專利名稱：Prm1基因的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因，尤其涉及一種PRM1基因的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大結(jié)腸癌是我國常見腫瘤之一，占全國惡性腫瘤死因的第五位。且大結(jié)腸癌的發(fā)
病率呈逐年升高趨勢，并且發(fā)病年齡趨于年輕化。我國每年約有13萬人新發(fā)大結(jié)腸
癌，發(fā)病率的增速是世界平均水平的兩倍，達到年均4%，目前大結(jié)腸癌在我國大部分
地區(qū)已經(jīng)成為發(fā)病率上升最快的惡性腫瘤之一。因此尋找有效的免疫治療靶點十分重
要(S Zheng， SR Cai. Colorectal cancer epidemiology and prevention study in
china. The Chinese-German J Clinical Oncology, 2003，2:72-75)。
腫瘤-睪丸(cancer-testis, CT)基因可在多種組織來源的腫瘤中表達，但在人類正
常組織中僅限于睪丸的生殖細胞中表達。因為生殖細胞不表達人類白細胞抗原分子，
并且體內(nèi)存在血-睪屏障，所以睪丸組織表達的CT抗原不會引起機體免疫反應(yīng)，而表達
于腫瘤組織的CT抗原，會引起特異性免疫反應(yīng)，因此這類抗原又被視為具有腫瘤特異
性。利用這一特性，發(fā)現(xiàn)與腫瘤相關(guān)的特異性CT基因，可促進抗原特異性腫瘤疫苗的
發(fā)展，為腫瘤免疫治療提供新的機遇(ELke J, Dirk J， Knuth Alexander. Clinical
cancer vaccine trials. Curr Opin Immunol, 2002, 14 (2): 178 - 182)。
PRM1 (Protamine 1)基因，又稱為精蛋白Pl，定位于染色體16P13. 2上，全長為
426個堿基，含有2個外顯子，2個內(nèi)含子，編碼一個含有50個氨基酸的核蛋白
(Choudhary， S. K. ; Wykes. A haploid expressed gene cluster exists as a single chromatin domain in human sperm. J. Biol. Chem, 1995, 270: 8755-8762)，艮卩精 蛋白Pl。精蛋白是精子細胞核內(nèi)DNA結(jié)合的主要蛋白(Cho.C， Willis. Haploinsuff iciency of protamine_l or -2 causes infertility in mice. Nature Genet: 2001， 28:82-86)。人類精蛋白基因族包括三個緊密調(diào)節(jié)的基因，PRM1、 P腿2和TNP2， 在精子形成過程中，三個基因的產(chǎn)物能夠重新包裝父系基因組形成有功能的配子
(Martins RP， Krawetz SA. Nuclear organization of the protamine locus. Soc R印rod Fertil Suppl， 2007,64:1-12)。在精子的形成中發(fā)揮了重要作用。在以往的研 究中，PRM1被認為與男性的不育有很重要的關(guān)系(Ravel C， Chantot-Bastaraud S.Mutations in the protamine 1 gene associated with male infertility. Mol Hum R印rod, 2007, 13 (7) :461-464)。
人PRM1基因是CT抗原家族的成員之一，關(guān)于PRM1基因與結(jié)腸癌的關(guān)系尚不清楚， 也未見文獻報道過。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種PRM1基因的應(yīng)用，該PRM1基因可作為 結(jié)腸癌診斷的標記分子，提高了結(jié)腸癌診斷的準確性。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種PRMl基因在制備診斷結(jié)腸癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。 所述診斷結(jié)腸癌的產(chǎn)品包括用RT-PCR、實時定量PCR或免疫檢測診斷結(jié)腸癌 的產(chǎn)品。
在本發(fā)明中，所述用RT-PCR診斷結(jié)腸癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增PRM1基 因的引物。
所述用實時定量PCR診斷結(jié)腸癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增PRM1基因的引物。
所述用免疫檢測診斷結(jié)腸癌的產(chǎn)品包括與PRM1蛋白特異性結(jié)合的抗體，包括 多克隆抗體和單克隆抗體。
在本發(fā)明中，可以使用一系列本領(lǐng)域已知的方法來制備針對PRM1蛋白特異的抗 體。例如，將提純的人PRM1基因產(chǎn)物或它的抗原片段注射入動物體內(nèi)以產(chǎn)生多克隆 抗體。同樣，表達人PRM1蛋白或它的抗原片段的細胞也可以用來對動物致免疫而產(chǎn) 生抗體。根據(jù)本發(fā)明制備的抗體也可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可用雜交瘤技 術(shù)制備(例如，Kohler et al. ， Nature 256: 495， 1975; Kohler et al.， Eur. J. Immunol. 6: 511, 1976; Kohler et al. ， Eur. J. Immunol. 6: 292, 1976)。本發(fā) 明的抗體包括可以阻抑PRM1功能的抗體，也可以是不影響人PRM1功能的抗體。每一 類抗體都可以通過對人PRM1基因產(chǎn)物的片段或功能域致免疫而產(chǎn)生，而人PRM1基因 產(chǎn)物及其片段可以用重組方法產(chǎn)生或用多肽合成儀進行合成。與非修飾形式的PRM1 基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體，可以利用在原核細胞例如AcoW中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動 物而得到。與翻譯后修飾形式如糖基化或磷酸化PRM1蛋白或多肽結(jié)合的抗體，可以 利用在真核細胞如酵母或昆蟲細胞中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而得到。本發(fā)明實驗證明PRM1基因在結(jié)腸癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，因此PRM1 基因可作為診斷結(jié)腸癌的特異標志基因，使結(jié)腸癌診斷更加準確、快速。


圖1是本發(fā)明通過RT-PCR檢測PRM1基因在人類正常組織中的表達圖； 圖2是本發(fā)明通過RT-PCR檢測PRM1基因在人結(jié)腸癌組織和癌旁組織中的差異表 達圖3是本發(fā)明通過實時熒光定量RT-PCR檢測PRM1基因在人結(jié)腸癌組織和癌旁組 織中差異表達的箱線圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。
以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條 件的實驗方法,通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議 的條件。
實施例1
RT-PCR實驗檢測PRM1基因在人類正常組織及結(jié)腸癌組織中的表達情況。
1. 組織分離(Tissue isolation)
本發(fā)明所用結(jié)腸癌及癌旁組織均來自臨床結(jié)腸癌的手術(shù)病人。手術(shù)切除的結(jié)腸 癌組織一經(jīng)離體，迅速切取病灶及周圍5公分以外正常組織，并放入液氮中保存。癌 和癌旁的診斷均以病理診斷為最終依據(jù)。15種人體正常組織(腦、心、肺、脾、腎、 胃、食管、小腸、卵巢、乳腺、前列腺、胰腺、肝、胎肝及睪丸)RNA均購自Clontech 公司。逆轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV Reverse Transcriptase, Promega CO. 。 PCR試劑Taq DNA 聚合酶、dNTP等均為大連寶生物技術(shù)有限公司。PRM1基因(GeneID: 5619)的引物 是Forward: 5' -CAGAGTTCCACCTGCTCACA-3' (SEQ ID NO: 1) 、 Reverse: 5， -TTCTCAGGCA GGAGTTTGGT-3' (SEQ ID N0:2)， PCR產(chǎn)物長度為280bp。作為內(nèi)對照的p-actin引物 是Forward:5'-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3' (SEQIDN0:3)、 Reverse: 5'-CAGCGG AACCGCTCATTGCCAATGG-3' (SEQ ID N0:4); p-actin擴增片斷長度為400bp。
2. 總RNA的抽提試劑盒
抽提RNA試劑采用TRIzol reagent (GIBC0/BRL)，該試劑是基于酸性酚一步抽提法生產(chǎn)的。用于抽提RNA所用的器皿和水均要進行無RNA酶處理，以保證實驗中無RNA 酶的環(huán)境。
3. RNA的抽提步驟
將碾杵和勻漿器等器皿在20(TC干烤4h，去除RNA酶，冷卻；加入液氮中預(yù)冷， 將組織從液氮中迅速取出，碾成粉末；用刮匙將組織放入預(yù)先加入TRIzol試劑的勻 漿器中，勻漿數(shù)分鐘；將勻漿后的液體轉(zhuǎn)入無RNA酶的離心管中，加入氯仿后，4°C 離心分層；將上層水相轉(zhuǎn)入一無RNA酶的離心管中，加入氯仿后，4。C離心分層；將 上層水相轉(zhuǎn)入一無RNA酶的離心管中，加異丙醇，4。C離心沉淀RNA;用75%乙醇洗 滌沉淀2次；用無RNA酶的去離子水溶解沉淀。抽提的RNA質(zhì)量鑒定紫外分光光度 計測定260/280比值(比值均在1. 7 2. 0);并在MOPS甲醛變性膠中觀察有無降解， 本發(fā)明所用MA均無降解。為了去除基因組DNA的污染,全部RNA均用無RNA酶的DNA 酶I (美國Ambion公司)消化。
4. cDNA的合成
取總RNA 2Pg，隨機引物1W， 70。C保溫3min，立即冰上變性5 min。加入5X buffer, DTT和0. 05g *L—1的dNTP各2 W及1 W的逆轉(zhuǎn)錄酶，充分混勻后，42°C 2h。 模板使用終濃度通常為0. Olg L—、
5. 半定量RT-PCR
以cDNA為模板，PCR擴增PRM1基因，同時以P-actin作為模板量的對照。PCR 條件為94。C預(yù)變性3min; 94。C變性30s， 57。C退火30s， 72。C延伸40s，共35循環(huán) (e -actin為25循環(huán))；72'C延伸5min。用2%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR產(chǎn)物。
6. 實驗結(jié)果顯示，PRM1基因僅在睪丸中表達，其它組織中均無表達(見圖l)。 利用半定量RT-PCR方法檢測PRM1基因在人類結(jié)腸癌組織及癌旁組織中的表達情況， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRM1基因在33% (3/9)的結(jié)腸癌中明顯上調(diào)，3例陽性結(jié)果見圖2。在圖2 中，"N"指癌旁組織，"C"指結(jié)腸癌組織。
7. 根據(jù)上述實驗結(jié)果，可通過RT-PCR診斷結(jié)腸癌設(shè)計PRM1基因的PCR引物， 檢測腫瘤組織中PRM1基因RNA的含量，RNA含量高則說明患結(jié)腸癌的可能性高，反之 則低。
實施例2實時熒光定量RT-PCR實驗
使用TaKaRa生物公司的新型實時熒光定量PCR儀(Thermal Cycler Dice
6Detection System,日本)，檢測PRM1基因在12對人類結(jié)腸癌組織及其對應(yīng)的癌旁 組織中的表達。反應(yīng)體系如下總體積20ul， SYBRPremixEXTaq 10ul，引物(10uM) 各0.4 ul ， DNA 2ul， ddH20 7.2ul，上下顛倒混勻試劑，離心后放入PCR儀中進行 擴增反應(yīng)。儀器使用按廠家的說明操作。(3-Actin被用來當作內(nèi)對照。所述實驗均重 復三次以確保結(jié)果的可靠性。結(jié)腸癌和癌旁組織中的PRM1基因的表達水平按以下方 法進行計算PRMl厶Ct =平均PRM1—Ct -平均(5-actin—Ct， PRM1A A Ct= PRM1A Ct— 癌組織-PRM1A Ct一癌旁組織，癌和癌旁組織中的PRM1基因的倍數(shù)關(guān)系用2—""""來計 算。實驗數(shù)據(jù)用SPSS軟件統(tǒng)計(x2檢驗)，P〈0.05定義為有統(tǒng)計學意義。
結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，PRMl基因在50y。 (6/12)的結(jié)腸癌組織中有高于2 倍的上調(diào)(P<0.01)，因此，PRM1基因在結(jié)腸癌組和癌旁組中的表達有明顯差異(見 圖3)。在圖3中，"*"代表p〈0.01，方框內(nèi)橫線代表每組檢測值A(chǔ)Ct的中值，方框 外的上下短線分別代表檢測值中的最高值和最低值。本發(fā)明熒光定量PCR檢測的陽性 率高于上述普通RT-PCR的結(jié)果，這可能與熒光定量PCR的高靈敏度有關(guān)。
該實驗結(jié)果表明，可通過實時熒光定量PCR診斷結(jié)腸癌設(shè)計PRM1基因的PCR 引物，檢測結(jié)腸癌組織中PRM1基因RNA的含量，RNA含量高則說明患結(jié)腸癌的可能性 高，反之則低。
實施例3免疫檢測
1. 抗原蛋白獲得
(1) 利用基因工程表達可從Genbank數(shù)據(jù)庫中獲得人PRM1基因的cDNA序列， 通過PCR擴增獲得編碼框，插入原核生物或真核生物表達載體中，表達PRM1蛋白， 并按基因工程表達產(chǎn)物的純化體系純化蛋白質(zhì)。
(2) 通過培養(yǎng)高表達PRM1基因的人體來源細胞或組織，再分離純化PRM1蛋白。
2. 抗體制備
可采用以下幾種方法制備抗體
(1) 細胞融合法用上述制備的PRM1蛋白免疫動物(包括兔子、山羊等)，獲得 脾臟細胞，再與骨髓瘤細胞融合，并按常規(guī)單克隆抗體制備技術(shù)制備單克隆抗體。
(2) 利用噬菌體表面展示庫，克隆免疫動物的脾臟IgG可變區(qū)并表達成基因工程 單克隆抗體。
(3) 利用純化的蛋白質(zhì)免疫動物，制備多抗血清。3.檢測
(1) 用制備的抗體(多抗或單抗)，用組織化學方法進行結(jié)腸癌的病理檢測，陽 性信號為結(jié)腸癌。
(2) 取患者血清，用ELISA方法檢測，陽性反應(yīng)為結(jié)腸癌可疑病人。
(3) 將PRM1抗體作為蛋白質(zhì)芯片的探針之一，用于多種腫瘤診斷。
8序列表
〈110〉 上海人類基因組研究中心
<120〉 PRM1基因的應(yīng)用
〈130〉 NP-08-12214
<160> 4
〈170> Patentln version 3. 3
〈210〉 1
<211> 20
〈212〉 腿
<213〉 人工序列
〈220〉
〈221〉 misc—feature
<222〉 (1)..(20)
〈223〉 引物
<400> 1
cagagttcca cctgctcaca 20
〈210〉 2
〈211〉 20
〈212〉 腿 〈213〉人工序列
<220>
<221〉 misc一feature
〈222〉 (l)..咖
〈223〉 引物
〈400〉 2
ttctcaggca ggagtttggt 20
〈210〉 3
〈211> 25
〈212〉 ■ 〈213〉人工序列
〈220>
<221〉 misc—feature
<222> (1)..(25)
〈223〉 引物<400〉 3
tcacccacac tgtgcccatc tacga 25
〈210> 4
〈211〉 25
〈212〉 DNA〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉 misc—feature
<222> (l),.咖
<223〉 引物
〈400〉 4
cagcggaacc gctcattgcc aatgg 2權(quán)利要求
1. 一種PRM1基因的應(yīng)用，其特征在于，所述PRM1基因在制備診斷結(jié)腸癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述診斷結(jié)腸癌的產(chǎn)品包括用 RT-PCR、實時定量PCR或免疫檢測診斷結(jié)腸癌的產(chǎn)品。
3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用RT-PCR診斷結(jié)腸癌的產(chǎn)品至 少包括一對特異擴增P服l基因的引物。
4. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用實時定量PCR診斷結(jié)腸癌的 產(chǎn)品至少包括一對特異擴增PRM1基因的引物。
5. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用免疫檢測診斷結(jié)腸癌的產(chǎn)品 包括與PRM1蛋白特異性結(jié)合的抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種PRM1基因的應(yīng)用，用于制備診斷結(jié)腸癌的產(chǎn)品。本發(fā)明的PRM1基因，可作為診斷結(jié)腸癌的特異標志基因，使結(jié)腸癌診斷更加準確、快速。
文檔編號C12Q1/68GK101497921SQ20081004310
公開日2009年8月5日 申請日期2008年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月2日
發(fā)明者滕小梅, 韓澤廣, 健 黃 申請人:上海人類基因組研究中心