專利名稱：由植物制備新型磷酸二酯酶的制作方法
由植物制備新型磷酸二酯酶
本發(fā)明涉及一種通過對酵母進(jìn)行酶處理以制備香料改良劑的方法、所制 得的香料改良劑及其用途。
市售的酵母提取物為粉末狀或糊狀，酵母提取物作為調(diào)味劑，被廣泛地應(yīng)
用于農(nóng)產(chǎn)加工食品X^lk中。
酵母提取物為酵母的可溶解部分的f織物， 一般M3！自解或水解而得到。 自解為M活化酵母的實(shí)際糊顆每(蛋白酶)，來破壞酵母的細(xì)胞質(zhì)膜，使
得細(xì)胞內(nèi)化合物溶解。
酵母提取物也可以用試劑或外加酶艦水解獲得，，使得細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)以高度
,率的形式釋放出來。
天然調(diào)味劑，是酵母提取物在農(nóng)產(chǎn)加工食品工業(yè)中廣泛使用的名稱。 和其它具有同等香味強(qiáng)度的調(diào)味劑(非天然的)相比較，天然調(diào)味劑也具
有一定的經(jīng)濟(jì)競爭能力。
酵母的這些酶處理方法在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的。
酵母經(jīng)受其自身內(nèi)在酶的作用下,軍制備的自解物，作為食品添加劑眾所周知。
自解可如此引發(fā)將酵母細(xì)胞置于高溫中孵育、加入有機(jī)^FU，使用濃度
逐薦形曾大的NaCl溶液，以^Jl^各種方法的組合。
在自解過程中，主要的轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍踪|(zhì)糊軍為肽和 酸。 所獲得的自解產(chǎn)物也不可避免地具有一些苦味和典型的表示^^^鉱自
解的另一不足是，自解產(chǎn)物中主要僅含有3'-核糖核苷酸，因?yàn)閮?nèi)在的核糖核酸
酶將細(xì)胞內(nèi)的RNA轉(zhuǎn)化為3'-核糖核苷酸，使得自解產(chǎn)物就調(diào)味劑而言沒有作用。
在Quest International B.V的歐洲專利EP0354610B1中，教導(dǎo)了一種制備酵 母提取物的方法。其中，首先，在厭氧條件下，細(xì)胞壁在外在蛋白水解酶的作 用下破裂；隨后，在有氧^#下，RNA在外加酶作用下,軍。這種方法能夠獲 得含有大量5、-核苷酸的自解產(chǎn)物。在酵母自解產(chǎn)物中，已知味道的化合物包 旗基酸、肽、核酸如5'-核苷酸、 糖類和有機(jī)酸。戶服5、-核苷酸的含量對P雜和調(diào)味非常重要。這種核酸l細(xì)作
制備調(diào)味食品的原料，例如5'-肌苷酸(5'-MP)、 5'-鳥苷酸(5、-GMP)，但也發(fā) 現(xiàn)其在藥物產(chǎn)品中的應(yīng)用。
鮮味(uanmi taste)是與甜、咸、苦和酸湘啲第五種基礎(chǔ)味道。具有顯著 增強(qiáng)味道的能力的5:核苷酸會她產(chǎn)生鮮味，因此增強(qiáng)天然存在于酵母提取物中 的谷氨鵬內(nèi)(MSG)的作用。
生成5:核苷酸，需要未加工的RNA在非常特殊的^~~5'-磷酸二酯酶 (5、-PDE)作用下進(jìn)行水解。Cohn和VoMi (1953)首次在蛇的毒液中發(fā)現(xiàn)了 5、-磷酸二酯酶的存在。盡管這種5、-磷酸二酯酶有很高的效率，但是由于A^f周 知的原因，它不能在農(nóng)產(chǎn)加工食品中使用。
5'-PDE的其它主要來源包括如桔青霉菌(Penicilliumcitrinum)的一些真菌 類和如金黃鏈霉菌(Streptomyces aureus)的一些放線菌(Actinomyces)類。
實(shí)際上，從桔青霉菌(Penicilliumcitrinum)獲得的5:PDE由 Amano Enzyme 市售，其商品名為NucleaseRP-1G (或者EC3丄30.1)。因?yàn)榉浅８叩纳a(chǎn)成本， 使得這種5'-PDE主要以固定的形，于工業(yè)中。將這種5:PDE用于生產(chǎn)富含 5、-核苷酸的酵母提取物，增加非常高的額》卜酶成本。
Schuster (1957)證實(shí)了 5、-PDE活性存在于一些植物胚芽中。隨后大量的 研究成為專利申請的主題，其介紹了從麥芽幼根(麥芽指大麥芽)提取物中產(chǎn) 生富含5'-核苷酸的酵母提取物的方法。麥芽是啤酒產(chǎn)業(yè)的副產(chǎn)品，因此可代表 育,從酵母RNA中獲得5'-核苷酸產(chǎn)品的酶的價(jià)棘源。在這種情況下，通過 蒸煮含有穩(wěn)定齊鵬昔麟辛的麥芽根粉末7K溶液，就能獲得5、-PDE，將此種方法獲 得的5:PDE用于生產(chǎn)富含5、-核苷酸的酵母提取物，所增加的額，成本很少。
例如在US-A4 810 509、 EP-A-0299078、 FR 75 08446，以及G Reed和 .T.WNagodawithana所編著的"酵母技術(shù)"(Yeast Technology),第2版(Van NostrandReinhold,ISBN0"442-31892-8)， 382-385頁中，都描述以大麥芽作為酶 的來源，進(jìn)而生產(chǎn)富含5:核苷酸的酵母衍生物的方法。
一個(gè)主要問題是，從麥芽或大麥芽中獲得的5、-PDE會g夠引起過敏反應(yīng)。這 是因?yàn)楫a(chǎn)生酶的原料中，這種情況下大麥含有大麥醇溶蛋白，其是一種和小麥 醇溶蛋白相對以的麟谷蛋白，具有引微敏的特性，能夠弓胞不耐受癥狀(如，雄撒celiac desease)。實(shí)際上，在2000/13/EC和2003/89/EC修訂版的EC指 令中，大麥被列入到含有谷蛋白的谷物。因此，據(jù)此指令，其為"過敏源"指 令，含有大麥或者大麥衍生物的產(chǎn)品，需要標(biāo)明。
這些蛋白質(zhì)的主要特性是，不論是在胃的酸性環(huán)境中，還是在腸道消化酶 作用下，都不會分解。這些蛋白質(zhì)保持完整地被腸道吸收，因此能引起免疫反 應(yīng)。至于辦撒其是弓胞體內(nèi)反應(yīng)的醇溶谷蛋白分解所致。所有這些醇溶谷 蛋白質(zhì)對空腹的人都有毒副作用，因?yàn)槠浞纸庖饛?qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，破壞小腸 表面的細(xì)胞，導(dǎo)致小腸吸收如蛋白質(zhì)、月旨肪、碳水化合物、維他命和礦物質(zhì)等 營養(yǎng)成分的能力減弱。過敏伴隨的腸胃癥狀為胃痛、脹氣、慢性腹灣。由此 還會導(dǎo)致對一些營養(yǎng)物質(zhì)(鐵、鈣、葉酸)的吸收能力減弱，進(jìn)而引發(fā)營養(yǎng)不 良(貧血、體重下降)、疲憊、骨痛、肌肉抽搐和應(yīng)激性。
如果能從大麥醇溶蛋白中成功分離出酶，這將是由大麥芽純化制得PDE的 另 一方式。然而，由Ai-Yu Wang等((1993 ) Biochemistry and Molecular Biologe Internatioanl,1095-1102,vol.29,No.6)和Beluhan等((2003) Biotechnology Letters 25,1099-1103)發(fā)表的研究都只關(guān)注由大麥芽制得的純化PDE的特性，而并沒 有考慮在制備過程中大麥醇溶蛋白的存在。這種純化的成本較高，而且沒有分 析數(shù)據(jù)證實(shí)在酶制備中去除了谷蛋白，但是臨床數(shù)據(jù)表明，由此制得的酶并沒 有導(dǎo)致過敏現(xiàn)象。
第二個(gè)可選擇的方式包括，用微生物源的5、-PDE，微生物有如桔青霉菌 (Penicillium citrinum)或黑曲霉菌(Aspergillus niger)等的絲狀真菌、如放線 菌(Actinomyces)或鏈霉菌鏈霉菌(Streptomyces)等的細(xì)菌。然而，這種較長
的發(fā)展涉及菌株改進(jìn)階段。另外，這種方式需要lik發(fā),凈化的廠房，以及最 終所獲得的酶的成本很高較的過程，因此。
第三種方式，是將植物5:PDE克隆到工業(yè)微生物中。這種方式已經(jīng)得到申 請人研究團(tuán)隊(duì)評估。但是，除了編碼酶的序列是未知的外，還將得到基因改造 生物(GMO)衍生的一種酶，這種產(chǎn)品也不被各個(gè)^fOT者看好。
因此，目前未解決的問題包括，找到一種沒有谷蛋白的食用酶，并且這種 酶沒有與現(xiàn)在市場上的可獲得的商品酶一樣的經(jīng)濟(jì)上的劣勢。同時(shí)，在加工過 程中不用,RNA片段或者核苷酸的核酸酶或磷酸酶，而導(dǎo)致不具有增強(qiáng)i]a 能力的卩絲軍產(chǎn)物。也不能在食用中產(chǎn)生能察覺到的不適宜的味道或調(diào)味特性。申請人岡,J發(fā)現(xiàn)，特別意料不到和令人驚奇的表明，在制備富含5'-核苷酸 的酵母提取物時(shí)，高梁芽完全能夠取代具有令人過敏的大麥芽。更重要的是，
根據(jù)C2003/89/EC指令，高梁未l妙ij入含有谷蛋白的谷物，因此，它也不具有 象谷蛋白一樣的令A(yù)31敏的性質(zhì)。
申請人發(fā)明了從高梁胚芽和高梁芽幼根的混合物中酶制備5'-PDE的方法。 更具體地說，這種高梁5、-PDE通過蒸煮高梁芽幼根的方式獲得。因此，高 梁芽幼根粉末的粒徑為20-200(Vm，優(yōu)選為100-200|im，粉末被懸浮于醋酸 鋅或者等同試劑的水溶液中，也就是說，具有相同的能夠起到穩(wěn)定 5'-PDE作用的試劑。該懸浮液在50-80t:下，培育30min到4h，并最好 加以攪拌。舉例來說，高梁芽幼根粉末所使用的比例為5-20%(w/w)，優(yōu) 選為10-15%，最優(yōu)選為13%;醋酸鋅溶液濃度優(yōu)選為0.2-5g/l。在一個(gè) 實(shí)施例中，用含有高梁芽幼根的高粱芽。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，回收 溶液中的可溶部分，如通過離心瓶分離制劑，然后將上清液在澄清瓶中 澄清。。
由此所制得的高梁5、-PDE制抓能l細(xì)來制造無谷蛋白的富含5'-核苷 酸的組合物，或者富含5、-核苷酸的酵母提取物。
因此，本發(fā)明涉及一種制備高梁5'-PDE的方法，該方、 飽括蒸煮醋f教辛 水溶液(0.2-5g/l)中的高梁芽幼根，溫度為50-80。C，時(shí)間為30min到4h， 并除去不溶解的部分。還可以包括一個(gè)濃縮的步驟。
本發(fā)明涉及一種由Ji^方法戶顧幌的高梁5'-PDE審擠U，及其分解RNA的 應(yīng)用，具體來說，用于帝恪富含5'-核苷酸的組合物，較佳為酵母提取物，戶腿 組合物中無谷蛋白。本發(fā)明還涉及從高梁芽中提取的5'-PDE的應(yīng)用，其用來增 加5、-核苷酸中的含有RNA組合物。因此，本發(fā)明還涉及一種制備無谷蛋白且 富含5、-核苷酸的組合物，尤其是酵母提取物的方法，其包 Silil處理微生物的 細(xì)胞，將RNA釋放到細(xì)胞外介質(zhì)中，然后處SA高梁5'-PDE得到的懸浮液， 使得RNA釋放出5:核苷酸；能夠4頓該方法的其他微生物舉例來說有如曲霉 菌的絲狀真菌(filamentours&ngus)、木霉菌類(Trichodermatype)、或者細(xì)菌， i^t為乳桿菌類(the genus Lactobacillus)的乳酸菌。該方法還可以包括一個(gè)中 間步驟，即完全或部分i魁屯化RNA (參見JP51106791)。
在一個(gè)ttit實(shí)施例中，其包括用高梁5'-PDE制劑處理酵母提取物或者酵母懸浮液的步驟。
因此，本發(fā)明更具體地涉及中帝恪富含5'-PDE且無谷蛋白的酵母提取物的 方法，其包括
-加熱酵母懸浮液；
-用5、-PDE處理酵職浮液；
-從懸浮液中分離出不溶物；和
-回收酵母提取物；
其特征在于，戶腿5、-PDE是從高梁中提取的，^/人高梁芽，更{雌從高 粱芽幼根中提取(malted sorghum rootlets )。
本發(fā)明中所用的酵母是可食用酵母。根據(jù)本發(fā)明，用來制皿取物的酵母 優(yōu)選為酵母菌類(Saccharomyces)，更優(yōu)選為釀酒酵母類(Saccharomyces cerevisiae)，包括Saccharomyces carlsbergensis。 ^f^酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酵母細(xì)胞在用于制造啤酒時(shí)也被叫做Saccharomyces carlsbergensis。 根據(jù)N丄W.Kreger van Rij所出版的"THE YEASTS， a taxonomic study" 1984第3 版中(另一方面，根據(jù)該手冊1998年第4版中，Saccharomyces carlsbergensis 有兩個(gè)同義字，為Saccharomyces cerevisiae禾口 Saccharomyces pastorianus,在本 發(fā)明中引用的是1984年第3版中的內(nèi)容)，確切的分類命名應(yīng)為Saccharomyces cerevisiae。而且，酵母還可以源自假絲酵母類(Candida,如C.utilis)、畢赤酵母 類(pichia)、漢遜酵母類(Hansenula)、克魯維酵母菌類(Kluyveromyces,如 K.lactis,K.marxanius或ICfragilis)、圓酵母(Torula)、鐮刀酶(Fusarium)、發(fā)酵 單胞菌(Zymonomas)等。酵母還可以來源自新鮮酵母培養(yǎng)、或者被用在酉隨 工藝中的酵母。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所使用的酵母源自酵母菌類 (Saccharomyces)、假絲酵母類(Candida)或者克魯維酵母菌類(Kluyveromyces)。
要選擇具有高RNA含量的酵母，在一個(gè)具體實(shí)施例中，RNA的質(zhì)量含量 為干重的6-15%。
酵母可以進(jìn)行初步處理以增加其中的RNA含量，這種處理在US3，909,352 和JP 11-196856中描述，其為酵母的突變和選擇；JP 5-176757中為在培育培養(yǎng)
基中4OT限量的硫,。
可以通^:添加由微生物中得到的RNA，來增加酵，浮液中RNA的含量, 這種微生物能夠用于人類食品或動(dòng)物飼料。這樣的微生物的實(shí)施例有如曲霉菌(Aspergillus)的絲狀真菌、木霉菌類(Trichoderma)、或細(xì)菌，伏選為乳桿菌 類的乳酸菌。在這種情況下，戶;M微生物經(jīng)處理以釋放出其中的RNA。在一個(gè) 具體實(shí)施例中，可以通過已知的方法完全或部分i魁屯化RNA (超濾、層析或沉 淀法)。
制備酵母提取物的方法是所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。以下專利中都列舉了 相應(yīng)的方法EP249435、 EP299078、 EP354610、 EP466922、 EP1 199353、 EP 1479 299、 US 3,961,080、 US 4,303,680、 US 4,810,509。上述方法中通常包括 的步驟有加熱酵"W;浮液、任選步驟酵母的自解和/或水解、,的步驟為從
懸浮液中分離不溶物。戶脫酵蹄浮液是有活酵蹄浮液。
雌地，酵職浮液被進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)壁分離，以鈍化包括磷酸酶和核酸酶在
內(nèi)的酵母酶的活性；滲透酵母以使其釋放出細(xì)胞內(nèi)容和RNA，較佳在細(xì)胞外介 質(zhì)中選擇性地溶解RNA，最后可得到的5'-核苷齢量大于酵職浮液中RNA 含量。f，地，所述酵，浮液包括干重的10-25%。在一較佳實(shí)施例中，所述 酵母懸浮液在5-95。C的溫度范圍內(nèi)加熱5min到3h。具體來說，所述懸浮 液在75"下被加熱2h，然后冷卻至60°C 。
可以使用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它技術(shù)來釋放酵母的細(xì)胞內(nèi) 容，例如機(jī)械處理(如弗氏壓碎器French press、玻璃珠glass beads、脈 沖電磁等類似方法)、化學(xué)處理(酸、堿、鹽、溶劑、去污劑等類似方 法)、或者酶處理(P-葡聚糖酶、殼多糖酶、蛋白酶等類似物)。
而且，戶;M方法還包括酶解步驟，戶，擇的酶可有蛋白酶、P-葡聚糖酶、
淀粉酶、脂肪酶和相類似的酶。
因此，本發(fā)明涉及制備富含5'-核苷酸的酵母提取物的方法，其包括
a) 加熱酵，浮液；
b) 酵母的自解和/或者酶水解； C)從懸浮液中分離出不溶物；和 d)回收酵母提取物；
其特征在于，戶，方^a括用從高梁芽提取的5、-磷酸二酯酶處理酵皿浮液。
b步驟中最好jOT戶;M酵母的外生酶，尤其是蛋白酶，以增加酵母蛋白的 降解。這種蛋白酶的實(shí)施例有植物蛋白酶(木瓜蛋白酶、波蘿蛋白酶和其它類似的酶)、或者微生物蛋白酶(枯草桿菌Bacillus subtilis、米曲霉Aspergillus oiyzae
和其它類似物)。
上述方法中還可以包括在用高梁5、-磷酸二酯酶處理之前完全或部分純化 RNA的步驟。
在一個(gè),的實(shí)施例中，用高梁5、-磷酸二酯酶處理酵母懸浮液的步驟1皿 的條件為pH值為5.0—7.5，溫度為35—70°C。含有高梁5、-磷酸二酯酶的酵母 懸浮液的培育時(shí)間為5—30h。加入到酵蹄浮液中的高梁5、-磷酸二酯酶制劑優(yōu) 選為10%w/w。例如，用高梁5、-磷酸二酯酶處理酵，浮液的步驟可在pH值 為63，在6(TC下處理18h。
優(yōu)選地，酵母提取物含有較多的5'-GMP禾tl/或5、-IMP。具體來說，5、-GMP 和5、-MP含量均會站到0.1-15% (以^^K合二鈉鹽的形式計(jì)量)，{雄2-5%。 所獲得的酵母提取物不含有谷蛋白。
該方法還可以包括一個(gè)附加步驟，即用脫氨酶處理酵母懸浮液的步驟。該 步驟可以在高梁PDE處理酵，浮液過程中進(jìn)行，或者在高梁PDE處理酵母 懸浮液后進(jìn)行。在一個(gè)較佳實(shí)施例中，使用脫氨酶處理的步驟與使用高梁PDE 的步驟同時(shí)進(jìn)行，或者在4OT高梁PDE之后進(jìn)行。例如，脫氨酶可以在5、-PDE 處理步驟的后幾個(gè)小時(shí)內(nèi)加入，即在冷卻至一定溫芰，如45T:后進(jìn)行。這一附 加步驟能使得5、AMP轉(zhuǎn)化為想要得到的5、-MP。這一附加步^^t所屬領(lǐng)i或技 術(shù)人員是已知的，在如EP 249 435和EP 354 610中也都有介紹。市售的脫氨酶 為Amano帝ij造的Deamizyme 5(K)00G。在一具體實(shí)施例中，該方法還包括發(fā)酵 步驟，使其可以將多糖轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸，如乳酸或者琥珀酸。該發(fā)酵步驟對所屬 領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，在EP 191 513和EP 354 610中也都有介紹。戶腿發(fā)酵 較佳可以在孚L桿菌類(the genus Lactobacillus)或體同的菌類幫助下進(jìn)行。
然后^^將酵母提取物從酵母細(xì)胞的不溶部分中分離。由于對不溶部分中 油脂膜的氧化，而沒有表現(xiàn)出香料氣味，因此，從不溶部分中分離出的酵母提 取物有更易于保存的優(yōu)點(diǎn)。例如，該步驟可以通過離心、過濾或者回收液體部 分的方式進(jìn)行。
然后液體部分可經(jīng)受己知酵母提取物后續(xù)的處理方式，具體為;鄉(xiāng)、過濾、 加熱殺菌和/鄉(xiāng)共干。
如前文戶，，酵母提取物被廣泛地用作味道增強(qiáng)劑。在本發(fā)明中"酵母提取物"的含義被理解為一般M:自解或7jC解獲得的酵母溶解部分的濃縮物。
富含5、-核苷酸的酵母提取物可以具有多種形式，如液態(tài)、糊狀或者固態(tài)形
式。戶腿酵母提取物中最好含有重量百分比至少90%， 94-98%的千性物質(zhì)。
因此，本發(fā)明涉及通過本發(fā)明的相應(yīng)方法獲得或者能獲得的酵母提取物， 或它們在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用。這些酵母提取物中無谷蛋白。酵母提取物中優(yōu)選 含有的5、-GMP和5、-MP的含量都為0.1-15% (以七水合二鈉鹽的形式計(jì)量)。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的酵母提取物在飲食配方中的應(yīng)用，這樣所獲得 的飲食配方和基于這禾中配方而得到的消費(fèi)食品產(chǎn)品。飲食配方舉例來說，可以 是肉湯、湯、沙司、肉制品、焙烤食品或者調(diào)味品。
本發(fā)明還涉及含有根據(jù)本發(fā)明的酵母提取物的香料改良劑，根據(jù)本發(fā)明的 這一香料改良劑還可以含有不溶物質(zhì)。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的香料改良齊蛀飲食配方中的應(yīng)用，如此獲得的 飲食配方和基于這種配方所獲得的消費(fèi)食品產(chǎn)品。飲食配方舉例來說，可以是 肉湯、湯、沙司、肉制品、焙烤食品或者調(diào)味品。
因此，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)香料食品的方法，其特征在于j頓了根據(jù)本發(fā) 明的香料改良劑。
以下的實(shí)施例僅是為了進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，而不應(yīng)理解為是乂寸本發(fā) 明傲戶范圍的限定。
鄉(xiāng)例l
制備高梁 ^取物
所用幼^A非洲高梁芽工廠獲得。取13g高粱幼根研磨或粉碎，得到平均 粒徑為500)tim的粉末。該粉末以13。/。(w/w)比例放入到0.2g/l的醋酸鋅水 溶液中，在6(TC下蒸煮2h。通過兩次離心分離后，提取蒸煮液中的固體 和不溶物即得到高梁幼根的提取物。
實(shí)施例2
制備富含5、-核苷酸的^^提取銀由高、難幌的5、-PDE與商業(yè)產(chǎn)品酶的對
比
取1000g酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)乳，其中干性物質(zhì)含量為15%,RNA的含量為9.5% (通過Trevelyan方法進(jìn)行水解，水解方法參見"Induction of Autolytic Breakdown of RNA in Yeast by Addition of Ettianol and by Dtying/Rehydration"，Trevdyan，J"Sci. FoodAgric" 1977,28,579-588，禾口"Processing
Simple Heat-shock Procedure "禾口 "an Efficient Chemical Method Based on Extraction of脂Aby Salt Solution at low pH" ,Trevelyan，J" Soc. Chem Ind"簡，141-174)， 將該釀Mll母乳在75。C下加熱2h，再冷卻至56r，調(diào)節(jié)pH值為5.3 (細(xì)
胞質(zhì)壁分離)。
將該酵母乳與含有5:PDE (10%w/w)的高梁幼根蒸煮液的上清液進(jìn)行混 合。然后，將混合物在56'C下緩慢攪拌15h，以使得RNA水解成5'-核苷酸。 通過離心方法分離出固體物質(zhì)，并且在再次離心前，用去離子7乂清洗該固體物 質(zhì)。將兩種上清液混合，經(jīng)濃縮后烘干。分析表明，烘干的粉末中5'-GMP的 含量為2.44% (以H^K合二鈉鹽的形式計(jì)量)。須啶艦RP-HPLC進(jìn)行，具體 方法參見 Enzymatic Production of Ribonucleotides from Autolysates of A7，eram_yces mana'畫us grow on whey; Bel, M.A.F"#X., Journal of Food Science, 62， 851-854。
lkg同樣的酵母乳，加入lg從Amano購得的5、-PDE (商品名PDE RP-l，Amano Enzyme Europe, Ltd)在同樣的條件下培育15h，經(jīng)分離、濃縮和干 燥后得到含有5、-GMP為2.60%的粉末。這兩個(gè)比較例中，水解的效率是相似的， 即從高梁中獲得的5'-PDE的水解效率與更加昂貴的商業(yè)產(chǎn)品酶的效率是基本一 致的。
鄉(xiāng)例3
戶;M方法和前面的實(shí)施例一樣，由i3g高粱芽幼根和iooog的酵母乳開始，
但是經(jīng)過15h培育后，溫度降至45。C，并加入0.1g Amino的5、-腺苷酸脫氨 酶(商品名為Deamizyme50000Q Amano Enzyme Europe, Ltd)。然后，再培育 5h，以使得5、-AMP在5、-腺苷^l兌氨謝乍用下轉(zhuǎn)化為5、-IMP。然后通過離心方 法分離出固體物質(zhì)，并且在再次離心前，用去離子水清洗該固體物質(zhì)。將兩種 上清液混合，？鄉(xiāng)后烘干。分析表明，烘干的粉末中5、GMP的含量為2.80%， 5、-MP的含量為3.21% (通過RP-HPLC進(jìn)行測定，均以七水合二鈉鹽的形式計(jì)鄉(xiāng)例4
戶服方法和前面的實(shí)施例一樣，由13g高粱芽幼根和lOOOg的酵母乳開始。 然而，在加入高梁芽5、PDE之前，加入a5g木瓜蛋白酶以f腿酵母中千性物質(zhì) 的溶解，戶脫方 緣下步驟與實(shí)施例3—致，也加入5、-腺苷翻兌氨酶。分析表 明，得到的粉末中5、-GMP的含量為1.96%， 5'-MP的含量為2.07% (通過 RP-HPLC進(jìn)行測定，均以4^JC合二鈉鹽的形式計(jì)量)。
鄉(xiāng)例5
戶，方法如實(shí)施例1和2進(jìn)行，除了用假絲酵母乳(Candida)取代敝 母(Saccharomycescerevisiae)乳，該假絲酵母乳中，干性物質(zhì)含量為13%， RNA 為12.5%。分析表明，得到的粉末中5'-GMP的含量為3.75%， 5、-MP的含量為 3.98% (均以^/JC合二鈉鹽的形式計(jì)量)。
權(quán)利要求
1、制備富含5`-核苷酸、且不含谷蛋白的酵母提取物的方法，所述方法包括以下步驟a)加熱酵母懸浮液；b)用5`-磷酸二酯酶處理酵母懸浮液；c)從懸浮液中分離出不溶物；和d)回收酵母提取物；其特征在于，所述5`-磷酸二酯酶是從高梁芽幼根中提取的。
2、 如權(quán)禾腰求1戶腿的方法，其特征在于，從高梁芽幼根中提取的5、-磷 酸二酯酶通過以下方法制備蒸煮醋勝辛水溶液(0.2-5g/l)中的高梁芽粉末懸 浮液，溫度為50-8(TC，時(shí)間為30min到4h，并除去不溶解的部分。
3、 如權(quán)利要求2戶艦的方法，其特征在于，戶脫粉^t徑為20-2000pm， 優(yōu)選為100-200^n。
4、 如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)戶，的方法，其特征在于，戶/M用5、-磷酸二 酯酶處理酵，浮液的步驟在pH值為5.0-7.5，溫度為35-7(TC ，時(shí)間為5-30h 下進(jìn)行。
5、 如權(quán)利要求14中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，戶皿方法還包括在 加熱步驟后，對酵，浮液進(jìn)行酶解的步驟。
6、 如權(quán)禾腰求1-5中任一項(xiàng)戶腿的方法，其特征在于，戶脫方法還包括在 用高梁5'-磷酸二酯酶處理步驟前，完全或部分純化RNA的步驟。
7、 如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，戶，方法還包括用 脫氨酶處理的步驟。
8、 如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)戶/M的方法，其特征在于，戶服酵母中RNA 的質(zhì)量含量為干重的6-15%。
9、 如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，戶，酵母是酵母菌 類(genus Saccharomyces)、假絲酵母類(genus Candida)或克魯維酵母菌類(Kluyveromyces )。
10、 富含5、-核苷酸、且不含谷蛋白的酵母提取物，其特征在于，戶腿酵 母提取物按照權(quán)利要求1-9的方法所得到。
11、 一種香料改良劑，包含如權(quán)利要求10戶腿的富含5'-核苷酸的酵母提 取物，或者能ffl51權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)戶服的方法而得到的富含5、-核苷酸的酵母提取物。
12、 制造含有香茅斗食品的方法，其特征在于，戶;M方法使用了如權(quán)利要求 ii所述的香料改良劑。
13、 一種食品，^m正在于，戶;M食品含有如權(quán)禾腰求ii戶誠的香料改良劑。
14、 從高梁芽中提取的5M粦酸二酯酶的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為制 造富含5、-核苷酸的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從高粱提取5′-磷酸二酯酶的制備方法，及其用途，即用于制備富含5′-核苷酸的組合物，特別是酵母提取物。
文檔編號C12P19/00GK101557724SQ200780041743
公開日2009年10月14日 申請日期2007年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月12日
發(fā)明者埃里克·奧里奧爾, 納迪亞·凱德 申請人:樂斯福公司