專利名稱：檢測靶dna序列的方法和采用該方法的基因芯片及應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因序列的分子生物學檢測方法，以及利用該方法進行基因序 列檢測的基因芯片，以及該方法的應用。
背景技術(shù)：
目前對遺傳背景相關(guān)基因(致病基因、腫瘤異?；?；細菌、病毒、轉(zhuǎn)基因動 植物的轉(zhuǎn)基因成分的檢測主要通過設計引物并對相應的DNA片段進行PCR擴增，然后通 過后續(xù)的檢測平臺來實現(xiàn)檢測的目的。通過PCR擴增進行檢測，容易導致假陰性(PCR 擴增失敗)或假陽性(PCR擴增污染)等結(jié)果，從而影響基因序列檢測的正確性和效率。 另外，PCR擴增所需要的靶基因的量較大，在樣品稀少的情況下，較難滿足檢測需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種無需PCR擴增，能對靶基因進行直接檢測，避免假陽 性和假陰性結(jié)果出現(xiàn)的檢測靶DNA序列的方法；另外提供了一種是用該方法的進行靶 DNA序列檢測的基因芯片；以及該方法的應用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明檢測靶DNA序列的方法包括如下步驟，步驟1 將RNA探針與靶DNA接觸并退火，所述的RNA探針的一端固定在基 片上，RNA探針包括靠近固定端的檢測序列和靠近游離端的記號序列，所述的靶DNA具 有與RNA探針中檢測序列互補的區(qū)段；步驟2 用核糖核酸酶水解退火后形成的DNA:RNA異源雙鏈中RNA部分，釋 放出靶DNA和該RNA探針中的記號序列；步驟3:洗滌除去游離的靶DNA、記號序列和核糖核酸酶，用帶標記的記號 DNA結(jié)合檢測序列未被水解的固定在基片上的RNA探針，所述的記號DNA與RNA探針 的記號序列互補，從而對靶DNA進行序列分析。其中，步驟2中的核糖核酸酶為核糖核酸酶H;記號DNA上的標記為生物素標 記、熒光標記或同位素標記。本發(fā)明所述的靶DNA為單鏈DNA或雙鏈DNA，所述的雙鏈DNA在步驟1退 火前變性形成單鏈DNA，靶DNA上與RNA探針中檢測序列互補的序列可以僅是靶DNA 上的一個片段。本發(fā)明步驟2中釋放出的靶DNA與該體系中其他RNA探針上互補的檢測序列再 次退火結(jié)合，形成DNA:RNA異源雙鏈，循環(huán)往復步驟2的過程直至體系中所有的含互補 檢測序列的RNA探針均被水解。一種基因芯片，RNA探針1的一端固定在芯片載體上，RNA探針包括靠近芯片 載體固定端的檢測序列和靠近游離端的記號序列，芯片載體上設置陣列式樣點，RNA探 針根據(jù)檢測序列的不同固定于不同的樣點內(nèi)。使用時，向各個樣點內(nèi)加入樣品DNA，按本發(fā)明所述的方法進行操作后，檢測
3各個樣點內(nèi)標記，樣品DNA含有與芯片上未檢測到標記的樣點內(nèi)RNA探針的檢測序列互 補的序列。本發(fā)明所述的樣品DNA —般為用戶送檢的未知樣品，其中可能含有與RNA探針 中檢測序列互補的靶DNA序列，也可能是不含有靶DNA序列的未知DNA序列。采用本發(fā)明所述的方法可用于檢測遺傳遺傳背景相關(guān)基因(致病基因、腫瘤異 ?；?。采用本發(fā)明所述的方法可用于檢測細菌或病毒的基因。采用本發(fā)明所述的方法可用于檢測轉(zhuǎn)基因動植物的轉(zhuǎn)基因成分。使用本發(fā)明的檢測方法對靶DNA進行檢測，無需對靶基因進行PCR擴增，直接 對靶DNA進行檢測，從而避免了 PCR檢測中出現(xiàn)的假陰性和假陽性結(jié)果，提高了檢測正 確率，同時極大的減少了實驗室由于PCR擴增及后續(xù)檢測所導致的核酸污染；另外，該 檢測方法僅需極少量的靶DNA分子就可以實現(xiàn)檢測目的。


圖1為本發(fā)明檢測靶DNA序列的方法的示意圖；圖2為本發(fā)明檢測樣品DNA基因芯片的結(jié)果檢測示意圖。
具體實施例方式下面對本發(fā)明中出現(xiàn)的部分術(shù)語進行進一步解釋，本文中術(shù)語“核糖核酸酶H”也稱為RNase H，指的是一種核糖核酸內(nèi)切酶， 特異性水解DNA:RNA雜交鏈上RNA鏈的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生5'核苷酸，該酶對單鏈的 核酸(單鏈DNA或單鏈RNA)、雙鏈DNA或雙鏈RNA沒有作用。本文中術(shù)語“退火”指的是兩條單鏈多核苷酸通過互補堿基之間的氫鍵形成雙 鏈分子的過程?？砂l(fā)生核酸鏈之間，可以形成雙鏈DNA分子、雙鏈RNA或DNA-RNA 雜交分子。本文中術(shù)語“變性”指的是核酸分子由穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)松解為無規(guī)則線性結(jié) 構(gòu)的現(xiàn)象。變性時維持雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵斷裂，堿基間的堆積力遭到破壞，但不涉及 到其一級結(jié)構(gòu)的改變。為詳細說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實施 方式并配合附圖詳予說明。如圖1所示，本發(fā)明的檢測靶DNA序列的方法包括如下步驟，步驟1 將RNA探針1與靶DNA2接觸并退火，所述的RNA探針1的一端固定 在基片上，RNA探針1包括靠近固定端的檢測序列11和靠近游離端的記號序列12，所述 的靶DNA2具有與RNA探針1中檢測序列11互補的區(qū)段；步驟2 用核糖核酸酶3水解退火后形成的DNA:RNA異源雙鏈4中RNA部分， 釋放出靶DNA2和該RNA探針1中的記號序列12 ；步驟3 洗滌除去游離的靶DNA2、記號序列12和核糖核酸酶3，用帶標記的記 號DNA5結(jié)合檢測序列11未被水解的固定在基片上的RNA探針1，所述的記號DNA5與 RNA探針1的記號序列12互補，從而對靶DNA2進行序列分析。
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其中，步驟2中的核糖核酸酶3為核糖核酸酶H;記號DNA5上的標記為生物素 標記、熒光標記或同位素標記，或者其他任何現(xiàn)有可行的標記方式。本發(fā)明所述的靶DNA2為單鏈DNA或雙鏈DNA，所述的雙鏈DNA在步驟1退 火前變性形成單鏈DNA。本發(fā)明步驟2中釋放出的靶DNA2與該體系中其他RNA探針1上互補的檢測序 列11再次退火結(jié)合，形成DNA:RNA異源雙鏈4，循環(huán)往復步驟2的過程直至體系中所有 的含互補檢測序列11的RNA探針1均被水解。如圖2所示，采用本發(fā)明所述的方法檢測樣品DNA的基因芯片，RNA探針1的 一端固定在芯片載體6上，RNA探針1包括靠近芯片載體6固定端的檢測序列11和靠近 游離端的記號序列12。芯片載體6上設置陣列式樣點61，RNA探針1根據(jù)檢測序列11 的不同固定于不同的樣點61內(nèi)。使用時，向各個樣點61內(nèi)加入樣品DNA，按本發(fā)明所述的方法進行操作后，檢 測各個樣點61內(nèi)標記，樣品DNA含有與芯片上未檢測到標記的樣點61內(nèi)RNA探針1的 檢測序列11互補的序列。該基因芯片的具體檢測步驟及原理如下當固定了 RNA探針的芯片樣點內(nèi)加入樣品DNA和核糖核酸酶H的混合液反應， 靶DNA片段將與RNA探針的檢測序列結(jié)合，這時，核糖核酸酶H將特異性識別所形成 的DNA:RNA異源雙鏈部分并選擇性的水解該異源雙鏈的RNA鏈部分。隨后靶DNA片 段和RNA探針記號序列釋放，靶DNA片段繼續(xù)與芯片樣點內(nèi)的其他RNA探針檢測序列 結(jié)合，這時，核糖核酸酶H將再次特異性識別所形成的DNA:RNA異源雙鏈部分并選擇性 的水解該異源雙鏈的RNA鏈部分。這一 “靶DNA片段結(jié)合-酶水解-靶DNA片段和 RNA探針記號序列釋放”的過程將持續(xù)進行，直到所有含有與靶DNA互補的檢測基因 的RNA探針分子被水解。隨后，洗滌去除游離的靶DNA、記號序列和核糖核酸酶。然 后，加入記號DNA，記號DNA將與留在芯片上的RNA探針的記號序列特異性結(jié)合。記 號DNA進行了生物素標記、或熒光標記、或同位素標記、或者其他任何可行的標記，通 過對記號DNA進行檢測，即能實現(xiàn)靶DNA序列的分析。不含有與靶DNA互補的檢測 序列的RNA探針不能被降解，保留在芯片表面，能被檢測到；而含有與靶DNA互補的 檢測序列的RNA探針的檢測序列與靶DNA特異結(jié)合，形成了 DNA:RNA異源雙鏈，被核 糖核酸酶特異性降解，其上的記號序列游離出來后被洗滌去除，因此無法被檢測到。這 樣就可以判斷樣品DNA含有與芯片上未檢測到標記的樣點內(nèi)RNA探針的檢測序列互補的 序列。采用本發(fā)明所述的方法可以用于檢測遺傳背景相關(guān)基因，如致病基因、腫瘤異 常基因。采用本發(fā)明所述的方法可以用于檢測細菌或病毒的基因。采用本發(fā)明所述的方法可以用于檢測轉(zhuǎn)基因動植物的轉(zhuǎn)基因成分。以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本 發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關(guān) 的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護范圍內(nèi)。實施例1
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本實施例使用本發(fā)明的基因芯片對志賀氏菌進行檢測，其中靶DNA來自志賀氏菌基因組，為雙鏈DNA，由SEQ ID NO 1構(gòu)成；RNA探針由人工合成，由SEQ ID NO 2構(gòu)成，SEQ ID NO 2的1-22位所 示的序列為檢測序列，23-42位所示的序列為記號序列；RNA探針的檢測序列與SEQ ID NO 1的478-499位所示的序列相同，與該序列的互補鏈互補；記號DNA由人工合成，由SEQ ID NO 3構(gòu)成，其中5，端進行了生物素標 記；具體實驗方法如下1、基因組DNA提??；取1.5ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入離心管中，12,000 Xg離心3min ；棄上清液，將細菌沉淀物懸浮于100 μ L ddH20，用渦旋混合器充分混勻；用漂子架住離心管，置于沸水浴中，IOmin ；取出后立刻離心lOmin，上清液即為所制備的基因組DNA溶液。2、基因芯片法檢測試劑包被液0.05mol/L磷酸氫二鈉溶液(pH8.5)；封閉液3%牛血清白蛋白或 0.5%酪蛋白溶液洗滌液PBST ；終止液2MH2S04步驟用經(jīng)包被液稀釋的RNA探針(Ο.ΙμΜ)ΙΟΟμ 包被核酸結(jié)合板，4°C 過夜。次日，用封閉液200yL于37°C封閉60min。用洗滌液洗滌3次，備用。在 封閉液洗滌后的包被板上每孔加入樣品DNA和核糖核酸酶H的混合液25 μ L(DNA量 10-1000拷貝；核糖核酸酶總量5U)，再加入雜交液lOOyL?；靹蚝螅?7°C反應60min， 用洗滌液洗滌5次(去除游離的靶DNA、記號序列和核糖核酸酶)；每孔中加入記號 DNA(0.01yM)100uL,混勻后，37°C反應60min，用洗滌液洗滌5次(去除游離的記號 DNA)。每孔中加入鏈親和素標記的辣根過氧化物酶100 μ L，37°C反應30min，用洗滌 液洗滌5次。每孔加入顯色液100 μ L，37°C顯色IOmin ；每孔加入終止液100 μ L終止 反應。以630nm為參考波長，于波長492nm處測定吸光度。其中，各孔加入如下樣品陰性對照樣品ddH20 ；陽性對照樣品陽性對照樣品為一段合成的寡核苷酸DNA序列，該序列與RNA 探針的檢測序列互補，此實施例中該陽性對照序列為SEQID NO: 4。該陽性對照濃度為 0.01 μ M，每孔加入lyL，另外加入核糖核酸酶H，總體積為25 μ L。樣品1含有10拷貝的靶DNA ；樣品2含有100拷貝的靶DNA ；樣品3含有1000 拷貝的靶DNA;檢測結(jié)果扣除值為陰性對照的吸光度值減少0.2。陰性對照吸光度值應不低于1.5。陽性對照應為陽性，且吸光度值應不高于0.2，如小于0.05按0.05計。點樣孔(列)123平均陰性對照樣品2.3172.4092.4152.380樣品1(10拷貝)0.7350.7930.8120.780樣品2(100拷貝)0.6930.7170.6590.670樣品3(1000拷貝)0.6270.6510.6900.658陽性對照樣品0.0560.0690.0530.059說明本發(fā)明的方法及采用該方法的基因芯片能夠快速，靈敏的檢測出樣品中是 否含有靶DNA并反映出其含量的多寡。其可用于檢測細菌或病毒的基因。實施例2 本實施例使用本發(fā)明的基因芯片對轉(zhuǎn)基因玉米Btll的轉(zhuǎn)基因成分CrylA(b)的 DNA進行檢測，其中靶DNA來自轉(zhuǎn)基因玉米Btl 1，為雙鏈DNA，由SEQ IDNO 5構(gòu)成；RNA探針由人工合成，由SEQ ID NO 6構(gòu)成，SEQ ID NO 6的1-21位所 示的序列為檢測序列，22-41位所示的序列為記號序列；RNA探針的檢測序列與SEQ ID NO 1的214-234位所示的序列相同，與該序列的互補鏈互補；記號DNA由人工合成，由SEQ ID NO: 7構(gòu)成，其中5，端進行了生物素標 記；具體實驗方法如下1、基因組 DNA 提取(提取液成分Tris-HCl pH7.5, 150mM ； NaCl IOOmM ； EDTApH8.0, 15mM ； CTAB 1.5% ； β-ME 1.5% (使用前加))。稱取一定量的玉米葉，液氮研成細末，每克材料加95°C預熱的CTAB提取液 2mL和5yL β-巰基乙醇，快速攪拌均勻后，65°C水浴60_90min。加入等體積氯仿。 輕微轉(zhuǎn)動半小時直至分層。室溫800rpm，離心lOmin，上清液加2/3體積異丙醇沉淀 DNA。粗DNA經(jīng)TE溶解，RNA酶消化RNA，酚/氯仿、氯仿純化，最后乙醇析出 DNA。2、基因芯片法檢測試劑包被液0.05mol/L磷酸氫二鈉溶液(pH8.5)；封閉液3%牛血清白蛋白或 0.5%酪蛋白溶液洗滌液PBST ；終止液2MH2S04步驟用經(jīng)包被液稀釋的RNA探針(Ο.ΙμΜ)ΙΟΟμ 包被核酸結(jié)合板，4°C 過夜。次日，用封閉液200yL于37°C封閉60min。用洗滌液洗滌3次，備用。在 封閉液洗滌后的包被板上每孔加入樣品DNA和核糖核酸酶H的混合液25 μ L(DNA量 10-1000拷貝；核糖核酸酶總量5U)，再加入雜交液lOOyL。混勻后，37°C反應60min， 用洗滌液洗滌5次(去除游離的靶DNA、記號序列和核糖核酸酶)；每孔中加入記號
7DNA(0.01yM)100uL,混勻后，37°C反應60min，用洗滌液洗滌5次(去除游離的記號 DNA)。每孔中加入鏈親和素標記的辣根過氧化物酶100 μ L，37°C反應30min，用洗滌 液洗滌5次。每孔加入顯色液100 μ L，37°C顯色IOmin ；每孔加入終止液100 μ L終止 反應。以630nm為參考波長，于波長492nm處測定吸光度。其中，各孔加入如下樣品陰性對照樣品ddH20 ；陽性對照樣品陽性對照樣品為一段合成的寡核苷酸DNA序列，該序列與RNA 探針的檢測序列互補，此實施例中該陽性對照序列為SEQID NO: 8。該陽性對照濃度為 0.01 μ M，每孔加入lyL，另外加入核糖核酸酶H，總體積為25 μ L。樣品1含有10拷貝的靶DNA ；樣品2含有100拷貝的靶DNA ；樣品3含有1000 拷貝的靶DNA;檢測結(jié)果扣除值為陰性對照的吸光度值減少0.2。陰性對照吸光度值應不低于1.5。陽性對照應為陽性，且吸光度值應不高于0.2，如小于0.05按0.05計。
權(quán)利要求
1.檢測靶DNA序列的方法，其特征在于其包括如下步驟，步驟1:將RNA探針與靶DNA接觸并退火，所述的RNA探針的一端固定在基片 上，RNA探針包括靠近固定端的檢測序列和靠近游離端的記號序列，所述的靶DNA具有 與RNA探針中檢測序列互補的區(qū)段；步驟2:用核糖核酸酶水解退火后形成的DNA:RNA異源雙鏈中RNA部分，釋放出 靶DNA和該RNA探針中的記號序列；步驟3:洗滌除去游離的靶DNA、記號序列和核糖核酸酶，用記號DNA結(jié)合檢測 序列未被水解的固定在基片上的RNA探針，所述的記號DNA與RNA探針的記號序列互 補，從而對靶DNA進行序列分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測靶DNA序列的方法，其特征在于步驟2中的核糖核 酸酶為核糖核酸酶H。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測靶DNA序列的方法，其特征在于步驟2中的記號 DNA上帶有標記。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測靶DNA序列的方法，其特征在于步驟2中的記號 DNA上的標記為生物素標記、熒光標記或同位素標記。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測靶DNA序列的方法，其特征在于所述的靶DNA為 單鏈DNA或雙鏈DNA，所述的雙鏈DNA在步驟1退火前變性形成單鏈DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任意一種所述的檢測靶DNA序列的方法，其特征在于所 述的步驟2中釋放出的靶DNA與該體系中其他RNA探針上互補的檢測序列再次退火結(jié) 合，形成DNA:RNA異源雙鏈，循環(huán)往復步驟2的過程直至體系中所有的含互補檢測序列 的RNA探針均被水解。
7.—種基因芯片，其特征在于，所述的RNA探針的一端固定在芯片載體上，RNA探 針包括靠近芯片載體固定端的檢測序列和靠近游離端的記號序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的基因芯片，其特征在于所述的芯片載體上設置陣列式樣 點，RNA探針根據(jù)檢測序列的不同固定于不同的樣點內(nèi)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的基因芯片，其特征在于向各個樣點內(nèi)加入樣品DNA，按 權(quán)利要求1至6中任意一種所述的方法進行操作后，檢測各個樣點內(nèi)標記，樣品DNA含 有與芯片上未檢測到標記的樣點內(nèi)RNA探針的檢測序列互補的序列。
10.權(quán)利要求1至6中任意一項所述的檢測靶DNA序列的方法的應用，其特征在于 該方法用于檢測遺傳背景相關(guān)基因或者用于檢測細菌或病毒的基因或者用于檢測轉(zhuǎn)基因 動植物的轉(zhuǎn)基因成分。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測靶DNA序列的方法，其包括如下步驟，步驟1將RNA探針與靶DNA接觸并退火，所述的RNA探針的一端固定在基片上，RNA探針包括靠近固定端的檢測序列和靠近游離端的記號序列，所述的靶DNA具有與RNA探針中檢測序列互補的區(qū)段；步驟2用核糖核酸酶水解退火后形成的DNA:RNA異源雙鏈中RNA部分，釋放出靶DNA和該RNA探針中的記號序列；步驟3洗滌除去游離的靶DNA和記號序列，用帶標記的記號DNA結(jié)合檢測序列未被水解的固定在基片上的RNA探針，所述的記號DNA與RNA探針的記號序列互補，從而對靶DNA進行序列分析。使用該方法對靶DNA進行檢測，無需對靶基因進行PCR擴增，直接對靶DNA進行檢測，從而避免了采用PCR擴增檢測的假陰性和假陽性結(jié)果，提高了檢測正確率。
文檔編號C12Q1/68GK102010911SQ201010563900
公開日2011年4月13日 申請日期2010年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月29日
發(fā)明者張偉紅, 張國寧, 張珮穎, 朱中偉, 楊祥, 柴寶玲, 歐陽輝, 汪朝暉, 胡春凌 申請人:深圳博睿祥暉生物技術(shù)有限公司