專利名稱：Cpt基因芯片及其檢測(cè)方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因芯片，尤其涉及一種基于ZipCode序列的CPT基因芯片;此外， 本發(fā)明還涉及該基因芯片的檢測(cè)方法與應(yīng)用。
技術(shù)背景基因芯片是人類基因組計(jì)劃帶來(lái)的最具應(yīng)用價(jià)值的科研成果，它融合了生命科 學(xué)、化學(xué)、微電子技術(shù)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)和生命信息學(xué)等多種學(xué)科的最新技術(shù)。 隨著微加工技術(shù)的發(fā)展，高密度寡核苷酸芯片最高密度可達(dá)上百萬(wàn)個(gè)探針，因此基因 芯片通量水平并不受芯片技術(shù)本身制約，而是受樣本的處理和基因芯片設(shè)計(jì)方法的限 制。高通量單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)芯片在臨床 診斷中的應(yīng)用，仍有賴于DNA處理、芯片設(shè)計(jì)等方面的發(fā)展。直接用基因組DNA進(jìn)行SNP分型顯然可以避開DNA擴(kuò)增這一問題，并能同時(shí)對(duì)幾 百萬(wàn)的SNPs進(jìn)行分型。低等生物的基因組復(fù)雜性較低，已成功地利用芯片直接對(duì)基 因組DNA進(jìn)行了多態(tài)分析，這些生物包括酵母(基因組DNA約為12Mb)和擬南芥(基因 組DNA約為120Mb)。然而，人類基因組DNA雖已成功地應(yīng)用于cDNA、 BAC和寡核苷酸 芯片比較基因組雜交(comparative genomic hybridization, CGH)芯片(Ishkanian AS， Malloff CA， Watson SK， et al. A tiling resolution DNA microarray with complete coverage of the human genome. Nat Genet. 2004; 36: 299-303),但由 于人類基因組DNA的高度復(fù)雜性，直接進(jìn)行SNP分析的難度顯然要高于低等生物，從 約30億堿基對(duì)序列中鑒別一個(gè)SNP仍是一項(xiàng)艱巨的挑戰(zhàn)工作。通過近幾年的研究， 已有幾種技術(shù)可以對(duì)人類基因組DNA進(jìn)行SNP分型，包括膠體金檢測(cè)技術(shù)、侵入切割 (invasive cleavage)、侵入切割結(jié)合滾環(huán)擴(kuò)增(rolling circle amplification) 和等位基因特異性引物延伸法(allele-specific primer extension)結(jié)合信號(hào)級(jí)聯(lián) 放大等技術(shù)，但這些技術(shù)普遍存在DNA用量大、信噪比低、操作復(fù)雜或低多重水平等 缺點(diǎn)，它們?cè)诩膊』蚪M學(xué)和藥物基因組學(xué)等領(lǐng)域和臨床診斷方面的應(yīng)用，尚有待于 進(jìn)一步的發(fā)展和完善。另一方面，人類基因組約有2-2.5萬(wàn)個(gè)基因，涵蓋這些人類基 因組所有的基因和表達(dá)序列標(biāo)簽對(duì)于目前的表達(dá)譜芯片技術(shù)雖然簡(jiǎn)單，但卻往往無(wú)法檢測(cè)出表達(dá)水平低下的基因，即使應(yīng)用RNA線性擴(kuò)增技術(shù)也無(wú)法解決。提高探針長(zhǎng)度 可在一定程度上提高檢出率，然而探針長(zhǎng)度增加的同時(shí)，探針局部序列的特異性也大 為降低，從而造成假陽(yáng)性率大為增高。鑒于核酸擴(kuò)增技術(shù)不足以解決基因表達(dá)譜和SNP芯片存在的問題，如何放大熒光信號(hào)將是提高芯片檢測(cè)能力的關(guān)鍵所在。級(jí)聯(lián)放大由 于放大倍數(shù)有限，顯然不如侵入切割，這也反應(yīng)在基于這兩種技術(shù)的基因組DNA直接 進(jìn)行SNP分型所用的DNA量(GundersonKL， Steemers FJ, Lee G, et al. A genome-wide scalable SNP genotyping assay using microarray technology. Nat Genet. 2005; 37: 549-54)。侵入切割對(duì)靶DNA序列的檢測(cè)是通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)來(lái)實(shí)現(xiàn)。它高效的信號(hào)放大作用使得基因組DNA 不經(jīng)擴(kuò)增可直接進(jìn)行SNP分型，但最大的缺陷是信噪比低下，并且探針設(shè)計(jì)較為復(fù)雜， 其在SNP芯片中的最終應(yīng)用尚有待于進(jìn)一步發(fā)展和完善。循環(huán)探針技術(shù)(cycling probe technology, CPT)是另一種對(duì)靶DNA信號(hào)進(jìn)行放大 的技術(shù)(DuckP, Alvarado-Urbina G, BurdickB， et al. Probe amplifier system based on chimeric cycling oligonucleotides. Biotechniques. 1990; 9: 142-8)。 CPT探 針為一含DNA-RNA-DNA的嵌合體，長(zhǎng)約25-30個(gè)堿基，內(nèi)含4-6個(gè)連續(xù)的嘌呤核苷酸。其 原理是在等溫反應(yīng)中，探針與單鏈靶DNA序列雜交后，在核糖核酸酶H (RNase H)的作 用下，DNA-RNA-DNA探針中的RNA部分被特異性切割。RNase H是一種核糖核酸內(nèi)切酶， 它能夠特異性地水解雜交到DNA鏈上的RNA磷酸二酯鍵，故能分解RNA/DNA雜交體系中的 RNA鏈，該酶不能消化單鏈RNA、單鏈或雙鏈DNA。由于酶切后的探針片段的退火溫度遠(yuǎn) 低于反應(yīng)溫度，切割后的CPT探針的兩端DNA部分也隨之從靶DNA序列上脫落下來(lái)，使得 靶DNA序列又可以與完整的探針結(jié)合，從而提高了耙DNA序列的使用率。因此，每條耙DNA 序列能與許多條完整探針雜交結(jié)合，從而產(chǎn)生很多切割的探針片段，其量隨著時(shí)間而堆 積，呈線性擴(kuò)增。通過結(jié)合凝膠電泳或免疫學(xué)檢測(cè)分析，CPT已被成功地應(yīng)用于細(xì)菌及 耐藥檢測(cè)。由于CPT具有線性擴(kuò)增的特性，在探針的兩端DNA序列分別標(biāo)記上熒光基團(tuán)和 淬滅基團(tuán)，就可對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行放大，達(dá)到實(shí)時(shí)定量檢測(cè)的目的。并且RNase H對(duì) DNA-RNA-DNA探針的切割存在著序列依賴性，只有RNA部分與耙DNA序列完全匹配的探針 才能被切割，因此CPT也可用于SNP檢測(cè)。與侵入切割一樣，CPT最大的特點(diǎn)就是不需要這種鏈?zhǔn)降臄U(kuò)增反應(yīng)，它們是對(duì)DNA 或者RNA的信號(hào)進(jìn)行擴(kuò)增。并且由于不需要鏈?zhǔn)綌U(kuò)增過程，整個(gè)反應(yīng)過程只要控制在探針的退火溫度，不需要像PCR那樣反復(fù)升溫、降溫，因此可以節(jié)省很多時(shí)伺。并且CPT 與PCR不同，它們不是放大的靶DNA序列被檢測(cè)，因此可減少由于PCR自身污染造成的假陽(yáng)性。只有當(dāng)特異的DNA存在時(shí)，這種方法才能使信號(hào)分析累積，并可用多種儀器檢測(cè)。 相比于侵入切割，CPT僅設(shè)計(jì)一條序列特異性探針或兩條等位基因特異性探針，設(shè)計(jì)較 為簡(jiǎn)單，所能檢測(cè)的基因序列更多。另一方面，在侵入切割中，酶切后的探針片段中能 與靶DNA序列互補(bǔ)的序列長(zhǎng)度僅比完整的探針少一個(gè)堿基，探針片段和完整的探針與耙 DNA序列的退火與分離的動(dòng)力學(xué)基本一致，兩者與靶DNA序列的結(jié)合存在著競(jìng)爭(zhēng)。而CPT 探針與靶DNA序列結(jié)合后，是被RNaseH從中間部分切開，酶切后的探針片段的退火溫度 遠(yuǎn)低于反應(yīng)溫度，脫落的探針片段不太可能再結(jié)合到靶DNA序列上，這使得CPT的信號(hào)放 大效應(yīng)遠(yuǎn)高于侵入切割。因此，若將CPT應(yīng)用于基因芯片中，產(chǎn)生的信噪比將明顯優(yōu)于 侵入切割，能大幅提高低表達(dá)基因的檢出率，并降低基因組DNA直接進(jìn)行SNP分型的難度， 更加適用于高通量、大規(guī)模的核酸檢測(cè)。當(dāng)前SNP芯片和表達(dá)譜芯片的技術(shù)已較為完善，但遠(yuǎn)不能滿足生物醫(yī)學(xué)研究和 臨床檢測(cè)診斷所需。在不影響準(zhǔn)確率的情況下，如何提高表達(dá)水平低下的基因的表達(dá) 譜芯片檢出率，如何將基因組DNA以最少的量直接應(yīng)用于SNP芯片檢測(cè)， 一直是當(dāng)今 基因芯片技術(shù)的難點(diǎn)所在。雖然核酸擴(kuò)增或級(jí)聯(lián)放大能在一定程度上提高熒光信號(hào)， 但這些技術(shù)不能根本性解決這些問題，并且操作相對(duì)較為復(fù)雜。通過改變傳統(tǒng)的每個(gè) 靶DM序列只與一條探針雜交的策略，從增加每條靶DM序列所能雜交的探針數(shù)目來(lái) 提高每條靶DNA序列的使用率，以達(dá)到放大熒光信號(hào)的目的。其高效的信號(hào)放大效應(yīng)， 不僅使樣本不需任何放大或擴(kuò)增處理即可用于芯片雜交檢測(cè)，而且能使基因組DNA更 易于直接進(jìn)行芯片檢測(cè)，大幅提高表達(dá)譜芯片中表達(dá)水平低下的基因的檢出率。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種CPT基因芯片，該芯片可有效放大檢測(cè) 信號(hào)，從而顯著提高表達(dá)譜芯片中表達(dá)水平低下的基因的檢出率。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供一種應(yīng)用上述基因芯片進(jìn)行檢測(cè)的方法。 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之三是提供上述基因芯片在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用。 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn) 在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種CPT基因芯片，包括DNA-RNA-DNA探針和固定 在固相載體上的Zip探針，所述DNA-RNA-DNA探針一端的DNA片段末端連接有與Zip探針互補(bǔ)的ZipCode序列。所述DNA-RNA-DNA探針可在連接有ZipCode序列的一端DNA片段上標(biāo)記有熒光基 團(tuán)，并在另一端DNA片段上標(biāo)記有淬滅基團(tuán)。所述DNA-RNA-DNA探針可在連接有ZipCode序列的一端DNA片段上不標(biāo)記熒光或淬 滅基團(tuán)，在另一端DNA片段上進(jìn)行標(biāo)記，該標(biāo)記包括熒光素標(biāo)記、生物素標(biāo)記、放 射性元素標(biāo)記、電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記和酶標(biāo)記。本發(fā)明中所述固相基質(zhì)可選用本領(lǐng)域周知的基質(zhì)，只要所述基質(zhì)與所述反應(yīng)物相 容，不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果就可以。所述DNA-RNA-DNA探針的序列與靶DNA序列互補(bǔ)，優(yōu)選該探針的RNA序列與靶DNA序 列完全互補(bǔ)，該探針的RNA序列與探針任何序列的連續(xù)互補(bǔ)堿基數(shù)不超過3個(gè)。所述DNA-RNA-DNA探針的退火溫度為37 75t 。所述DNA-RNA-DNA探針序列可包含1 10個(gè)錯(cuò)配堿基，較佳地，可包含1 5個(gè) 錯(cuò)配堿基，更佳地，可包含1 2個(gè)錯(cuò)配堿基。本發(fā)明基因芯片還包括至少一種對(duì)照探針，所述對(duì)照探針選自陰性對(duì)照探針、 陽(yáng)性對(duì)照探針和固定化對(duì)照探針。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種應(yīng)用上述基因芯片進(jìn)行檢測(cè)的方法，包括如下 步驟(1) 獲取待測(cè)樣品核酸；(2) 將上述的DNA-RNA-DNA探針和待測(cè)樣品核酸在含RNase H酶的溶液中進(jìn)行酶 切，并使其反應(yīng)足夠時(shí)間；(3) 在適于與所述Zip探針進(jìn)行雜交的條件下，在固定有該Zip探針的芯片上加 入含步驟(2)酶切產(chǎn)物的雜交液，并使其反應(yīng)足夠時(shí)間；(4) 洗滌后檢測(cè)雜交反應(yīng)的結(jié)果。本發(fā)明中的RNase H酶包括耐高溫和不耐高溫RNase H酶，耐高溫RNase H酶在 變性前后均可加入，而不耐高溫RNase H酶在變性冷卻后加入。所述的雜交溫度為25"C 72'C，所述雜交時(shí)間為1分鐘 40小時(shí)?？梢愿淖冸s交條 件以提高或降低雜交的嚴(yán)謹(jǐn)程度、雜交特異性。所述雜交結(jié)果在檢測(cè)前的洗滌可使用任何適當(dāng)?shù)南礈煲?，該洗滌液可含? 3% (w/w)的表面活性劑，洗滌可持續(xù)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，如1 30分鐘?？梢杂檬覝氐南礈煲哼M(jìn)行洗滌，或預(yù)熱后洗滌，如42'C?？捎貌煌南礈煲合群筮M(jìn)行洗滌。在本發(fā)明的另一方面，還提供了本發(fā)明的基因芯片在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用。本發(fā)明的CPT基因芯片，使基因芯片的檢測(cè)能力達(dá)到新的高度，不僅大幅提高表 達(dá)譜芯片中表達(dá)水平低下的基因的檢出率，而且由于本發(fā)明CPT探針?biāo)腪ipcode 序列與被檢測(cè)物種的基因組DNA不存在同源性，使該基因芯片的非特異性雜交大大減 少，此外，本發(fā)明RNaseH酶的酶切反應(yīng)在液相進(jìn)行，比原先在固相載體上反應(yīng)效率更高。


圖1是本發(fā)明的芯片雜交與信號(hào)放大的原理圖； 圖2是本發(fā)明的芯片雜交與信號(hào)降低的原理圖；圖3是本發(fā)明實(shí)施例2的芯片雜交結(jié)果圖； 圖4是本發(fā)明實(shí)施例3的芯片雜交結(jié)果圖；圖5是本發(fā)明實(shí)施例5的芯片雜交結(jié)果圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅 用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 CPT探針和Zip探針設(shè)計(jì)和芯片制備1. CPT探針設(shè)計(jì)探針的設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)如下1)所選擇的基因或SNP位點(diǎn)側(cè)翼的序列經(jīng)Blast,排除 序列特異性差的基因序列或SNPs，以免造成非特異性雜交；2) SNP位點(diǎn)處于RNA序 列中，并位于探針的中間部分；3)探針退火溫度48-6(TC之間，兩端DNA部分的退火 溫度比整條探針至少低15t:，使酶切后的探針片段與靶DNA序列分離；4)探針自身 互補(bǔ)序列不超過3個(gè)堿基對(duì)，并且探針之間不得形成二聚體，特別是RNA序列，以免 產(chǎn)生高熒光背景；5)進(jìn)行SNPBlast，確保探針序列在目的SNP位點(diǎn)外，無(wú)其他多態(tài) 位點(diǎn)，以免影響雜交效率。2. ZipCode設(shè)計(jì)ZipCode的設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)如下1 ) Zipcode序列與被檢測(cè)物種的基因組DNA不存在同 源性，特別是目的基因或SNP,因此Zipcode序列能有效減少非特異性雜交；2)探針 長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)；3)退火溫度不低于6(TC: 4)自身互補(bǔ)序列不超過8個(gè)堿基對(duì)。3. ZipCode芯片的制備(1) 與ZipCode序列互補(bǔ)的Zip探針溶解ZipCode序列互補(bǔ)的Zip探針合成，先在Zip探針的5'端加上一段連接臂，再 將每條探針用TE溶液稀釋，終濃度為10 mM。將濃度為10 mM的探針與濃度為200 mM 的PBS溶液于384孔板中等體積混合，以粘膠片封好384孔板，室溫下振蕩2分鐘， 離心，-2(TC保存，以備點(diǎn)樣使用。(2) 點(diǎn)樣將預(yù)先設(shè)計(jì)并合成好的探針通過接觸式點(diǎn)樣或噴墨式點(diǎn)樣點(diǎn)載到玻片、硅片等材 質(zhì)的固相載體片基上，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性和陰性對(duì)照。片基采用Cell Associates CSS-100 醛基片基，GeneMachine公司的OrainigridlOO型號(hào)的點(diǎn)樣儀，在濕度65—75% (以 FullMoon片基為準(zhǔn))，溫度為25t:的條件下點(diǎn)樣，點(diǎn)樣的格式為1X3，每個(gè)矩陣為8 X18，點(diǎn)樣完畢后，放置半小時(shí)后，將芯片取出，室溫干燥保存。實(shí)施例2應(yīng)用具有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的CPT探針對(duì)基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)1.目的基因擴(kuò)增(1) 引物序列弓l物1F5， -gtcgcaacctggtgcctataa-3， (SEQ ID N0:1); 引物1R5， -tgctataagccagctgagagattt-3， (SEQIDN0:2); 弓I物2F5， -3agccaaggctatgacattct-3， (SEQIDN0:3); 弓I物2R5， -aattcccggagaacttgtgct-3， (SEQIDN0:4)。(2) 探針序列CY3是熒光基團(tuán)，ECLIPSE是淬滅基團(tuán)，中間括號(hào)內(nèi)大寫堿基序 列為RNA序列。rsl3431727-A5' -GATGATCGACGAGACACTCTCGCCA-ggcctt(Cy3)(ATAG)g(ECLIPSE)ggaattta-3， (SEQ ID NO:5);rsl3431727-T5， -ACGACTGCGAGGTGCGGTAAGCACA-ggcctta(Cy3)(TTGG)g(ECLIPSE)gaattta-3， (SEQ ID N0:6);rsl3431727-C5' -CGGTCGACGAGCTGCCGCGCAAGAT-ggcctta(Cy3)(TCGG)g(ECLIPSE)gaattta-3， (SEQID N0:7);rsl146808-A5， -GCGATCGCCGGGAGATATACCCAAC-ggaaatgt(Cy3)(TATC)a(ECLIPSE)aattatctg-3，( SEQ ID NO:8); rsl146808-C5， -GACATTCGCGATCGCCGCCCGCTTT-ggaaatgt(Cy3)(TCTC)a(ECLIPSE)aattatct-3， (SEQ ID NO:9); rsl146808-C5 ， —TGGTGGGGGAGTGGAGGAGGAATAG-ggaaatgt(Gy3)(TGTG)a(EGLIPSE)aattatct—3 ， (SEQ ID NO:10)。用SEQ ID NO:l 4所示序列的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在60 W反應(yīng)體系進(jìn)行，反 應(yīng)體系是0.3 mM dNTP、 10 mM Tris-HCl、 50 mM KCl、 2 mM MgCl2、 20% Q solution (Qiagen)、上游和下游引物的濃度0. 16 MM、基因組DNA 60ng, Taq酶1. 2 U(Takara)。 應(yīng)用Touch-down PCR反應(yīng)程序[Don RH, Cox PT， Wainwright BJ, Baker K, Mattick JS- 'Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acids Res. 1991， 19: 4008]: 94。C變性5 mins; 94。C變性40 s, 64。C退 火lmin，每個(gè)循環(huán)降低0.5。C， 72。C延伸30 s，共10個(gè)循環(huán)；然后94"C變性40 s， 59。C退火40 s， 72。C延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5 mins。2. PCR產(chǎn)物單鏈化處理取上述PCR產(chǎn)物5 W，進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系含O. 3 mM dNTP、 10 mM Tris-HC1、 50 mM KC1、 2 mM MgCl2、 20% Q solution (Qiagen)、下游引物的濃度0. 16 MM和Taq 酶0.6U (Takara)。 PCR循環(huán)參數(shù)94。C變性5 min;然后94。C變性40s， 56。C退火 40 s， 72。C延伸50 s，共35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Cat. No. 28106)純化，操作按照試劑盒說(shuō)明書。3. 酶切反應(yīng)將上述的PCR產(chǎn)物95。C變性10分鐘，立即置于冰上，加入RNase H混勻，用于 酶切反應(yīng)。反應(yīng)體系275 mM KCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8. 3 @ 25°C)， 3 mM MgCl" 10 mM DTT， 0.05% SDS, 15 U RNase H， 200 ng純化PCR產(chǎn)物，1 nM CPT探針。60 'C溫浴15分鐘，隨后加入1 pi的0. 1 M EDTA終止反應(yīng)。4.雜交和洗漆酶切產(chǎn)物與等量的雜交液混合，用ZipCode芯片進(jìn)行雜交，55°C 1小時(shí)。然后用 含0. 5X SSC和0. 1% SDS洗液洗滌5分鐘，最后用ddH20洗滌15秒。 5.檢測(cè)雜交結(jié)果芯片雜交與信號(hào)放大的原理如圖1所示，當(dāng)RNase H從中間RNA部分切開探針， 標(biāo)記有淬滅基團(tuán)的游離端DNA片段和連接有ZipCode序列并標(biāo)記有熒光基團(tuán)的DNA片 段分開，當(dāng)ZipCode序列再與ZipCode芯片上的Zip探針雜交，并通過洗滌去除淬滅 基團(tuán)后，使芯片的熒光信號(hào)放大。洗滌后的芯片，經(jīng)甩干后，即可用激光掃描儀進(jìn)行掃描(這里用的是GenePix 4000B共聚焦激光掃描儀，也可以用其他的激光掃描儀)。掃描雜交后的芯片得到的 雜交結(jié)果如圖3所示，再用GenePixPro處理圖像得到數(shù)據(jù)文件，然后對(duì)數(shù)據(jù)文件進(jìn) 行分析就可以判斷目的序列。實(shí)施例3應(yīng)用僅有熒光基團(tuán)的CPT探針對(duì)基因組DNA進(jìn)行檢測(cè) 1.目的基因擴(kuò)增(1) 引物序列弓l物1F5， -gtcgcaacctggtgcctataa-3， (SEQ ID N0:1); 弓l物1R5， -tgctataagccagctgag卿ttt-3， (SEQID歐2); 弓i物2F5， -aagccaaggctatgacattct-3，(SEQ ID N0:3); 弓I物2R5， -aattcccggagaacttgtgct-3，(SEQ ID N0:4)。(2) 探針序列CY3是熒光基團(tuán)，中間括號(hào)內(nèi)大寫堿基序列為RNA序列。 rsl3431727-A5， -GATGATCGACGAGACACTCTCGCCA-ggcctt(ATAG)gggaattta(Cy3)-3， (SEQID N0:11); rsl3431727-T5， -ACGACTGCGAGGTGCGGTAAGCACA-ggcctta(TTGG)ggaattta(Cy3)-3， (SEQID N0:12); rsl3431727-C5， -CGGTCGACGAGCTGCCGCGCAAGAT-ggcctta(TCGG)ggaattta(Cy3)-3, (SEQID N0:13); rsl146808-A5' -GCGATCGCCGGGAGATATACCCAAC-ggaaatgt(TATC)aaattatctg(Cy3)-3' (SEQ ID NO:14);rsl146808-C5， -GACATTCGCGATCGCCGCCCGCTTT-ggaaatgt(TCTC)aaattatct(Cy3)-3， (SEQ ID NO:15); rsl146808-C5' -TCGTGCCGGACTCGAGCACCAATAC-ggaaatgt(TGTC)aaattatct(Cy3)-3 ， (SEQ ID NO: 16)。用SEQ ID N0:1 4所示序列的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在60 W反應(yīng)體系進(jìn)行，反 應(yīng)體系是0.3 mM dNTP、 10 mM Tris-HC1、 50 mM KC1、 2 mM MgCl2、 20% Q solution (Qiagen)、上游和下游引物的濃度0. 16幽、基因組DNA 60ng， Taq酶1. 2 U(Takara)。 應(yīng)用Touch-down PCR反應(yīng)程序(同實(shí)施例2): 94。C變性5 mins; 94t變性40 s， 64 t:退火l min，每個(gè)循環(huán)降低0.5'C， 72。C延伸30 s，共10個(gè)循環(huán)；然后94'C變性 40 s， 59。C退火40 s， 72。C延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5 mins。2.接著依次進(jìn)行PCR產(chǎn)物單鏈化處理、酶切反應(yīng)、雜交和洗滌，具體操作步驟 和反應(yīng)條件同實(shí)施例2。 3.檢測(cè)雜交結(jié)果芯片雜交與信號(hào)降低的原理如圖2所示，當(dāng)RNase H從中間RNA部分切開探針， 標(biāo)記有熒光基團(tuán)的游離端DNA片段和連接有ZipCode序列的DNA片段分開，當(dāng)ZipCode 序列再與ZipCode芯片上的Zip探針雜交，并通過洗滌去除熒光基團(tuán)后，使芯片的熒 光信號(hào)降低。洗滌后的芯片，經(jīng)甩干后，即可用激光掃描儀進(jìn)行掃描(這里用的是GenePix4000B共聚焦激光掃描儀，也可以用其他的激光掃描儀)。掃描雜交后的芯片得到的雜交結(jié)果如圖4所示，再用GenePixPro處理圖像得到數(shù)據(jù)文件，然后對(duì)數(shù)據(jù)文件進(jìn)行分析就可以判斷目的序列。實(shí)施例4應(yīng)用具有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的CPT探針對(duì)RNA進(jìn)行檢測(cè) 1.總RNA抽提(TRIzol法)(1) 100mg甲狀腺組織可以加入l ml Trizol，用液氮研磨或采用電動(dòng)勻漿器充分 打碎組織塊。(2) 加入約l/5體積的氯仿，上下顛倒充分混勻l分鐘左右，室溫下靜置5分鐘。 (3M。C, 12,000 rpm離心15分鐘后小心將上清液轉(zhuǎn)入新的1. 5 ml離心管，加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置5分鐘。(4) 4°C， 12000 rpm離心10分鐘后，去上清，向沉淀中加入2/5體積的70%乙醇， 4°C， 12000 rpm離心洗滌沉淀15分鐘。(5) 去上清，沉淀室溫晾千后加入適量無(wú)RNA酶的水充分溶解沉淀，測(cè)定A26。和A28。值c2. cDNA探針的制備(1)從-70冰箱中取出RNA，在室溫下解凍，然后在0.2mlPCR管中配制反應(yīng)溶液?？俁NA隨機(jī)引物6聚體(5pg/Vl) 10 mM dNTP mix 無(wú)核酸酶的水51 pi 1 nlX pl (補(bǔ)充水至12^1)總體積12 pi(2) 7CTC預(yù)變性10 min，立即置于冰上冷卻2 min，隨后在PCR管中配制cDNA第 一鏈合成反應(yīng)體系5X first-strand buffer 4 jxl0. 1 M DTT 2 piRNA抑制劑 1 pi總體積19 )al42。C保溫2 min后加入l pi Superscript II (200U/ pi) (Invitrogen， USA)。(3) 42。C保溫2小時(shí)，70。C變性10 min。 3.酶切反應(yīng)探針序列CY3是熒光基團(tuán)，ECLIPSE是淬滅基團(tuán)，中間括號(hào)內(nèi)大寫堿基序列為 RNA序列。rsl3431727-A5， -GATGATCGACGAGACACTCTCGCCA-ggcctt(Cy3)(ATAG)g(ECLIPSE)ggaattta-3' (SEQ ID NO:5);rsl3431727-T5， -ACGACTGCGAGGTGCGGTAAGCACA-ggcctta(Cy3)(TTGG)g(ECLIPSE)gaattta-3， (SEQ ID NO:6);rsl3431727-C5， -CGGTCGACGAGCTGCCGCGCAAGAT-ggcctta(Cy3)(TCGG)g(ECLIPSE)gaattta-3' (SEQ ID NO:7)。cDNA于95"變性10分鐘，立即置于冰上，加入RNaseH混勻，用于酶切反應(yīng)。 反應(yīng)體系275 mM KCl， 50 mM Tris-HCl (pH 8. 3 @ 25°C), 3 mM MgCl2， 10 mM DTT， 0.05% SDS， 20 U RNase H， 1 nM CPT探針，15 cDNA。 60。C溫浴60分鐘。4.雜交和洗滌酶切產(chǎn)物與等量的雜交液混合，用ZipCode芯片進(jìn)行雜交，55°C l小時(shí)。然后用 含0. 5X SSC和0.1% SDS洗液洗漆5分鐘，最后用ddH20洗滌15秒。洗滌后的芯片，經(jīng)甩干后，即可用激光掃描儀進(jìn)行掃描(這里用的是GenePix 4000B共聚焦激光掃描儀，也可以用其他的激光掃描儀)。掃描雜交后的芯片得到的 雜交結(jié)果圖，再用GenePix Pro處理圖像得到數(shù)據(jù)文件，然后對(duì)數(shù)據(jù)文件進(jìn)行分析就可以判斷基因表達(dá)情況。實(shí)施例5應(yīng)用具有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的CPT探針進(jìn)行DNA直接雜交的檢測(cè) 探針序列CY3是熒光基團(tuán)，ECLIPSE是淬滅基團(tuán)，中間括號(hào)內(nèi)大寫堿基序列為RNA序列。Wa2 5， -ACGACTGCGAGGTGCGGTAAGCACA-cttgtcga(Cy3)(TTCTT)C(ECLIPSE)ttgggat (SEQ ID NO:17);WaZ 5， - CGGTCGACGAGCTGCCGCGCAAGAT-gccaagag (Cy3) (GTAAT)G(ECLIPSE)aaggaa (SEQ ID NO:18);EH10 5' - GCGATCGCCGGGAGATATACCCAAC-ccatctcg(Cy3) (AAAAA)A(ECLIPSE)cggtgaa (SEQ ID NO:19);EH15， -GACATTCGCGATCGCCGCCCGCTTT-tcagtaccta(Cy3) (AAAGA)T(ECLIPSE)attcagct (SEQ ID NO:20)。抽提的DNA用DNase I進(jìn)行片段化，反應(yīng)體系包括<formula>formula see original document page 13</formula>37。C溫浴5 min，然后95°C 15 min。片段化產(chǎn)物95。C變性IO分鐘，立即置于冰上，加入RNaseH混勻，用于酶切。 反應(yīng)體系275幽KC1, 50 mM Tris-HC1 (pH 8. 3 @ 25°C), 3 mM MgCl2， 10 mM DTT， 0.05% SDS， 20 U RNase H， 1 nM CPT探針。5(TC溫浴120分鐘。然后酶切產(chǎn)物與等 量的雜交液混合，用ZipCode芯片進(jìn)行雜交，55°C 1小時(shí)。然后用含0.5X SSC和 0. 1% SDS洗液洗條5分鐘，最后用ddH20洗滌15秒。洗滌后的芯片，經(jīng)甩干后，即可用激光掃描儀進(jìn)行掃描(這里用的是GenePix 4000B共聚焦激光掃描儀，也可以用其他的激光掃描儀)。掃描雜交后的芯片得到的 雜交結(jié)果如圖5所示，再用GenePixPro處理圖像得到數(shù)據(jù)文件，然后對(duì)數(shù)據(jù)文件進(jìn) 行分析就可以判斷目的序列。實(shí)施例6應(yīng)用僅有熒光基團(tuán)的CPT探針進(jìn)行DNA直接雜交的檢測(cè)探針序列CY3.是熒光基團(tuán)，ECLIPSE是淬滅基團(tuán)，中間括號(hào)內(nèi)大寫堿基序列為 RNA序列。Wa2 5， -ACGACTGCGAGGTGCGGTMGCACA-cttgtcga (TTCTT)Cttgggat (Cy3) (SEQ ID NO:21);/WaZ 5， -CGGTCGACGAGCTGCCGCGCAAGAT-gccaagag(GTAAT)Gaaggaa(Cy3) (SEQ ID NO:22);EH10 5， -GCGATCGCCGGGAGATATACCCAAC-ccatctcg(AAAAA)Acggtgaa(Cy3) (SEQ ID NO:23);EH1 5, -GACATTCGCGATCGCCGCCCGCTTT-tcagtaccta(AAAGA)Tattcagct(Cy3) (SEQ ID NO:24)。抽提的DNA用DNase I進(jìn)行片段化，反應(yīng)體系包括<formula>formula see original document page 14</formula>37。C溫浴5 min，然后95°C 15 min。片段化產(chǎn)物95。C變性IO分鐘，立即置于冰上，加入RNase H混勻，用于酶切。 反應(yīng)體系275 raM KCl， 50 raM Tris-HC1 (pH 8. 3 @ 25°C)， 3 mM Mgcl2， 10mM DTT, 0.05%SDS, 20U RNase H, 1 nM CPT探針。50。C 溫浴120分鐘。然后酶切產(chǎn)物與等量的雜交液混合，用ZipCode芯片進(jìn)行雜交，55°C 1小時(shí)。然后用含0.5X SSC和 0. 1% SDS洗液洗滌5分鐘，最后用ddH20洗滌15秒。洗滌后的芯片，經(jīng)甩干后，即可用激光掃描儀進(jìn)行掃描(這里用的是GenePix 4000B共聚焦激光掃描儀，也可以用其他的激光掃描儀)。掃描雜交后的芯片得到雜 交結(jié)果圖，再用GenePixPro處理圖像得到數(shù)據(jù)文件，然后對(duì)數(shù)據(jù)文件進(jìn)行分析就可 以判斷目的序列。序 列 表〈110〉上海生物芯片有限公司〈120> CPT基因芯片及其檢測(cè)方法和應(yīng)用<130> NP-07-11228〈160〉 24〈170〉 Patentln version 3.3〈210> 1<211〉 21〈212> DNA <213>人工序列<220〉〈221> misc一feature〈223> 引物<400〉 1gtcgcaacct ggtgcctata a 21<210> 〈211〉 〈212> <213〉〈220> <221> 〈223〉224 腿人工序列misc—feature 引物—〈400> 2tgctataagc cagctgagag attt 24<210> 〈211〉 <212> <213〉〈220〉 <221〉 <223〉321 腿人工序列misc—feature 引物<400> 3aagccaaggc tatgacattc t 21〈210〉 4〈211〉 21<212> DNA〈213> 人工序列〈220〉〈221> misc—feature<223> 引物〈400〉 4aattcccgga gaacttgtgc t 21〈210> 5〈211〉 44〈212〉 腿 <213>人工序列〈220〉〈221〉 misc—feature〈222〉 (1)..(25)〈220>〈221〉 modified—base〈222〉 (31).. (31)〈220〉〈221> modified—base〈222〉 (36)..(36)<400> 5gatgatcgac g卿cactct cgccaggcct tataggggaa ttta 44〈210> 6〈211> 44<212> DNA 〈213〉人工序列〈220>〈221> misc—feature〈222> (l)..咖〈220>〈221> modified—base<222〉 (32). .(32) <220〉〈221〉 modified—base<222> (37)..(37)<400> 6acgactgcga ggtgcggtaa gcacaggcct tattggggaa ttta 44〈210〉 7<211> 44〈212〉 DNA 〈213〉人工序列<220>〈221> misc—feature〈222〉 (1)..(25)<220〉<221〉 modified—base〈222〉 (32).. (32)<220><221> modified—base<222> (37)..(37)<400〉 7cggtcgacga gctgccgcgc aagatggcct tatcggggaa ttta 44〈210〉 8〈211> 47〈212> DNA 〈213>人工序列〈220>〈221〉 misc—feature〈222> (1)..(25)<220><221> modified—base〈222> (33). .(33)<220><221> modified—base〈222〉 (38).. (38)〈400〉 8gcgatcgccg ggagatatac ccaacggaaa tgttatcaaa ttatctg 47<210> 9〈211> 46<212> DNA 〈213>人工序列〈220><221> misc—feature〈222〉 (1)..(25)〈220>〈221> modified—base〈222> (33).. (33)〈220〉<221> modified—base<222〉 (38).. (38)<400> 9gacattcgcg atcgccgccc gctttggaaa tgttctcaaa ttatct 46〈210〉 10〈211> 46<212> DNA 〈213>人工序列〈220〉〈221> misc一feature <222> (1)..(25)<220>〈221> modified—base 〈222〉 (33).. (33)〈220〉〈221> modified—base 〈222〉 (38).. (38)〈400> 10tcgtgccgga ctcgagcacc aatacggaaa tgttgtcaaa ttatct 46〈210〉 11〈211> 44<212> DNA〈213> 人工序列〈220〉〈221> misc一feature〈222> (1)..(25)<220>〈221〉 modified—base〈222〉 (44).. (44)〈400〉 11gatgatcgac gagacactct cgccaggcct tataggggaa ttta 44<210〉 12<211> 44<212> DNA 〈213>人工序列〈220〉<221> misc一feature〈222> (1)..(25)〈220>〈221〉 modified—base〈222〉 (44).. (44)〈400〉 12acgactgcga ggtgcggtaa gcacaggcct tattggggaa ttta 44〈210〉 13〈211> 44〈212〉 DNA〈213> 人工序列<220><221> misc一feature〈222> (1)..(25)<220>〈221〉 modified—base〈222〉 (44)..(44)〈400〉 13cggtcgacga gctgccgcgc aagatggcct tatcggggaa ttta 44〈210〉 14<211> 47 〈212〉腿 <213>人工序列〈220〉〈221〉 misc—feature〈222> (1)..(25)〈220〉<221> modified—base〈222> (47).. (47)〈400〉 14gcgatcgccg ggagatatac ccaacggaaa tgttatcaaa ttatctg 47<210> 15〈211〉 46<212> 腿 <213>人工序列〈220〉〈221〉 misc—feature〈222> (1)..(25)〈220〉<221> modified—base〈222> (46).. (46)<400> 15gacattcgcg atcgccgccc gctttggaaa tgttctcaaa ttatct 46〈210〉 16〈211〉 46〈212> 腿 <213〉人工序列〈220〉<221> misc feature〈222> (1)..(25) 〈220〉<221> modified—base〈222> (46) . (46)<400〉 16tcgtgccgga ctcgagcacc aatacggaaa tgttgtcaaa ttatct 46〈210〉 17〈211> 46〈212〉 腿 〈213〉人工序列〈220><221> misc—feature〈222> (1)..(25)〈220〉<221> modified—base〈222〉 (33).. (33)〈220>〈221> modified—base <222> (39).. (39)〈400〉 17acgactgcga ggtgcggtaa gcacacttgt cgattcttct tgggat 46〈210〉 18〈211> 45〈212> 腿〈213〉 人工序列〈220〉〈221〉 misc—feature 〈222〉 (1)..(25)<220>〈221> modified—base <222〉 (33).. (33)<220><221〉 modified—base〈222〉 (39)..(39)<400〉 18cggtcgacga gctgccgcgc aagatgccaa gaggtaatga aggaa 45<210> 19<211> 46〈212〉 DNA 〈213〉人工序列〈220>〈221> misc—feature〈222〉 (1)..(25)<220>〈221〉 modified—base〈222〉 (33).. (33)<220>〈221> modified_base〈222〉 (39).. 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權(quán)利要求
1. 一種CPT基因芯片，包括DNA-RNA-DNA探針和固定在固相載體上的Zip探針，其特征在于，所述DNA-RNA-DNA探針一端的DNA片段末端連接有與Zip探針互補(bǔ)的ZipCode序列。
2. 如權(quán)利要求1所述的CPT基因芯片，其特征在于，所述DNA-RNA-DNA探針可在連 接有ZipCode序列的一端DNA片段上標(biāo)記有熒光基團(tuán)，并在另一端DNA片段上標(biāo)記有淬 滅基團(tuán)。
3. 如權(quán)利要求1所述的CPT基因芯片，其特征在于，所述DNA-RNA-DNA探針可在連 接有ZipCode序列的一端DNA片段上不標(biāo)記熒光或淬滅基團(tuán)，在另一端DNA片段上進(jìn)行 標(biāo)記。
4. 如權(quán)利要求3所述的CPT基因芯片，其特征在于，所述另一端DNA片段上的標(biāo)記 包括熒光素標(biāo)記、生物素標(biāo)記、放射性元素標(biāo)記、電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記和酶標(biāo)記。
5. 如權(quán)利要求1所述的CPT基因芯片，其特征在于，所述DNA-RNA-DNA探針的退火 溫度為37 75t:。
6. —種應(yīng)用權(quán)利要求1所述的CPT基因芯片進(jìn)行檢測(cè)的方法，其特征在于，包括 如下步驟(1) 獲取待測(cè)樣品核酸；(2) 將權(quán)利要求1所述的DNA-RNA-DNA探針和待測(cè)樣品核酸在含RNase H酶的溶 液中進(jìn)行酶切，并使其反應(yīng)足夠時(shí)間；(3) 在適于與所述Zip探針進(jìn)行雜交的條件下，在固定有該Zip探針的芯片上加 入含步驟(2)酶切產(chǎn)物的雜交液，并使其反應(yīng)足夠時(shí)間；(4) 洗滌后檢測(cè)雜交反應(yīng)的結(jié)果。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述的RNaseH酶包括耐高 溫和不耐高溫RNase H酶。
8. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的步驟(3)中雜交溫度為25'C 72°C，雜交時(shí)間為1分鐘 40小時(shí)。
9. 權(quán)利擎求1所述的CPT基因芯片在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種CPT基因芯片，包括DNA-RNA-DNA探針和固定在固相載體上的Zip探針，所述DNA-RNA-DNA探針一端的DNA片段末端連接有與Zip探針互補(bǔ)的Zip Code序列。本發(fā)明還公開了應(yīng)用上述基因芯片進(jìn)行檢測(cè)的方法以及該芯片在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用。本發(fā)明的CPT基因芯片不僅大幅提高低表達(dá)基因的檢出率，而且使芯片的非特異性雜交明顯降低。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101225434SQ20071003660
公開日2008年7月23日 申請(qǐng)日期2007年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月18日
發(fā)明者盛海輝, 肖華勝 申請(qǐng)人:上海生物芯片有限公司