專利名稱：：通過基因表達(dá)分析進(jìn)行研究、判定或評價(jià)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及對SART應(yīng)激負(fù)荷動物投入被檢物質(zhì)后，對其神經(jīng)組織的基因表達(dá)變化進(jìn)行分析，由此在基因水平上對SART應(yīng)激負(fù)荷導(dǎo)致的病態(tài)以及該被檢物質(zhì)的藥理作用，例如鎮(zhèn)痛作用、自律神經(jīng)失調(diào)的改善作用或者抗應(yīng)激作用進(jìn)行研究、判定或評價(jià)的方法。
背景技術(shù)：
：對實(shí)驗(yàn)動物以飼養(yǎng)環(huán)境溫度白天每1小時(shí)變換溫度、夜間為低溫的方式飼養(yǎng)數(shù)日，對動物負(fù)荷SART(SpecificAlternationofRhythminTemperature)應(yīng)激，即反復(fù)寒冷應(yīng)激，由此能夠制作得到小鼠、大鼠、豚鼠等的SART應(yīng)激負(fù)荷動物。SART應(yīng)激負(fù)荷動物被認(rèn)為是疼痛過敏、自律神經(jīng)失調(diào)、應(yīng)激狀態(tài)的病態(tài)模型動物，能夠根據(jù)喜多等的方法(日薬理誌，71巻，195頁，1975年)制作。例如，在使用大鼠的情況下，將飼養(yǎng)溫度在上午10點(diǎn)至下午5點(diǎn)間每1小時(shí)在24。C和一3'C之間交互變換，之后，從下午5點(diǎn)至次日清晨的上午10點(diǎn)之間維持在一3°C，使其自由攝取水和飼料，飼養(yǎng)4天以上，使其負(fù)荷反復(fù)寒冷應(yīng)激。在大鼠，低溫的溫度設(shè)定為一3'C，在小鼠為4'C，在豚鼠為0°C，由此能夠分別制作SART應(yīng)激小鼠、SART應(yīng)激豚鼠模型。已知這樣制作得到的SART應(yīng)激負(fù)荷動物具有以下的特征，g卩，因反復(fù)寒冷應(yīng)激而導(dǎo)致疼痛閾值降低，變得不安、郁悶，體重也下降，CRH(促腎上皮質(zhì)激素釋放激素)、去甲腎上腺素、IL-lp的釋放分別亢進(jìn)，5-羥色胺(5-HT)的釋放受到抑制。此外，本發(fā)明中作為被檢物質(zhì)使用的痘菌病毒接種家兔炎癥皮膚提取液，含有從接種過痘菌病毒的家兔的炎癥皮膚組織提取并分離得到的非蛋白性的活性物質(zhì)。迄今為止，已知該痘菌病毒接種炎癥組織提取液對于SART應(yīng)激負(fù)荷動物具有疼痛閾值降低(疼痛過敏)的抑制作用(鎮(zhèn)痛作用)，CRH、去甲腎上腺素、IL-lp的釋放亢進(jìn)的抑制作用，5-羥色胺(5-HT)的釋放抑制的促進(jìn)作用，對體重減少的抑制作用(自律神經(jīng)失調(diào)的改善作用，抗應(yīng)激作用)等(參照非專利文獻(xiàn)1和2)。以痘菌病毒接種的家兔炎癥皮膚提取液為有效成分的醫(yī)藥品制劑(商品名Neurotropin)，規(guī)定作為使用該SART應(yīng)激負(fù)荷動物進(jìn)行鎮(zhèn)痛效力實(shí)驗(yàn)的效力檢測的定量實(shí)驗(yàn)。痘菌病毒接種的家兔炎癥皮膚提取液制劑是一種已經(jīng)明確廣泛適用于腰痛癥、頸肩腕綜合征、癥狀性神經(jīng)痛、肩周炎、變形性關(guān)節(jié)炎、帶狀皰疹后神經(jīng)痛等疼痛性疾病，除此以外還廣泛適用于皮膚疾病(濕疹、皮炎、蕁麻疹)伴隨的瘙癢、過敏性鼻炎、亞急性脊髓視神經(jīng)病后遺癥等的冷覺、異常知覺、痛覺等的非常獨(dú)特的制劑，其皮下注射、肌肉注射、靜脈注射用的注射劑和片劑作為醫(yī)療用醫(yī)藥品己被允許制造并在市場上出售。近年來，在美國正在進(jìn)行關(guān)于難治性神經(jīng)性疼痛RSD(反射性交感神經(jīng)萎縮癥，CRPS-typel)的臨床實(shí)驗(yàn)。另外，有報(bào)告稱，痘菌病毒接種炎癥組織提取物對纖維肌痛癥有效(參照專利文獻(xiàn)1)。關(guān)于纖維肌痛癥的發(fā)病原因和機(jī)制，目前推測為壓力等導(dǎo)致的心理原因、病毒感染、遺傳、免疫異常以及神經(jīng)遞質(zhì)的異常等，但仍然沒有被闡明。近年，纖維肌痛癥和SART應(yīng)激負(fù)荷動物的病態(tài)顯示出共性。另一方面，作為痘菌病毒接種炎癥組織的提取物顯示鎮(zhèn)痛作用的機(jī)制，報(bào)告了活化下行性病痛抑制系統(tǒng)的機(jī)制，本發(fā)明的發(fā)明人等以闡明SART應(yīng)激負(fù)荷導(dǎo)致的病態(tài)和痘菌病毒接種炎癥組織提取物的藥理作用的機(jī)制為目的，使用SART應(yīng)激負(fù)荷的大鼠的神經(jīng)組織(脊髓后根神經(jīng)節(jié)、脊髓后角、腦組織)，通過實(shí)時(shí)定量PCR(RealtimePCR)進(jìn)行研究。但是，以實(shí)時(shí)定量PCR能夠進(jìn)行分析的基因數(shù)量有限，因此，無法對表達(dá)量受到痘菌病毒接種炎癥組織提取物影響的全部的基因進(jìn)行網(wǎng)羅式的探索。非專利文獻(xiàn)l:基礎(chǔ)^臨床，15巻，5號，2459頁，1981年非專利文獻(xiàn)2:応用薬理，32巻，3號，599頁，1986年專利文獻(xiàn)1:國際公開WO2004/039383號公報(bào)
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種在基因表達(dá)水平上對SART應(yīng)激負(fù)荷導(dǎo)致的病態(tài)以及該被檢物質(zhì)的藥理作用，例如鎮(zhèn)痛作用、對自律神經(jīng)失調(diào)的改善作用或者抗應(yīng)激作用進(jìn)行研究，判定或評價(jià)的方法，以及對疼痛性疾病、自律神經(jīng)失調(diào)和應(yīng)激性疾病有效的物質(zhì)進(jìn)行篩選的方法。本發(fā)明的發(fā)明人等對于痘菌病毒接種炎癥組織的提取物對SART應(yīng)激負(fù)荷動物的鎮(zhèn)痛作用，從改善疼痛的下行性抑制系統(tǒng)的應(yīng)激導(dǎo)致的機(jī)能低下的機(jī)制著眼，進(jìn)行了深入研究。其結(jié)果，通過對SART應(yīng)激負(fù)荷動物投與被檢物質(zhì)之后，對該動物的神經(jīng)組織的基因表達(dá)進(jìn)行網(wǎng)羅式的探索，確定表達(dá)量受到SART應(yīng)激負(fù)荷以及該被檢物質(zhì)影響的基因，從而完成本發(fā)明。發(fā)明的效果本發(fā)明提供一種對SART應(yīng)激負(fù)荷動物投與被檢物質(zhì)之后，對其神經(jīng)組織的基因表達(dá)變化進(jìn)行網(wǎng)羅式的分析，由此在基因水平上對該被檢物質(zhì)的藥理作用，特別是鎮(zhèn)痛作用、自律神經(jīng)失調(diào)的改善作用或者抗應(yīng)激作用進(jìn)行研究、判定或評價(jià)的方法，由此對疼痛性疾病、自律神經(jīng)失調(diào)、應(yīng)激性疾病等有效的物質(zhì)進(jìn)行探索，對該物質(zhì)進(jìn)行效果的判定、評價(jià)，或者對該物質(zhì)的靶基因進(jìn)行分析。具體實(shí)施例方式SART應(yīng)激負(fù)荷動物能夠采用上述的方法制作。另外，作為被檢物質(zhì)的痘菌病毒接種炎癥組織提取物能夠通過將痘菌病毒接種動物使其發(fā)痘，將發(fā)痘的組織破碎，添加提取溶劑除去組織碎片之后，進(jìn)行除蛋白處理，使用吸附劑進(jìn)行吸附，之后將吸附成分溶出而得到。例如，可以通過如下的工序制造痘菌病毒接種炎癥組織提取物。(a)收集接種痘菌病毒使其發(fā)痘的兔子、小鼠等的皮膚組織，破碎發(fā)痘組織，添加水、苯酚水溶液、生理鹽水或苯酚加甘油水溶液等提取溶劑后，通過過濾或離心分離得到提取液(濾液或上清)。(b)將上述提取液調(diào)整為酸性pH，加熱，除蛋白處理。接著將除蛋白后的溶液調(diào)整為堿性，加熱后過濾或離心分離。(c)將得到的濾液或上清調(diào)整至酸性，使其吸附在活性炭、高嶺土等吸附劑上。(d)向上述的吸附劑中加入水等提取溶劑，調(diào)整為堿性pH，使吸附成分溶出，由此能夠得到痘菌病毒接種炎癥組織提取物。下面，對上述各工序進(jìn)行更詳細(xì)的說明。關(guān)于(a)))將痘菌病毒接種家兔等兔子并使其發(fā)痘，收集炎癥皮膚組織并破碎，添加其1至5倍量的提取溶劑，使其成為乳化懸濁液。提取溶劑可以使用蒸餾水、生理鹽水、弱酸性至弱堿性的緩沖液等，也可以適當(dāng)添加甘油等的穩(wěn)定劑、苯酚等殺菌防腐劑、氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂等鹽類等。此時(shí)，也可以通過凍融、超聲波、細(xì)胞膜溶解酶或者表面活性劑等的處理破壞細(xì)胞組織，使提取容易進(jìn)行。關(guān)于(b)將得到的乳狀提取液通過過濾或離心分離等除去組織碎片之后，進(jìn)行除蛋白處理。除蛋白操作可以根據(jù)通常進(jìn)行的公知的方法進(jìn)行，可以適當(dāng)使用加熱處理、使用蛋白變性劑，例如酸、堿、尿素、胍、丙酮等有機(jī)溶劑等的處理、等電點(diǎn)沉淀、鹽析等方法。接著，采用除去不溶物的通常的方法，例如使用濾紙(纖維素、硝化纖維素等)、玻璃濾器、西萊特(Cdite)、塞式過濾板等進(jìn)行過濾、超濾、離心分離等除去析出的不溶蛋白。關(guān)于(c)使用鹽酸、硫酸、溴化氫等酸將這樣得到的含有有效成分的提取液調(diào)整為酸性，優(yōu)選調(diào)整為pH3.5至5.5，進(jìn)行向吸附劑吸附的操作。作為可以使用的吸附劑，可以列舉活性炭、高嶺土等，在提取液中添加吸附劑并攪拌，或者使提取液通過填充有吸附劑的柱，能夠使有效成分吸附到該吸附劑上。在提取液中添加吸附劑的時(shí)候，通過過濾或離心分離等除去溶液，從而能夠得到吸附有有效成分的吸附劑。關(guān)于(d)為了使有效成分從吸附劑中溶出(脫離)，能夠通過在上述的吸附劑中添加洗脫溶劑，室溫或者適當(dāng)加熱或者攪拌而溶出，以過濾或離心分離等通常方法除去吸附劑而實(shí)現(xiàn)。作為所使用的溶出溶劑，可以使用堿性溶劑，例如調(diào)整為堿性pH的水、甲醇、乙醇、異丙醇等或者這些溶劑的適當(dāng)?shù)幕旌先芤?，?yōu)選使用調(diào)整為pH9至12的水。另外，關(guān)于痘菌病毒接種炎癥組織提取物的制造，在例如上述專利文獻(xiàn)1等中記載了更具體的制造方法。此外，動物的脊髓后根神經(jīng)節(jié)和脊髓后角等神經(jīng)組織采用通常的方法采集即可。實(shí)施例1.實(shí)驗(yàn)材料首先，如下制作SART應(yīng)激負(fù)荷動物的神經(jīng)組織樣品。(1)動物對6周齡的Wistar系雄性大鼠進(jìn)行SART應(yīng)激負(fù)荷，制作SART應(yīng)激大鼠。使大鼠自由攝取飼料以及自來水，5天內(nèi)反復(fù)進(jìn)行寒冷應(yīng)激負(fù)荷，第六天解除應(yīng)激負(fù)荷，以供實(shí)驗(yàn)。(2)痘菌病毒接種炎癥組織提取物作為痘菌病毒接種炎癥組織提取物，使用將根據(jù)上述專利文獻(xiàn)1中的實(shí)施例2制造得到的痘菌病毒接種的兔子的炎癥皮膚由來的提取物調(diào)整為20NU/mL的物質(zhì)(痘菌病毒接種家兔炎癥皮膚提取物)。NU規(guī)定為使用疼痛閾值比正常動物低的慢性應(yīng)激動物SART應(yīng)激小鼠，根據(jù)Randall-Selitto法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到的鎮(zhèn)痛效力的ED5Q值。1NU為ED50值為100mg/kg時(shí)的痘菌病毒接種家兔炎癥皮膚提取物的鎮(zhèn)痛活性含有成分lmg所顯示的活性。(3)痘菌病毒接種炎癥組織提取物的給藥對上述的SART應(yīng)激負(fù)荷大鼠，從SART應(yīng)激負(fù)荷開始之日開始，將痘菌病毒接種家兔炎癥皮膚提取物以每lkg體重給藥200NU的給藥量1天1次連續(xù)腹腔內(nèi)給藥(正常被檢物質(zhì)給藥組以及SART應(yīng)激被檢物質(zhì)給藥組)。以同樣的日程對正常對照組以及SART應(yīng)激負(fù)荷對照組投與生理鹽水。給藥的液體量為每lkg體重10mL。分組如下正常對照組(n=3)、正常被檢物質(zhì)給藥組(n=3)、SART應(yīng)激負(fù)荷對照組(n=4)、SART應(yīng)激負(fù)荷被檢物質(zhì)給藥組(n=4)。(4)疼痛閾值的測定使用壓力刺激鎮(zhèn)痛效果測定裝置，根據(jù)Randall-Selitto法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測定疼痛閾值。即，以一定的加壓速度對大鼠右后肢腳趾施加壓力刺激，測定動物表現(xiàn)出逃避或者嘶叫反應(yīng)時(shí)的加壓重量(g)作為疼痛閾值。5天的SART應(yīng)激負(fù)荷結(jié)束后，進(jìn)行最后一次痘菌病毒接種家兔炎癥皮膚提取物的給藥，給藥30分鐘后測定痛覺閾值。由此，得到以下結(jié)果。(1)痘菌病毒接種家兔炎癥皮膚提取物對于SART應(yīng)激負(fù)荷大鼠的疼痛閾值降低的效果SART應(yīng)激負(fù)荷5日后的SART應(yīng)激負(fù)荷對照組的疼痛閾值與正常對照組相比顯著低下。與此相對，SART應(yīng)激負(fù)荷被檢物質(zhì)給藥組最后一次給藥30分鐘后測定疼痛閾值的結(jié)果，與SART應(yīng)激負(fù)荷對照組相比，觀察到顯著的改善。另一方面，不進(jìn)行SART應(yīng)激負(fù)荷而投與了痘菌病毒接種家兔炎癥皮膚提取物的正常被檢物質(zhì)給藥組的痛覺閾值沒有變化。(2)樣品如上所述，在能夠確認(rèn)SART應(yīng)激負(fù)荷導(dǎo)致的疼痛閾值降低和痘菌病毒接種家兔炎癥皮膚提取物的鎮(zhèn)痛效果之后，將各組大鼠斷頭并回收血液，取出脊髓后根神經(jīng)節(jié)以及脊髓后角，分別浸存于RNAlater(商品名，Ambion公司制)中，為了防止RNA降解，將其置于冰箱中孵育1晚后，在一80'C冷凍保存。2.實(shí)驗(yàn)方法接著，使用以上述方法得到樣品，通過DNA陣列(DNA微陣列、DNA芯片等)對SART應(yīng)激負(fù)荷動物的脊髓后根神經(jīng)節(jié)(DRG)和脊髓后角(DH)的基因表達(dá)量進(jìn)行網(wǎng)羅式的定量，并對這些基因表達(dá)變化對病態(tài)的意義進(jìn)行闡明。詳細(xì)說明如下。(1)總RNA的調(diào)制和品質(zhì)鑒定各樣品的總RNA使用RNeasyLipidTissueMiniKit(商品名，Qiagen公司制)和RNase-FreeDNaseSet(商品名，Qiagen公司制)提取并精制，用2100Bioanalyzer(商品名，Agilent公司制)對RNA的品質(zhì)進(jìn)行鑒定。全部樣品的總RNA的吸光度(260/280)比均為2.02.1，各樣品為不含蛋白質(zhì)的核酸成分。通過微芯片電泳分析RNA有無分解，結(jié)果可以確認(rèn)在全部樣品中都存在18S核糖體RNA的尖峰，并且不存在基線紊亂以及分解物的峰，據(jù)此可以判斷RNA樣品沒有分解。由于這些樣品中的總RNA每個(gè)都符合品質(zhì)鑒定，所以作為DNA陣列實(shí)驗(yàn)的樣品使用。(2)DNA陣列實(shí)驗(yàn)(與Cyanine3標(biāo)記互補(bǔ)的RNA(Cy3-cRNA)調(diào)制和雜交)使用RatGenomeOligoMicroarrayKit(商品名，Agilent公司帝!j，商品號G4131A)進(jìn)行基因表達(dá)的網(wǎng)羅式分析。探針的調(diào)制、雜交以及洗凈方法根據(jù)Agilent1色法對應(yīng)的DNA微陣列試劑盒的操作說明(Verl.O)進(jìn)行。通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)從總RNA制得雙鏈互補(bǔ)的DNA之后，使用LowRNAInputLinearAmplification&LabelKit在Cy3標(biāo)記胞嘧啶3磷酸(Cy3-CTP)存在的條件下進(jìn)行擴(kuò)增和標(biāo)記，使用RNeasyMiniKit(商品名，Qiagen公司制)對Cy3-cRNA進(jìn)行精制。使用U-3300Spectrophotometer(商品名，Hitachi公司制)對樣品的濃度和熒光色素的攝入進(jìn)行確認(rèn)之后，使Cy3-cRNA擴(kuò)增1000倍以上，并且，當(dāng)全部樣品的Cy3攝入率達(dá)到9pmoL/昭以上時(shí)，達(dá)到Agilent的操作說明中表示的基準(zhǔn)范圍內(nèi)(915pmoL/|Lig)。因此，從總RNA制作得到的Cy3-cRNA的擴(kuò)增效率和熒光色素的攝入率在操作說明的基準(zhǔn)范圍內(nèi)，可以確認(rèn)正在進(jìn)行正確的擴(kuò)增以及熒光色素的攝入。使用GeneExpressionHybridizationKit(商品名，Agilent公司制)中的試劑將上述得到的Cy3-cRNA片段化后，與雜交緩沖液混合，滴加于RatGenomeOligoMicroarraySlide上，在65°C進(jìn)行17小時(shí)的雜交。反應(yīng)結(jié)束后，使用DNA微陣列掃描儀，在分解能量為lO]iim的條件下，對洗凈并干燥后的DNA微陣列上的與各探針互補(bǔ)結(jié)合的Cy3-cRNA量的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測定。(3)數(shù)據(jù)分析熒光強(qiáng)度的數(shù)值化和數(shù)據(jù)處理使用數(shù)值化變換軟件FeatureExtractionVer8.5(商品名，Agilent公司制)，進(jìn)行各點(diǎn)內(nèi)一定范圍的熒光強(qiáng)度的數(shù)值化和異常點(diǎn)的檢測，排除背景值和統(tǒng)計(jì)學(xué)上不具有顯著差異的點(diǎn)。[2]基因表達(dá)量的修正和縮小目標(biāo)基因組群的范圍使用基因表達(dá)分析軟件GeneSpringVer7.3(商品名，SiliconGenetics公司制)對陣列間和探針間的基因表達(dá)水平進(jìn)行修正后，根據(jù)下述的方法進(jìn)行表達(dá)模式異常的基因的排除和目標(biāo)基因的選擇。(A)基于表達(dá)模式(Flag)的選擇除去Flag異常的基因。(B)基于通過方差分析得到的基因表達(dá)水平的顯著性差異的基因的選擇通過對正常對照組(n=3)，SART應(yīng)激負(fù)荷對照組(n=4)以及SART應(yīng)激負(fù)荷被檢物質(zhì)給藥組(n=4)間的方差分析(onewayONOVA)，選出基因表達(dá)水平具有顯著性(P<0.05)差異的基因。(C)目標(biāo)基因組群的選擇為了根據(jù)SART應(yīng)激負(fù)荷和被檢物質(zhì)對基因表達(dá)的組合效果縮小目的基因的范圍，選擇與正常對照組相比SART應(yīng)激負(fù)荷組中基因表達(dá)增加1.25倍以上，并且與SART應(yīng)激負(fù)荷組相比SART應(yīng)激負(fù)荷被檢物質(zhì)給藥組中表達(dá)減少1.25倍以上的基因組群。相反地，選擇與正常對照組相比SART應(yīng)激負(fù)荷組中基因表達(dá)減少1.25倍以上，并且與SART應(yīng)激負(fù)荷組相比SART應(yīng)激負(fù)荷被檢物質(zhì)給藥組中表達(dá)增加1.25倍以上的基因組群。目標(biāo)基因的推定所選擇的目標(biāo)基因的功能使用基因數(shù)據(jù)庫GenBank以及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫PubMed進(jìn)行調(diào)査。3.結(jié)果根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)方法得到的結(jié)果如下。(1)目標(biāo)基因組群的選擇將DNA陣列上的41071個(gè)與探針結(jié)合的基因所發(fā)出的熒光量數(shù)值化，并排除表達(dá)模式(Flag)異常的基因。在剩下的基因組群(DRG-Flag:19371個(gè)基因，DH-Flag:20623個(gè)基因)中，選擇正常對照組、SART應(yīng)激負(fù)荷組、SART應(yīng)激負(fù)荷被檢物質(zhì)給藥組的3組間通過方差分析(onewayANOVA)可以確認(rèn)具有顯著性(P<0.05)差異的基因(DRG-ANOVA:1538個(gè)基因，DH-ANOVA:3570個(gè)基因)。從通過方差分析選擇得到的基因組群中，以上述目標(biāo)基因的選擇方法，選擇可以確認(rèn)在各樣品中表達(dá)量發(fā)生變化的以下的基因組群，表示在表1至表5中。下表中，(-)表示沒有基因符號的分子，(predicted)表示推測的分子，另外，SART的數(shù)值表示為以正常對照組為1.00時(shí)的SART應(yīng)激負(fù)荷組的表達(dá)量，SART-NSP的數(shù)值表示為以SART應(yīng)激負(fù)荷組為1.00時(shí)的SART應(yīng)激負(fù)荷被檢物質(zhì)給藥組的表達(dá)量。12[1]脊髓后根神經(jīng)節(jié)(DRG)中確認(rèn)表達(dá)量發(fā)生變化(SART應(yīng)激負(fù)荷時(shí)促進(jìn)表達(dá)，投與被檢物質(zhì)時(shí)抑制表達(dá))的37個(gè)基因(表l和表2)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>[表2]<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>[2]脊髓后根神經(jīng)節(jié)中確認(rèn)表達(dá)量發(fā)生變化(SART應(yīng)激負(fù)荷時(shí)抑制表達(dá)，投與被檢物質(zhì)時(shí)恢復(fù)表達(dá))的12個(gè)基因(表3)[表3]<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>[3]脊髓后角(DH)中確認(rèn)表達(dá)量發(fā)生變化(SART應(yīng)激負(fù)荷時(shí)促進(jìn)表達(dá)，投與被檢物質(zhì)時(shí)抑制表達(dá))的10個(gè)基因(表4)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>脊髓后角中確認(rèn)表達(dá)量發(fā)生變化(SART應(yīng)激負(fù)荷時(shí)抑制表達(dá)，投與被檢物質(zhì)時(shí)恢復(fù)表達(dá))的27個(gè)基因(表5)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(2)目標(biāo)基因的功能分析上述選擇的目標(biāo)基因的功能使用基因數(shù)據(jù)庫GenBank以及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫PubMed進(jìn)行調(diào)查，將類似的功能總結(jié)于表6至表11中表示。下表中，(-)表示沒有基因符號的分子，(predicted)表示推測的分子。脊髓后根神經(jīng)節(jié)(DRG)中確認(rèn)表達(dá)量發(fā)生變化(SART應(yīng)激負(fù)荷時(shí)促進(jìn)表達(dá)，投與被檢物質(zhì)時(shí)抑制表達(dá))的37個(gè)基因中，確認(rèn)含有具有巨噬細(xì)胞的趨化性和活化以及炎癥相關(guān)功能的基因(表6和表7)。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>脊髓后根神經(jīng)節(jié)中確認(rèn)表達(dá)量發(fā)生變化(SART應(yīng)激負(fù)荷時(shí)抑制表達(dá)，投與被檢物質(zhì)時(shí)恢復(fù)表達(dá))的12個(gè)基因中，確認(rèn)含有具有細(xì)胞生長發(fā)育相關(guān)功能的基因等(表8)。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>如上所述，本實(shí)驗(yàn)中，確認(rèn)了SART應(yīng)激負(fù)荷動物的脊髓后根神經(jīng)節(jié)中，趨化因子、巨噬細(xì)胞、細(xì)胞粘著、炎癥相關(guān)功能的基因表達(dá)被上調(diào)。這些基因表達(dá)的上調(diào)，可以認(rèn)為與巨噬細(xì)胞類細(xì)胞向脊髓后根神經(jīng)節(jié)內(nèi)游走及其活化的促進(jìn)所導(dǎo)致的痛覺過敏以及應(yīng)激導(dǎo)致的疾病等相關(guān)。另一方面，確認(rèn)了SART應(yīng)激負(fù)荷動物的脊髓后角中，髓鞘形成以及C1通道功能相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)。髓鞘形成相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)可以認(rèn)為是痛覺過敏的原因，具有誘發(fā)脫髓樣變性的可能性，而誘導(dǎo)超極化的氯離子通道功能相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)與痛覺過敏的產(chǎn)生有很強(qiáng)的相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)中，提示痘菌病毒接種家兔炎癥皮膚提取物具有通過調(diào)節(jié)這些基因表達(dá)從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用以及抗應(yīng)激作用的可能性。如上所述，上述實(shí)驗(yàn)中，因SART應(yīng)激負(fù)荷以及投與痘菌病毒接種家兔炎癥皮膚提取物而確認(rèn)表達(dá)改變的基因，可能是SART應(yīng)激負(fù)荷動物中疼痛閾值降低等的生理機(jī)能異常或者應(yīng)激性疾病的病因相關(guān)的基因，可能是痘菌接種家兔炎癥皮膚提取物相關(guān)的目標(biāo)基因。因此，當(dāng)這些基因的表達(dá)變化被被檢物質(zhì)介導(dǎo)而正?；瘯r(shí)，則該被檢物質(zhì)可能是對腰痛癥、頸肩腕綜合征、癥候性神經(jīng)痛、肩周炎、變形性關(guān)節(jié)炎、帶狀皰疹后神經(jīng)痛、RSD、纖維肌痛綜合癥等疼痛性疾病以及神經(jīng)性疼痛、自律神經(jīng)失調(diào)或者應(yīng)激導(dǎo)致的生理機(jī)能異常等有效的藥物。產(chǎn)業(yè)上的可利用性如上所述，根據(jù)本發(fā)明的方法，可以確認(rèn)能夠檢出并鑒定因SART應(yīng)激負(fù)荷以及投與痘菌病毒接種家兔炎癥皮膚提取物而表達(dá)改變的基因。因此，本發(fā)明作為通過對SART應(yīng)激負(fù)荷動物投與被檢物質(zhì)后對神經(jīng)組織的基因表達(dá)進(jìn)行分析，由此研究、判定或評價(jià)該被檢物質(zhì)的鎮(zhèn)痛作用、自律神經(jīng)失調(diào)的改善作用或抗應(yīng)激作用等的藥理作用的方法有用。權(quán)利要求1.一種對被檢物質(zhì)的藥理作用進(jìn)行研究、判定或評價(jià)的方法，其特征在于該方法基于對投入有被檢物質(zhì)的SART應(yīng)激負(fù)荷動物的神經(jīng)組織進(jìn)行的基因表達(dá)分析。2.如權(quán)利要求l所述的研究、判定或評價(jià)的方法，其特征在于-所述藥理作用為鎮(zhèn)痛作用、自律神經(jīng)失調(diào)改善作用或抗應(yīng)激作用。3.如權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)所述的研究、判定或評價(jià)的方法，其特征在于所述SART應(yīng)激負(fù)荷動物為大鼠。4.如權(quán)利要求13中任一項(xiàng)所述的研究、判定或評價(jià)的方法，其特征在于所述神經(jīng)組織為脊髓后根神經(jīng)節(jié)或脊髓后角。5.如權(quán)利要求14中任一項(xiàng)所述的研究、判定或評價(jià)的方法，其特征在于所述基因表達(dá)分析是采用DNA陣列的分析。6.如權(quán)利要求15中任一項(xiàng)所述的研究、判定或評價(jià)的方法，其特征在于-進(jìn)行基因表達(dá)分析，與正常動物進(jìn)行比較，將在SART應(yīng)激負(fù)荷動物中表達(dá)發(fā)生改變的基因作為指標(biāo)。7.如權(quán)利要求15中任一項(xiàng)所述的研究、判定或評價(jià)的方法，其特征在于-進(jìn)行基因表達(dá)分析，與未投入被檢物質(zhì)的SART應(yīng)激負(fù)荷動物進(jìn)行比較，將在投入有被檢物質(zhì)的SART應(yīng)激負(fù)荷動物中表達(dá)發(fā)生改變的基因作為指標(biāo)。8.如權(quán)利要求6或7所述的研究、判定或評價(jià)的方法，其特征在于作為表達(dá)發(fā)生改變的基因，以表1表5中記載的基因中的任1種或2種以上作為指標(biāo)。9.如權(quán)利要求18中任一項(xiàng)所述的研究、判定或評價(jià)的方法，其特征在于-所述被檢物質(zhì)為痘菌病毒接種炎癥組織的提取物。10.如權(quán)利要求9所述的研究、判定或評價(jià)的方法，其特征在于所述被檢物質(zhì)為痘菌病毒接種家兔炎癥皮膚的提取物。11.一種用權(quán)利要求18中任一項(xiàng)所述的方法進(jìn)行了研究、判定或評價(jià)的藥劑。12.如權(quán)利要求ll所述的藥劑，其特征在于-所述藥劑為鎮(zhèn)痛劑。13.如權(quán)利要求ll所述的藥劑，其特征在于所述藥劑為自律神經(jīng)失調(diào)治療劑。14.如權(quán)利要求ll所述的藥劑，其特征在于所述藥劑為抗應(yīng)激劑。15.如權(quán)利要求ll所述的藥劑，其特征在于-有效成分為痘菌病毒接種家兔炎癥皮膚的提取物。16.SART應(yīng)激負(fù)荷動物在權(quán)利要求18所述的研究、判定或評價(jià)的方法中的使用方法。17.SART應(yīng)激負(fù)荷動物在被檢物質(zhì)為痘菌病毒接種家兔炎癥皮膚的提取物的權(quán)利要求18所述的研究、判定或評價(jià)的方法中的使用方法。■全文摘要本發(fā)明提供一種在基因水平上對SART應(yīng)激負(fù)荷動物導(dǎo)致的病態(tài)以及被檢物質(zhì)對該病態(tài)的鎮(zhèn)痛作用、自律神經(jīng)失調(diào)的改善作用、抗應(yīng)激作用等藥理作用進(jìn)行研究、判定或評價(jià)的方法。對SART應(yīng)激負(fù)荷動物投入被檢物質(zhì)之后，對其神經(jīng)組織的基因表達(dá)變化進(jìn)行網(wǎng)羅式分析，由此在基因水平上對SART應(yīng)激負(fù)荷動物導(dǎo)致的病態(tài)以及該被檢物質(zhì)的藥理作用，特別是鎮(zhèn)痛作用、自律神經(jīng)失調(diào)的改善作用以及抗應(yīng)激作用進(jìn)行研究、判定或評價(jià)，從而能夠探索對疼痛性疾病、應(yīng)激性疾病、自律神經(jīng)失調(diào)等有效的物質(zhì)，對該物質(zhì)進(jìn)行效果的判定和評價(jià)，或者對該物質(zhì)的靶基因進(jìn)行分析。文檔編號C12Q1/68GK101528947SQ200780040398公開日2009年9月9日申請日期2007年9月5日優(yōu)先權(quán)日2006年9月6日發(fā)明者內(nèi)木充,岡田智行申請人:日本臟器制藥株式會社