774A、C972T、 C1003A、T1011C、G1353T。在實(shí)施方案中，當(dāng)在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，比在相同條件下培養(yǎng)的包含含SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4所提供的核苷酸序列的外源多核苷酸的同基因細(xì)菌細(xì)胞所產(chǎn)生的，產(chǎn)生至少2倍、優(yōu)選至少5倍的量的多肽。在另一實(shí)施方案中，當(dāng)在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，比在相同條件下培養(yǎng)的包含含SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4所提供的核苷酸序列的外源多核苷酸的同基因細(xì)菌細(xì)胞所產(chǎn)生的，產(chǎn)生至少2倍、優(yōu)選至少5倍的量的可溶性生物學(xué)活性多肽。在另外的實(shí)施方案中，當(dāng)在大腸桿菌菌株BL21XDE3中表達(dá)并在補(bǔ)加了 200 μ g. mL—1氨芐青霉素、ΙμΜ IPTG并用lmg. mL—1莠去津(90%莠去津w/w)浸漬的LB瓊脂平板上培養(yǎng)時(shí)，菌落附近培養(yǎng)基的澄清可以在培養(yǎng)約8天內(nèi)、更優(yōu)選在約6天內(nèi)、更優(yōu)選在約2天內(nèi)檢測到。這樣的條件下多核苷酸的表達(dá)更詳細(xì)地描述于實(shí)施例部分。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽具有比包含SEQ ID NO 1所提供的氨基酸序列的多肽高至少2倍、更優(yōu)選高至少5倍、更優(yōu)選高7倍的莠去津水解活性。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽具有比包含SEQ ID NO 1所提供的氨基酸序列的多肽高至少2倍、更優(yōu)選高至少5倍的西瑪津水解活性?？梢员槐景l(fā)明的多核苷酸編碼的多肽水解的S-三嗪的實(shí)例包括但不限于莠去津、莠滅凈、撲滅津、撲草凈、西瑪津、西草凈、抑草津、草達(dá)津或氰草津(cyanozine)。所述細(xì)菌細(xì)胞可以是能夠產(chǎn)生本發(fā)明多核苷酸編碼的多肽的任何細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)菌細(xì)胞是大腸桿菌。大腸桿菌的合適菌株的實(shí)例包括但不限于 BL21 λ DE3 (ATCC 登錄號(hào) ΡΤΑ-2657)、JM109 和 DHlO β。在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多核苷酸與能夠指引該多核苷酸在細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子可操作地連接。在另一實(shí)施方案中，所述多核苷酸編碼還包含至少一種其他多肽序列的融合蛋白。所述至少一種其他多肽可以是例如增強(qiáng)本發(fā)明多肽穩(wěn)定性的多肽，促進(jìn)融合蛋白從諸如細(xì)菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞的細(xì)胞分泌的多肽、或者有助于融合蛋白純化的多肽。在另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的多核苷酸的載體。還提供了包含本發(fā)明的多核苷酸和/或本發(fā)明的載體的宿主細(xì)胞。在實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞還包含編碼分子伴侶的外源多核苷酸。本發(fā)明的宿主細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞或植物細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明提供了包含至少一種本發(fā)明的細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物。在另一方面，本發(fā)明提供了包含至少一種本發(fā)明的細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。在另一方面，本發(fā)明提供了水解S-三嗪和/或二嗪的基本上純化的和/或重組的多肽，其中所述多肽與包含SEQ ID NO :1所提供的氨基酸序列的多肽具有至少40%的同一性，并且其中i)當(dāng)在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，比在相同條件下培養(yǎng)的包含編碼SEQ ID NO :1所提供的氨基酸序列的外源多核苷酸的同基因細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生更多的多肽，和/或
ii)所述多肽具有大于包含SEQ ID NO=I所提供的氨基酸序列的多肽的s_三嗪和/或二嗪水解活性。在優(yōu)選實(shí)施方案中，比在相同條件下培養(yǎng)的包含編碼SEQ ID NO 1所提供的氨基酸序列的外源多核苷酸的同基因細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生更多的可溶性生物學(xué)活性形式的多肽。在另外的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽在對應(yīng)于SEQ ID NO 1的氨基酸編號(hào) 159的位置處包含蘇氨酸或纈氨酸。在另一實(shí)施方案中，所述多肽還額外包含i)對應(yīng)于SEQ ID NO 1的氨基酸編號(hào)38的位置處的天冬酰胺；和ii)對應(yīng)于SEQ ID NO=I的氨基酸編號(hào) 131的位置處的脯氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、酪氨酸或異亮氨酸?？梢员槐景l(fā)明的多肽所水解的S-三嗪的實(shí)例包括但不限于莠去津、莠滅凈、撲滅津、撲草凈、西瑪津、西草凈、抑草津、草達(dá)津或氰草津。 在實(shí)施方案中，所述多肽是融合蛋白還包含至少一種其他多肽序列。該至少一種其他多肽可以是例如增強(qiáng)本發(fā)明多肽穩(wěn)定性的多肽、促進(jìn)融合蛋白從諸如細(xì)菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞的細(xì)胞分泌的多肽、或者有助于融合蛋白純化的多肽在另一實(shí)施方案中，所述多肽固定于固體支持物上。在另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明宿主細(xì)胞、本發(fā)明植物和/或本發(fā)明動(dòng)物的提取物，其中該提取物包含本發(fā)明的多肽。在另外的方面，本發(fā)明提供了組合物，其包含本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的載體、 本發(fā)明的宿主細(xì)胞、本發(fā)明的多肽和/或本發(fā)明的提取物、以及一種或多種可接受的載體。在另外的方面，本發(fā)明提供了水解S-三嗪或二嗪的方法，所述方法包括使S-三嗪或二嗪與本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的宿主細(xì)胞、本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的提取物和/或本發(fā)明的組合物接觸。在實(shí)施方案中，樣品選自由以下組成的組土壤、水、生物材料或其組合。在另一方面，本發(fā)明提供了處理對象中的S-三嗪或二嗪所引起的毒性的方法，所述方法包括給所述對象施用本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的宿主細(xì)胞、本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的提取物和/或本發(fā)明的組合物。在另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明多核苷酸、本發(fā)明載體、本發(fā)明宿主細(xì)胞、本發(fā)明多肽、本發(fā)明提取物和/或本發(fā)明組合物在制備用于處理對象中的S-三嗪或二嗪所引起的毒性的藥物中的用途。在另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生能夠水解S-三嗪和/或二嗪的多肽的方法，所述方法包括在允許編碼所述多肽的多核苷酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)編碼所述多肽的本發(fā)明的宿主細(xì)胞或編碼所述多肽的本發(fā)明的載體，以及回收表達(dá)的多肽。在另外的方面，本發(fā)明提供了檢測宿主細(xì)胞的方法，所述方法包括i)使細(xì)胞或細(xì)胞群在允許所述細(xì)胞攝取本發(fā)明多核苷酸的條件下與所述多核苷酸接觸，和ii)通過將步驟i)的細(xì)胞或其后代細(xì)胞暴露于S-三嗪或二嗪來選擇宿主細(xì)胞。在實(shí)施方案中，所述多核苷酸編碼本發(fā)明的多肽。在實(shí)施方案中，所述多核苷酸包含第一可讀框，其包含本發(fā)明的多核苷酸；以及第二可讀框，其不包含本發(fā)明的多核苷酸。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二可讀框編碼多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二可讀框編碼不翻譯的多核苷酸。在這兩種情況下，所述第二可讀框均優(yōu)選可操作地連接至合適的啟動(dòng)子。優(yōu)選地，所述不翻譯的多核苷酸編碼催化性核酸、dsRNA分子或反義分子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為植物細(xì)胞。在另外的方面，本發(fā)明提供了用于水解S-三嗪或二嗪的試劑盒，所述試劑盒包含本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的宿主細(xì)胞、本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的提取物和/ 或本發(fā)明的組合物。在另外的方面，本發(fā)明的提供了本發(fā)明多肽的晶體。在另一方面，本發(fā)明提供了設(shè)計(jì)多肽的方法，所述多肽具有大于包含SEQ ID NO 1 所提供的氨基酸序列的多肽的S-三嗪和/或二嗪水解活性，所述方法包括使用本發(fā)明晶體的原子坐標(biāo)來從計(jì)算上評價(jià)S-三嗪或二嗪與候選多肽結(jié)合的能力，并選擇具有大于包含 SEQ ID NO :1所提供的氨基酸序列的多肽的S-三嗪和/或二嗪水解活性的多肽。 顯然，本發(fā)明一個(gè)方面的優(yōu)選特性和特征適用于本發(fā)明的許多其他方面。在整個(gè)本說明書中，詞語“包含(comprise)，，或其變體如“包含(comprises)，，或 “包含(comprising) ”應(yīng)當(dāng)被理解為表示包括指定的元件、整體或者步驟，或者元件、整體或步驟的組，但并不排除任何其他元件、整體或步驟，或者元件、整體或步驟的組。通過以下非限制性實(shí)施例并參照附圖來描述本發(fā)明。


圖1.被本發(fā)明的酶降解的各種S-三嗪的結(jié)構(gòu)。圖 2. pETcc2: :egfp 的圖示。圖3.野生型TrzN、TrzN cc3. 2以及中間突變體形式的部分純化。野生型TrzN的值取自Siapir et al. (2005)，從5升產(chǎn)生2. 8mg。包括了分子量標(biāo)記(泳道M)，并標(biāo)明了它們的分子量(kDa)。TrzN及其變體的位置用箭頭標(biāo)出。從TrzN及其變體的相同純化物添加等體積(5 μ 1)至至每個(gè)泳道。圖4. TrzN結(jié)構(gòu)的示意圖及卡通圖(cartoon)。TrzN形成99. 6kDa的同源二聚體。 每個(gè)單體分成兩個(gè)結(jié)構(gòu)域β夾層結(jié)構(gòu)域和β /CI8桶結(jié)構(gòu)域。β /CI8桶在上表面具有若干環(huán)插入，其用于修飾活性位點(diǎn)入口(entrace)，或另外形成二聚體界面。圖5.圖示構(gòu)成TrzNcc3.2底物結(jié)合袋的殘基。莠去津、Si2+中心和氫氧根離子 (0H_)顯示在中心。組成底物結(jié)合袋的氨基酸的名稱和序列被標(biāo)出。圖6. Apo-TrzNcc3. 2用Zn2+飽和。以2. 6 μ M ZnCl2恢復(fù)一半的最大活性。圖7.活性位點(diǎn)氨基酸殘基和金屬配位(coordinating)氨基酸殘基的圖示。莠去津、Zn2+和氫氧根離子(0H_)顯示在中心，并表示出相關(guān)殘基的名稱和序列。圖8.描述TrzN的推測的反應(yīng)機(jī)理的圖示。圖9. TrzN與莠滅凈的速率常數(shù)(k。at)和反應(yīng)緩沖液pH之間的關(guān)系。圖10. TrzNcc3. 2的田野實(shí)驗(yàn)結(jié)果。添加TrzNcc3. 2后10. 5小時(shí)，1. 5ML蓄水壩 (holding dam)中莠去津耗盡。通過QHFSS (方框)和CSIRO Entomology (圓圈)分析樣品。
序列表說明SEQ ID NO 野生型TrzN的氨基酸序列SEQ ID NO :2_編碼iTrzN(TrzNco)的密碼子優(yōu)化的可讀框SEQ ID NO :3_編碼TrzN的密碼子優(yōu)化的可讀框，且第156位密碼子從TTT變?yōu)?TTC (Trz Li)SEQ ID NO :4_編碼野生型TrzN的可讀框SEQ ID NO 5至30-寡核苷酸引物發(fā)明詳述一般技術(shù)和定義除非另外具體定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本領(lǐng)域技術(shù)人員的通常理解的具有相同的含義(如，在細(xì)胞培養(yǎng)、生物整治、分子遺傳學(xué)、免疫學(xué)、免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)和生物化學(xué)中)。除非另外指出，本發(fā)明所用的重組蛋白、細(xì)胞培養(yǎng)和免疫學(xué)技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法。這樣的技術(shù)在諸如以下文獻(xiàn)中有描述和解釋J.Pertal，A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T. A. Brown (editor), Essential Molecular Biology :A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D. M. Glover and B. D. Hames (editors), DNA Cloning :A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), and F. M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988,包括至目前所有的更新)， Ed Harlow and David Lane(editors)Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), and J. E. Coligan et al. (editors)Current Protocols in Immunology, John Wiley&Sons (包括至目前所有的更新)。本文所用的術(shù)語“水解(hydrolyses) ”、“水解(hydrolysing) ”、“水解活性”及其變體指本發(fā)明的多肽催化化學(xué)鍵水解的能力。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶是一種或多種如下酶脫鹵素酶(如氯水解酶、氟水解酶、鹵素水解酶、水解脫氯酶、水解脫氟酶和/或水解脫鹵素酶)、甲氧基水解酶和甲硫基水解酶。在優(yōu)選實(shí)施方案中，多肽“降解” S-三嗪或二嗪從而使酶活性的產(chǎn)物比S-三嗪或二嗪底物對例如哺乳動(dòng)物和/或魚的毒性較低和 /或穩(wěn)定性較差。本文所用的術(shù)語“較高的S-三嗪和/或二嗪水解活性”指本發(fā)明的多肽比包含SEQ ID NO :1所提供的氨基酸序列的多肽對S-三嗪或二嗪具有更高的比活性、催化常數(shù)(k。at)、 底物特異性(Km)和/或次級速率常數(shù)(k。at/Km)，或較高的穩(wěn)定性。所述比活性可以如實(shí)施例所述來確定。本文所用的短語“在對應(yīng)于氨基酸的位置處”和“對應(yīng)于氨基酸編號(hào)...的位置處”指與周圍氨基酸相比的氨基酸相對位置。例如，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽可以具有缺失或取代突變，其在例如與SEQ ID NO :1比對時(shí)改變氨基酸的相對位置。在實(shí)施方案中，所述多肽包含給定殘基編號(hào)處的指定氨基酸。類似地，短語“在對應(yīng)于核苷酸位置處”和“對應(yīng)于核苷酸編號(hào)...的位置處”指與周圍核苷酸相比的核苷酸相對位置。例如，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸可以具有缺失或取代突變，其在例如與SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4比對時(shí)改變核苷酸的相對位置。在實(shí)施方案中，所述多核苷酸包含給定核苷酸編號(hào)處的指定核苷酸。本文所用的術(shù)語“處理(treating) ”、“處理(treat) ”或“處理(treatment) ”包括施用治療有效量的本發(fā)明的多肽、或編碼其的多核苷酸，足以減少或消除S-三嗪或二嗪所引起的毒性的至少一種癥狀。術(shù)語“生物材料”在本文中以其最廣泛的含義使用以包含生物來源的任何產(chǎn)物。這樣的產(chǎn)物包括但不限于用于人和動(dòng)物飼喂的食品。所述產(chǎn)物包括液體介質(zhì)，其包括水和液體食物如奶；以及半固體食物如酸奶等。本發(fā)明還拓展至固體食物，特別是動(dòng)物飼料。在實(shí)施方案中，所述生物材料優(yōu)選為植物材料，例如但不限于甘蔗、油菜籽(canola seed)、小麥種子、大麥種子、高粱種子、大米、玉米、菠蘿或棉籽。本文所用的術(shù)語“提取物”指本發(fā)明的宿主細(xì)胞、植物或非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的任何部分。所述部分可以是完整的實(shí)體如植物的種子，或者通過至少部分均質(zhì)化和/或純化所獲得。此術(shù)語包括宿主細(xì)胞所分泌的部分，并因此涵蓋培養(yǎng)上清。本文所用的術(shù)語“分子伴侶”指功能是輔助其他蛋白實(shí)現(xiàn)適當(dāng)?shù)恼郫B或伸展以改變蛋白從細(xì)胞輸出的蛋白。分子伴侶在本領(lǐng)域是已知的，包括但不限于核糖體結(jié)合蛋白如引發(fā)因子(TF) ；Hsp70分子伴侶家族，如Hsp70、DnaK, Hsp40、DnaJ、GrpE ；以及陪伴蛋白分子伴侶家族，如GroEL、GroES, Hsp60、HsplO0作為非限制性實(shí)例，來自大腸桿菌的分子伴侶GroEL是分子伴侶的熱休克蛋白60(Hsp60)類的成員，并從大腸桿菌GroE操縱子與 GroES—起表達(dá)。GroEL促進(jìn)蛋白折疊反應(yīng)，這是通過結(jié)合未折疊的蛋白，其降低了傾向于聚集的多肽中間體的濃度及偏離途徑(off-pattway)聚集的速率，從而有利于分配為天然構(gòu)象。已知共陪伴蛋白GroES以及輔因子如ATP、K+和Mg2+進(jìn)一步增加GroEL介導(dǎo)的多肽折疊反應(yīng)的產(chǎn)率。因此，在特定的實(shí)施方案中，技術(shù)人員會(huì)包括本領(lǐng)域已知的組分、輔因子、 另外的分子伴侶蛋白等以改善或增強(qiáng)分子伴侶介導(dǎo)(或輔助)的蛋白折疊?？梢杂糜诰幋aGroEL的載體的實(shí)例包括但不限于含有dnaK-dnaJ-grpE-groES-groEL的pG_KJE8，含有 groES-groEL ^ pGro7, UR^^ groES-groEL-tig ^ pG-Tf2 (Nishihara et al. , 1998 and 2000)。s-三嗪和二嗪本文所用的“S-三嗪”是有機(jī)化合物，其包含具有由3個(gè)碳原子和3個(gè)氮原子組成的6元雜環(huán)芳環(huán)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。三嗪環(huán)中的原子是苯環(huán)中那些原子的類似物。被本發(fā)明的酶水解(降解)的S-三嗪類型的實(shí)例包括但不限于氯-S-三嗪、氟-S-三嗪、甲硫基-S-三嗪和甲氧基-S-三嗪。被本發(fā)明的酶水解(降解)的某些S-三嗪的化學(xué)結(jié)構(gòu)在圖1中提供。在優(yōu)選實(shí)施方案中，S-三嗪具有以下結(jié)構(gòu)-2-R1-4-R2-6-R3-1,3,5-三嗪(trainzine)； 其中 Rl 可以是(1、？1、0013、5013、5(0)013或吧，其中 R2 或 R3 可以是 0CH3、NHCH2CH20H、 NH (CH2) 2CH3、NH (CH2) 3CH3、NHCH2CH (CH3) 2、NHCH (CH3) CH2CH3、NHC (CH3) 2CN、NHC (CH3) 3、 NH2 或 OH。氯化的(氯)S-三嗪包含至少一個(gè)氯。氯化S-三嗪的實(shí)例包括但不限于莠去津(6-氯-N-乙基-N' -(1-甲基乙基)-1，3，5_三嗪-2，4-二胺)(見圖1)、可樂津(chl0razine，6-氯-N，N，N' , N'-四乙基 _1，3，5-三嗪-2，4-二胺)、氰草津(2-[[4_氯-6-(乙基氨基)-1，3，5_三嗪-2-基]氨基]-2-甲基丙腈)、環(huán)丙津(cyprazine, 6-氯-N-環(huán)丙基-N' -(1-甲基乙基)-1，3，5_三嗪-2，4-二胺)、甘草津(eglinazine， N-[4-氯-6-(乙基氨基)-l，3，5-三嗪-2-基]甘氨酸)、抑草津(6-氯-N，N-二乙基-N' -(1-甲基乙基)-1，3，5-三嗪-2，4-二胺)、滅莠津(1^80 儀2丨116，6-氯-^(3-甲氧基丙基)-N' (1-甲基乙基)-1，3，5_三嗪-2，4-二胺)、環(huán)丙青津(procyazine， 2-[ [4-氯-6-(環(huán)丙基氨基)-1，3，5-三嗪-2-基]氨基]-2-甲基丙腈)、甘撲津 (proglinazine, N_[4_氯_6_[ (1-甲基乙基)氨基]_1，3，5-三嗪-2-基]甘氨酸)、撲滅津(6-氯-N，N'-雙(1-甲基乙基)_1，3，5-三嗪-2，4-二胺)、另丁津(sebuthylazine， 6-氯-N-乙基-N' -(1-甲基丙基)-1，3，5_三嗪-2，4-二胺、西瑪津(6-氯-N，N' -二乙基-1，3，5-三嗪-2，4- 二胺)、草凈津(terbuthylazine，6-氯-N-(1，1- 二甲基乙基)-N'-乙基-1，3，5-三嗪-2，4-二胺)和草達(dá)津(6-氯-N，N，N'-三乙基-1，3，5-三嗪-2，4-二胺)以及氯-S-三嗪脫烷基化的產(chǎn)物(包括莠去津脫烷基化，如脫乙基莠去津和脫異丙基莠去津)。甲硫基-S-三嗪包含至少一個(gè)硫醇(thiol)基。甲硫基-S-三嗪的實(shí)例包括但不限于莠滅凈(N2-乙基-N4-異丙基-6-甲硫基-1，3，5-三嗪-2，4-二胺)、撲草凈(N2， N4-二異丙基-6-甲硫基-1，3，5-三嗪-2，4-二胺)和西草凈(N2，N4-二乙基-6-甲硫基-1，3，5-三嗪-2，4-二胺)。甲氧基-S-三嗪包含至少一個(gè)甲氧基。甲氧基-S-三嗪的實(shí)例包括但不限于莠去通(N2-乙基-N4-異丙基-6-甲氧基-1，3，5-三嗪-2，4-二胺)、西瑪通(N2，N4-二乙基-6-甲氧基-1，3，5-三嗪-2，4-二胺)和撲滅通(N2，N4-二異丙基-6-甲氧基_1，3， 5-三嗪-2，4-二胺)。氟-S-三嗪包含至少一個(gè)氟。氟-S-三嗪的實(shí)例為氟莠去津(2-氟-4-N-乙基氨基-6-N-異丙基氨基-1,3,5-三嗪)。在實(shí)施方案中，S-三嗪具有至少一個(gè)N-乙基、N-異丙基、N-二乙基和/或N-氰基二甲基甲基烷基側(cè)鏈。在優(yōu)選實(shí)施方案中，二嗪具有以下結(jié)構(gòu)-2-Rl-4-R2-6-R3_l，3-嘧啶；其中Rl可以是 Cl、Fl、0CH3、SCH3、S (0) CH3 或 N3，其中 R2 或 R3 可以是 0CH3、NHCH2CH20H、NH (CH2) 2CH3、 NH (CH2) 3CH3、NHCH2CH (CH3) 2、NHCH (CH3) CH2CH3、NHC (CH3) 2CN、NHC (CH3) 3、NH2 或 0H。二嗪類型的實(shí)例包括但不限于氯-S- 二嗪和氟-S- 二嗪。作為除草劑的二嗪的實(shí)例為除草定 (5-溴-3-叔丁基-6-甲基尿嘧啶)。多肽“基本上純化的”或“純化的”表示這樣的多肽，其已從該多肽在天然狀態(tài)相伴的一種或多種脂質(zhì)、核酸、其他多肽或其他污染分子中分離。優(yōu)選地，基本上純化的多肽為至少 60%不含該多肽天然相伴的其他組分、更優(yōu)選至少75%、更優(yōu)選至少90%。然而，目前還沒有本發(fā)明多肽在自然中存在的證據(jù)。以多肽為背景的術(shù)語“重組”指當(dāng)由細(xì)胞或在無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生時(shí)，與天然狀態(tài)相比量發(fā)生改變或速率發(fā)生改變的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是天然不產(chǎn)生所述多肽的細(xì)胞。然而，所述細(xì)胞可以是包含非內(nèi)源基因的細(xì)胞，所述非內(nèi)源基因?qū)е滤a(chǎn)生的多肽的量發(fā)生改變優(yōu)選增加。本發(fā)明的重組多肽包括尚未與產(chǎn)生其的轉(zhuǎn)基因(重組)細(xì)胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的其他組分分離的多肽；和在這樣的細(xì)胞或無細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)生并隨后隨后從至少某些其他組分純化分離的多肽。術(shù)語“多肽”與“蛋白”通常可互換使用，并指單一多肽鏈，其可以被或未被非氨基酸基團(tuán)的添加所修飾。應(yīng)當(dāng)理解，這樣的多肽鏈可以與其他多肽或蛋白或者其他分子如輔因子相結(jié)合。本文所用的術(shù)語“蛋白”和“多肽”還包括本文所述的多肽的變體、突變體、生物學(xué)活性片段、修飾物、類似物和/或衍生物。多肽的％ 同一性通過 GAP (Needleman and ffunsch, 1970)分析(GCG program)以缺口建立(gap creation)罰分=5和缺口延伸罰分=0.3來確定。查詢序列的長度為至少25個(gè)氨基酸，GAP分析在至少25個(gè)氨基酸的區(qū)域上比對兩個(gè)序列。更優(yōu)選地，查詢序列的長度為至少50個(gè)氨基酸，GAP分析在至少50個(gè)氨基酸的區(qū)域上比對兩個(gè)序列。更優(yōu)選地，查詢序列的長度為至少100個(gè)氨基酸，GAP分析在至少100個(gè)氨基酸的區(qū)域上比對兩個(gè)序列。更優(yōu)選地，查詢序列的長度為至少250個(gè)氨基酸，GAP分析在至少250個(gè)氨基酸的區(qū)域上比對兩個(gè)序列。更優(yōu)選地，查詢序列的長度為至少400個(gè)氨基酸，GAP分析在至少400 個(gè)氨基酸的區(qū)域上比對兩個(gè)序列。更優(yōu)選地，GAP分析在其全長上比較兩個(gè)序列。本文所用的“生物學(xué)活性片段”是本文所述的多肽的部分，其保留了全長多肽指定的活性。生物學(xué)活性片段可以是任何大小，只要它們保留指定的活性。優(yōu)選地，生物學(xué)活性片段的長度為至少100個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至少400個(gè)氨基酸。優(yōu)選實(shí)施方案涉及以“可溶性生物學(xué)活性形式”產(chǎn)生的多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，這指的是當(dāng)在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，多肽不以不溶并因而失活的形式存在。此外，生物學(xué)活性表示水解S-三嗪和/或二嗪的能力。對于指定的多肽，應(yīng)當(dāng)理解，高于上文所提供的那些％同一性數(shù)字的％同一性數(shù)字涵蓋了優(yōu)選的實(shí)施方案。因此，當(dāng)可用時(shí)，對于最小的％同一性數(shù)字，優(yōu)選所述多肽包含這樣的氨基酸序列，其與相關(guān)指定的SEQ ID NO具有至少50%的同一性，更優(yōu)選具有至少 60%的同一性，更優(yōu)選具有至少70%的同一性，更優(yōu)選具有至少75%的同一性，更優(yōu)選具有至少80 %的同一性，更優(yōu)選具有至少85 %的同一性，更優(yōu)選具有至少90 %的同一性，更優(yōu)選具有至少91%的同一性，更優(yōu)選具有至少92%的同一性，更優(yōu)選具有至少93%的同一性，更優(yōu)選具有至少94%的同一性，更優(yōu)選具有至少95%的同一性，更優(yōu)選具有至少96% 的同一性，更優(yōu)選具有至少97 %的同一性，更優(yōu)選具有至少98 %的同一性，更優(yōu)選具有至少99%的同一性，更優(yōu)選具有至少99. 的同一性，更優(yōu)選具有至少99. 2%的同一性，更優(yōu)選具有至少99. 3%的同一性，更優(yōu)選具有至少99. 4%的同一性，更優(yōu)選具有至少99. 5% 的同一性，更優(yōu)選具有至少99. 6%的同一性，更優(yōu)選具有至少99. 7%的同一性，更優(yōu)選具有至少99. 8%的同一性，更優(yōu)選具有至少99. 9%的同一性。本文所述多肽的氨基酸序列突變體可以通過向本文指定的核酸引入合適的核苷酸改變，或通過期望多肽的體外合成來制備。這樣的突變體包括例如氨基酸序列中殘基的缺失、插入或取代。可以組合進(jìn)行缺失、插入和取代以達(dá)到最終的構(gòu)建物，只要該最終構(gòu)建物具有期望的特征。突變體(改變的)多肽可以利用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)來制備。例如，可以對本文所述的多核苷酸進(jìn)行體外誘變。這樣的體外誘變技術(shù)可以包括將多核苷酸亞克隆入合適的載體，將載體轉(zhuǎn)化入“增變(mutator)”菌株如大腸桿菌XL-I red (Stratagene)并使轉(zhuǎn)化的細(xì)菌增殖合適的代數(shù)。在另一實(shí)例中，對本發(fā)明的多核苷酸進(jìn)行Harayama(1998)所廣泛描述的DNA混編技術(shù)。源自突變/改變的DNA的產(chǎn)物可以容易地利用本文所述的技術(shù)進(jìn)行篩選，以確認(rèn)它們是否能夠賦予期望的表型，如增強(qiáng)的活性和/或改變了的底物特異性。在設(shè)計(jì)氨基酸序列突變體中，突變位點(diǎn)的位置和突變的性質(zhì)取決于要修飾的特征。突變的位點(diǎn)可以單獨(dú)或系列地修飾，例如通過(1)首先用保守氨基酸選擇來取代，然后根據(jù)獲得的結(jié)果用更激進(jìn)的選擇(radical selection)進(jìn)行取代；( 缺失靶殘基；或者 (3)向相鄰位點(diǎn)插入其他殘基。氨基酸序列缺失的范圍一般為約1-15個(gè)殘基，更優(yōu)選約1-10個(gè)殘基，并且通常為約1-5個(gè)連續(xù)殘基。取代突變體在多肽分子中移除至少一個(gè)氨基酸殘基并在該位置插入不同的殘基。 取代誘變最感興趣的位點(diǎn)包括鑒定為對功能重要的位點(diǎn)。其他感興趣的位點(diǎn)是得自各種菌株或物種的特定殘基相同的那些位點(diǎn)。這些位置對生物學(xué)活性可能是重要的。這些位點(diǎn)， 特別是位于至少3個(gè)其他相同的保守位點(diǎn)的序列中的那些位點(diǎn)，優(yōu)選地以相對保守的方式取代。這樣的保守性取代示于表1中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體/變體多肽與本文特別定義的多肽相比具有1或2 或3或4個(gè)保守性氨基酸改變。保守性氨基酸改變詳細(xì)示于表1中。在優(yōu)選實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO :1所提供的氨基酸序列，并且具有一個(gè)或多個(gè)以下氨基酸取代或者對應(yīng)于其氨基酸位置處的取代I2T、F13L、L26M, D28E, A34D、 D38N、S43G、M53L、Y67F、S84R、L90M、T91S、D99G、K101R、D105E、D105G、V106A、I107T、E109A、 I123V、L131P、L131N、L131T、L131D、L131V、L131G、L131C、L131S、L131Q、L131H、L131Y、 L131I、T137I、S140R、T150S、F156L、A159T、A159V、S161G、M163I、F177L、D182E、D182G、 R183H、G190D、G190S、Y195F、E197K、P210A、V213I、M227I、M227I、A229V、D230E、L243P、 L243G、G246A、G246S、G246D、G246E、G246K、G246V、D249N、A294T、A294S、A294L、I310V、 Y313F、L314P、V320E、L335M、D350N、D350Y、D350F、D350R、D350H、R365H、L396M、V399A、 A408V、V424I、V429D、V437I 和 L451M。表1.示例性取代
權(quán)利要求
1.編碼水解S-三嗪和/或二嗪的多肽的分離的和/或外源多核苷酸，其中所述多肽與包含SEQ ID NO :1所提供的氨基酸序列的多肽具有至少40%的同一性，并且i)當(dāng)在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，比在相同條件下培養(yǎng)的包含含SEQID NO :2或SEQ ID NO: 4所提供的核苷酸序列的外源多核苷酸的同基因細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生更多的多肽，和/或ii)所述多肽具有的S-三嗪和/或二嗪水解活性大于包含SEQID NO :1所提供的氨基酸序列的多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其編碼多肽，所述多肽在對應(yīng)于SEQID N0:1的氨基酸編號(hào)159的位置處包含蘇氨酸或纈氨酸。
3.如權(quán)利要求1或2所述的多核苷酸，其包含SEQID NO 2或SEQ ID NO 4所提供的核苷酸序列，具有一或多個(gè)以下核苷酸取代或者對應(yīng)于其核苷酸位置處的取代T5C，C39A， C76A, C84A, T87C, C101A, T108A, T108A, G112A, A127G, C135T, A157T, C165T, G168A, C180T,C189T,Α200Τ,C207T,G210A,G225T,A228G,C229T,T240C,A250C,C268A,G270A,Α271Τ,Τ273Α,C279T,A296G,A302G,A303G,A314G,C315A,T317C,T320C,A326C,A333G,T336C,C346T,G357A,A367G,C372T,C375A,C381T,T384C,C391A,C391G,C391T,T392C,Τ392Α,T392G,G393C,T399C,C410T,C411A,C411T,A414G,A418C,T423C,Τ426Α,Α432Τ,C438T,C449G,C454T,T466C,T468C,T471C,C474T,G475A,C476T,A481G,C483T,G489A,G489T,T498C,Τ531Α,A537G,A540G,A545G,T546G,G548A,T555C,T555C,C564T,G567A,G567A,G568A,G569A,G573C,T579C,Α584Τ,G589A,A600G,T618C,T618C,T627C,C628G,G630A,C633T,G637A,T639C,T639C,A654G,G660A,G660T,T663C,C675A,G681T,C686T,C690A,C696T,G705A,A723G,C727G,T728C,T728G,G729C,G736A,G737C,G737A,G737T,T738G,T738C,T738C,G745A,G753C,G768A,Τ774Α,C807A,Τ840Α,A843G,Α852Τ,A855G,C867T,T879C,G880A,G880T,G880C,C881T,G882T,C885T,G897A,T900C,Τ906Α,A928G,Α938Τ,T941C, C957A, T959A, C972T, T978A, C981T, C993T, C999T, C1003A, C1003T, T1011C, G1048A, G1048T，G1048C，A1049T，A1049G，G1053A，A1059G，A1086G，G1094A，T1101C，T1101G，C1128T， A1152G，G1176T，C1186A，C1186T，T1196C，C1203T，G1221A，C1223T，C1236T，G1248T，G1270A， C1278T, T1286A, T1305C, G1309A, C1321T, A1326G, C1329T, C1329T, C1332T, C1344A, C1351A 和 G1353T。
4.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其編碼包含SEQID NO :1所提供的氨基酸序列的多肽，具有一或多個(gè)以下氨基酸取代或者在對應(yīng)于其氨基酸位置處的取代I2T， F13L, L26M, D28E, A34D, D38N, S43G, M53L, Y67F, S84R, L90M, T91S, D99G, K101R, D105E, D105G, V106A, Ι107Τ, Ε109Α, I123V, L131P, L131N, L131T, L131D, L131V, L131G, L131C, L131S, L131Q, L131H, L131Y, L131I, Τ137Ι, S140R, T150S, F156L, Α159Τ, A159V, S161G, Μ163Ι, F177L, D182E, D182G, R183H, G190D, G190S, Y195F, Ε197Κ, Ρ210Α, V213I, Μ227Ι, Μ227Ι, A229V, D230E, L243P, L243G, G246A, G246S, G246D, G246E, G246K, G246V, D249N, Α294Τ, A294S, A294L, I310V, Y313F, L314P, V320E, L335M, D350N, D350Y, D350F, D350R, D350H, R365H, L396M, V399A, A408V, V424I, V429D, V437I 和 L451M。
5.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其在對應(yīng)于SEQID NO 2或SEQ ID NO 4 的核苷酸編號(hào)468的位置處包含胞嘧啶。
6.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其編碼多肽，所述多肽包含i)對應(yīng)于SEQID NO 1的氨基酸編號(hào)67的位置處的苯丙氨酸；和/或ii)對應(yīng)于SEQID NO 1的氨基酸編號(hào)91的位置處的絲氨酸，和/或iii)對應(yīng)于SEQID NO 1的氨基酸編號(hào)131的位置處的脯氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、酪氨酸或異亮氨酸；和/或iv)對應(yīng)于SEQID NO 1的氨基酸編號(hào)159的位置處的蘇氨酸或纈氨酸；和/或 ν)對應(yīng)于SEQ ID NO 1的氨基酸編號(hào)161的位置處的甘氨酸；和/或vi)對應(yīng)于SEQID NO 1的氨基酸編號(hào)210的位置處的丙氨酸；和/或vii)對應(yīng)于SEQID NO 1的氨基酸編號(hào)243的位置處的脯氨酸或甘氨酸；和/或viii)對應(yīng)于SEQID NO 1的氨基酸編號(hào)Μ6的位置處的天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、 賴氨酸、纈氨酸或丙氨酸；和/或ix)對應(yīng)于SEQID NO 1的氨基酸編號(hào)四4的位置處的蘇氨酸、絲氨酸或亮氨酸；和/或χ)對應(yīng)于SEQ ID NO 1的氨基酸編號(hào)335的位置處的甲硫氨酸；和/或xi)對應(yīng)于SEQID NO :1的氨基酸編號(hào)350的位置處的酪氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、 精氨酸或組氨酸；和/或xii)i)至xi)的任一種的生物學(xué)活性片段。
7.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其編碼包含SEQ ID NO :1所提供的氨基酸序列的多肽，具有以下氨基酸取代或取代組之一或者對應(yīng)于其氨基酸位置處的一或多個(gè)取代i)Y313Fii)Y67Fiii)A159Viv)A159V,L243Pv)D350Yvi)G190D,M227Ivii)A159Tviii)A408Vix)L26M,S161Gx)F13L,A34D, G246A,D350Yxi)T137I,S140Rxii)L335Mxiii)P210Axiv)A294Txv)I123Vxvi)Y67F,V437Ixvii)M163I,D249Nxviii)T137Ixix)G246Sxx)L90Mxxi)A159V,L243P, L451Mxxii)T150S,A159V, A229V, D230E, L243Pxxiii)Y67F,L335Mxxiv)Y67F, K101R, A294Txxv)L335Mxxvi)V106A,S161G, F177L, L335Mxxvii)S43G, I107T, A159V, D350Yxxviii)M53L,T137I, S140R, D182G, G190S, D350Yxxix)A159V,L335M,D350Yxxx)D28E,A294T, D350Nxxxi)P210A,V424Ixxxii)A159V,G190Dxxxiii)P210A,A294T, R365H, D350Yxxxiv)I123V,S161G, A294Txxxv)Y67F, A159V, D350Yxxxvi)T91S,A159V,A294Txxxvii)Y67F,A 159V, L243Pxxxviii)A159V,P210Axxxix)A159V,I310V, L335M, L396M,L243Pxl) I2T, D105E, A159V, E197K, M227I, L243P, L335Mxli)A159V, L335Mxlii)S84R, D105G, A159Vxliii)Y67F, A294Txliv)A159V, D182E, L335M, D350Yxlv) Y67F, A159V, L243Pxlvi)D38N, A159Vxlvii)A159V, M163I, Y195F, D350Yxlviii)F156L, P210A, D350Yxlix)Y67F, D350Y1)A159V, D350Yli)Y67F, D99G, A159V, V213I, L243P, L335Mlii)E109A, A159V, L314P, V320E, V399A, V429Dliii)A159V, L335Mliv) Y67F, A159V, L335M, D350Ylv)D38N, L131P, A159Vlvi)T91S, L131P, A159V, A294T, R365H, L396M, D350Y lvii)R183H, P210A,D350Y lviii)Y67F, A159V,D350Y lix)A159V, P210A, A294T, D350Nlx) Y67F, A159V, D350N lxi)A159V, L335M, D350Y lxii)P210A, A294T, D350Y lxiii)T91S, A159V, A294T lxiv) P210A, A294T, L335M,或 lxv)Y67F, L335M。
8.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO :2或SEQ ID N0:4所提供的核苷酸序列，具有以下核苷酸取代或取代組之一或者對應(yīng)于其核苷酸位置處的一或多個(gè)取代i)T468C,ii)T468C,A938T,iii)A200T,G210A,T468C,iv)T468C,C476T, G753C, ν)T468C, C476T, T728C,vi)T468C,1048T,vii)T384C,T468C, G569A, G681T,viii)T468C,G475A,ix)C279T, T468C, C1223T, C1329T,x)C76A, T468C, A481G,xi)C39A,C101A, T468C,T639C,G737C, G1048T,xii)C410T,A418C, T468C, A600G,xiii)T468C,G705A,C 1003A,xiv)T468C,G573C,xv)T468C, C474T, C628G, C1278T,xvi)T399C,T468C, G880A, T900C,xvii)T468C,C1236T,xviii)T87C,A367G,T468C,xix)T468C,G1176T,xx)C135T,T468C, C1344A,xxi)T468C,A852T,xxii)T468C,T738C,xxiii)C454T,T468C,xxiv)A200T,T468C, G1309A,xxv)T468C, G489T, G745A,xxvi)C410T,T468C,xxvii)T468C,G736A,xxviii)G225T,C268A, A414G, T468C, T627C, C1321T,xxix)A432T,T468C, T471C, C476T, T728C, G1053A, C1351A,xxx)A303G,C449G, T468C, C476T, C686T, C690A, T728C, C1128T,xxxi)A200T,G210A, C372T, T468C, A654G, C1003A,xxxii)C180T,A200T, A302G, C375A, T399C, C411T, T468C, A540G, G880A, T900C,xxxiii)C229T,T468C,G705A, C1003A,xxxiv)T317C,T468C, A481G, T531A, G753C, T906A, T978A, C1003A, A1326G,xxxv)A127G,T320C, T468C, C476T, G753C, G1048T,xxxvi)A157T,C410T, A418C, T468C, A545G, G568A, A600G, C628G, G630A, G1048T, C1332T,xxxvii)T468C,C476T, A723G, C1003A, G1048T, C1329T,xxxviii)C84A,T399C, T468C, C483T, G880A, T900C, G1048A,xxxix)T468C, T498C, C628G, C885T, A1086G, G1270A, xl)T384C, T468C, C476T,G569A,G753C,A1152G, xli)T336C, T468C, C476T, A537G, C564T, xlii)A228G, T240C, T468C, C628G, G880A, G1048T, G1094A, xliii)T273A, A367G, C381T, T399C, T468C, A481G, G880A, T900C, xliv)A200T, C207T, G210A, T468C, C476T, G1048T, A1059G, xlv)A271T, A333G, T399C, T468C, C476T, A843G, G880A, T900C, C1236T, xlvi)A200T, G210A, C346T, T468C, C476T, T579C, T728C, C1278T, xlvii)C438T, T468C, C476T,A855G,xlviii)G168A, T426A, T468C, C476T, C628G, C1203T, T1305C,xlix)T468C, C476T, T663C, C1236T,1)T384C, T468C, C476T, T728C, A928G, C1003A, C1186A,li)T5C, C315A, T468C, C476T, G589A, G681T, T728C, G897A, C1003A,lii)C279T, T468C, C476T,C1003A,liii)A250C, A314G, T468C, C476T,liv)A200T, G210A,T468C,T555C,G880A,T900C,lv) T468C, C476T, T546G, C696T, C1003A, G1048T,lvi)A200T, G210A, T468C, C476T, T728C, T1101G,lvii)G112A, C165T, T468C, C476T, T618C, G753C, C999T, T1101C,lviii)T423C, T468C, C476T, G489A, A584T, G753C, G1048T,lix)T466C, T468C, C474T, C628G, G1048T,lx)T 108A, A200T, G210A, G357A, T468C, G1048T, A1059G, C1278T lxi)T468C, C476T, G567A, G753C, G1048T, lxii)A200T, G210A, A296G, T468C, C476T, G637A, T728C, C1003A, lxiii)C189T, A326C, T468C, C476T, T941C, T959A, A1059G, C1186T, T1196C, G1248T, T1286A,lxiv) T468C, C476T, C1003A,lxv)A200T, G210A, C279T, T468C, C476T, T879C, C1003A, G1048T, lxvi)G112A, C165T, T392C, T468C, C476T, T618C, G660A, C675A, G753C, C807A, C993T, C999T, T1101C, T1305C,lxvii)A271T, T392C, T468C, C476T, G753C, G880A, G1048T, G1094A, C1186A, G1221A,lxviii)A228G, T240C, T468C, G548A, C628G, G1048T, C1332T,lxix)T108A, A200T, G210A, T423C, T468C, C476T, G567A, G1048T,lxx)T384C, T468C, C476T, C628G, C867T, G880A, T900C, C981T, G1048A, A1326G,lxxi)A200T, C207T, G210A, T468C, C476T, T840A, T900C, G1048A,lxxii)T468C, C476T, C633T, G660T, A723G, C1003A, G1048T, C1329T,lxxiii)A228G, T240C, G270A, T468C, C628G，880A，G1048T,lxxiv)A271T, A333G, T399C, T468C, C476T, A843G, G880A, T900C, C1003T, C1236T,lxxv)A228G, T240C, T468C, C628G, G880A, C957A, C1003A, orlxxvi)A200T，G210A,C411A,T468C,T555C,T639C，A654G，G768A,T774A,C972T, C1003A, T1011C, G1353T.
9.如權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其中所述s-三嗪是莠去津、莠滅凈、撲滅津、撲草凈、西瑪津、西草凈、抑草津、草達(dá)津或氰草津。
10.如權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其中所述細(xì)菌細(xì)胞是大腸桿菌。
11.如權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其包含與SEQID NO :2和/或SEQ ID NO 4具有至少90%同一性的序列。
12.如權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其可操作地連接于能指引所述多核苷酸在細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子。
13.如權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼還包含至少一種其他多肽序列的融合蛋白。
14.一種包含權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)所述多核苷酸的載體。
15.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)所述的多核苷酸和/或權(quán)利要求14所述的載體。
16.如權(quán)利要求15所述的宿主細(xì)胞，其還包含編碼分子伴侶的外源多核苷酸。
17.如權(quán)利要求15或16所述的宿主細(xì)胞，其是細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞或植物細(xì)胞。
18.一種轉(zhuǎn)基因植物，其包含至少一種權(quán)利要求15-17任一項(xiàng)所述的細(xì)胞。
19.一種轉(zhuǎn)基因非人類動(dòng)物，其包含至少一種權(quán)利要求15或權(quán)利要求16所述的細(xì)胞。
20.水解S-三嗪和/或二嗪的基本上純化的和/或重組的多肽，其中所述多肽與包含 SEQ ID NO :1所提供的氨基酸序列的多肽具有至少40%的同一性，并且其中i)當(dāng)在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，比在相同條件下培養(yǎng)的包含編碼所述SEQID N0:1所提供的氨基酸序列的外源多核苷酸的同基因細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生更多的多肽，和/或ii)所述多肽具有的S-三嗪和/或二嗪水解活性大于包含SEQID NO :1所提供的氨基酸序列的多肽。
21.如權(quán)利要求20所述的多肽，其在對應(yīng)于SEQID NO 1的氨基酸編號(hào)159的位置處包含蘇氨酸或纈氨酸。
22.權(quán)利要求20或21所述多肽，包含SEQID NO :1提供的氨基酸序列，具有一或多個(gè)以下氨基酸取代或者對應(yīng)于其氨基酸位置處的取代I2T，F(xiàn)13L，L26M，D28E，A34D，D38N， S43G,M53L,Y67F,S84R,L90M,T91S,D99G,K101R,D105E,D105G,V106A,I107Τ,Ε109Α,I123V, L131P, L131N, L131T, L131D, L131V, L131G, L131C, L131S, L131Q, L131H, L131Y, L131I,T137I, S140R, T150S, F156L, A159T, A159V, S161G, M163I, F177L, D182E, D182G, R183H, G190D, G190S, Y195F, E197K, P210A, V213I, M227I, M227I, A229V, D230E, L243P, L243G, G246A, G246S, G246D, G246E, G246K, G246V, D249N, A294T, A294S, A294L, I310V, Y313F, L314P, V320E, L335M, D350N, D350Y, D350F, D350R, D350H, R365H, L396M, V399A, A408V, V424I, V429D, V437I 和 L451M。
23.如權(quán)利要求20-22任一項(xiàng)所述的多肽，其包含i)對應(yīng)于SEQID NO 1的氨基酸編號(hào)67的位置處的苯丙氨酸；和/或ii)對應(yīng)于SEQID NO 1的氨基酸編號(hào)91的位置處的絲氨酸，和/或iii)對應(yīng)于SEQID NO 1的氨基酸編號(hào)131的位置處的脯氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、酪氨酸或異亮氨酸；和/或iv)對應(yīng)于SEQID NO 1的氨基酸編號(hào)159的位置處的蘇氨酸或纈氨酸；和/或 ν)對應(yīng)于SEQ ID NO 1的氨基酸編號(hào)161的位置處的甘氨酸；和/或vi)對應(yīng)于SEQID NO 1的氨基酸編號(hào)210的位置處的丙氨酸；和/或vii)對應(yīng)于SEQID NO 1的氨基酸編號(hào)243的位置處的脯氨酸或甘氨酸；和/或viii)對應(yīng)于SEQID NO 1的氨基酸編號(hào)Μ6的位置處的天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、 賴氨酸、纈氨酸或丙氨酸；和/或ix)對應(yīng)于SEQID NO 1的氨基酸編號(hào)四4的位置處的蘇氨酸、絲氨酸或亮氨酸；和/或χ)對應(yīng)于SEQ ID NO 1的氨基酸編號(hào)335的位置處的甲硫氨酸；和/或xi)對應(yīng)于SEQID NO :1的氨基酸編號(hào)350的位置處的酪氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、 精氨酸或組氨酸；和/或xii)i)至xi)的任一種的生物學(xué)活性片段。
24.如權(quán)利要求20-22任一項(xiàng)所述的多肽，其包含SEQID NO :1所提供的氨基酸序列， 具有以下氨基酸取代或取代組之一或者對應(yīng)于其氨基酸位置處的一或多個(gè)取代i)Y313Fii)Y67Fiii)A159Viv)A159V,L243Pv)D350Yvi)G190D,M227Ivii)A159Tviii)A408Vix)L26M,S161Gx)F13L,A34D, G246A,D350Yxi)T137I,S140Rxii)L335Mxiii)P210Axiv)A294Txv)I123Vxvi)Y67F,V437Ixvii)M163I,D249Nxviii)T137Ixix)G246Sxx)L90Mxxi)A159V,L243P,L451Mxxii)T150S,A159V, A229V, D230E, L243Pxxiii)Y67F,L335Mxxiv)Y67F, K101R, A294Txxv)L335Mxxvi)V106A,S161G, F177L, L335Mxxvii)S43G, I107T, A159V, D350Yxxviii)M53L,T137I, S140R, D182G, G190S, D350Yxxix)A159V,L335M,D350Yxxx)D28E,A294T, D350Nxxxi)P210A,V424Ixxxii)A159V,G190Dxxxiii)P210A,A294T, R365H, D350Yxxxiv)I123V,S161G, A294Txxxv)Y67F, A159V, D350Yxxxvi)T91S,A159V,A294Txxxvii)Y67F,A159V, L243Pxxxviii)A159V,P210Axxxix)A159V,I310V, L335M, L396M,L243Pxl) I2T, D105E, A159V, E197K, M227I, L243P, L335Mxli)A159V, L335Mxlii)S84R, D105G, A159Vxliii)Y67F, A294Txliv)A159V, D182E, L335M, D350Yxlv) Y67F, A159V, L243Pxlvi)D38N, A159Vxlvii)A159V, M163I, Y195F, D350Yxlviii)F156L, P210A, D350Yxlix)Y67F, D350Y1)A159V, D350Yli)Y67F, D99G, A159V, V213I, L243P, L335M lii)E109A, A159V, L314P, V320E, V399A, V429D liii)A159V, L335M liv) Y67F, A159V, L335M, D350Ylv)D38N, L131P, A159Vlvi)T91S, L131P, A159V, A294T, R365H, L396M, D350Ylvii)R183H, P210A,D350Ylviii)Y67F, A159V,D350Ylix)A159V, P210A, A294T, D350Nlx)Y67F, A159V, D350Nlxi)A159V, L335M, D350Ylxii)P210A, A294T, D350Ylxiii)T91S, A159V, A294Tlxiv) P210A, A294T, L335M,或lxv)Y67F, L335M。
25.如權(quán)利要求20- 任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述s-三嗪是莠去津、莠滅凈、撲滅津、 撲草凈、西瑪津、西草凈、抑草津、草達(dá)津或氰草津。
26.如權(quán)利要求20-25任一項(xiàng)所述的多肽，其具有比包含SEQID NO :1所提供的氨基酸序列的多肽高至少2倍的莠去津水解活性。
27.如權(quán)利要求2046任一項(xiàng)所述的多肽，其是還包含至少一種其他多肽序列的融合蛋白。
28.如權(quán)利要求20-27任一項(xiàng)所述的多肽，其固定于固體支持物上。
29.權(quán)利要求15-17任一項(xiàng)所述宿主細(xì)胞、權(quán)利要求18所述植物和/或權(quán)利要求19所述動(dòng)物的提取物，其中所述提取物包含權(quán)利要求20- 任一項(xiàng)所述的多肽。
30.一種組合物，其包含權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)所述的多核苷酸、權(quán)利要求14所述的載體、權(quán)利要求15-17任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求20- 任一項(xiàng)所述的多肽和/或權(quán)利要求四所述的提取物，以及一種或多種可接受的載體。
31.一種水解S-三嗪或二嗪的方法，所述方法包括使S-三嗪或二嗪與權(quán)利要求1-13 任一項(xiàng)所述的多核苷酸、權(quán)利要求14所述的載體、權(quán)利要求15-17任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞、 權(quán)利要求20- 任一項(xiàng)所述的多肽、權(quán)利要求四所述的提取物和/或權(quán)利要求30所述的組合物接觸。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述S-三嗪或二嗪在樣品中，所述樣品選自由以下組成的組土壤、水、生物材料或其組合。
33.處理對象中由S-三嗪或二嗪所引起的毒性的方法，所述方法包括向所述對象施用權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)所述的多核苷酸、權(quán)利要求14所述的載體、權(quán)利要求15-17任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求20- 任一項(xiàng)所述的多肽、權(quán)利要求四所述的提取物和/或權(quán)利要求30所述的組合物。
34.權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)所述的多核苷酸、權(quán)利要求14所述的載體、權(quán)利要求15-17 任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求20- 任一項(xiàng)所述的多肽、權(quán)利要求四所述的提取物和 /或權(quán)利要求30所述的組合物在制備用于處理對象中由S-三嗪或二嗪所引起的毒性的藥物中的用途。
35.一種產(chǎn)生能夠水解S-三嗪和/或二嗪的多肽的方法，所述方法包括在允許表達(dá)編碼所述多肽的多核苷酸的條件下培養(yǎng)編碼所述多肽的權(quán)利要求15-17任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞、或編碼所述多肽的權(quán)利要求14所述的載體，并回收所表達(dá)的多肽。
36.一種檢測宿主細(xì)胞的方法，所述方法包括i)使細(xì)胞或細(xì)胞群在允許所述細(xì)胞攝取權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)所述的多核苷酸的條件下與所述多核苷酸接觸，和 )通過將步驟i)的細(xì)胞或其后代細(xì)胞暴露于S-三嗪或二嗪來選擇宿主細(xì)胞。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述多核苷酸編碼權(quán)利要求20- 任一項(xiàng)所述的多肽。
38.如權(quán)利要求36或37所述的方法，其中所述多核苷酸包含第一可讀框，其包含權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)所述的多核苷酸；以及第二可讀框，其不包含權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)所述的多核苷酸。
39.一種用于水解S-三嗪或二嗪的試劑盒，所述試劑盒包含權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)所述的多核苷酸，權(quán)利要求14所述的載體、權(quán)利要求15-17任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求 20-28任一項(xiàng)所述的多肽、權(quán)利要求四所述的提取物和/或權(quán)利要求30所述的組合物。
40.權(quán)利要求20-27任一項(xiàng)所述多肽的晶體。
41.一種設(shè)計(jì)多肽的方法，所述多肽具有的S-三嗪和/或二嗪水解活性大于包含SEQ ID NO :1所提供的氨基酸序列的多肽，所述方法包括使用權(quán)利要求40所述晶體的原子坐標(biāo)來從計(jì)算上評價(jià)S-三嗪或二嗪與候選多肽結(jié)合的能力，并選擇具有大于包含SEQ ID NO 1 所提供的氨基酸序列的多肽的S-三嗪和/或二嗪水解活性的多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于降解諸如莠去津的s-三嗪以及二嗪的多肽。還提供了編碼這些多肽的多核苷酸。本發(fā)明還提供了這些多核苷酸和多肽在s-三嗪和二嗪生物整治中的用途。
文檔編號(hào)C12N9/14GK102245762SQ200980143896
公開日2011年11月16日 申請日期2009年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月3日
發(fā)明者C·J·杰克遜, C·W·科潘, C·斯科特, J·G·奧克肖特, R·J·拉塞爾 申請人:聯(lián)邦科學(xué)技術(shù)研究組織