專(zhuān)利名稱(chēng)：肽、包含該肽的藥物組合物及其用途的制作方法
肽、包含該肽的藥物組合物及其用途技術(shù)領(lǐng)域和
背景技術(shù)：
本發(fā)明在其一些實(shí)施方式中涉及肽，并且更具體但不排他地，涉及其在抑制胰島素降解酶(IDE)中的用途。糖尿病是一種綜合癥，其特征為由激素胰島素水平不足引起的代謝紊亂和不正常的高血糖(高血糖癥)。最常見(jiàn)的糖尿病形式為I型糖尿病、II型糖尿病和妊娠糖尿病。 糖尿病常常與引起補(bǔ)償性口渴和液體攝入增加的過(guò)多的排尿量、視力模糊、無(wú)法解釋的體重減輕、嗜睡以及能量代謝變化相關(guān)。自從1921年可醫(yī)學(xué)獲得胰島素，所有類(lèi)型的胰島素均是可治療的。I型糖尿病患者依賴(lài)于外源胰島素(最通常為皮下注射)，因?yàn)樗鼈兊囊扰K(由胰島)不再產(chǎn)生該激素。II型糖尿病或妊娠糖尿病患者通常具有胰島素抗性并且需要胰島素來(lái)控制血糖水平 [Vinik 等人，Q004)MedGenMed6 :12]。在正常的主體(即非糖尿病患者)中，升高的胰島素水平使得葡萄糖吸收并貯存在細(xì)胞內(nèi)，從而減少了糖原向葡萄糖的轉(zhuǎn)化，降低了血糖水平，并由此降低了胰島素釋放。 因此，正常情況下血液葡萄糖水平在進(jìn)食后會(huì)在某種程度上升高并且在一個(gè)小時(shí)左右回復(fù)至正常的“空腹”水平。當(dāng)用胰島素(例如合成的人胰島素或胰島素類(lèi)似物)治療患者時(shí)必需確定正確的劑量和正確的給予時(shí)間并且試圖像在非糖尿病患者中那樣達(dá)到對(duì)血糖的生理調(diào)節(jié)。然而，用胰島素治療糖尿病患者常常遠(yuǎn)不能達(dá)到正常的葡萄糖控制并且維持基礎(chǔ)率(basal rate)和給予率(推注率，bolus rate)是胰島素依賴(lài)性糖尿病患者每天必需設(shè)法實(shí)現(xiàn)的一種持續(xù)的平衡作用[Vinik等人，如上文]。此外，由于對(duì)體重增加、低血糖、心血管后果的擔(dān)憂或者由于患者不愿意配合，許多醫(yī)護(hù)人員常常不愿意開(kāi)胰島素處方。而且， 持續(xù)注射胰島素增加了胰島素與抗體結(jié)合的風(fēng)險(xiǎn)，這似乎是I型糖尿病患者中無(wú)法解釋的嚴(yán)重低血糖癥的高危因子。胰島素對(duì)葡萄糖、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)代謝以及細(xì)胞生長(zhǎng)和分化是關(guān)鍵性的。其主要通過(guò)肝臟和腎臟從人體清除，但是大多數(shù)其他組織也降解胰島素。胰島素降解酶(IDE，胰島素溶酶)是引起胰島素降解的主要的酶[Simkin等人，(1949)Arch Biochem 24 =422-428] 0 IDE是位于胞質(zhì)溶膠、過(guò)氧化物酶體、內(nèi)涵體內(nèi)和細(xì)胞表面的約IlOkDa的巰基鋅-金屬內(nèi)肽酶。該酶裂解各種不同序列的小蛋白，其中許多共有形成富含β-片層(pleated sheet)的淀粉樣纖維的傾向，所述小蛋白包括淀粉樣蛋白(Αβ)、胰島素、胰高血糖素、胰淀素、 心房利鈉因子和降鈣素[Simkin等人，如上文]。染色體IOq 的 IDE 區(qū)與 II 型糖尿病[DM2，Ghosh 等人，(2000) Am J Hum Genet 67 1174-1185 !Wiltshire 等人，(2002)Am J Hum Genet70 :543-546]和升高的空腹葡萄糖水平[Meigs等人，(2002)Diabetes51 =833-840]遺傳學(xué)相關(guān)。此外IDE+小鼠具有高胰島素血癥和葡萄糖耐受，這些是DM2的特點(diǎn)[Farris等人，(2003) Proc Natl Acad Sci USA100 4162-4167]。該模型證明了引起胰島素降解的蛋白酶的體內(nèi)缺乏會(huì)響應(yīng)葡萄糖負(fù)荷導(dǎo)致高血糖癥(即葡萄糖耐受不良)。研究報(bào)告已進(jìn)一步表明在阿爾茨海默病中IDE在Αβ降解中的作用[Farris等人，如上文]。IDE+模型動(dòng)物中大腦A β的升高(約10-65% )驗(yàn)證了 IDE在體內(nèi)A β蛋白質(zhì)水解中的作用，但是在完整的大腦中很可能存在另外的Αβ清除機(jī)制，特別是Αβ 42。 其他蛋白酶(例如，ΝΕΡ，內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶)可能參與Αβ清除并且部分補(bǔ)償IDE功能的缺失。IDE還是介導(dǎo)水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)感染和細(xì)胞間擴(kuò)散的細(xì)胞受體[Li等人， (2006) Cell 127:305-316]。通過(guò)SiRNA下調(diào)IDE或者用抗體、可溶性IDE蛋白(從肝臟提取)或者桿菌肽阻斷IDE可抑制VZV感染[Li等人，如上文]。IDE與病毒感染必需的糖蛋白E (gE)通過(guò)該糖蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域相互作用，然而，IED不降解VZV。已解析的IDE晶體結(jié)構(gòu)[Shen等人，(2006) Nature 443 :870-874]顯示IDE的氨基端和羧基端結(jié)構(gòu)域(分別為IDE-N和IDE-C)形成包含鋅結(jié)合活性位點(diǎn)的蛋白水解腔，其正好足夠大以包裹胰島素。IDE-N和IDE-C之間的大面積接觸保持底物不能進(jìn)入IDE降解腔。IDE結(jié)構(gòu)域的復(fù)位(從IED-閉合轉(zhuǎn)變成其活性形式IDE-開(kāi)放)使得底物能夠進(jìn)入催化腔(圖1)。IDE對(duì)多種生理學(xué)底物的活性可由該酶的詳細(xì)的晶體結(jié)構(gòu)得到部分解釋。該結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)顯示IED的形狀類(lèi)似蛤殼，由通過(guò)柔性鉸鏈連接的兩個(gè)碗狀半體組成，這使得該酶能夠以?xún)煞N構(gòu)象存在，即閉合和開(kāi)放。在底物的催化過(guò)程中，當(dāng)IDE結(jié)合、催化然后釋放其底物時(shí)，該酶分別從開(kāi)放結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化成閉合構(gòu)型并且回復(fù)至開(kāi)放結(jié)構(gòu)。兩個(gè)IDE半體之間延長(zhǎng)的氫鍵形成了充當(dāng)將酶保持于閉合狀態(tài)的“門(mén)閂”。促進(jìn)開(kāi)放構(gòu)象的突變已被證明可將該蛋白質(zhì)裂解底物的效率提高30-40倍[Sien等人，如上文]。已指出限速步驟是該酶重新開(kāi)放并且接著夾住新的底物的速度而不是將某些物質(zhì)降解(chew)所需要的時(shí)間。第20030104981號(hào)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)了用于治療糖尿病的新的人胰島素類(lèi)似物， 該類(lèi)似物的特征在于對(duì)胰島素降解酶(IDE)具有增強(qiáng)的穩(wěn)定性以及達(dá)到比天然胰島素更長(zhǎng)的壽命。第20030104981號(hào)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)教導(dǎo)的胰島素類(lèi)似物的結(jié)構(gòu)特征為除去了人胰島素B-鏈中的B^-B30并且在BIO、B14和B17具有至少一個(gè)特定的置換。第7，108，972號(hào)美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)了多核苷酸和多肽以及它們的用途，包括兩個(gè)編碼胰島素樣蛋白質(zhì)的N0V3核酸序列。根據(jù)第7，108，972號(hào)美國(guó)專(zhuān)利，這些胰島素樣蛋白質(zhì)可用于診斷和治療包括糖尿病在內(nèi)的各種疾病和病癥。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的一方面，提供了包含長(zhǎng)度不大于25個(gè)氨基酸的氨基酸序列的分離的肽在制備經(jīng)鑒定用于治療選自糖尿病、肥胖癥、高血糖癥、視網(wǎng)膜損傷、 腎衰竭、神經(jīng)損傷、微血管損傷以及水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)感染的疾病的藥物中的用途，所述氨基酸序列包含至少一個(gè)天冬氨酸(aspartate)或其同系物，所述肽具有胰島素降解酶(IDE)抑制活性。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的一方面，提供了包含長(zhǎng)度不大于25個(gè)氨基酸的氨基酸序列的分離的肽在治療選自糖尿病、肥胖癥、高血糖癥、視網(wǎng)膜損傷、腎衰竭、神經(jīng)損傷、微血管損傷以及水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)感染的疾病中的用途，所述氨基酸序列包含至少一個(gè)天冬氨酸或其同系物，所述肽具有胰島素降解酶(IDE)抑制活性。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的一方面，提供了在需要其的主體中治療選自糖尿病、肥胖癥、高血糖癥、視網(wǎng)膜損傷、腎衰竭、神經(jīng)損傷、微血管損傷以及水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)感染的疾病的方法，所述方法包括向主體給予包含長(zhǎng)度不大于25個(gè)氨基酸的氨基酸序列的分離的肽，所述氨基酸序列包含至少一個(gè)天冬氨酸或其同系物，所述肽具有胰島素降解酶(IDE)抑制活性。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的一方面，提供了包含長(zhǎng)度不大于25個(gè)氨基酸的氨基酸序列的分離的肽，所述氨基酸序列包含至少一個(gè)天冬氨酸或其同系物，所述肽具有胰島素降解酶(IDE)抑制活性。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的一方面，提供了包含作為活性成分的權(quán)利要求4-18 中任一項(xiàng)的分離的肽和藥學(xué)可接受載體的藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的一方面，提供了制品，其包含權(quán)利要求4-18中任一項(xiàng)的分離的肽和胰島素，它們各自包裝于包裝材料中并且在包裝材料內(nèi)或包裝材料上通過(guò)印刷指明用于糖尿病治療。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的一方面，提供了鑒定具有胰島素降解酶(IDE)抑制活性的肽的方法，所述方法包括于存在或不存在權(quán)利要求4-18中任一項(xiàng)的肽的條件下使 IDE與IDE的報(bào)告子底物接觸，其中在所述肽存在下報(bào)告子活性的降低可指示具有IDE抑制活性的肽。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式。所述氨基酸序列選自SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15、 SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ IDNO :19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :62、SEQ ID NO :63、SEQ ID NO 64,SEQ IDNO 65,SEQ ID NO 66、SEQ ID NO 67、SEQ ID NO 68、SEQ ID NO 69、SEQ ID NO 70,SEQ ID NO :71、SEQ ID NO :72、SEQ ID NO :73、SEQ IDNO :74、SEQ ID NO :75、SEQ ID NO :76、SEQ ID NO :77、SEQ ID NO :78、SEQ ID NO :79、SEQ ID NO :80、SEQ ID NO :81、SEQ ID NO :82、SEQ IDNO :83、SEQ ID NO :84、SEQ ID NO 85 以及 SEQ ID NO 86 構(gòu)成的組。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述氨基酸序列如SEQ ID NO 19中所列。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述氨基酸序列包含在至少一個(gè)天冬氨酸或其同系物和所述氨基酸序列的N-端序列之間添加柔性(flexibility)的基團(tuán)。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述添加柔性的基團(tuán)包括氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述氨基酸序列包括SEQ ID N0:13。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述N-端序列包含IDE結(jié)合序列。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述氨基酸序列包含IDE結(jié)合序列。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述IDE結(jié)合序列選自SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、 SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 24 和 SEQ ID NO 25 構(gòu)成的組。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述至少一個(gè)天冬氨酸或其同系物包括兩個(gè)天冬氨酸或其同系物。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述兩個(gè)天冬氨酸或其同系物在所述肽中連續(xù)定位。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述天冬氨酸同系物是結(jié)構(gòu)同系物。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述結(jié)構(gòu)同系物包括天冬酰胺。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述天冬氨酸同系物是帶負(fù)電荷的氨基酸。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述帶負(fù)電荷的氨基酸是谷氨酸。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述給予(給藥)是鼻內(nèi)給予。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述治療有效量使得給予后主體的血胰島素水平升
尚ο根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述治療有效量使得給予后主體的血胰島素生長(zhǎng)因子(IGFl)水平升高。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述治療有效量使得給予后主體的T淋巴細(xì)胞的 IL-17分泌減少。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述治療有效量使得給予后主體的T淋巴細(xì)胞的 IFN-Y分泌減少。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述治療有效量為0. 1-10μ g/kg體重。除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)和/或科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。盡管與本文所述那些相似或相等的方法和材料可用于實(shí)施或檢測(cè)本發(fā)明的實(shí)施方式，但是仍在下文描述了示例性方法和/或材料。如有沖突，以包括定義在內(nèi)的本專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)施例僅為示例性的并且不旨在具有必然的限制性。


僅通過(guò)例舉方式，參照附圖在本文中描述了本發(fā)明的一些實(shí)施方式?，F(xiàn)詳細(xì)參照具體的附圖，應(yīng)強(qiáng)調(diào)所顯示的細(xì)節(jié)僅為示例性的并且用于例示性討論本發(fā)明的實(shí)施方式。 就此而言，說(shuō)明書(shū)連同附圖可使本領(lǐng)域技術(shù)人員明了如何實(shí)施本發(fā)明的實(shí)施方式。在附圖中圖1描繪了抑制胰島素降解酶(IDE)活性的模型。該圖示出了描繪IDE結(jié)合至本發(fā)明抑制劑(例如ADT-21)的模型。IDE的開(kāi)放狀態(tài)(IDE-開(kāi)放-IDE-°)使得底物能夠進(jìn)入催化腔，然而，當(dāng)抑制劑與酶結(jié)合時(shí)其抑制IDE向其開(kāi)放狀態(tài)的構(gòu)象變化并且保持其處于閉合狀態(tài)。圖2描繪了 VZV IDE結(jié)合蛋白與其他已知的IDE底物在催化裂隙(催化部位， catalytic cleft)結(jié)合區(qū)段的多序列比對(duì)(MSA)。該MSA顯示了底物之間的相似特征并且指明VZV gE(24-50, SEQ ID NO 5)氨基酸為可能有助于IDE結(jié)合的候選物。應(yīng)注意的是， MSA還指明了 VZV gE主要切割(裂解，cleavage)位點(diǎn)的重要特征(DD重復(fù)，SEQ ID NO: 26)。圖3描繪了靶向IDE催化裂隙的具有潛在抑制性質(zhì)的短肽的設(shè)計(jì)。圖4描繪了不同IDE底物的N端結(jié)合區(qū)段。應(yīng)注意的是，MSA顯示Asn 3在胰島素B鏈、胰淀素(Amylin)和VZV gE中高度保守。圖5描繪了具有共同作用(輔助作用，co-effect)的IDE抑制劑的設(shè)計(jì)靴向IDE N-端結(jié)合區(qū)段和催化裂隙。應(yīng)注意的是，這些IDE抑制劑還包含接頭(連接子，linker)序列。圖6是描繪ADT-21 (SEQ ID NO 9)對(duì)IDE活性的劑量依賴(lài)性抑制的條形圖。為了測(cè)量IDE活性，用靶酶(IDE)包被ELISA板，然后將板與選擇的合成肽候選物溫育并且對(duì)照無(wú)候選肽的孔測(cè)量酶活性。使用InnoZyme 胰島素溶酶Gnsulysin)/IDE試劑盒測(cè)量IDE 活性(IC50 = IOOnM)，***p < 0. 0001 ；**p < 0. 001。應(yīng)注意的是，ADT-21 以劑量依賴(lài)方式抑制IDE活性。圖7描繪了 ADT21對(duì)IDE降解胰島素的抑制。在有或無(wú)IDE(1. 14nM)的條件下將分離自牛胰臟的胰島素(0. 87nM) (SIGMA)和ADT21 (SEQ IDNO :19,0. 2nM)溫育。結(jié)果表示三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)*P <0.05。圖8描繪了 NOD小鼠中的疾病進(jìn)展。NOD小鼠模型被用作胰島素依賴(lài)型糖尿病 (IDDM)的模型。將12周齡的小鼠分成2個(gè)治療組(η = 10-12)。一組每隔一天接受鼻內(nèi) 10 μ 1 ADT21 (3. 76 μ g/kg)。第二組接受PBS (對(duì)照組)。使用葡萄糖試紙監(jiān)測(cè)小鼠血糖水平*ρ < 0. 05。圖9描繪了 ADT21治療后NOD小鼠中糖尿病患者百分?jǐn)?shù)降低。用鼻內(nèi)10 μ 1 ADT21(治療)或PBS (對(duì)照)治療12周齡NOD小鼠[n = 10-12]并且使用葡萄糖試紙每周監(jiān)測(cè)血糖水平。中度糖尿和高于250mg/dl*p < 0. 05的非空腹血糖表明糖尿病發(fā)病。圖10描繪了 NOD小鼠的體重分布。用10 μ 1 ADT21 (治療)或PBS (對(duì)照)治療 12周齡NOD小鼠并且每周監(jiān)測(cè)體重變化。圖11描繪了與對(duì)照小鼠相比ADT21治療小鼠中更高的血胰島素水平。在第30周與未治療的NOD小鼠(對(duì)照)和非糖尿病小鼠[n = 6]相比監(jiān)測(cè)(使用HTRF hsulin assay)用10 μ 1 ADT21治療的NOD小鼠的血胰島素水平*ρ < 0. 05，< 0. 01。圖12A-C描繪了胰島炎(insulitis)的組織學(xué)分析。在第30周齡時(shí)，將用或未用 10 μ 1 ADT21治療的NOD小鼠處死；分離它們的胰腺并且用Η&Ε染色法染色。圖12Α-Β顯示取自對(duì)照和ADT-21治療的NOD小鼠的胰腺切片。這些圖示出了胰島(放大率Χ40)；圖 12C是圖解獲自ADT-21治療的和未治療的小鼠(對(duì)照)[η = 6]的胰腺的胰島炎評(píng)分(組織學(xué)評(píng)分)的條形圖*P = 0. 001。圖13描繪了與對(duì)照小鼠相比ADT-21治療小鼠中更高的血IGFl水平。在第30周使用AssayMax小鼠IGFl試劑盒監(jiān)測(cè)NOD小鼠的血胰島素生長(zhǎng)因子1 (IGFl)水平。[n = 6]*ρ < 0. 05。圖14Α-Β描繪了獲自ADT-21治療小鼠的細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子IFN- γ和IL-17的分泌減少。在30周齡時(shí)將未治療的或用10 μ 1 ADT21治療的NOD小鼠(n = 6-7)處死并且分離它們的脾細(xì)胞。在96-孔板中以1x106個(gè)細(xì)胞/孔的濃度培養(yǎng)脾細(xì)胞并且與10 μ g/ml 胰島素溫育。培養(yǎng)4 后收集上清用于細(xì)胞因子測(cè)量。通過(guò)ELISA測(cè)量IFN-γ (FIG. 14A) 或 IL-17(FIG. 14B)的分泌，*p < 0. 05。圖15A-B描繪了與抗原遞呈細(xì)胞和ADT21共培養(yǎng)后⑶4+細(xì)胞的促炎性細(xì)胞因子 IFN- γ和IL-17的分泌減少。用胰島素免疫NOD小鼠后，從淋巴樣組織分離⑶4+T-細(xì)胞。 然后將分離的CD4+T-細(xì)胞與分離自未免疫NOD小鼠的脾細(xì)胞在胰島素存在下、在有或無(wú) ADT21的條件下共培養(yǎng)。通過(guò)ELISA測(cè)量IFN-y (FIG. 15A)或IL-17 (FIG. 15B)的分泌[η =4]，*ρ < 0· 05。圖16Α-Β描繪了 IDE-/-小鼠中促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生減少。用胰島素免疫WT和IDE-/-小鼠。分離這些小鼠的脾并且測(cè)量免疫應(yīng)答的水平。通過(guò)ELISA測(cè)量 IFN- y (FIG. 16A)或 IL-17 (FIG. 16B)的分泌[n = 4]，*p < 0. 05。
具體實(shí)施例方式
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本發(fā)明在其一些實(shí)施方式中涉及肽，并且更具體但不排他地，涉及其在抑制胰島素降解酶(IDE)中的用途。參照附圖和以下描述，可以更好地理解本發(fā)明的原理和操作。在詳細(xì)闡述本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方式之前，應(yīng)理解本發(fā)明的應(yīng)用不一定受限于下文說(shuō)明中所列或?qū)嵤├兴e例說(shuō)明的細(xì)節(jié)。本發(fā)明還有其他實(shí)施方式或能夠以各種方式實(shí)踐或?qū)嵤?。而且，?yīng)理解本文使用的表達(dá)方式和術(shù)語(yǔ)是用于描述目的并且不應(yīng)認(rèn)為其具有限制性。在實(shí)施本發(fā)明時(shí)，本發(fā)明人已鑒定了特異結(jié)合胰島素降解酶(IDE)(例如GenBank 登錄號(hào)NM_004969和NP_004960中所列)并且抑制它們的酶活性的新肽。這些肽可能結(jié)合至IDE的催化裂隙但是抑制其催化活性，并且因此可用作強(qiáng)效的IDE抑制劑并加工 (processing)其天然底物[例如，胰島素B鏈和水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)]。如下文和之后的實(shí)施例部分所示，本發(fā)明人通過(guò)多序列比對(duì)(MSA)出乎意料地鑒定出VZV糖蛋白E (gE)氨基酸序列(例如GenBank登錄號(hào)NP_040189中所列)，其為VZV特有的，特異結(jié)合IDE催化裂隙并且阻止酶裂解。該氨基酸序列包含兩個(gè)重復(fù)的氨基酸天冬氨酸(D)(Aspl3、Aspl4，見(jiàn)圖2)。此外，本發(fā)明人已鑒定出各種IDE底物的N-端結(jié)合區(qū)段 (圖4)。綜合而言，鑒定這些序列使能夠生成特異結(jié)合IDE并且可能抑制其活化的新肽(SEQ ID NO 14-18和19-23，分別為圖3和5)。為了提高所述肽的構(gòu)象柔性(conformational flexibility)并且使能夠增加與IDE的結(jié)合，本發(fā)明人還向本發(fā)明的新肽加入了添加柔性的部分(moiety) (SEQ ID N0:13)(圖3)。此外，本發(fā)明人已證明這些新肽中的一種 ADT-21 (SEQ ID NO 19)包含特異的IDE抑制性質(zhì)(圖6)和減少的胰島素降解(圖7)。還證明當(dāng)鼻內(nèi)給予時(shí)ADT-21可緩解非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的I型糖尿病(圖8_10)并且增加血胰島素水平(圖11)，因此使血糖的生理調(diào)節(jié)成為可能。此外，已證明ADT-21可增加 NOD小鼠血清中的IGF-I水平(圖13)并且降低這些小鼠中促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生(IFN-γ 和IL-17分泌，分別為圖14Α-Β)。此外，已證明ADT21降低對(duì)胰島素的⑶4+Τ細(xì)胞炎癥反應(yīng) (圖 15Α-Β)。因此，根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了包含長(zhǎng)度不大于25個(gè)氨基酸的氨基酸序列的分離的肽，所述氨基酸序列包含至少一個(gè)天冬氨酸或其同系物，所述肽具有胰島素降解酶 (IDE)抑制活性。本文使用的術(shù)語(yǔ)“肽”包括天然肽(降解產(chǎn)物、合成肽或重組肽)和擬肽(通常為合成肽)以及為肽類(lèi)似物的類(lèi)肽(P印toid)和半類(lèi)肽(semip印toid)，其具有例如至少一個(gè)使得所述肽在體內(nèi)更穩(wěn)定或者滲透細(xì)胞的能力更強(qiáng)的修飾(例如合成的，即非天然的)。 此類(lèi)修飾進(jìn)一步描述于下文。所述肽至少為如下文進(jìn)一步描述的二肽。本文使用的術(shù)語(yǔ)“分離的”指可從其天然存在的環(huán)境中分離的肽的均質(zhì)制劑。根據(jù)本發(fā)明一實(shí)施方式，所述肽的長(zhǎng)度不大于2個(gè)氨基酸，長(zhǎng)度不大于4個(gè)氨基酸，長(zhǎng)度不大于6個(gè)氨基酸，長(zhǎng)度不大于8個(gè)氨基酸，長(zhǎng)度不大于10個(gè)氨基酸，長(zhǎng)度不大于 15個(gè)氨基酸，長(zhǎng)度不大于20個(gè)氨基酸，或者長(zhǎng)度不大于25個(gè)氨基酸，應(yīng)理解本發(fā)明的肽包含胰島素降解酶(IDE)抑制活性。本文使用的術(shù)語(yǔ)“胰島素降解酶(IDE) ”指胰島素溶酶或胰島素蛋白酶，其為參與包括胰島素和胰高血糖素在內(nèi)的多個(gè)短多肽的細(xì)胞加工的M16A金屬蛋白酶亞家族的大鋅結(jié)合蛋白酶(例如,如GenBank登錄號(hào)NM_004969和NP_004960中所列)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“IDE抑制活性”指特異下調(diào)IDE的酶活性。例如，測(cè)定ADT-21對(duì) IDE的IC50的范圍為10-200nM。根據(jù)示例性實(shí)施方式，本發(fā)明的肽能夠?qū)DE的酶活性下調(diào)至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、 至少70%、至少80%、至少90%或至少100%。應(yīng)理解本發(fā)明的肽的IDE抑制活性導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞的IFN- γ和IL-17分泌減少 (如實(shí)施例7所描繪)。此外，本發(fā)明的肽的IDE抑制活性導(dǎo)致糖尿病進(jìn)展延遲(如實(shí)施例 4所描繪)并且阻礙對(duì)胰島素的自身免疫應(yīng)答(實(shí)施例8)。應(yīng)理解IDE是包含用于底物結(jié)合的胞外結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞酶。此外。IDE還可從細(xì)胞分泌并且因此在胞外結(jié)合其底物[Li等人，(2006)Celll27 :305-316 Jhen等人，(2006) Nature 443 :870-874]。因此，本發(fā)明人設(shè)想，通過(guò)在細(xì)胞表面或胞外接觸，用本發(fā)明的肽抑制 IDE。如上文所述，本發(fā)明的肽包含至少一個(gè)天冬氨酸或其同系物。本文使用的術(shù)語(yǔ)“天冬氨酸或其同系物”指氨基酸天冬氨酸或與其具有結(jié)構(gòu)相似性的氨基酸。根據(jù)示例性實(shí)施方式，所述結(jié)構(gòu)同系物為天冬酰胺。根據(jù)其他示例性實(shí)施方式，所述同系物是帶負(fù)電荷的氨基酸，例如但不限于谷氨酸。根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施方式，所述肽包含一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)天冬氨酸或其同系物。根據(jù)一示例性實(shí)施方式，所述肽包含兩個(gè)天冬氨酸或其同系物。根據(jù)本發(fā)明這一方面的一實(shí)施方式，所述天冬氨酸或其同系物在所述肽中的位置是連續(xù)的。本發(fā)明的一示例性肽如SEQ ID NO 26中所列。應(yīng)理解所述天冬氨酸或其類(lèi)似物可位于肽內(nèi)的任何位置，例如位于肽的N端、肽的C-端或肽的IDE催化裂隙結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)，從而使本發(fā)明的肽能夠特異結(jié)合并且抑制IDE。 因此，本發(fā)明的肽的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO 14,SEQ ID NO 15,SEQ ID NO 16,SEQ ID NO 17, SEQ IDNO :18、SEQ ID NO 62、SEQ ID NO 63、SEQ ID NO 64、SEQ ID NO :65 禾口 SEQ ID NO 66 中所列。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，所述肽可能包含至少一個(gè)IDE結(jié)合序列(例如，1個(gè)、2 個(gè)、3 個(gè)或更多個(gè))，例如 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQID NO :8、SEQ ID NO 24 或 SEQ ID N0:25中所列。該序列可位于肽內(nèi)的任何位置，例如肽的N-端或肽的C-端。應(yīng)理解本發(fā)明的肽還包含添加柔性的部分。該部分可向肽添加柔性并且使其具有構(gòu)象柔性用于增加對(duì)IDE的結(jié)合和抑制。本發(fā)明教導(dǎo)的可添加柔性的部分可包括肽部分 (peptide moiety)或化學(xué)部分(chemical moiety)，例如有機(jī)聚合物。應(yīng)理解該添加柔性的部分可包含共價(jià)鍵(例如肽鍵)或非共價(jià)鍵。添加本發(fā)明柔性的部分的示例性化學(xué)交聯(lián)法描述于下文巰基-氨基交聯(lián)(Thiol-amine crosslinking)在該路線中，通常通過(guò)兩步或三步反應(yīng)過(guò)程使肽的氨基基團(tuán)與巰基基團(tuán)間接結(jié)合。巰基的高反應(yīng)性以及它們?cè)诖蠖鄶?shù)肽中的相對(duì)稀少性使得巰基成為受控化學(xué)交聯(lián)的理想靶位。可使用包括SPDP在內(nèi)的數(shù)種巰基化方法之一將巰基基團(tuán)引入肽中。然后使用異雙功能基交聯(lián)劑(heterobifunctional crosslinking reagent)使含巰基的生物分子與含氨基的生物分子反應(yīng)。
氨基-氨基交聯(lián)可使用包括但不限于戊二醛、二(亞胺酯)、二(琥珀酰亞胺酯)、二異氰酸酯和二酰氯(diacid chloride)的氨基-氨基交聯(lián)劑，通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法實(shí)現(xiàn)部分單元(moiety element)的結(jié)合。碳二亞胺(carbodiimide)結(jié)合可使用脫水劑例如碳二亞胺，通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，實(shí)現(xiàn)部分單元的結(jié)合。最優(yōu)選在4-二甲基氨基吡啶存在下使用碳二亞胺。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，碳二亞胺結(jié)合可用于在一個(gè)肽的羧基和第二個(gè)肽的羥基(導(dǎo)致形成酯鍵)，或第二個(gè)肽的氨基基團(tuán)(導(dǎo)致形成酰胺鍵)或者第二個(gè)肽的巰基(導(dǎo)致形成硫酯鍵)之間形成共價(jià)鍵。相似的，碳二亞胺偶聯(lián)可用于在第一個(gè)肽的碳基團(tuán)和第二個(gè)肽的羥基、氨基或巰基基團(tuán)之間形成類(lèi)似的共價(jià)鍵。一般性參見(jiàn)，J.March，Advanced Organic Chemistry Reaction' s, Mechanism, and Structure,H 349-50&372—74 M ( H 3 片反)，1985。添加本發(fā)明柔性的示例性部分包括氨基酸序列，例如SEQ ID NO 13中所列。應(yīng)理解添加柔性的部分的氨基酸序列可位于肽內(nèi)的任何位置以使例如天冬氨酸或其類(lèi)似物和本發(fā)明的N-端序列之間的構(gòu)象柔性成為可能(如圖5所示)。因此，根據(jù)本發(fā)明另一實(shí)施方式，本發(fā)明的肽的氨基酸序列如SEQ IDNO :19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :67、SEQ ID NO :68、 SEQ ID NO 69,SEQ ID NO 70、SEQ IDNO :71、SEQ ID NO 72、SEQ ID NO 73、SEQ ID NO :74、 SEQ ID NO :75、SEQ ID NO :76、SEQ ID NO :77、SEQ ID NO :78、SEQ ID NO :79、SEQ IDNO 80,SEQ ID N0:81、SEQ ID NO :82、SEQ ID NO :83、SEQ ID NO :84、SEQ ID NO :85 和 SEQ ID N0:86中所列。根據(jù)一示例性實(shí)施方式，所述氨基酸序如SEQ ID NO :19中所列。如所述，本發(fā)明的肽可包含修飾。此類(lèi)修飾包括但不限于N端修飾、C端修飾、包括但不限于 CH2-NH、CH2-S、CH2-S = 0、0 = C-NH、CH2-0、CH2_CH2、S = C_NH、CH = CH ^ CF = CH的肽鍵修飾、骨架修飾和殘基修飾。制備擬肽化合物的方法為本領(lǐng)域所熟知，并且詳細(xì)說(shuō)明于例如 Quantitative Drug Design，C. A. Ramsden Gd.，章節(jié) 17. 2，F(xiàn). Choplin Pergamon Press (1992)中，其以全文并入本文中以供參考。該方面的另外的細(xì)節(jié)提供于下文。肽內(nèi)的肽鍵(-C0-NH-)可被以下鍵置換，例如N-甲基化鍵(_N (CH3) -C0-)、酯鍵(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、酮亞甲基鍵(-C0-CH2-)、其中R為諸如甲基的烷基的α-氮雜(aza)鍵(-NH-N(R)-CO-)、卡巴(carba)鍵(-CH2-NH-)、羥乙烯(hydroxyethylene) 鍵(-CH(0H)-CH2-)、硫代酰胺(thioamide)鍵(-CS-NH-)、烯烴雙鍵(-CH = CH-)、逆酰胺 (retro amide)鍵(-NH-C0-)、其中R為天然存在于碳原子上的“正?！眰?cè)鏈的肽衍生物 (-N(R) -CH2-C0-)。這些修飾可出現(xiàn)在沿著肽鏈的任何鍵上并且甚至同時(shí)出現(xiàn)在數(shù)個(gè)(2- 鍵上。可使用保守置換(例如上文對(duì)天冬氨酸或其同系物所述)。天然芳香族氨基酸 Trp,Tyr和Phe可被合成的非天然酸，例如TIC、萘基丙氨酸(Nol) ,Phe的環(huán)甲基化衍生物、 Phe的鹵化衍生物或ο-甲基-Tyr置換。除上文所述，本發(fā)明的肽還可包含一個(gè)或多個(gè)被修飾的氨基酸或一個(gè)或多個(gè)非氨基酸單體(例如脂肪酸、復(fù)合碳水化合物等)。術(shù)語(yǔ)“一種氨基酸”或“多種氨基酸”應(yīng)理解為包括20種天然氨基酸；這些氨基酸通常在體內(nèi)被翻譯后修飾，包括例如羥脯氨酸、磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨酸；以及其他非天然氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羥賴(lài)氨酸、異鎖鏈素、正纈氨酸、正亮氨酸和鳥(niǎo)氨酸。 此外，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”包括D-和L-氨基酸二者。下文表1和2列出了可與本發(fā)明使用的天然氨基酸(表1)和非天然或被修飾的氨基酸(表2)表 權(quán)利要求
1.包含長(zhǎng)度不大于25個(gè)氨基酸的氨基酸序列的分離的肽在制備經(jīng)鑒定用于治療選自糖尿病、肥胖癥、高血糖癥、視網(wǎng)膜損傷、腎衰竭、神經(jīng)損傷、微血管損傷以及水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)感染所構(gòu)成的組的疾病的藥物中的用途，所述氨基酸序列包含至少一個(gè)天冬氨酸或其同系物，所述肽具有胰島素降解酶(IDE)抑制活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中，所述至少一個(gè)天冬氨酸或其同系物包括兩個(gè)天冬氨酸或其同系物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其中，所述兩個(gè)天冬氨酸或其同系物在所述肽中連續(xù)定位。
4.包含長(zhǎng)度不大于25個(gè)氨基酸的氨基酸序列的分離的肽在治療選自糖尿病、肥胖癥、高血糖癥、視網(wǎng)膜損傷、腎衰竭、神經(jīng)損傷、微血管損傷以及水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)感染所構(gòu)成的組的疾病中的用途，所述氨基酸序列包含至少一個(gè)天冬氨酸或其同系物，所述肽具有胰島素降解酶(IDE)抑制活性。
5.一種在需要其的主體中治療選自糖尿病、肥胖癥、高血糖癥、視網(wǎng)膜損傷、腎衰竭、神經(jīng)損傷、微血管損傷以及水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)感染所構(gòu)成的組的疾病的方法，所述方法包括向所述主體給予治療有效量的包含長(zhǎng)度不大于25個(gè)氨基酸的氨基酸序列的分離的肽，所述氨基酸序列包含至少一個(gè)天冬氨酸或其同系物，所述肽具有胰島素降解酶(IDE)抑制活性。
6.一種分離的肽，包含長(zhǎng)度不大于25個(gè)氨基酸的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含至少一個(gè)天冬氨酸或其同系物，所述肽具有胰島素降解酶(IDE)抑制活性。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、4、5或6所述的用途、方法或分離的肽，其中，所述氨基酸序列選自SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :26、SEQ IDNO :62, SEQ ID NO :63、SEQ ID NO :64、SEQ ID NO :65、SEQ ID NO :66、SEQ ID NO :67、SEQID NO :68, SEQ ID NO :69、SEQ ID NO :70、SEQ ID NO :71、SEQ ID NO :72、SEQ ID NO :73、SEQ ID NO :74,SEQ ID NO :75,SEQ ID NO :76,SEQ ID NO :77,SEQ ID NO :78,SEQ ID NO:79、SEQ ID NO :80、SEQ ID NO :81、SEQ ID NO :82、SEQ ID NO :83、SEQ ID NO :84、SEQ IDNO 85以及SEQ ID NO :86構(gòu)成的組中。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、4、5或6所述的用途、方法或分離的肽，其中，所述氨基酸序列如SEQID NO 19中所示。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、4、5或6所述的用途、方法或分離的肽，其中，所述氨基酸序列包含在所述至少一個(gè)天冬氨酸或其同系物和所述氨基酸序列的N端序列之間添加柔性的部分。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途、方法或分離的肽，其中，所述添加柔性的部分包括氨基酸序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途、方法或分離的肽，其中，所述氨基酸序列包括SEQIDNO :13ο
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途、方法或分離的肽，其中，所述N-端序列包含IDE結(jié)合序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求1、4、5或6所述的用途、方法或分離的肽，其中，所述氨基酸序列包含IDE結(jié)合序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的用途、方法或分離的肽，其中，所述IDE結(jié)合序列選自 SEQ ID NO 6, SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :24 禾口 SEQ ID NO :25 所構(gòu)成的組中。
15.根據(jù)權(quán)利要求4、5或6所述的用途、方法或分離的肽，其中，所述至少一個(gè)天冬氨酸或其同系物包括兩個(gè)天冬氨酸或其同系物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的用途、方法或分離的肽，其中，所述兩個(gè)天冬氨酸或其同系物在所述肽中連續(xù)定位。
17.根據(jù)權(quán)利要求1、4、5或6所述的用途、方法或分離的肽，其中，所述天冬氨酸的所述同系物是結(jié)構(gòu)同系物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的用途、方法或分離的肽，其中，所述結(jié)構(gòu)同系物包括天冬酰胺。
19.根據(jù)權(quán)利要求1、4、5或6所述的用途、方法或分離的肽，其中，所述天冬氨酸的所述同系物是帶負(fù)電荷的氨基酸。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的用途、方法或分離的肽，其中，所述帶負(fù)電荷的氨基酸是谷氨酸。
21.一種藥物組合物，包含權(quán)利要求6-20中任一項(xiàng)所述的分離的肽作為活性成分、以及藥學(xué)可接受的載體。
22.—種制品，包含權(quán)利要求6-20中任一項(xiàng)所述的分離的肽和胰島素，所述分離的肽和胰島素各自被包裝于包裝材料中，并且在所述包裝材料內(nèi)或所述包裝材料上通過(guò)印刷被指明用于糖尿病的治療。
23.一種鑒定具有胰島素降解酶(IDE)抑制活性的肽的方法，所述方法包括在權(quán)利要求6-20中任一項(xiàng)所述的肽存在或不存在的情況下，使IDE與所述IDE的報(bào)告子底物接觸， 其中，在所述肽存在的情況下，所述報(bào)告子的活性降低指示為具有IDE抑制活性的肽。
24.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述給予為鼻內(nèi)給予。
25.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述治療有效量在所述給予后使得所述主體的血胰島素水平升高。
26.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述治療有效量在所述給予后使得所述主體的血胰島素生長(zhǎng)因子I(IGFl)水平升高。
27.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述治療有效量在所述給予后使得所述主體的 T淋巴細(xì)胞分泌IL-17減少。
28.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述治療有效量在所述給予后使得所述主體的 T淋巴細(xì)胞分泌IFN-Y減少。
29.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述治療有效量是0.l-10yg/kg體重。
全文摘要
本發(fā)明披露了包含長(zhǎng)度不大于25個(gè)氨基酸的氨基酸序列的分離的肽在制備經(jīng)鑒定用于治療選自糖尿病、肥胖癥、高血糖癥、視網(wǎng)膜損傷、腎衰竭、神經(jīng)損傷、微血管損傷以及水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)感染構(gòu)成的組中的疾病的藥物中的用途，所述氨基酸序列包含至少一個(gè)天冬氨酸或其同系物，所述肽具有胰島素降解酶(IDE)抑制活性。
文檔編號(hào)A61P3/12GK102369015SQ201080014546
公開(kāi)日2012年3月7日 申請(qǐng)日期2010年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月2日
發(fā)明者丹·弗雷克爾, 塔利·本羅曼諾, 諾菲特·博雷恩施泰因, 阿迪·科佩勒維奇, 韋羅尼卡·里夫什茨 申請(qǐng)人:雷蒙特亞特特拉維夫大學(xué)有限公司