專利名稱：復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad41載體系統(tǒng)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因治療和重組疫苗領(lǐng)域中一種復(fù)制缺陷型重組腺病 毒Ad41載體系統(tǒng)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腸道作為基因治療的靶器官有如下優(yōu)點(diǎn)(a)給藥途徑簡便，可 以直接口服給藥或內(nèi)窺鏡給藥；(b)腸道上皮的表面積大，便于載體 的充分吸附和感染；(c)腸道上皮的隱窩細(xì)胞是干細(xì)胞，對其的感染 能延長目的基因的表達(dá)時間(Croyle MA， Stone M， Amidon GL， Roessler BJ. In vitro and in vivo assessment of adenovirus 41 as a vector for gene delivery to the intestine. Gene Ther， 1998，5(5》645-654. [pubmed:9797869)。粘膜是阻止多數(shù)病原微生物入侵機(jī)體的第 一道屏 障，口服給藥的疫苗能激發(fā)粘膜免疫和系統(tǒng)免疫，是今后疫苗研究的 重要方向。然而，目前缺乏安全有效的能夠腸道給藥的載體系統(tǒng)，將 把基因或抗原基因傳遞到腸道細(xì)胞非常困難，使得胃腸道的基因治療 和口服重組疫苗研究相對滯后(Lecollinet S， Gavard F， Havenga MJ， Spiller OB， Lemckert A， Goudsmit J， Eloit M， Richardson J. Improved gene delivery to intestinal mucosa by adenoviral vectors bearing subgroup B and d fibers. J Virol， 2006，80(6):2747國2759. [pubmed:16501084)。
腺病毒載體(Adenovector， Ad)由于感染細(xì)胞效率高、遺傳穩(wěn)定、 容易制備高滴度病毒、不整合入細(xì)胞基因組、既能感染分裂期也能感 染非分裂期細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于基因治療和重組疫苗研究。現(xiàn)在得 到廣泛應(yīng)用的腺病毒載體多是基于人5型腺病毒基因組，但胃酸或腸 消化液能夠較大幅度的降低Ad5的感染力，所以其不是理想的腸道給 藥的基因治療載體(Favier AL， Burmeister WP， Chroboczek J. Unique physicochemical properties of human enteric Ad41 responsible for its
4survival and replication in the gastrointestinal tract. Virology, 2004，322(1):93-104. [pubmed:15063120)。
人F組腺病毒包括2個成員Ad40和Ad41,能引起嬰幼兒急性 胃腸炎，是天然的腸道病原，被稱為腸腺病毒(enteric adenovirus )。 研究表明Ad41對胃酸和腸消化液有很強(qiáng)的耐受性，對分化的腸上皮 細(xì)胞感染能力強(qiáng)，是理想的用于腸道給藥的基因治療載體(Tiemessen CT， Kidd AH. The subgroup F adenoviruses. J Gen Virol, 1995,76 ( Pt 3):481-497. [pubmed:7897343])。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad41載體系統(tǒng)。 本發(fā)明提供的載體系統(tǒng)包括1個骨架質(zhì)粒、1個穿梭質(zhì)粒和1個包 裝細(xì)胞系。所述骨架質(zhì)粒含有缺失了腺病毒包裝所需編碼區(qū)的腺病毒 Ad41基因組，所述穿梭質(zhì)粒含有用于插入目的基因的多克隆位點(diǎn)以及 用于與骨架質(zhì)粒發(fā)生同源重組的腺病毒Ad41基因組片段，所述包裝 細(xì)胞系在細(xì)胞基因組中整合了所述腺病毒Ad41包裝所需基因并能穩(wěn) 定表達(dá)該包裝基因。
利用本載體系統(tǒng)能夠制備由CMV啟動子控制目的基因表達(dá)的重 組Ad41腺病毒。將目的基因編碼區(qū)克隆到穿梭質(zhì)粒pSh41-CMV的多 克隆位點(diǎn)處，攜帶目的基因的穿梭質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶PacI酶切線性 化，與骨架質(zhì)粒pAdbone41共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183菌林(美國 Stratagene公司)，在BJ5183細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過同源重組得到攜帶目的基因 的腺病毒質(zhì)粒。該質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶Pmel酶切，釋放重組腺病毒 基因組，利用DNA轉(zhuǎn)染方法將重組腺病毒基因組轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞 293-E1B,在包裝細(xì)胞內(nèi)拯救得到攜帶目的基因的重組Ad41腺病毒。 起始得到的少量重組病毒可以進(jìn)一步用包裝細(xì)胞擴(kuò)增，制備大量的重 組病毒。
在制備的重組腺病毒中，Ad41基因組El區(qū)由含目的基因的表達(dá) 框(含啟動子、目的基因CDS和多聚腺苷酸加尾信號)替代，故該重 組病毒只能在穩(wěn)定表達(dá)Ad41 E1B55K基因的包裝細(xì)胞系293-E1B中 復(fù)制包裝，對于其他非包裝細(xì)胞系，其是復(fù)制缺陷的。該重組病毒顆 粒中，除基因組含有部分外源序列(目的基因表達(dá)框)外，基因組其他部分以及病毒所有結(jié)構(gòu)蛋白均源于野生型Ad41 (GenBank登錄號 DQ315364)。該野生型Ad41是從Ad41陽性的嬰幼兒病毒性腹瀉的糞 便標(biāo)本中得到的。
由于Ad41是天然的腸道病原，預(yù)計(jì)本發(fā)明產(chǎn)生的重組Ad41病毒 在腸道基因治療和口服重組疫苗研究中有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1是骨架質(zhì)粒pAdbone41構(gòu)建示意圖。圖中Larm:左臂同系 物(left arm homolog );R arm: 右臂同系物(right arm homolog ); ORI:復(fù)制起點(diǎn)(origin of replication); Amp:氨千青霉素抗性的開 方文讀碼框(ampicillin resistance ORF )。骨架質(zhì)粒中，從R arm開始
(含Rarm)至Larm結(jié)束(含L arm )的部分為Ad41基因組序列， 其包括基因組E1B55K編碼區(qū)(CDS )右側(cè)全部序列(含E1B55K CDS 內(nèi)側(cè)3'端46個核苷酸)。
圖2是穿梭質(zhì)粒pSh41-CMV構(gòu)建示意圖。圖中Kan:卡那霉素 抗性的開》文讀碼框(kanamycin resistance ORF ); ITR:反向重復(fù)序列
(the inverted terminal repeat); ES:包裝信號(encapsidation signal); CMV:巨細(xì)胞病毒啟動子(CMV promoter ); MCS:多克隆位點(diǎn)
(multiple cloning site ); pA:多聚腺苦酸加尾信號(polyA signal); L arm, R arm: 左臂或右臂同系物(left or right arm homolog ); ORI: 復(fù)制起點(diǎn)(origin of replication )。
圖3是結(jié)晶紫染色法顯示Ad41在293細(xì)胞和293-E1B包裝細(xì)胞 中形成的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。將293和293-E1B細(xì)胞接種于96孔 板，18~24小時后，按100jil/孔的接種量接種梯度稀釋的Ad41病毒， 繼續(xù)培養(yǎng)6天后，用2%戊二醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色。由圖可見400 倍稀釋的Ad41在293-E1B包裝細(xì)胞中引起CPE的情況與50倍稀釋 Ad41在293細(xì)胞中引起的CPE強(qiáng)度相當(dāng)，說明293-E1B細(xì)胞對Ad41 的敏感性較293細(xì)胞高。
圖4顯示的是重組Ad41-GFP在293-E1B包裝細(xì)胞中的擴(kuò)增以及 用氯化銫密度梯度離心法對其純化。a.用收獲的第9代Ad41-GFP
(P9)感染293-E1B包裝細(xì)胞4天后出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE); b.箭 頭標(biāo)示了氯化銫密度梯度離心后形成的病毒條帶；c,純化的Ad41-GFP的負(fù)染電鏡照片。
圖5顯示的是重組Ad41-GFP感染Hep2細(xì)胞2天(MOI=1000，
以顆粒數(shù)計(jì)算)的情況。a.顯微鏡下觀察；b.流式細(xì)胞儀定量測定。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的骨架質(zhì)粒含有缺失了腺病 毒包裝所需編碼區(qū)E1 (SEQIDNO: 1)的腺病毒Ad41基因組。
在具體實(shí)施方案中，所述骨架質(zhì)粒為pAdbone41，依次含有 pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)(Ori)、氨千青霉素的抗性基因(Amp)和 Ad41基因組ElB55K編碼區(qū)(CDS ) ( SEQ ID NO: 1)下游全部序列 (含E1B55KCDS內(nèi)側(cè)3，端46個核苷酸)，參見圖1。
在具體實(shí)施方案中，骨架質(zhì)粒pAdbone41在Ad41基因組右側(cè)末 端添加有一個限制性內(nèi)切酶Pmel酶切位點(diǎn)(GTTTAAAC )。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的穿梭質(zhì)粒為pSh41-CMV, 依次含有pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)(Ori )、卡那霉素的抗性基因(Kan )、 Ad41基因組左側(cè)反向重復(fù)序列(ITR)、Ad41的包裝信號(ES X ITR-ES 在野生型Ad41 (GenBank登錄號DQ315364)基因組上的片段位置 lnt 361nt)、巨細(xì)胞病毒啟動子(CMV )、多克隆位點(diǎn)(MCS)、猴病 毒40( SV40 )的多聚腺苷酸加尾信號(pA )、用于與骨架質(zhì)粒pAdbone41 發(fā)生同源重組的右臂和左臂(Rarm、 L arm ) ( L arm在野生型Ad41 (GenBank登錄號DQ315364 )基因組上的片段位置 33373nt 34189nt，R arm在野生型Ad41( GenBank登錄號DQ315364 ) 基因組上的片段位置3101nt 3964nt )，參見圖2。
在具體實(shí)施方案中，穿梭質(zhì)粒pSh41-CMV在能夠與骨架質(zhì)粒 pAdbone41發(fā)生同源重組的右臂和左臂(Rarm、 L arm )序列之間含 有一個限制性內(nèi)切酶Pad的識別位點(diǎn)(TTAATTAA),并且在Ad41 基因組左側(cè)反向重復(fù)序列(ITR)左側(cè)末端添加有一個限制性內(nèi)切酶 Pmel的識別位點(diǎn)(GTTTAAAC )。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的包裝細(xì)胞系通過用攜帶有 E1B55K的重組真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后獲得，該包裝細(xì)胞系是在293細(xì)胞基 因組中整合了 Ad41 E1B55K基因并且能夠穩(wěn)定表達(dá)該整合基因。所述 包裝細(xì)胞系中控制Ad41 E1B55K表達(dá)的啟動子為巨細(xì)胞病毒啟動子(CMV)，其mRNA加尾信號為牛生長激素基因的polyA加尾信號 (BGH polyA )。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述包裝細(xì)胞系于2008年6月2日 保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC ) (北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101), 分類命名為人胚腎293細(xì)胞，保藏號為CGMCC No.2534。
以下通過實(shí)施例來對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，本申請的 內(nèi)容不限于以下具體實(shí)施例。
實(shí)施例1、骨架質(zhì)粒pAdbone41的構(gòu)建
1) 含有重組用左臂、右臂(Larm、 Rarm)序列、復(fù)制子和氨 千青霉素抗性基因序列的質(zhì)粒pAM-RLarm構(gòu)建
在標(biāo)準(zhǔn)的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)條件下(50微升體系模板10 納克，引物各30皮摩爾，4種脫氧核苷三磷酸各10納摩爾，高保真 耐熱DNA聚合酶1單位；反應(yīng)條件94攝氏度預(yù)變性2分鐘，94攝 氏度變性30秒，以較引物的解鏈溫度低4攝氏度的溫度退火30秒， 68攝氏度延伸，延伸時間根據(jù)產(chǎn)物的長度按擴(kuò)增800堿基對需1分鐘 計(jì)算，擴(kuò)增30循環(huán)，68攝氏度末端補(bǔ)平5分鐘；以下的PCR擴(kuò)增條 件與此同)，以野生型Ad41基因組(GenBank登錄號DQ315364)為 模板(來源于Ad41陽性的嬰幼兒病毒性腹瀉的糞便標(biāo)本)，用引物 Larm F: gcgg2ttaattaa(TacI)caaaaagctt(HindlII)gttgagagcgccc ( SEQ ID NO : 2 ) 和 引 物 Larm R : ccccglai2￡(BstZ17I)g|||gaS￡(PmeI)catcatcaataatatacc ( SEQ ID NO: 3 ) 擴(kuò)增得到 848bp左臂片段Larm ; 用引物 Rarm F : eccgaattc(EcoRI)gatgttgtcgtgtcttcgcaccgact (SEQ ID NO: 4)和引物 Rarm R: cttttt2ttaattaa(TacI)cccgcat2c(Sphl)atccttcccaac ( SEQ ID NO: 5)擴(kuò)增得到888bp右臂片段Rarm。由于Rarm的3，端與Larm 的5，端有20bp的核苷酸序列相同，將回收的Rarm和Larm片段混 合后作為模板，以Rarm F和Larm R為引物PCR擴(kuò)增得到Rarm與 Larm串聯(lián)的片段RLarm ( 1716bp )。
用EcoRI和BstZ171雙酶切pAdeasy-1質(zhì)粒(美國stratagene戶> 司)，回收較小片段2049bp (GenBank登錄號AY370909;片段位置1622nt 3670nt)，其含有復(fù)制起點(diǎn)和氨千抗性基因；EcoRI和BstZ171 雙酶切RLarm后，將二者連接(連接反應(yīng)條件為IO微升體系，10x 連接緩沖液l微升，2個片段各2微升，1微升T4 DNA連接酶(美 國NEB公司)，IO攝氏度反應(yīng)12小時；后續(xù)的連接反應(yīng)條件與此同)。 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B得質(zhì)粒pAM-RLarm (圖1 )。 2 )重組獲得骨架質(zhì)粒pAdbone41
將pAM-RLarm用HindIII和Sphl雙酶切線性化，與Ad41基因 組DNA共同電轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183菌林(美國Stratagene公司)，篩 選氨千抗性菌落以獲得發(fā)生重組的質(zhì)粒pAdbone41(圖1),用重組的 質(zhì)粒pAdbone41轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，擴(kuò)增并純化得到較大量 pAdbone41質(zhì)粒，保存并將pAdbone41測序。具體操作過程參照 stratagene公司AdEasy腺病毒載體系統(tǒng) <吏用手冊進(jìn)4亍(AdEasy Adenoviral Vector System第21頁Cotransforming the BJ5183 Cells to Produce Recombinant Ad Plasmid; Catalog #240009 )。
實(shí)施例2、穿梭質(zhì)粒pSh41-CMV的構(gòu)建(圖2 ) l)含卡那霉素的抗性基因(Kan)的克隆質(zhì)粒pKan的構(gòu)建 以pShuttle畫CMV (Stratagene公司)為模板，用引物5F070522: gcccggatce ( BamHI) cgagcggtatcagctcactcaaag ( SEQ ID NO: 6 )和 引物5R070522: gccccgcgcgc( BssHII )aaactggaacaacactcaaccctat( SEQ ID NO: 7 )擴(kuò)增得到2483bp片段(參照pShuttle畫CMV序列，version 017005;片段位置4660nt 7122nt)，該片段含有復(fù)制起點(diǎn)和卡那霉素 的抗性基因。使用位于該片段兩端的內(nèi)切酶BamHI和BssHII雙酶切 后回收； 將引物 5F : cgcgcaaggg gaagagctcg gg肌ggggaa ttcggagaagggtatacc ( SEQ ID NO: 8 )和引物5R: gatcggtatacccttctccg aattccccttcccgagctcttccccttg ( SEQ ID NO: 9 )混合后退火得到兩端為 粘端的長約為50bp的雙鏈DNA，該段DNA含有Sacl， EcoRI, BstZl71 酶切位點(diǎn)；上述酶切回收的片段(含復(fù)制起點(diǎn)和卡那霉素抗性基因) 與引物退火形成的約50bp片段連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài) 細(xì)胞得pKan質(zhì)粒。具體轉(zhuǎn)化步驟如下取連接產(chǎn)物5微升，加到100 微升感受態(tài)細(xì)菌中，混勻；冰水浴30分鐘，42攝氏度保溫卯秒，添 加800微升LB液體培養(yǎng)基，以37攝氏度下150轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速振搖60分鐘；將菌液涂布到含卡那霉素的LB瓊脂平板上，37攝氏度下培 養(yǎng)12-18小時，挑取單菌落，培養(yǎng)細(xì)菌提取質(zhì)粒。
2) 含Ad41包裝信號(ES)、 CMV啟動子、多克隆位點(diǎn)(MCS ) 和SV40polyA加尾信號(pA )的質(zhì)粒pKan-ES-CMV的構(gòu)建
以野生型Ad41基因組為模板(來源于Ad41陽性的嬰幼兒病毒性 腹竭的糞{更標(biāo)本)，用引物6F: ccccgcgcgc ( BssHII) gtttaaac ( Pmel) catcatcaataa tataccttaaag ( SEQ ID NO: 10)和引物6R: ccccgagctc
(Sacl) gtggcagtgccacgtagggaaac ( SEQ ID NO: 11)擴(kuò)增得到388bp 片段ITR-ES，其中含有Ad41左端反向重復(fù)序列(ITR)和包裝信號
(ES);用BssHII和SacI雙酶切該片段及pKan，連接后得pKan-ES 質(zhì)粒。
以pShuttle國CMV為模板，用引物7F: ccccgagctc (Sacl) taatagtaatcaattacggggtcat (SEQ ID NO: 12)和引物7R: ccccgaattc (EcoRI)taagatacattgatgagtttggaca ( SEQ ID NO: 13 )擴(kuò)增得到913bp 片段CMVpA (參照pShuttle-CMV序列，version 017005;片段位置 346nt 1238nt)，該片段含有CMV啟動子、多克隆位點(diǎn)(MCS)和 SV40polyA加尾信號；用Sacl和EcoRI雙酶切PCR產(chǎn)物和pKan后 連接，得pKan-CMVpA質(zhì)粒。
用Sacl和EcoRI雙酶切pKan-CMVpA,回收約卯3bp片段 (CMVpA)，連接到pKan-ES質(zhì)粒的Sacl和EcoRI位點(diǎn)間，得 pKan-ES-CMV質(zhì)粒。
3) 克隆得到穿梭質(zhì)粒pSh41-CMV
用EcoRI和BstZ171雙酶切pAM-RLarm并回收1705bp片段 (RLarm )，連接到pKan-ES-CMV的EcoRI和BstZ171切點(diǎn)間，即 得pSh41-CMV，其多克隆位點(diǎn)含有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)BglII、 Kpnl、 Sall、 Notl、 XhoI和EcoRV。
實(shí)施例3、包裝細(xì)胞系293-E1B的構(gòu)建 l)Ad41 E1B55K基因的克隆
以Ad41陽性的嬰幼兒病毒性腹瀉的糞便標(biāo)本DNA為模板，利用 PCR擴(kuò)增E1B55K基因，反應(yīng)條件與前同。所用引物為8F: gcccaagctt (HindIII )atggagcgcccaaacccatctg( SEQ ID NO: 14 )和8R: gccctctaga
10(Xbal) tacccttaatcctcatcgctggattc ( SEQ ID NO: 15),擴(kuò)增包含 E1B55K完整CDS的片段。將擴(kuò)增片段連接到T載體(pMD-18T， TAKARA公司)，測序證實(shí)序列無誤后(測序在北京奧科生物4支術(shù)公 司進(jìn)行)，用Hindlll和Xbal雙酶切，連接到pcDNA3質(zhì)粒(Invitrogen ) 的酶切位點(diǎn)Hindlll和Xbal之間，得到真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3國ElB55K。
2)基因轉(zhuǎn)染及細(xì)胞系的篩選
用脂質(zhì)體(lipofectamine 2000 ， Invitrogen ) 包裹質(zhì)粒 pcDNA3-ElB55K并轉(zhuǎn)染293細(xì)胞(具體操作按照Invitrogen公司 lipofectamine2000產(chǎn)品說明書進(jìn)行)，用800fig/ml G418 (Roche)篩選 2~3周后挑取單克隆(293-ElB，)，擴(kuò)增后，用RT-PCR的方法檢測 E1B55K的表達(dá)，保留E1B55K表達(dá)陽性的克隆，使用完全CPE法檢 測其擴(kuò)增Ad41腺病毒的能力(詳細(xì)篩選鑒定過程參照文獻(xiàn)進(jìn)行韓 炳娟，郭麗，屈建國，王敏，王健偉，魯茁壯，洪濤.轉(zhuǎn)染E1B55K 基因提高Hep2細(xì)胞包裝腸腺病毒Ad41的能力.病毒學(xué)報.2007， 23(4):258-264 )。
以2 x 1(^細(xì)胞/孔的接種密度將293和293-ElB，的單克隆細(xì)胞接種 于96孔板，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)18~24小時；將含 有Ad41陽性的嬰幼兒病毒性腹瀉的糞便標(biāo)本上清，用PBS稀釋，過 濾除菌后，用含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行2倍的梯度稀釋，將稀 釋好的各梯度以100 ja 1/孔的接種量分別接種293和293-ElB，單克隆細(xì) 胞；繼續(xù)培養(yǎng)6~9天后，直接加入2%戊二醛固定液(PBS配制)100 lil/孔，固定0.5~2小時，吸棄固定液，用蒸餾水沖洗3次后，加入 0.1%結(jié)晶紫水溶液50pl/孔，染色30min，再用蒸餾水沖洗3次后晾 干，棵眼觀察CPE的強(qiáng)弱，得到一林能引起較強(qiáng)CPE的單克隆 293-ElB，細(xì)胞。達(dá)到相同的CPE的強(qiáng)度時，其病毒接種量約為對照293 細(xì)胞的1/8(圖3)。該單克隆的編號為12號，將其重新命名為293-E1B, 于2008年6月2日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心 (CGMCC ),保藏號為CGMCC No.2534。
實(shí)施例4、攜帶GFP報告基因的重組腺病毒Ad41-GFP的制備 本實(shí)施例以"攜帶GFP報告基因的重組腺病毒Ad41-GFP的制備" 的為例，具體表述制備攜帶目的基因的重組Ad41病毒的制備過程。利用本載體系統(tǒng)能夠制備由CMV啟動子控制目的基因表達(dá)的重 組Ad41腺病毒。將目的基因編碼區(qū)克隆到穿梭質(zhì)粒pSh41-CMV的多 克隆位點(diǎn)處。攜帶目的基因的穿梭質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶PacI酶切線性 化后，與骨架質(zhì)粒pAdbone41共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183菌林，在BJ5183 細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過同源重組得到攜帶目的基因的腺病毒質(zhì)粒。該質(zhì)粒經(jīng)限制 性內(nèi)切酶PmeI酶切，釋放重組腺病毒基因組，利用DNA轉(zhuǎn)染方法將 重組腺病毒基因組轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293-E1B,在包裝細(xì)胞內(nèi)拯救得到攜 帶目的基因的重組Ad41腺病毒。起始得到的少量重組病毒可以進(jìn)一 步用包裝細(xì)胞擴(kuò)增，制備大量的重組病毒。
1)GFP基因的克隆及腺病毒質(zhì)粒pAd41-GFP的制備 以pLEGFP國Cl (BDCLONTECH公司)為模板，以9F: ggccagatct (BglII) gctaccggtcgccaccatggtgag ( SEQ ID NO: 16 )和9R: gccgtcgac (Sail) ttagagtccggacttgtacagctcgt ( SEQ ID NO: 17 )為引物，擴(kuò)增 得到764bp片段(參照Clontech公司提供的序列，文件編號PT3232-5; 片段在原pLEGFP-Cl質(zhì)粒上的位置3058 nt~ 3799 nt )，用BglII、 Sail雙酶切后，連接到穿梭質(zhì)粒pSh41-CMV的BglII、 Sail酶切位點(diǎn) 之間，得到pSh41-GFP。將pSh41-GFP用Pad線性化后，與骨架質(zhì) 粒pAdbone41共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183菌林(美國Stratagene公司)，經(jīng) 卡那霉素篩選得到重組腺病毒質(zhì)粒pAd41-GFP。具體操作過程參照 stratagene公司AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)4吏用手冊進(jìn)4亍(AdEasy Adenoviral Vector System第21頁Cotransforming the BJ5183 Cells to Produce Recombinant Ad Plasmid; Catalog #240009 )。
2 )重組腺病毒Ad41-GFP的拯救
將pAd41-GFP使用Pmel線性化后，轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系293-E1B, 培養(yǎng)3-5天，去除部分培養(yǎng)基，收獲細(xì)胞，凍融裂解3次，離心后用 上清(P0代)再次感染293-E1B細(xì)胞，隨著盲傳代數(shù)的增加，GFP+ 細(xì)胞逐漸增多，P7代病毒上清使得培養(yǎng)的293-E1B產(chǎn)生完全CPE， 說明病毒得到擴(kuò)增(圖4a)。具體操作過程參照stratagene公司AdEasy 腺病毒載體系統(tǒng)使用手冊進(jìn)行(AdEasy Adenoviral Vector System第 27頁P(yáng)reparation of Primary Adenovirus Stock with Recombinant Ad Plasmid; Catalog #240009 )。
3 )重組腺病毒Ad41-GFP的制備和純化繼續(xù)用293-E1B細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)病毒，傳至Pll代，能獲得約20 個培養(yǎng)皿(150cm2)由293-E1B細(xì)胞產(chǎn)生的病毒上清，氯化銫密度梯 度離心，可見病毒富集成單一線性條帶，收獲病毒，透析后保存于5% 甘油Hanks液中(圖4b和c)。氯化銫密度梯度離心的具體過程參加 手冊(Ng P， Graham FL Construction of first-generation adenoviral vectors, gene therapy protocols, 2nd Edition, Edited by Morgan JR. Humana Press Inc.)。
4 ) Ad41-GFP滴度測定及對Hep2細(xì)胞的感染
用293細(xì)胞以2 x 104細(xì)胞/孔的接種密度接種96孔板，培養(yǎng)18 ~ 24小時，對純化的重組腺病毒Ad41-GFP進(jìn)行10倍的梯度稀釋，吸 棄96孔板中細(xì)胞的原培養(yǎng)基，加入病毒稀釋液100yl/孔，培養(yǎng)2天 后，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)每孔GFP+細(xì)胞數(shù)，以同一稀釋度下各孔平均 GFP+細(xì)胞數(shù)除以0.1ml/孔，再乘以該列孔所加病毒液的稀釋倍數(shù)，即 得病毒原液的滴度。以這種有限稀釋法測定批號為071116的純化 Ad41畫GFP的感染滴度為2.4 x 109IU/ml (infection units per milliliter)。
通過測定病毒基因組含量計(jì)算病毒顆粒數(shù)滴度。將純化病毒與等 量的2x裂解液(20mMEDTA、 1%SDS、 0.8mg/ml蛋白酶K)混合， 50度下保溫3小時，取5微升裂解液加樣到不含溴化乙啶(EB)的 0.7%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳完畢后再用EB染色，紫外燈下照相記 錄電泳結(jié)果，根據(jù)病毒基因組條帶與內(nèi)參DNA條帶的灰度，計(jì)算病毒 基因組的含量，根據(jù)基因組的分子量換算為摩爾數(shù)， 一個完整病毒粒 子含有一個病毒基因組，得到病毒的顆粒數(shù)滴度。批號為071116的純 化Ad41-GFP的顆粒數(shù)滴度為2.4 xl011 vp/ml (Viral particle per milliliter )。
Ad41-GFP感染H印2細(xì)胞的情況如圖5所示。用1000 MOI (以 顆粒數(shù)計(jì)算)的Ad41-GFP感染Hep2細(xì)胞，2天后，在熒光顯微鏡下 照相，用胰酶消化細(xì)胞并且用流式細(xì)胞儀測定GFP+細(xì)胞含量為 72.3%。序列表
〈110>中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 〈120〉 復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad41載體系統(tǒng)及其應(yīng)用 <130> CP1080242 <160> 17
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 1422
<212> DNA
<213> 人類
<220〉
<221> Ad41 E1B55K CDS <222>(1). (1422)
<400> 1
atggagcgcc caaacccatc tgtcggaggg gtatactctg gattacatga caatggccct 60
gtggagaacc ctgctgcgga ggaagagggt cttaggttgc tcgccggcgc agcctccgca 120
cggtctggat ccagtgcggg aggaggagga ggaggaggag gaggaggagg agaacctgag 180
ggccggtctg gatcctcaaa cggaattgta actgaacctg accccgaaga gggtactagc 240agtgggcaaa ggggggagaa aaggaagtU gaaa"gacg gggcgg"tt tcU^ggag 300
ttaaccttga gtttaatgtc tcgttgttat cctgagtctg tctggtgggc tgatttggaa 360
gatgagttta aaaatggaaa catgaatctt ttatacaagt atggatttga acagctgaaa 420
acacattgga tggagccttg ggaggactgg gaactagctt tgaaUtgtt tgccaaagtg 480
gctcttcgcc cagacactat ttataccatt aagaaaactg ttaatatacg taaatgtgcc 540
tatgtaattg gaaatggagc cgtggttaga ttccaaacct ttgaccgggt ggtttttaac 600
tgtgcaatgc agagtttagg tcctggggtg attggtatga gcggggtaac atttaataat 660
gtcagatttg cagcagatgg atttaatggc aaggtgtttg cttctaccac tcaattaact 720
ttgcatggtg tgttttttca aaattgcagc ggtgtttgcg tggattcctg gggtagggtg 780
tctgccagag gttgUcgtt tgtgggatgt tggaaagggc tggtggggca aaacaagagc 840
caaatgtctg taaaaaaatg tgtgtttgaa cgatgcattt tggctatggt ggtagaaggc 900
caggcgcgaa ttcgacataa tgcgggttcc gaaaatgtgt gctttttact gctgaaggga 960
actgccagtg ttaagcataa tatgatttgt ggcactggtc actctcagct gctaacttgc 1020
gcagatggaa actgtcagac tctaeiaagtg attcatgtgg tttcccatca gcgccgcccc 1080
tggcctgttt ttgagcataa catgcttatg cgttgtacca tgcatttggg ggctcgtcgt 1140
ggcatgtttt ctccatatca gagtaatttt tgccatacta aagttttaat ggaaactgat 1200gctttttcgc gggtgtggtg gagcggggtg tttgatttga ccatagagct gtataaagtg 1260
gtgagatatg "gagttaaa ggctcgttgt cgcccctgtg agtgtggagc caatcacatc 1320
aggttatatc cagcaactct gaacgtgacg gagcagctgc gcacggacca tcagatgttg 1380
tcgtgtcttc gcaccgacta cgaatccagc gatgaggatt 1422
<210> 2
<211> 36
<212> DM <213>人工序列
<400〉 2
gcgggttaat taacaaaaag cttgttgaga gcgccc 36
<210> 3
<211> 36
<212> 畫
<213> 人工序列
<400> 3
ccccgtatsc gtttaaacca tc"caataa tatscc 36
<210> 4
<211> 35
<212〉 DM
<213> 人工序列<400> 4
cccgaattcg "gttgtcgt gtcttcgcac cgact 35
<210> 5
<211> 36
<212> DNA <213>人工序列
<400> 5
ctttttgtta attaacccgc atgcatcctt cccaac 36
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcccggatcc cgagcggtat cagctcactc aaag 34
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gccccgcgcg caaactggaa caacactcaa ccctat 36 <210〉 8<211> 48 <212> 腿 <213〉 人工序列
<400> 8
cgcgcaaggg gaagagctcg ggaaggggaa ttcggagaag ggtatacc 48
<210> 9
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gatcggtata cccttctccg aattcccctt cccgagctct tccccttg 48
<210> 10
<211〉 42
<212> ■
<213> 人工序列
<400> 10
ccccgcgcgc gtttaaacca tcatcaataa tataccttaa ag 42
<210> 11
<211〉 33
<212〉 DNA
<213> 人工序列
<400> 11ccccgagctc gtggcEigtgc cacgtaggga aac 33
<210〉 12
<211> 35
<212> DM
<213> 人工序列
<權(quán)> 12
ccccgagctc taatagtaat caattacggg gtcat 35
<210> 13
<211> 35
<212> ■
<213> 人工序列
<權(quán)> 13
ccccgaattc taagatacat tgatgagttt ggaca 35
<210> 14
<211> 32
<212> DM
<213> 人工序列
<權(quán)> 14
gcccaagctt atggagcgcc caaacccatc tg 32
<210> 15 <211〉 36
19<212〉 DM
<213> 人工序列
<400> 15
gccctctaga tacccttaat cctcatcgct ggattc 36
<210> 16
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ggccagatct gctaccggtc gccaccatgg tgag
<210> 17
<211> 35
<212> ■
<213> 人工序列
<400> 17
gccgtcgact tagagtccgg acttgtacag ctcgt
34
3權(quán)利要求
1.一種復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad41載體系統(tǒng)，包括一個骨架質(zhì)粒、一個穿梭質(zhì)粒和一個包裝細(xì)胞系，其中所述骨架質(zhì)粒含有缺失了腺病毒包裝所需基因編碼區(qū)的腺病毒Ad41基因組；其中所述穿梭質(zhì)粒含有用于插入目的基因的多克隆位點(diǎn)以及用于與骨架質(zhì)粒發(fā)生同源重組的腺病毒Ad41基因組片段；其中所述包裝細(xì)胞系在細(xì)胞基因組中整合了所述腺病毒Ad41包裝所需基因并能穩(wěn)定表達(dá)該包裝基因。
2. 權(quán)利要求1所述的復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad41載體系統(tǒng)，其 中所述腺病毒包裝所需基因?yàn)镋l區(qū)基因(SEQIDNO: 1)。
3. 權(quán)利要求2所述的復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad41載體系統(tǒng)，其 中所述骨架質(zhì)粒為pAdbone41,所述骨架質(zhì)粒pAdbone41依次含有 pBR322的復(fù)制起點(diǎn)、氨爺青霉素抗性基因以及Ad41基因組E1B55K 編碼區(qū)下游全部序列，包括E1B55KCDS內(nèi)側(cè)3，端46個核苷酸。
4. 權(quán)利要求3所述的復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad41載體系統(tǒng)，其 中所述穿梭質(zhì)粒為pSh41-CMV,所述穿梭質(zhì)粒pSh41-CMV依次含有 pBR322的復(fù)制起點(diǎn)、卡那霉素抗性基因、巨細(xì)胞病毒啟動子、多克隆 位點(diǎn)、猴病毒40的多聚腺苷酸加尾信號和用于與骨架質(zhì)粒pAdbone41 發(fā)生同源重組的左臂和右臂。
5. 權(quán)利要求l-4任一項(xiàng)的復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad41載體系統(tǒng)， 其中所述包裝細(xì)胞系為在293細(xì)胞基因組中整合有Ad41 E1B55K基 因并且能夠穩(wěn)定表達(dá)該E1B55K基因，控制Ad41 E1B55K表達(dá)的啟動 子為巨細(xì)胞病毒啟動子，其mRNA加尾信號為牛生長激素基因的 polyA加尾信號。
6. 權(quán)利要求5所述的復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad41載體系統(tǒng)，其 中所述骨架質(zhì)粒pAdbone41中，在Ad41基因組右側(cè)末端添加有一個 限制性內(nèi)切酶Pmel酶切位點(diǎn)GTTTAAAC。
7. 權(quán)利要求6所述的復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad41載體系統(tǒng)，其 中所述穿梭質(zhì)粒pSh41-CMV中，在能夠與骨架質(zhì)粒pAdbone41發(fā)生 同源重組的右臂和左臂序列之間含有一個限制性內(nèi)切酶Pacl的識別 位點(diǎn)TTAATTAA，并且在Ad41基因組左側(cè)反向重復(fù)序列左側(cè)末端添加有一個限制性內(nèi)切酶Pmel的識別位點(diǎn)GTTTAAAC。
8. 權(quán)利要求7所述的復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad41載體系統(tǒng)，其 中所述包裝細(xì)胞系的保藏號為CGMCC No.2534。
9. 權(quán)利要求l-4任一項(xiàng)的載體系統(tǒng)用于制備重組腺病毒的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因治療和重組疫苗領(lǐng)域中一種復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad41載體系統(tǒng)及其應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明提供的載體系統(tǒng)包括1個骨架質(zhì)粒、1個穿梭質(zhì)粒和1個包裝細(xì)胞系，其中所述骨架質(zhì)粒含有缺失了腺病毒包裝所需編碼區(qū)的腺病毒Ad41基因組，所述穿梭質(zhì)粒含有用于插入目的基因的多克隆位點(diǎn)以及用于與骨架質(zhì)粒發(fā)生同源重組的腺病毒Ad41基因組片段，所述包裝細(xì)胞系在細(xì)胞基因組中整合了所述腺病毒Ad41包裝所需基因并能穩(wěn)定表達(dá)該包裝基因。本發(fā)明產(chǎn)生的重組Ad41病毒在腸道基因治療和口服重組疫苗研究中有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/861GK101619324SQ20081012685
公開日2010年1月6日 申請日期2008年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月1日
發(fā)明者屈建國, 濤 洪, 魯茁壯 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所