專利名稱：有機(jī)磷降解酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶突變體，尤其涉及有機(jī)磷降解酶的突變體及其編碼基因，本發(fā)明還 涉及該有機(jī)磷降解酶突變體在降解有機(jī)磷農(nóng)藥中的應(yīng)用，屬于有機(jī)磷降解酶領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
有機(jī)磷農(nóng)藥是我國甚至全世界范圍內(nèi)使用最廣泛的一類農(nóng)藥。目前，我國化學(xué)農(nóng) 藥年產(chǎn)量為200多萬噸，共600多種，其中常用品種約300多種，其中有機(jī)磷農(nóng)藥占70%以 上。我國農(nóng)藥的生產(chǎn)既滿足了國內(nèi)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需要，又滿足了世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需求，為世 界農(nóng)業(yè)發(fā)展做出了很大的貢獻(xiàn)。在我國，農(nóng)藥在農(nóng)作物病蟲害防控中年挽回經(jīng)濟(jì)損失3500 億元以上；在美國，殺線蟲的使用使甜菜增產(chǎn)175% ；在非洲加納，可可的產(chǎn)量能夠翻3倍， 這也是歸功于殺蟲劑的使用(http//www. agri. gov. cn/gndt/t20100423_1472380. htm, 2010)。有機(jī)磷農(nóng)藥作為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的一分子，常被作為殺蟲劑或除草劑噴灑在各類農(nóng)作物 上，如蔬菜、果樹、水稻、棉花等等，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮了巨大的作用。然而，農(nóng)藥的殘留問題 普遍存在。同時，在殺蟲劑中多數(shù)為高毒的有機(jī)磷農(nóng)藥，但農(nóng)藥的利用率只有10-20%，其殘 留進(jìn)入土壤和水體，嚴(yán)重破壞了農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)，危害了人民健康，還直接影響了農(nóng)產(chǎn)品的銷 售和出口創(chuàng)匯。鑒于農(nóng)藥對人及環(huán)境造成如此重大的損害，中國先后出臺了各項(xiàng)政策。2007年1 月1日，據(jù)農(nóng)業(yè)部第322號公告，全面禁止甲胺磷、甲基對硫磷、久效磷、對硫磷和磷胺5種 高毒有機(jī)磷農(nóng)藥。即使如此，由于長期的農(nóng)藥使用，有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留已經(jīng)造成了環(huán)境的嚴(yán) 重污染。在金銀花、花生、蔬菜、水、空氣中均能檢測到有機(jī)磷農(nóng)藥殘留(呂春紅等，毛細(xì)管 氣相色譜法測定金銀花中敵敵畏、甲基對硫磷和馬拉硫磷的殘留量，中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2008， 5，32 33 ；朱臻怡等，氣相色譜法同時測定花生中12種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量.化學(xué)分析計(jì) 量，2009，18，32 34 ；閆貽洋等，蔬菜中農(nóng)殘分析方法及殘留農(nóng)藥去除率的研究.應(yīng)用化 工，2009，38，1708 1716)。因此，禁用農(nóng)藥雖然能解決不再對環(huán)境施加壓力的問題，但如 何快速治理環(huán)境有機(jī)磷農(nóng)藥殘留依然是現(xiàn)在人們最迫切的需求。有研究表明，如果有機(jī)磷中的一個磷酸酯鍵被水解將大大降低其毒性，以對硫 磷為例，將使其毒性降低 100 倍(Serdar, C. M. et al.，Hydrolysis of cholinesterase inhibitors using parathion hydrolase. U. S. patent. December 1996. 5, 589, 386)。有機(jī) 磷降解酶(Organophosphorus hydrolase, EC3. 1.8. 1)，也稱為磷酸三酯酶，它是一種能夠 破壞有機(jī)磷農(nóng)藥分子上的磷酯鍵而使其脫毒的酶。有機(jī)磷化合物由于取代基的不同而不 同，因此一種有機(jī)磷降解酶可以作用多種底物，具有一定的廣譜性。通過基因工程的手段將 有機(jī)磷水解酶應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，是目前認(rèn)為治理有機(jī)磷農(nóng)藥污染的最有效的方法。(虞云龍 等，農(nóng)藥微生物降解的研究現(xiàn)狀與發(fā)展策略，環(huán)境科學(xué)進(jìn)展，1996，Vol. 4，No. 3，28 36)。自有機(jī)磷水解酶發(fā)現(xiàn)以來，很多科學(xué)工作者都在致力于有機(jī)磷降解酶結(jié)構(gòu)與功能 關(guān)系的研究并取得了進(jìn)展。不僅對有機(jī)磷降解酶催化機(jī)制進(jìn)行了解析，也為基因工程和蛋白質(zhì)工程提供了很多信息，為有機(jī)磷降解酶的分子改良工作提供了指導(dǎo)。目前研究的較為 清楚的兩類酶是甲基對硫磷水解酶(MPH)和乙基對硫磷水解酶(OPH)，其中，MPH的最適降 解底物是甲基對硫磷，而OPH的最適降解底物為乙基對硫磷。對于MPH，從Pseudomonas sp. WBC-3中分離得到的甲基對硫磷水解酶(MPH)的 三級結(jié)構(gòu)獲得了解析，它屬于β -內(nèi)酰胺酶家族，由331個氨基酸殘基組成，其中前35 個氨基酸殘基是信號肽序列，采用等離子體質(zhì)譜儀測定出其活性中心有兩個Zn2+離子， 晶體結(jié)構(gòu)為同型二聚體(Dong Y.J et al. , Crystal Structure of Methyl Parathion Hydrolase from Pseudomonas sp. WBC-3. J Mol Biol 2005，353 :655 663)。對于乙 基對硫磷水解酶0ΡΗ，它是最早發(fā)現(xiàn)的有機(jī)磷水解酶，因此對它的研究已經(jīng)非常的透徹， 其三維結(jié)構(gòu)也已獲得解析。通過原子光譜分析發(fā)現(xiàn)，乙基對硫磷水解酶是雙金屬酶，活性 中心也有兩個Zn2+離子，可被Μ2+，Co2+，Mn2+取代而不影響其催化能力。乙基對硫磷水解 酶X-射線晶體衍射的三級結(jié)構(gòu)研究顯示其蛋白分子為軸向?qū)ΨQ的二聚體，亞基間的作用 力主要發(fā)生在A亞基的Ser61、Asp33和B亞基的Phe73、Arg52之間。每個亞基是一個扭 曲的α/β桶結(jié)構(gòu)，由8個β折疊形成一個桶狀，以14個α螺旋側(cè)向相連(Berming匪 et al. ， Three-dimensional structure of phosphotriesterase :an enzyme capable of detoxifying organophosphate nerve agents. Biochemistry 1994，33 15001 15007 ；Benning MM et al. Three-dimensional structure of the binuclear metal center of phosphotriesterase. Biochemistry 1995，34 :7973 7978 ；Benning MM et al. ， High resolution X-ray structures of different metal-substituted forms of phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta. Biochemistry 2001,40 :2712 2722)。隨著人們對有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶的分子結(jié)構(gòu)的不斷認(rèn)識，以及蛋白質(zhì)工程技術(shù) 的發(fā)展，研究酶蛋白的分子結(jié)構(gòu)并進(jìn)行了分子改造，使其改變底物特異性，從而能對多 種有機(jī)磷農(nóng)藥具有高效的降解效率。1998年，Shim等人利用定點(diǎn)突變技術(shù)對有機(jī)磷水 解酶進(jìn)行突變，獲得了一個突變株M317A，對磷酸二脂鍵的催化能力比原酶高(Shim et al. ， Hydrolysis of phosphodiesters through transformation of the bacterial phosphotriesterase. J Biol Chem 1998,273(28) 17445 17450)。2000 年，Gopal S 對OPH的活性中心點(diǎn)進(jìn)行突變，獲得的突變體L136Y對神經(jīng)毒劑VX的催化能力得到提高 (Gopal et al. ， Mutagenesis of organophosphorus hydrolase to enhance hydrolysis of the nerve agent VX. Biochemical and Biophysical Research Communications 2000, 279 516 519)。Wu Mngfeng等從農(nóng)藥污染的土壤中分離得到一株高效降解有機(jī)磷農(nóng)藥的細(xì)菌， 經(jīng)鑒定為假單胞假產(chǎn)堿菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)(此菌保藏在中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC 1150)，同時，對此細(xì)菌產(chǎn)生的有機(jī) 磷降解酶0PHC2進(jìn)行了分離純化及酶學(xué)性質(zhì)的研究[Wu Ningfeng, Deng Minjie, et al Isolation,purification and characterization of a new organphosphorus hydrolase 0PHC2. Chinese Science Bulletin, 2004,49 (3) :268_272]，并從中克隆了有機(jī)磷降解酶的 編石馬基因[WuNingfeng, Deng Minjie, et al :Cloning and expression of ophc2, a new organphosphorus hydrolase gene. Chinese Science Bulletin,2004,49 (12) 1245-1249](編碼基因的核苷酸序列已在GenBank中登錄，登錄號為AJ605330)。0PHC2屬于甲基對硫磷水解酶，其降解的最適底物為甲基對硫磷，對于乙基對硫磷 的降解率較低。因此，研究0PHC2的空間結(jié)構(gòu)，并通過計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)， 對0PHC2進(jìn)行突變，期望能獲得對乙基對硫磷降解活性更好的突變酶，可望為有效擴(kuò)大有 機(jī)磷降解酶0PHC2的底物特異性提供新的基因源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是克服原有機(jī)磷降解酶(該基因在GenBank中的 登錄號為AJ605330)對乙基對硫磷降解率低的缺陷，對原有機(jī)磷降解酶基因進(jìn)行突變，得 到對乙基對硫磷降解活性有顯著提高的突變酶，擴(kuò)大其底物特異性。本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題是提供編碼上述有機(jī)磷降解酶突變體的基因。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種有機(jī)磷降解酶突變體(0PHC2_Al-5)，其氨基酸序列為SEQID NO. 2所示；另外一種有機(jī)磷降解酶突變體(0PHC2_E6)，其氨基酸序列為SEQID NO. 4 ；又一種有機(jī)磷降解酶突變體(0PHC2_AE)，其氨基酸序列為SEQID NO. 6所示；編碼上述三種有機(jī)磷降解酶突變體的基因也當(dāng)然的在本發(fā)明的保護(hù)范疇之內(nèi)；優(yōu) 選的編碼SEQ ID NO. 2所示氨基酸的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示；編碼SEQ ID N0. 4 所示氨基酸的核苷酸序列為SEQ ID N0. 3所示；編碼SEQ ID N0. 6所示氨基酸的核苷酸序 列為SEQID N0. 5所示，此外，含有上述核苷酸的表達(dá)載體以及含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞也屬于本發(fā)明 的保護(hù)范疇之列。本發(fā)明采用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)的組合活性位點(diǎn)飽和實(shí)驗(yàn)(Combinatorial Active-Site Saturation Test，CAST)構(gòu)建突變體庫，通過高通量篩選得到上述三種對乙 基對硫磷降解活性更高的有機(jī)磷降解酶突變體，其主要步驟如下首先對有機(jī)磷降解酶0PHC2進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)分析以發(fā)表的來源于Pseudomonas sp. WBC-3的MPH晶體結(jié)構(gòu)為模版，構(gòu)建0PHC2三維結(jié)構(gòu)，確定活性中心；然后依據(jù)0PHC2的 空間結(jié)構(gòu)特征，在活性中心附近酶與底物結(jié)合的口袋處設(shè)計(jì)了 5個突變區(qū)域，這些區(qū)域突 變后不會影響酶催化活性中心的結(jié)構(gòu)。每個區(qū)域的突變都是一個突變體庫，通過高通量篩 選得到對乙基對硫磷降解活性更高的突變體，每個庫至少要篩3000個克隆，這樣能夠95% 覆蓋要選的突變體；按照設(shè)計(jì)的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，采用重疊延伸PCR技術(shù)構(gòu)建突變體庫， 將構(gòu)建好的突變體庫首先通過挑選12個克隆子檢測插入片段陽性率和測序以鑒定突變體 庫質(zhì)量，然后用Genetics QPix2自動挑取克隆機(jī)器人從每個大平板上挑3840個菌，分別放 置于10個384孔板中，再利用96針復(fù)制器將菌復(fù)制到96孔深孔板中培養(yǎng)，再通過96孔酶 標(biāo)板測定酶活性，并通過酶標(biāo)儀讀數(shù)，以確定目標(biāo)突變體。篩選出的好的突變體再進(jìn)行組合 突變以得到更好的突變酶。乙基對硫磷降解活性分析表明，相比于原酶，本發(fā)明所篩選到的三種有機(jī)磷降解 酶突變體對乙基對硫磷的降解率均呈顯著性提高有機(jī)磷降解酶突變體0PHC2_Al-5與原 酶相比對乙基對硫磷的降解率提高了 2. 7倍；有機(jī)磷降解酶突變體0PHC2_E6與原酶相比對 乙基對硫磷的降解率提高了 3. 3倍；有機(jī)磷降解酶突變體0PHC2_AE與原酶相比對乙基對硫磷的降解率提高了 4. 2倍。酶學(xué)性質(zhì)分析表明，本發(fā)明的三種突變酶酶學(xué)性質(zhì)與原酶相比基本沒有變化，均 有很好的耐熱性；其最適反應(yīng)PH為9，與原酶一致；三種突變酶最適反應(yīng)溫度為60°C ；三種 突變酶在65 °C下突變酶相對較穩(wěn)定。綜上所述，本發(fā)明成功地通過計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)了突變位點(diǎn)，運(yùn)用組合活性位點(diǎn)飽 和實(shí)驗(yàn)成功地構(gòu)建了飽和突變體庫，并建立了高通量的篩選技術(shù)，有效地篩選到了對乙基 對硫磷降解活性高的突變體，再通過組合突變得到很好的突變酶。本發(fā)明篩選得到的三種 突變酶與原酶相比，對乙基對硫磷降解比活性分別提高了 2. 45,2. 56和4. 51倍，其對乙基 對硫磷的降解能力(kcat/Km值)是原酶(0PHC2)的2. 7,3. 3和4. 2倍。說明書附10PHC2三維結(jié)構(gòu)圖。圖2重疊延伸PCR過程。圖3純化后0PHC2及其突變酶的SDS-PAGE分析。圖40PHC2和突變酶對乙基對硫磷降解的比活性分析。圖50PHC2和突變酶反應(yīng)最適溫度。圖60PHC2和突變酶反應(yīng)最適pH。圖70PHC2和突變酶在65°C下的溫度穩(wěn)定性。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明的制備方法及有益效果，應(yīng)該理解的是，這 些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。一、試驗(yàn)材料和試劑1、生化試劑、酶、試劑盒工具酶PCR用Taq plus DNA聚合酶定購于天根生化科技(北京)有限公司，限 制性內(nèi)切酶均定購于TaKaRa公司，RNase定購于Sigma公司(鼎國公司分裝)，T4DNA連接 酶定購于NEB (北京)有限公司。試劑甲基對硫磷(MP)及乙基對硫磷(EP)均定購于國家農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心， Ikb的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)定購于鼎國公司，dNTP、DNA純化試劑盒、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提 試劑盒均定購于天根生化科技有限公司，瓊脂糖定購于Sigma公司，X-gal和IPTG定購于 經(jīng)科宏達(dá)公司，其他試劑均為分析純。2、質(zhì)粒與菌株基因來源于假產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenesC2_l)的甲 基對硫磷水解酶基因ophc2已由本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室克隆得到，它在GenBank中的登錄號為 AJ605330。質(zhì)粒pUC19購自 NEB (北京)有限公司，pET_30a (+)購自 Novagen 公司，pEASY_T3 購自北京全式金生物有限公司，PPIC9購自Invitrogen公司。菌株大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(E. Coli)T0P10購自天根生化科技(北京)有限公司， BL21 (DE3)購自Novagen公司。酵母宿主菌株GSl 15購自Invitrogen公司。3、培養(yǎng)基
LB完全培養(yǎng)基NaCl 10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，調(diào)整pH值至7. 0 (固體 培養(yǎng)基中瓊脂粉的濃度為1.5%)，高溫高壓滅菌。Freezing培養(yǎng)基蛋白胨 10g，酵母粉5g，NaCl 1 Og，KH2PO4L 8g，K2HPO4 8.2g，檸檬 酸鈉0. 5g，(NH4)2SO4 0.9g，甘油44mL，加水定容至IL后高溫高壓滅菌。使用前加入40mmol/ L的MgSO4至終濃度為0. 4mmol/L (注=MgSO4 —定要滅完菌后再加，否則會形成沉淀)。轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基RDB =YNB 13. 4g/L，葡萄糖20g/L，生物素4X 10_4g/L，瓊脂粉20g/L，山 梨醇186g/L，100X氨基酸。選擇培養(yǎng)基MD =YNB 13. 4g/L，葡萄糖20g/L，生物素4X 10_4g/L，瓊脂粉20g/L。選擇培養(yǎng)基匪YNB 13. 4g/L，甲醇5mL/L，生物素4X 10_4g/L，瓊脂粉20g/L。誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基BMGY 酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，酵母氮源(YNB) 13. 4g/L， 生物素 4X10_4g/L，甘油 IOmL, pH 6.0。誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基BMMY 酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，酵母氮源(YNB) 13. 4g/L， 生物素 4 X 10 VL,甲醇 5mL/L，ρΗ6· 0。4、相關(guān)溶液(1)抗生素氨芐青霉素使用濃度為100 μ g/mL ；卡那霉素使用濃度為50 μ g/mL。(2)TAE(50X) :100mL 0. 5mol/L EDTA(ρΗ7· 5)，57. ImL冰乙酸，242g Tris堿，用無 菌水定容至1L。(3)質(zhì)粒提取溶液溶液I :25mmol/L Tris-Cl (ρΗ8· 0)，10mmol/L EDTA, 50mmol/L 葡萄糖。溶液11:1% SDS, 0. 2mol/L NaOH(現(xiàn)配現(xiàn)用)。溶液III :5mol/L 冰乙酸(pH 4. 8)，3mol/L 乙酸鉀。(4) RNase溶液10mg/mL RNase, 15mmol/L NaCl，10mmol/LTris-Cl (ρΗ8· 0)，100°C 加熱15min，冷卻至室溫后分裝成小份，-20°C保存。(5) lmol/L Tris-Cl 緩沖液(ρΗ8· 0) 121. Ig Tris 堿，加濃 HCl 調(diào)節(jié) pH 值到 8. 0， 定容至1L，分裝以后高壓滅菌。(6) SDS-PAGE 蛋白電泳30%丙烯酰胺溶液lg N, N’ -亞甲叉丙烯酰胺、29g丙烯酰胺，溶于IOOmL水。上樣緩沖液(2X)2% β-巰基乙醇、10% 甘油、100mmol/LTriS-Cl(pH6.8)、4% SDS、2%溴酚藍(lán)。考馬斯亮藍(lán)染液將0. 24g考馬斯亮藍(lán)R250溶于90mL甲醇水(1 1，ν/ν)和 IOmL冰乙酸。Tris-甘氨酸電泳緩沖液0. 1 % SDS、25mmol/L Tris 堿、250mmol/L 甘氨酸 (ρΗ8· 3)。脫色液=IOmL冰乙酸和90mL甲醇水(1 1，ν/ν)混合至IOOmL05、DNA測序、引物合成委托農(nóng)作物基因資源與基因改良國家重大科學(xué)工程開放實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行DNA測序；委 托三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)公司合成所有實(shí)驗(yàn)用的引物。實(shí)施例1計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)組合活性位點(diǎn) 飽和實(shí)驗(yàn)的突變位點(diǎn)首先是對有機(jī)磷降解酶0PHC2 (GenBank中的登錄號為AJ605330)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)分析以發(fā)表的來源于Pseudomonas sp. WBC-3的MPH晶體結(jié)構(gòu)為模版，應(yīng)用Accelrys Discovery Studio software (Ver. 2. 5)軟件構(gòu)建0PHC2三維結(jié)構(gòu)，確定活性中心，其三維結(jié) 構(gòu)如

圖1。0PHC2是一個同源二聚體，屬于典型的β/α (TIM)折疊桶結(jié)構(gòu)，其中8個折疊結(jié) 構(gòu)構(gòu)成一個桶，為酶的活性中心區(qū)域，中間含有兩個Zn2+。依據(jù)0PHC2的空間結(jié)構(gòu)特征，在 活性中心附近酶與底物結(jié)合的口袋處設(shè)計(jì)了 5個突變區(qū)域，這些區(qū)域突變后不能影響酶催 化活性中心的結(jié)構(gòu)。要保證所選擇的氨基酸對能夠在空間位置上相互接近，則需遵循以下 原則選擇兩個相鄰的氨基酸做飽和突變，即如果選擇的第一個氨基酸是蛋白的第η個氨基 酸，且這第η個氨基酸在環(huán)上，則另一個氨基酸選擇第η+1位；若在β折疊上則選擇第η+2 位，若在31(|螺旋上，則選擇第η+3位；若在α螺旋上，則選擇第η+4位。因此在依據(jù)以上原 則設(shè)計(jì)了 5 個突變區(qū)域，分別是 A 庫(Μ188/Μ191)，B 庫(L250/N251)，C 庫(E168/F171)，D 庫(E264/F265)，E庫(V55/L57)。其中A和C庫位于螺旋上，B庫位于loop上，D庫在β 轉(zhuǎn)角處，E庫在β折疊上，見圖1。實(shí)施例2突變基因片段的獲得采用的是重疊延伸PCR技術(shù)。設(shè)計(jì)一對兩端側(cè)翼引物(a和d)及五對含所需突變 位點(diǎn)的引物(b和c)，其中b引物含有希望引入的突變位點(diǎn)。突變位點(diǎn)是雙點(diǎn)的飽和突變， 所需突變的氨基酸對的中間引物對應(yīng)的是6個堿基，并將每個氨基酸對應(yīng)的堿基換成rmk 的形式，引物序列見表1。每個點(diǎn)突變均進(jìn)行了兩輪PCR，第一輪PCR分別用引物a和c擴(kuò) 增基因的上游序列的DNA片段，同時用引物b和d擴(kuò)增含有突變位點(diǎn)及其下游序列的DNA 片段。用瓊脂糖凝膠回收這兩段DNA片段，再混合這兩段PCR產(chǎn)物，由于b和c有重疊區(qū)， 重疊片段之間退火，可延伸成異源雙鏈，加入兩端側(cè)翼引物進(jìn)行第二次PCR，即可得到含一 個位點(diǎn)突變的突變體，重疊延伸PCR過程見圖2。PCR反應(yīng)具體擴(kuò)增程序如下第一輪PCR 以原菌C2-1基因組為模板，b和c為引物，Taq plus酶進(jìn)行兩個反應(yīng) 的擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94°C 5min，94°C 30sec，58°C 45sec，72°C 45sec，共 30 個循環(huán)，72°C延 伸 IOmin0 PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收備用。第二輪PCR 取以上兩種PCR產(chǎn)物等體積混合，取1 μ L作為PCR模板，a和d為 引物，Taq plus酶進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94 °C 5min，94°C 45sec，55°C 45sec， 72°C 30sec, 5 個循環(huán)；94°C 30sec, 58°C 45sec, 72°C 45sec, 30 個循環(huán)，72°C延伸 lOmin。PCR 產(chǎn)物的回收按照凝膠回收試劑盒所示方法進(jìn)行。表1突變位點(diǎn)和突變引物 η = A/G/C/T ；k = G/T實(shí)施例3飽和突變體庫的構(gòu)建連接將實(shí)施例2所回收的PCR產(chǎn)物直接用BamHI和HindIII雙酶切后與用同樣 雙酶切處理的PUC19載體進(jìn)行連接，連接體系為pUC19 2 μ L，PCR產(chǎn)物6. 5 μ L，T4連接酶 0. 5 μ L，IOX反應(yīng)緩沖液1 μ L，輕輕混合，16°C反應(yīng)過夜。每個庫做5個連接體系。轉(zhuǎn)化將_70°C保存的ToplO感受態(tài)細(xì)胞在冰上凍融，取50 μ L感受態(tài)細(xì)胞加入到 上述的連接體系中，輕輕吸打混勻，冰浴30min。將冰浴好的體系于42°C準(zhǔn)確熱激90seC，然 后立即置于冰上2min，并加400 μ L預(yù)冷的LB平衡至室溫，200rpm, 37°C搖床孵育lh。加入 4 μ L lmol/L IPTG，40 μ L 20mg/ml X-gal 混合，轉(zhuǎn)化后的菌液全部涂布 LB (含 100 μ g/mL， Amp) 23cmX 23cm的大平板，37°C培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。每個突變體庫的所有連接體系轉(zhuǎn)化的 菌全涂于同一個平板上，保證每個庫的轉(zhuǎn)化子在3000個以上。為了保證篩選菌株的數(shù)目足夠覆蓋所有可能出現(xiàn)的突變體，首先需要驗(yàn)證突變體 庫構(gòu)建的質(zhì)量，也就是插入片段陽性率的高低。本實(shí)驗(yàn)從5個庫中隨機(jī)挑取了 12個克隆進(jìn) 行BamHI和HindIII雙酶切鑒定。A、B、E庫插入片段的陽性率可以達(dá)到為100%，C和D庫 的12個克隆中僅有一個為假陽性，陽性率能達(dá)到90%以上，這樣的陽性率已達(dá)到了要求。 為確定設(shè)計(jì)突變位點(diǎn)的氨基酸是否突變，在鑒定出的陽性克隆中隨機(jī)選取兩個進(jìn)行序列測 定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所突變位點(diǎn)均都為突變堿基。因此，可以認(rèn)為所構(gòu)建的突變體庫已經(jīng)達(dá)到了 要求，可以進(jìn)行進(jìn)一步篩選。實(shí)施例4突變體庫的篩選將384孔板里的每個孔中加50 μ L含Amp抗性的Freezing培養(yǎng)基，用Genetics QPix2自動挑取克隆機(jī)器人從每個大平板上挑3840個菌，分別放置于10個384孔板中， 37°C過夜培養(yǎng)。在96深孔板中加ImL含Amp抗性的LB培養(yǎng)基，利用96針復(fù)制器將菌復(fù)制 到96孔深孔板中，同時在另一個96深孔板中加8個含野生酶基因重組質(zhì)粒pUC19-ophc2 的菌株，做為陽性對照，37 °C過夜振蕩培養(yǎng)。取50 μ L過夜培養(yǎng)的菌液(已測定0D_數(shù)據(jù))，加入到含有2 μ L，2mg/mL乙基對 硫磷(EP)和100 μ L 50mM Tris-Cl (pH 8.0)緩沖液的96孔酶標(biāo)板中，進(jìn)行初篩。37°C保 溫30min，然后用酶標(biāo)儀測定OD41tl和OD55tl的數(shù)值。為去除菌體量不同對測定結(jié)果的影響，參照Miller的方法(Miller，1972)，用下列公式計(jì)算后與陽性對照比較。 T 反應(yīng)時間(min) ；V 反應(yīng)體系中菌體體積(mL)將上述測得比原酶降解以及乙基對硫磷活性好的突變株進(jìn)行復(fù)篩，挑單菌接種于 2. 5mL含Amp抗性的LB培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)。將每個樣品的菌濃度用LB培養(yǎng)基調(diào)成一 致后，取 100 μ L菌液加入到含有 4μ L 10mg/mL EP 禾口 900 μ L 50mM Tris-Cl (pH 8.0)緩沖 液的體系中，37°C保溫IOmin后加入ImL 10%的TCA終止反應(yīng)，再加入ImL 10% Na2CO3顯 色，410nm測定光吸收值。對5個突變體庫中約15，OOO個克隆子進(jìn)行了篩選，初篩得到了 12個對乙基對硫 磷水解活性提高的突變株。復(fù)篩后，發(fā)現(xiàn)A庫中的Al-5，A2-5，A6-3和E庫中的E6、E8五 個菌株對乙基對硫磷的水解能力比原酶0PHC2好。通過再次測定確定了 2個突變株最好， 分別為A1-5和E6。將A1-5和E6送去測序，結(jié)果顯示，A1-5的突變位點(diǎn)為M188L/M191S。 E6的突變位點(diǎn)為L57V，其中55位的V的核苷酸序列也發(fā)生了改變，但氨基酸序列未變。實(shí)施例5組合突變體的構(gòu)建為了獲得對乙基對硫磷水解活性更高的突變體，本實(shí)驗(yàn)將A庫中最好的突變體 A1-5和E庫中最好的突變體E6的突變位點(diǎn)進(jìn)行組合突變。以A1-5的重組質(zhì)粒為模板，參 照E6突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)突變引物，將A1-5中第57位的亮氨酸(Leu)定點(diǎn)突變?yōu)槔i氨酸(Val)， 構(gòu)建了組合突變體AE(M188L/M191S/L57V)。突變體的構(gòu)建方法與前面突變基因片段獲得的 方法相同，均是采用重疊延伸PCR技術(shù)。實(shí)施例6突變酶在畢赤酵母中表達(dá)以及酶活性的測定將Al-5、E6和AE中的突變基因先用PCR擴(kuò)增，再用限制性內(nèi)切酶SnaBI和NotI 消化PCR產(chǎn)物，連入用同樣兩種酶切好的pPIC9載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO，測序正確后，轉(zhuǎn) 化酵母GS115。線性化的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入酵母菌株，通過RDB、MM和MD平板篩選，得到表型 為His+的克隆子，進(jìn)一步在搖床水平上進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將His+Muts轉(zhuǎn)化子首先在BMGY培 養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，離心棄BMGY，換入誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY，誘導(dǎo)培養(yǎng)48h，取上清液按下述方法進(jìn) 行有機(jī)磷降解酶活性測定取IOOyL待測酶液加入含有5μ L 10mg/mL甲基對硫磷和900 μ L 50mmol/L Tris-Cl (pH9. 0)緩沖液的體系中，37°C保溫10分鐘，加入ImL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)，再 加入ImL 10% Na2CO3溶液顯色，410nm測定OD值，計(jì)算水解產(chǎn)物對硝基酚的含量和酶的活 性。一個酶的活性單位(U)定義為在37°C，每分鐘釋放出Iymol對硝基酚所需酶量。有機(jī)磷降解酶酶活單位計(jì)算公式 其中3Χ10_3:反應(yīng)總體積(L) ；N:酶液的稀釋倍數(shù)；10@ JflOOyL稀釋酶液中 的酶活性折算為ImL的酶活性；10 反應(yīng)時間。選取表達(dá)高的菌株進(jìn)行大量誘導(dǎo)培養(yǎng)用于下一步的降解活性分析。試驗(yàn)例1突變酶和原酶的純化及底物降解活性分析
10
由于需要純蛋白來測定酶對不同底物的降解活性，因此本實(shí)驗(yàn)先對酵母表達(dá)的原 酶和突變酶進(jìn)行純化。挑取具有較高酶活性的重組菌株(實(shí)施例6所構(gòu)建)，接入IL BMGY 培養(yǎng)基中，28°C搖床震蕩培養(yǎng)48h后，離心棄上清，加入200ml BMMY培養(yǎng)基，28°C誘導(dǎo)培養(yǎng) 48h。離心得到的培養(yǎng)上清液即為含有重組酶蛋白的粗酶液。由于酵母表達(dá)的重組蛋白約 為上清液總蛋白的90%以上，采用PalKPall Life Sciences，USA)切向流過濾器進(jìn)行純 化和蛋白的濃縮。首先使用孔徑為0.22 μ m的微濾膜包，過濾去除上清液中的離心未能去 除的細(xì)胞碎片。然后根據(jù)目的蛋白分子量的大小選用超濾膜包進(jìn)行蛋白截流和濃縮，由于 目的蛋白分子量為36kDa，因此選擇截流分子量為IOkDa的超濾膜包，將其他它小的蛋白和 一些小分子化合物過濾掉，并將緩沖液置換成50mMTris-Cl(pH 8.0)緩沖液。純化后的酶 蛋白進(jìn)行SDS PAGE電泳分析，結(jié)果顯示，只有一條單一條帶，大小為36kDa(圖3)。純化的 原酶0PHC2和三種突變酶用來進(jìn)行降解底物比活性及動力學(xué)參數(shù)的比較分析。測定不同的酶液的蛋白含量，并測定酶活性，這樣得出酶的比活性。應(yīng)用BioRad Protein Assay Kit (BioRad,USA)來測定蛋白濃度。將蛋白染料蒸餾水以4 1比例混 合，取60 μ L待測酶液加入到3mL上述混合溶液中，準(zhǔn)確反應(yīng)30min，595nm讀數(shù)，將所獲得 的數(shù)據(jù)代入到蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算蛋白質(zhì)的濃度。通過比較突變酶與野生型0PHC2對甲基對硫磷和乙基對硫磷水解的比活性(表 2)，可以看出本發(fā)明的三種突變酶 0PHC2_A1-5(SEQID NO :2)、0PHC2_E6 (SEQ ID NO 4)和 0PHC2_AE(SEQ ID NO 6)對乙基對硫磷的降解比活性均比原酶有顯著提高，分別是原酶 (0PHC2)的 2. 45 倍，2. 56 倍和 4. 51 倍(圖 4)。表20PHC2和突變酶比活性分析 本試驗(yàn)進(jìn)一步測定了突變酶0PHC2_Al-5、0PHC2_E6、0PHC2_AE和野生型0PHC2對 甲基對硫磷(MP)及乙基對硫磷(EP)的動力學(xué)參數(shù)。首先以乙基對硫磷為底物，進(jìn)行了反 應(yīng)初速度的測定。分別配制9個反應(yīng)體系，在37°C水浴鍋中預(yù)熱5min，用同一管酶液依次 加樣，在酶作用l、3、5、7、10、15、20、30min時用TCA終止反應(yīng)，Na2CO3顯色，410nm測定光 吸收值，然后算出反應(yīng)時間和酶活性的比值，若在一定時間范圍內(nèi)其比值保持恒定，則在這 個時間范圍內(nèi)酶反應(yīng)為一級反應(yīng)。據(jù)此來確定測Kn^PVmax的反應(yīng)時間。根據(jù)所測的反應(yīng) 初速度，確定測Kn^PVmax的反應(yīng)時間。用不同濃度的甲基對硫磷和乙基對硫磷作底物，在 50mM Tris-CKpH 8. 0)緩沖液中，37°C下測定酶活性，計(jì)算酶的反應(yīng)速度。按雙倒數(shù)作圖法(Lineweaver-Burk法)求取Km和Vmax0結(jié)果見表3，發(fā)現(xiàn):A1_5、E6和AE對EP的親和能 力基本上沒有太大變化，但對其降解能力均有所提高，其k。at/Km值均比0PHC2要高，分別是 2. 7倍、3. 3倍和4. 2倍。A1-5對MP的降解能力(kcat/Km)略有提高，E6和AE對MP的降解 能力有不同水平的下降。表30PHC2和突變酶對MP和EP的動力學(xué)參數(shù)結(jié)果 試驗(yàn)例2突變酶和原酶的酶學(xué)性質(zhì)分析為了確定突變酶的酶學(xué)性質(zhì)是否變化，本試驗(yàn)將原酶(0PHC2)和突變酶 0PHC2-Al-5、0PHC2-E-6和0PHC2-AE在不同溫度和不同pH下進(jìn)行酶促反應(yīng)測定其酶活性， 結(jié)果顯示本發(fā)明的三種突變酶的最適反應(yīng)溫度為60°C (圖5)，最適反應(yīng)pH為9. 0(圖6)， 與原酶基本一致。同時，還測定了在65°C下原酶與突變酶的熱穩(wěn)定性(圖7)，從圖中可以 看出三種突變酶的熱穩(wěn)定性都很好，在保溫30分鐘后其相對剩余酶活性大于70%。
權(quán)利要求
有機(jī)磷降解酶突變體，其特征在于其氨基酸為SEQ ID NO.2所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述有機(jī)磷降解酶突變體的基因；優(yōu)選的，所述基因的堿基為SEQ ID NO. 1 所示。
3.有機(jī)磷降解酶突變體，其特征在于其氨基酸為SEQID NO. 4所示。
4.編碼權(quán)利要求3所述有機(jī)磷降解酶突變體的基因；優(yōu)選的，所述基因的堿基為SEQ ID NO. 3 所示。
5.有機(jī)磷降解酶突變體，其特征在于其氨基酸為SEQID NO. 6所示。
6.編碼權(quán)利要求5所述有機(jī)磷降解酶突變體的基因。
7.按照權(quán)利要求6所述的基因，其特征在于其堿基為SEQIDN0.5所示。
8.含有權(quán)利要求2、4、6或7任何一項(xiàng)所述基因的表達(dá)載體。
9.含有權(quán)利要求8所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
10.權(quán)利要求1、3或5所述的有機(jī)磷降解酶突變體在降解有機(jī)磷農(nóng)藥中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了有機(jī)磷降解酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明根據(jù)有機(jī)磷降解酶OPHC2的空間結(jié)構(gòu)特征，通過計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)，對原酶編碼基因進(jìn)行定點(diǎn)突變篩選得到三個有機(jī)磷降解酶突變體，其氨基酸序列分別為SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示。與原酶相比，本發(fā)明有機(jī)磷降解酶突變體對乙基對硫磷降解比活性分別提高了2.45倍、2.56倍和4.51倍，其對乙基對硫磷的降解能力(kcat/Km值)分別是原酶的2.7倍、3.3倍和4.2倍。酶學(xué)性質(zhì)分析表明，本發(fā)明有機(jī)磷降解酶突變體的酶學(xué)性質(zhì)與原酶相比沒有變化，均有很好的耐熱性。
文檔編號A62D101/04GK101914509SQ20101024445
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月3日
發(fā)明者伍寧豐, 初曉宇, 呂紅, 田 健, 范云六 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所