專利名稱：一種基底、基因芯片及其制備方法以及檢測靶標的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基底、基因芯片及其制備方法以及檢測 靶標的方法。
背景技術(shù)：
基因芯片技術(shù)是一種被廣泛應用于研究基因表達，蛋白質(zhì)與基因序列相互作用以 及單核苷酸多態(tài)性的高通量的分析方法。在基因芯片的應用過程中，檢測的靈敏度和選擇 性是兩個非常重要的考察參數(shù)，所以，制作一種理想的，具有高的固定化效率，并且不與反 應體系中的其他物質(zhì)進行非特異性反應的芯片基底成為了基因芯片技術(shù)的關(guān)鍵。基因芯片由基底和靶標探針組成?；状笾路譃閮深?、表面修飾有醛基、環(huán)氧基 或羧基等官能團的二維(2D)平板基底；2、在2D平板基底上涂覆聚丙烯酰胺凝膠使其表面 具有三維(3D)結(jié)構(gòu)的3D基底。相對于2D基底，3D基底具有高的固定化效率，能提供較多 的反應位點與靶標反應，這樣就大大提高了芯片的檢測靈敏度，但是涂覆凝膠依然存在反 應點少，與靶標探針結(jié)合不完全，生物相容性和可降解性不好的缺點。樹枝狀大分子是一種特殊的聚合物，它不像鏈狀高聚物那樣會發(fā)生卷曲，因此能 夠提供很多末端基團用于功能化反應。此外，這種樹枝狀的分子還具有比較好的生物相容 性。鑒于它的這種優(yōu)良的性質(zhì)，很多的研究工作者已經(jīng)利用它來修飾基底，制作3D的基因 芯片。這種大分子修飾的3D基底不僅具有很高的固定化效率，而且在后面的一系列反應和 洗滌過程中性能穩(wěn)定。目前，對表面修飾有樹枝狀大分子的3D基因芯片的檢測主要依賴傳統(tǒng)的熒光分 子染料檢測方法，但是熒光染料檢測方法不僅光穩(wěn)定性差，還必須使用高精度的儀器，檢測 過程步驟復雜，不易控制。在不斷尋求創(chuàng)新方法的過程中，本領(lǐng)域人員發(fā)現(xiàn)，金屬、半導體以 及磁納米粒子具有比較特殊的性質(zhì)，能夠取代熒光染料而用于基因檢測。尤其是金屬納米 粒子的共振光散射檢測法靈敏度更高，甚至能夠檢測單分子識別反應。Mirkin研究小組將 金納米粒子應用于芯片上來檢測靶標，文中用金標記的靶標探針來識別靶標，再用基于無 電導的銀沉積步驟來提高共振光散射信號。這種方法能夠靈敏的檢測靶標而不用聚合酶鏈 反應(PCR)等靶標放大技術(shù)。此外，這種基于金納米粒子共振光散射的基因芯片的信號提 取可以直接使用普通的白光掃描儀，因此，能夠節(jié)省很多經(jīng)費，但是Mirkin只報道了金納 米粒子應用于2D基底或涂覆凝膠的3D基底制備的芯片，應用于樹枝狀大分子修飾的芯片 還未有報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有的生物芯片檢測靈敏度和識別度欠佳的缺 陷，提供一種靈敏度和識別度更高的基因芯片和檢測靶標的方法。為了解決以上問題，本發(fā)明提供了一種用于生物芯片的基底，由聚酰胺-胺型樹 枝狀大分子通過共價鍵結(jié)合在固體支持物上形成，所述聚酰胺-胺型樹枝狀大分子為以乙二胺為中心放射出64個氨基末端的樹枝狀大分子，分子量為14214 14220 ；所述聚酰 胺_胺型樹枝狀大分子經(jīng)醛基活化。優(yōu)選的，所述固體支持物為玻片。優(yōu)選的，所述生物芯片為基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、糖芯片或組織芯片。本發(fā)明還提供了一種基因芯片，包括表面通過共價鍵結(jié)合了聚酰胺-胺型樹枝 狀大分子的固體支持物，以及通過共價鍵固定在所述聚酰胺_胺型樹枝狀大分子上的靶標 探針；所述靶標探針含有能與靶標雜交的序列；所述聚酰胺_胺型樹枝狀大分子為以乙二 胺為中心放射出64個氨基末端的樹枝狀大分子，分子量為14214 14220;所述聚酰胺-胺 型樹枝狀大分子經(jīng)醛基活化。
優(yōu)選的，所述固體支持物為玻片。優(yōu)選的，所述玻片為二氧化硅玻片或有機硅玻片。優(yōu)選的，所述靶標探針為3' -NH2修飾的DNA探針或RNA探針。本發(fā)明還提供了所述基因芯片的制備方法，包括以下步驟步驟1 將表面醛基化的固體支持物浸泡于聚酰胺-胺型樹枝狀大分子溶液中 IOh 14h得到與聚酰胺_胺型樹枝狀大分子共價結(jié)合的固體支持物；步驟2 用pH值為7 7. 4的戊二醛溶液將所述與聚酰胺-胺型樹枝狀大分子共 價結(jié)合的固體支持物活化；步驟3 取靶標探針在步驟2所得固體支持物上點樣，得到基因芯片。本發(fā)明還提供了利用所述基因芯片進行靶標檢測的方法，包括以下步驟步驟1 使半徑為IOnm 13nm金納米粒子與二硫鍵修飾檢測探針反應，制備與檢 測探針耦合的金納米粒子，所述檢測探針與靶標雜交；步驟2 使固定于權(quán)利要求4所述基因芯片上的靶標探針與可能含靶標的待測樣 品反應，洗滌后使所述基因芯片與步驟1所制備的與檢測探針耦合的金納米粒子反應，所 述靶標探針不與檢測探針雜交；步驟3 取0. 05 0. 09mol/L的硝酸銀溶液與0. 02 0. 05mol/L的對苯二酚溶 液按體積比1 1.5 1混合后，與經(jīng)步驟2處理后的基因芯片在室溫下反應，洗滌后檢測 共振光散射信號。優(yōu)選的，所述靶標為DNA序列或RNA序列。本發(fā)明提供了一種用于生物芯片的基底，由聚酰胺-胺型樹枝狀大分子通過共價 鍵結(jié)合在固體支持物上形成，所述聚酰胺-胺型樹枝狀大分子為以乙二胺為中心放射出64 個氨基末端的樹枝狀大分子，分子量為14214 14220 ；所述聚酰胺-胺型樹枝狀大分子經(jīng) 醛基活化。該基底可以用于基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、糖芯片和組織芯片的制備。本發(fā)明還提 供了一種基因芯片，包括表面通過共價鍵結(jié)合了聚酰胺-胺型樹枝狀大分子的固體支持 物，以及通過共價鍵固定在所述聚酰胺_胺型樹枝狀大分子上的靶標探針；所述靶標探針 含有能與靶標雜交的序列；所述聚酰胺-胺型樹枝狀大分子為以乙二胺為中心放射出64個 氨基末端的樹枝狀大分子，分子量為14214 14220 ；所述聚酰胺-胺型樹枝狀大分子經(jīng)醛 基活化。本發(fā)明提供的基因芯片，使用聚酰胺_胺樹枝狀大分子修飾玻片，并將靶標探針通 過共價鍵固定在所述樹枝狀大分子上，由于所述聚酰胺_胺樹枝狀大分子具有64個氨基末 端，與現(xiàn)有技術(shù)相比增加了反應點，這樣就能夠連接更多的相同的靶標探針，增加了基因芯片的靈敏度；也可以同時連接不同的靶標探針，以增加基因芯片的檢測通量。本發(fā)明還提供了一種基因芯片的制備方法，包括步驟1 將表面醛基化的玻片浸泡于聚酰胺-胺型樹枝 狀大分子溶液中IOh 14h得到與聚酰胺-胺型樹枝狀大分子共價結(jié)合的玻片；步驟2 用 PH值為7 7. 4的戊二醛溶液將所述與聚酰胺-胺型樹枝狀大分子共價結(jié)合的玻片活化； 步驟3 取靶標探針在步驟2所得玻片上點樣，得到基因芯片。由于使用的是聚酰胺-胺型 樹枝狀大分子，所以具有多個反應點，與靶標探針和玻片的反應及固化速率都很高，降低了 反應條件，不需要大型的復雜的設(shè)備，節(jié)約了成本。本發(fā)明還提供了一種利用基因芯片檢測 靶標的方法，包括步驟1 使半徑為IOnm 13nm金納米粒子與二硫鍵修飾檢測探針反應， 制備與檢測探針耦合的金納米粒子，所述檢測探針與靶標雜交；步驟2 使固定于權(quán)利要求 4所述基因芯片上的靶標探針與可能含靶標的待測樣品反應，洗滌后使所述基因芯片與步 驟1所制備的與檢測探針耦合的金納米粒子反應，所述靶標探針不與檢測探針雜交；步驟 3 取0. 05 0. 09mol/L的硝酸銀溶液與0. 02 0. 05mol/L的對苯二酚溶液按體積比1 1.5 1混合后，與經(jīng)步驟2處理后的基因芯片在室溫下反應，洗滌后檢測共振光散射信號。 本發(fā)明提供的檢測方法，用檢測探針耦合的金納米粒子做為靶標的標記物。如果靶標探針 與靶標不能完全配對，靶標探針序列與靶標序列中的錯位堿基越多，金納米粒子的共振光 散射信號就越弱，因此通過共振光散射信號的強弱以及靶標探針的序列就可以判斷靶標的 序列，與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明提供的靶標檢測方法提高了識別度。靈敏度和準確性。


圖1示本發(fā)明所述基底的制備過程；a為玻片通過醛基共價結(jié)合聚酰胺_胺型樹枝狀大分子的過程，b為用硼氫化鈉 除去希夫堿的過程，c為聚酰胺-胺型樹枝狀大分子與戊二醛反應的過程。GA為戊二醛、 PAMAM為聚酰胺-胺型樹枝狀大分子；圖2示用本發(fā)明所述基因芯片進行靶標檢測的過程，其中a為通過醛基共價結(jié)合 聚酰胺-胺型樹枝狀大分子的玻片，P為靶標探針，τ為靶標，G為檢測探針耦合的金納米粒 子；圖3示共振光散射信號與靶標探針P1濃度的關(guān)系，白色對應于未通過醛基共價 結(jié)合聚酰胺-胺型樹枝狀大分子的玻片制作的基因芯片，黑色對應通過醛基共價結(jié)合聚酰 胺-胺型樹枝狀大分子的玻片制備的基因芯片；圖4示不同基底制備的基因芯片的信噪比、質(zhì)量因子對比，其中，共振光散射強度 在3X IO4 4X IO4之間的正方形點對應使用修飾有聚酰胺-胺型樹枝狀大分子的基底制 備的基因芯片上各個檢測點的共振光散射信號，而IX IO4 2X IO4之間的圓形點是未使用 聚酰胺_胺型樹枝狀大分子修飾的基底制備的基因芯片上各個檢測點的共振光散射信號， 0 IXIO4之間的正方形點和圓點為背景的共振光散射信號；圖5示共振光散射信號與靶標T濃度的關(guān)系，圖中正方形點對應于未使用聚酰 胺_胺型樹枝狀大分子修飾的基底制備的基因芯片上的共振光散射信號，圓點對應于使用 聚酰胺_胺型樹枝狀大分子修飾的基底制備的基因芯片上的共振光散射信號；圖6示未使用聚酰胺-胺型樹枝狀大分子修飾的基底制備的基因芯片檢測靶標序 列結(jié)果，圖中橫坐標為5 μ mol/L的不同靶標探針，縱坐標為共振光散射相對強度，即以完全匹配的靶標探針P1的信號為基準，其他靶標探針的信號與P1信號的比值；圖7示使用醛基共價結(jié)合聚酰胺-胺型樹枝狀大分子修飾的基底制備的基因芯片 檢測靶標序列結(jié)果，圖中橫坐標為5 μ mol/L的不同靶標探針，縱坐標為共振光散射相對強 度，即以完全匹配的探針P1的信號為基準，其他探針的信號與P1信號的比值。
具體實施例方式為了進一步了解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的優(yōu)選實施方案進行描述，但 是應當理解，這些描述只是為進一步說明本發(fā)明的特征和優(yōu)點而不是對本發(fā)明專利要求的 限制。本發(fā)明提供了一種用于生物芯片的基底，由聚酰胺-胺型樹枝狀大分子通過共價 鍵結(jié)合在固體支持物上形成，所述聚酰胺-胺型樹枝狀大分子為以乙二胺為中心放射出64 個氨基末端的樹枝狀大分子，分子量為14214 14220 ；所述聚酰胺-胺型樹枝狀大分子 經(jīng)醛基活化。按照本發(fā)明，利用醛基修飾的玻片(2D基底)與聚酰胺-胺型樹枝狀大分子 通過共價鍵結(jié)合，得到聚酰胺_胺型樹枝狀大分子修飾的玻片(3D基底)，再通過所述聚酰 胺_胺樹枝狀大分子表面的氨基末端醛基化即可用于制備基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、糖芯片、 組織芯片等生物芯片。本發(fā)明提供的用于生物芯片的基底利用樹枝狀大分子的多氨基末端 增加了反應點，使生物芯片靈敏度提高。本發(fā)明提供了一種使用所述基底的基因芯片，包括表面通過共價鍵結(jié)合了聚酰 胺_胺型樹枝狀大分子的固體支持物，以及通過共價鍵固定在所述聚酰胺_胺型樹枝狀大 分子上的靶標探針；所述靶標探針含有能與靶標雜交的序列；所述聚酰胺_胺型樹枝狀大 分子為以乙二胺為中心放射出64個氨基末端的樹枝狀大分子，分子量為14214 14220 ； 所述聚酰胺_胺型樹枝狀大分子經(jīng)醛基活化。按照本發(fā)明，玻片優(yōu)選為本領(lǐng)域人員熟知的二氧化硅玻璃片或有機硅半導體玻 片，本發(fā)明不做限定，所述玻片的表面預先經(jīng)過了醛基修飾。聚酰胺_胺型樹枝狀大分子優(yōu) 選以乙二胺為中心的含有64個氨基末端的第四代聚酰胺-胺型樹枝狀大分子(PAMAM)，而 所述64個氨基末端形成了一個近似的圓球狀，增加了玻片的表面積與反應點，能夠結(jié)合更 多的靶標探針，使制備的基因芯片靈敏度更高，檢測更準確，所述PAMAM與玻片上醛基的個 數(shù)比為1 2 4。所述靶標探針為10 12個核苷酸組成的基因序列，是靶標一部分序列的 互補鏈，用于和靶標結(jié)合。本發(fā)明優(yōu)選使用西格瑪(SIGMA)公司生產(chǎn)的分子量為14214. 17 的 PAMAMjl^S 64. 7°C，在 25°C下，密度為 0. 813g/mL。本發(fā)明還提供了一種基因芯片的制備方法，包括步驟1 將表面醛基化的固體支持物浸泡于聚酰胺-胺型樹枝狀大分子溶液中 IOh 14h得到與聚酰胺_胺型樹枝狀大分子共價結(jié)合的固體支持物；步驟2 用pH值為7 7. 4的戊二醛溶液將所述與聚酰胺-胺型樹枝狀大分子共 價結(jié)合的固體支持物活化；步驟3 取靶標探針在步驟2所得固體支持物上點樣，得到基因芯片。按照本發(fā)明，將醛基修飾的玻片放入25mL 35mL的第四代PAMAM甲醇溶液中，第 四代PAMAM的質(zhì)量百分數(shù)優(yōu)選為0. 05% 0. 15%，在輕微攪拌下，PAMAM上的氨基末端會與 玻片上的醛基反應，將PAMAM通過共價結(jié)合在醛基修飾的玻片上，室溫反應IOh 14h后，用25mL 35mL甲醇洗滌2 3次，每次2min 3min，目的是用甲醇除去未反應的PAMAM， 洗滌結(jié)束后用N2吹干所述通過醛基共價結(jié)合有PAMAM的玻片。PAMAM與玻片的共價結(jié)合 過程中，PAMAM上的氨基末端和玻片上的醛基反應后，會生成希夫堿，而希夫堿中含有不穩(wěn) 定的亞胺鍵，容易水解，通過硼氫化鈉還原亞胺鍵會變?yōu)檩^穩(wěn)定的仲胺，按照本發(fā)明，將上 述通過醛基共價結(jié)合PAMAM的玻片浸泡在體積為25mL 35mL，濃度為8mmol/L 12mmol/ L硼氫化鈉(NaBH4)溶液中，還原所述希夫堿。然后，將通過醛基共價結(jié)合PAMAM的玻片放 入25mL 35mL的戊二醛溶液中反應3h 5h，使PAMAM上的未與玻片表面上醛基反應的 氨基波段與戊二醛反應。所述戊二醛溶液優(yōu)選包括2wt % 5wt %的戊二醛和95wt % 98wt%的磷酸鹽緩沖溶液，所述磷酸鹽緩沖液優(yōu)選為含有40mmol/L 60mmol/L的磷酸鹽、 0. 10mol/L 0. 20mol/L的氯化鈉的PBS溶液，添加磷酸鹽緩沖液的目的在于保持整個戊二 醛溶液的PH值為7 7. 4。所述反應結(jié)束后用25mL 35mL上述磷酸鹽緩沖溶液洗滌所述 玻片2 3次，每次2min 3min，再優(yōu)選使用Milli-Q超純水洗滌所述玻片2 3次，每次 2min 3min，所有洗滌步驟結(jié)束后，優(yōu)選使用離心干燥器將所述通過共價鍵結(jié)合PAMAM的 玻片離心干燥后得到3D基底，并將所述基底在3°C 4°C下保存待用?；椎闹苽溥^程如 圖1所示。3D基底制備完成后，將點樣緩沖液與靶標探針混合得到靶標探針溶液。本發(fā)明 提供的靶標探針末端均有一個氨基修飾，目的是為了能和PAMAM上的醛基反應，將靶標 探針鏈接到基底上。所述點樣緩沖液包括40mmol/L 50mmol/L檸檬酸三鈉，0. 4mol/ L 0. 5mol/L的氯化鈉，lmol/L 2mol/L甜菜堿，0. 004wt% 0. 006wt%十二烷基磺酸 鈉。取10 μ L 20 μ L所述樣品溶液于樣品板中，用Smartarrayer48點樣系統(tǒng)，在3D基 底上點樣。將點好樣的基底放入恒濕箱中，在20 30°C下恒溫反應至少10小時，再升溫 90°C 100°C，反應IOmin 20min。使得靶標探針上的氨基與醛基反應，將靶標探針連接 在3D芯片基底上，反應結(jié)束后用25mL 35mL洗液洗滌2 3次每次2min 3min，再用 Milli-Q超純水洗滌2 3次每次2min 3min以除去未被固定的靶標探針。所述洗液優(yōu) 選包括15mmol/L 17mmol/L檸檬酸三鈉緩沖溶液，0. 15mol/L 0. 16mol/L的氯化鈉， 0.01wt% 0.03wt%十二烷基磺酸鈉。洗滌結(jié)束后得到基因芯片。按照本發(fā)明首先恒溫 反應是為了時靶標探針能夠均勻的與3D基底均勻結(jié)合，而升溫反應是為了防止基底表面 通過共價鍵結(jié)合的的靶標探針自雜交而降低基因芯片的檢測靈敏度。按照本發(fā)明優(yōu)選將制 備好的基因芯片放入封閉溶液中，在25 30°C下反應Ih 1. 5h，目的是為了除去基因芯 片表面未反應的活性醛基。所述封閉溶液為40mmol/L 60mmol/L磷酸鹽、0. 15mol/L 0. 2mol/L 氯化鈉、0. lmol/L 0. 2mol/L 乙醇胺的 PBS 溶液，pH = 7 7. 4。本發(fā)明還提供了一種靶標的檢測方法，包括步驟1 使半徑為IOnm 13nm金納米粒子與二硫鍵修飾檢測探針反應，制備與檢測探針耦合的金納米粒子，所述檢測探針與 靶標雜交；步驟2 使固定于權(quán)利要求4所述基因芯片上的靶標探針與可能含靶標的待測樣品反應，洗滌后使所述基因芯片與步驟1所制備的與檢測探針耦合的金納米粒子反應，所 述靶標探針不與檢測探針雜交；步驟3 取0. 05 0. 09mol/L的硝酸銀溶液與0. 02 0. 05mol/L的對苯二酚溶液按體積比1 1.5 1混合后，與經(jīng)步驟2處理后的基因芯片在室溫下反應，洗滌后檢測共振光散射信號。按照本發(fā)明，優(yōu)選使用“Turkevich-Frens”方法制備金納米粒子GNPs，即用檸檬 酸三鈉還原氯金酸制備的金納米粒子，所述金納米粒子的直徑優(yōu)選為IOnm 13nm。按照 本發(fā)明，檢測探針耦合的金納米粒子優(yōu)選為將檢測探針通過共價鍵與金納米粒子GNPs耦 合得到檢測探針耦合的金納米粒子，所述檢測探針優(yōu)選為二硫鍵修飾的探針(SP)。在本發(fā) 明中首先將體積為20 μ L 30 μ L、濃度為30 μ mol/L 40 μ mol/L的SP水溶液與體積優(yōu) 選為450 μ L 550 μ L、濃度優(yōu)選為4nmol/L 8nmol/L的GNPs溶液混合，靜置過夜；然后 加入450 μ L 550 μ L磷酸鹽緩沖溶液，得到第一混合溶液。所述磷酸鹽緩沖溶液的ρΗ值 為7. 0 7. 4。所述磷酸鹽緩沖溶液中優(yōu)選含8mmol/L 12mmol/L磷酸鹽、0. lmol/L 0. 5mol/L氯化鈉的PB S溶液。將所述第一混合溶液靜置1. 5h 2. 5h后優(yōu)選使用真空離 心濃縮儀將第一混合液溶液濃縮至120 μ L 180 μ L得到第一濃縮液。然后再以8000 10000轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速，10 20min的時間離心第一濃縮液2 3次，除去游離在第一濃縮 液中未與金納米粒子耦合的檢測探針，將離心濃縮后得到的檢測探針耦合的金納米粒子溶 于雜交緩沖液中并保持檢測探針耦合的金納米粒子最終濃度為4nmol/L 6nmol/L。所述 雜交緩沖液優(yōu)選包括50mmol/L 70mmol/L檸檬酸三鈉，0. 5mol/L 0. 7mol/L的氯化鈉， 0. 05wt% 0. 15襯％十二烷基磺酸鈉。所述檢測探針耦合的金納米粒子為靶標檢測中靶標 的標記物，如果靶標探針與靶標不能完全配對，那么檢測探針就無法與靶標雜交，就無法檢 測到金納米粒子的共振光散射信號，靶標探針序列與靶標序列中的錯位堿基越多，共振光 散射信號就越弱，因此通過共振光散射信號的強弱以及靶標探針的序列就可以判斷靶標的 序列。利用預先制備好的基因芯片以及檢測探針耦合的金納米粒子就可以用來檢測靶 標的基因序列，檢測分為兩個階段，第一階段為靶標與基因芯片的雜交反應，然后所述靶標 再與檢測探針耦合的金納米粒子進行雜交反應得到金納米粒子標記的連接有靶標的基因 芯片，第二階段為用銀粒子沉積在所述檢測探針耦合的金納米粒子上的金納米粒子的表 面，擴大金納米粒子的半徑，增強了共振光散射信號強度，從而提高檢測的靈敏度和準確 性。按照本發(fā)明，靶標探針為靶標互補鏈的一部分，而與金納米粒子耦合的檢測探針 為靶標互補鏈的另一部分，當把靶標與靶標探針雜交后，再用檢測探針耦合的金納米粒子 與靶標雜交，且靶標探針不與檢測探針雜交，通過金納米粒子特有的共振光散射性質(zhì)，可以 通過檢測信號的強弱來判斷互補鏈與靶標是否完全匹配。具體雜交步驟為指將靶標溶解在雜交緩沖液中得到靶標溶液，取15 μ L 25 μ L 的靶標溶液與在所述封閉溶液中封閉好的基因芯片在25°C 35°C下反應25min 35min。 所述雜交緩沖液優(yōu)選包括60mmol/L 70mmol/L檸檬酸三鈉溶液，0. 6mol/L 0. 8mmol/L 的氯化鈉溶液，0. lwt% 0. 2襯％十二烷基磺酸鈉。洗滌反應后的芯片，所述洗滌包括用上 述雜交緩沖液在30°C下洗滌2 3次，每次2min 3min，再用所述洗液在室溫下洗滌2 3次，每次2min 3min，最后用Milli-Q超純水洗滌2 3次，每次2min 3min，洗滌結(jié)束 后，再離心干燥Imin 2min，讓芯片與之前制備好的檢測探針耦合的金納米粒子在30°C下 反應30min，再對芯片進行以上洗滌和干燥過程過程。按照本發(fā)明在芯片與檢測探針耦合的金納米粒子反應完之后，用銀增強溶液在室溫下反應6min lOmin，用水洗滌所述銀增強處理后的基因芯片2 3次，每次2min 3min，離心干燥Imin 2min。所述銀增強溶液優(yōu)選為體積比為1 1. 5 1的硝酸銀溶液 和對苯二酚溶液。最后，用微陣列掃描儀(Arraylt Spotffare Colorimetric Microarray Scanner)掃描所述銀增強后的基因芯片，提取共振光散射信號(RLS)。本發(fā)明中討論所用 的RLS信號值都是扣除背景以后的信號值，通過RLS信號的強弱可以判斷靶標探針和靶標 的匹配度進而推斷出靶標的序列信息。以下用具體實施例來詳細闡述本發(fā)明的方案實施例1按照以下步驟來制備檢測探針耦合的金納米粒子用Turkevich-Frens法制備直徑為13nm金納米粒子。將體積為25 μ L、濃度為 40 μ mol/L的SP水溶液與500 μ L、6nmol/L的GNPs溶液混合，靜置過夜，然后加入500 μ L 磷酸鹽緩沖溶液，得到第一混合溶液。所述磷酸鹽緩沖溶液的PH為7. 4，且所述磷酸鹽緩 沖溶液為含有l(wèi)Ommol/L磷酸鹽、0. 2mol/L氯化鈉的PBS溶液。將所述第一混合溶液靜置 2h后優(yōu)選使用真空離心濃縮儀將溶液濃縮至150 μ L得到濃縮液。然后再以9000rad/min 的轉(zhuǎn)速離心濃縮液3次每次15min，將離心濃縮后得到的檢測探針耦合的金納米粒子溶于 60mmol/L檸檬酸三鈉，0. 6mol/L的氯化鈉，0. Iwt %十二烷基磺酸鈉組成的雜交緩沖液中 并保持檢測探針耦合的金納米粒子溶液的最終濃度為5nmol/L。實施例2按照以下方法來制作3D基底將醛基修飾的玻片放入30mL質(zhì)量分數(shù)為0. Iwt%的第四代的PAMAM甲醇溶液中， 在攪拌下，室溫反應12h后，用30mL甲醇洗滌3次，每次3min，再用N2吹干。用30mL，IOmmol/ L的硼氫化鈉(NaBH4)溶液還原上述反應中生成的希夫堿。然后，將修飾有樹枝狀分子的基 底放入30mL的戊二醛溶液中反應4小時，所述戊二醛溶液優(yōu)選包括5wt%的戊二醛和95% 的磷酸鹽緩沖溶液，所述磷酸鹽緩沖液為含有50mmol/L磷酸鹽、0. 15mol/L的氯化鈉的PBS 溶液，PH值為7. 4。用30mL上述磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次，每次3min，用Milli-Q超純水 洗滌3次，每次3min，離心干燥Imin后得到PAMAM修飾的3D基底，將該3D基底保存于4°C 下待用。其具體制作過程參看圖1。實施例3PAMAM修飾的3D基底制備的基因芯片的反應效率實驗首先，按照實施例1，實施例2的方法得到檢測探針耦合的金納米粒子和PAMAM修 飾的3D基底；其次，用45mmol/L檸檬酸三鈉緩沖液，0.45mol/L的氯化鈉，1. 5mol/L甜菜堿， 0. 005wt %十二烷基磺酸鈉組成的點樣緩沖液分別配制濃度為20 μ mol/L、5 μ mol/L、 500nmol/L、50nmol/L、5nmol/L 的探針 P1 溶液，P1 的序列如 SEQ ID No. 1 所示。取 15 μ L 樣 品于樣品板中，用Smartarrayer48點樣系統(tǒng)，在普通的2D芯片基底上和修飾有PAMAM的3D 基底上點樣。將點好樣的芯片放入恒溫恒溫箱中反應12小時，反應條件為T = 25°C，相對 濕度90%，再在100°C下反應15min ；接下來，用30mL洗液3次，每次3min，再用Milli-Q超 純水3次，每次3min。最后，將芯片放入封閉溶液中，在30°C下反應1小時得到基因芯片。
將靶標溶于雜交緩沖液中得到靶標溶液，取20 μ L的靶標溶液與在所述封閉溶液中封閉好的基因芯片在30°C下反應20min。所述雜交緩沖液包括60mmol/L檸檬酸三鈉， 0. 6mol/L的氯化鈉，0. 十二烷基磺酸鈉。洗滌反應后的芯片，所述洗滌包括用上述雜 交緩沖液在30°C下洗滌3次，每次3min，再用15mmol/L檸檬酸三鈉，0. 15mol/L的氯化鈉， 0. 0Iwt %十二烷基磺酸鈉組成的洗液在室溫下洗滌3次，每次3min，最后用Mi 11 i_Q超純水 洗滌3次，每次3min，洗滌結(jié)束后，再離心干燥lmin，讓芯片與之前制備好的檢測探針耦合 的金納米粒子在30°C下反應30min，再對芯片進行以上洗滌和干燥過程過程。按照本發(fā)明在芯片與檢測探針耦合的金納米粒子反應完之后，用體積比為1 1 的濃度為0. 08mol/L的硝酸銀溶液和濃度為0. 04mol/L的對苯二酚溶液組成的銀增強溶 液在室溫下與檢測探針耦合的金納米粒子標記的基因芯片反應8min，用水洗滌所述銀增 強處理后的基因芯片3次，每次3min，離心干燥lmin。所述銀增強溶液為體積比為1 1 的硝酸銀溶液和對苯二酚溶液。最后，用微陣列掃描儀(ArrayltSpotWare Colorimetric Microarray Scanner)掃描所述銀增強后的基因芯片，提取共振光散射信號(RLS)。本發(fā)明 中討論所用的RLS信號值都是扣除背景以后的信號值。芯片上的具體反應過程參看圖2。按照以上實驗步驟，我們得到的結(jié)果如圖3所示。圖3是在2D和3D基底上，共振光散射信號隨著探針P1 (與靶標完全匹配)濃度的 變化而變化的圖像以及相應的數(shù)據(jù)提取圖其中，白色對應于2D基底，黑色對應于3D基底。 實驗中用到的探針 P1 的濃度分別為 20ymol/L、5ymol/L、500nmol/L、50nmol/L、5nmol/L ； 靶標T的濃度為lOOnmol/L，檢測探針耦合的金納米粒子的濃度為5nmol/L。當P1濃度大 于50nmol/L時得到最佳的信噪比值(3倍的標準偏差)，且當P1濃度在50nmol/L-5 μ mol/ L之間時，共振光散射信號隨著濃度的增加而增強并在5 μ mol/L時基本達到飽和值。而在 同樣的實驗條件下，2D基底制備的基因芯片上的信號則相對較弱。這個結(jié)果表明樹枝狀 分子修飾的3D基底制備的基因芯片相對于普通的2D基底制備的基因芯片具有較高的反應 效率。實施例4PAMAM修飾的3D基底制備的基因芯片的性能首先，按照的實施例1和實施例2方法得到檢測探針耦合的金納米粒子和PAMAM 修飾的3D基底；用實施例3的方法進行點樣、雜交反應和檢測標靶并做了大于50組的實驗作為對 比，其中靶標探針P1的濃度為5 μ mol/L。芯片上的具體反應過程參看圖2。按照以上實驗步驟，我們得到的結(jié)果參看圖4我們通過對2D(圓點)和3D (正方 形)兩種基底制備的基因芯片上的50個點的共振光散射信號，以及背景提取噪音信號的考 察即共振光散射在0 10000之間的正方形點和圓形點，分別計算了兩種基底的信噪比S/ N和質(zhì)量因子V。實驗中用到的探針P1的濃度為5 μ mol/L，靶標T的濃度為lOOnmol/L，檢 測探針耦合的金納米粒子的濃度為5nmol/L。圖中我們考察了 50個點的共振光散射信號以 及背景，分別計算了兩種基底的S/N值和Z’質(zhì)量因子，S/N值根據(jù)通過RSL檢測的共振光散射信號強度與背景噪音信號的比值，而ζ’是通過公式Z = 1-3σs+3σc/us－uc︳︳計算，其中μ。背景信號的平均值；σ。背景的信號標準偏差；μ s金納米粒子共振光散射信號的平均值；ο s金納米粒子共振光散射信號的標準偏差。通過計算得到3D基底制備的基因芯片的S/N為9.0，V為0. 87，而2D基底制備 的基因芯片S/N為5.72，Z’為0.57。S/N值越大，Z’值越趨向于1，芯片的質(zhì)量越好。所以通過以上的結(jié)果證明本發(fā)明提供的3D基底制備基因芯片的性能優(yōu)于2D基底 制備的基因芯片。實施例5本發(fā)明提供的基因芯片的檢測限和線性范圍首先，按照實施例1和實施例2的方法得到檢測探針耦合的金納米粒子和PAMAM 修飾的3D基底；按照實施例4的方法進行點樣、雜交反應和檢測靶標，其中靶標溶液的濃度分別 為 1 μ mol/L、100nmol/L、50nmol/L、10nmol/L、5nmol/L、lnmol/L、500pmol/L、100pmol/Lo芯片上的具體反應過程參看圖2。按照以上實驗步驟，我們得到的結(jié)果參看圖5。圖5為是在2D基底制備的基因芯片和3D基底制備的基因芯片上，共振光散射信 號隨著靶標T濃度的變化而變化的圖像以及相應的數(shù)據(jù)提取圖，其中，正方形對應于2D基 底制備的基因芯片上的信號曲線，圓點對應于3D基底上制備的基因芯片的信號曲線。圖 中橫坐標為靶標濃度取對數(shù)值，縱坐標為共振光散射信號。實驗中用到的探針P1的濃度為 5μΜ ；靴標 T 的濃度分別為 1 ymol/L、100nmol/L、50nmol/L、10nmol/L、5nmol/L、lnmol/L、 500pmol/LU00pmol/L ；檢測探針耦合的金納米粒子的濃度為5nmol/L。在3D基底制備的基因芯片上，此方法對靶標的檢測限為lOOpmol/L，且當濃度在 Inmol/L-lOOnmol/L之間時，共振光散射信號隨著濃度的增加而增強，在濃度為lOOnmol/L 時達到飽和。而對于2D基底制備的基因芯片，信號值明顯較低，且檢測限為lOnmol/L，即靈 敏度降低了兩個數(shù)量級。實施例6本發(fā)明提供的檢測方法的選擇性。首先，按照實施例1和實施例2的方法得到檢測探針耦合的金納米粒子和PAMAM 修飾的3D基底；按照實施例4的方法進行點樣、雜交反應和檢測靶標，其中使用了 10中不同的靶 標探針溶液P1-Picit5芯片上的具體反應過程參看圖2。實驗中用到的10種靶標探針P1 Pltl的序列如SEQ ID No. 1、No. 2Νο· 3、No. 4、 No. 5、No. 6、No. 7、No. 8、No. 9、No. 10 所示。靶標 T 的序列如 SEQ ID No. 11 所示。其中，只 有P1與靶標完全匹配，P2 P7在不同位點各有一個錯配堿基，P8 Pltl各有兩個錯配堿基。按照以上實驗步驟，我們得到的結(jié)果如圖6，圖7所示。圖中y軸代表共振光散射 的相對強度，即以完全匹配的探針P1的信號為基準，其他探針的信號與P1信號的比值；X軸 代表相應的靶標探針種類。是對單核苷酸多態(tài)性考察。圖6是在2D基底上10種靶標探針(P1-Pio)的共振光散射信號圖及相應的數(shù)據(jù)提取圖，圖7是在3D基底上10種探針的共振光散射信號圖及相應的數(shù)據(jù)提取圖。實驗中用到的探針(P1-Pltl)的濃度均為5ymol/L，靶標 T的濃度為lOOnmol/L，檢測探針耦合的金納米粒子的濃度為5nmol/L。通過以上實驗結(jié)果可以證明(1)只有與靶標相匹配的探針P1有強的共振光散射 信號；(2)具有一個錯配堿基的寡聚物P2-P7有很弱的信號，且其信號值與堿基對的種類和 錯配位點有關(guān)錯配位點越靠近探針的固定端即3’端信號值越弱，且在同一錯配位點處， 含有T:G堿基對的靶標探針比含有T:C堿基對的信號要高；(3)具有兩個錯配堿基的寡聚 物P8-Pltl沒有可檢測的共振光散射信號；(4)通過圖中柱狀數(shù)據(jù)的比較計算得出結(jié)論含有 一個錯配堿基的靶標探針與完全匹配的靶標探針的散射光信號比值，2D基底制備的基因芯 片的比值在0-24. 3%之間，3D的基底制備的基因芯片比值在0-4. 2%之間，說明3D基底制 備的基因芯片的選擇性明顯優(yōu)于2D基底制備的基因芯片。以上對本發(fā)明提供的一種靶標的檢測方法及其檢測用基因芯片進行了詳細的介 紹，本文中應用了具體個例對本發(fā)明的原理及實施方式進行了闡述，以上實施例的說明只 是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想，應當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修 飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
一種用于生物芯片的基底，其特征在于，由聚酰胺-胺型樹枝狀大分子通過共價鍵結(jié)合在固體支持物上形成，所述聚酰胺-胺型樹枝狀大分子為以乙二胺為中心放射出64個氨基末端的樹枝狀大分子，分子量為14214～14220；所述聚酰胺-胺型樹枝狀大分子經(jīng)醛基活化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基底，其特征在于，所述固體支持物為玻片。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基底，其特征在于，所述生物芯片為基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、 糖芯片或組織芯片。
4.一種基因芯片，包括表面通過共價鍵結(jié)合了聚酰胺-胺型樹枝狀大分子的固體支 持物，以及通過共價鍵固定在所述聚酰胺_胺型樹枝狀大分子上的靶標探針；所述靶標探 針含有能與靶標雜交的序列；所述聚酰胺-胺型樹枝狀大分子為以乙二胺為中心放射出64 個氨基末端的樹枝狀大分子，分子量為14214 14220 ；所述聚酰胺-胺型樹枝狀大分子經(jīng)醛基活化。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因芯片，其特征在于，所述固體支持物為玻片。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因芯片，其特征在于，所述玻片為二氧化硅玻片或有機硅 玻片。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因芯片，其特征在于，所述靶標探針為3'-NH2修飾的DNA 探針或RNA探針。
8.權(quán)利要求4-7任一項所述基因芯片的制備方法，包括以下步驟步驟1 將表面醛基化的固體支持物浸泡于聚酰胺_胺型樹枝狀大分子溶液中IOh 14h，得到與聚酰胺-胺型樹枝狀大分子共價結(jié)合的固體支持物；步驟2 用pH值為7 7. 4的戊二醛溶液將所述與聚酰胺-胺型樹枝狀大分子共價結(jié) 合的固體支持物活化；步驟3 取靶標探針在步驟2所得固體支持物上點樣，得到基因芯片。
9.一種靶標的檢測方法，包括以下步驟步驟1 使半徑為IOnm 13nm金納米粒子與二硫鍵修飾檢測探針反應，制備與檢測探 針耦合的金納米粒子，所述檢測探針與靶標雜交；步驟2 使固定于權(quán)利要求4所述基因芯片上的靶標探針與可能含靶標的待測樣品反 應，洗滌后使所述基因芯片與步驟1所制備的與檢測探針耦合的金納米粒子反應，所述靶 標探針不與檢測探針雜交；步驟3 取0. 05 0. 09mol/L的硝酸銀溶液與0. 02 0. 05mol/L的對苯二酚溶液按 體積比1 1.5 1混合后，與經(jīng)步驟2處理后的基因芯片在室溫下反應，洗滌后檢測共振 光散射信號。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測方法，其特征在于，所述靶標為DNA序列或RNA序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種用于生物芯片的基底，由聚酰胺-胺型樹枝狀大分子通過共價鍵結(jié)合在固體支持物上形成，所述聚酰胺-胺型樹枝狀大分子為以乙二胺為中心放射出64個氨基末端的樹枝狀大分子，分子量為14214～14220；所述聚酰胺-胺型樹枝狀大分子經(jīng)醛基活化。本發(fā)明提供的用于生物芯片的基底利用樹枝狀大分子的多氨基末端增加了反應點，使生物芯片靈敏度提高。本發(fā)明還提供用所述基底制備的基因芯片、所述基因芯片的制備方法以及利用該基因芯片檢測靶標的方法。
文檔編號C12M1/34GK101824477SQ20101015773
公開日2010年9月8日 申請日期2010年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月28日
發(fā)明者劉殿俊, 李小梅, 王振新 申請人:中國科學院長春應用化學研究所