一種lgr4基因檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種LGR4基因檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒含有m36b4、mPEPCK、mG6pase、mHNF4a、mChREBP、mSREBP1c、mFAS、mSCD1和mLGR4的引物對(duì)。本發(fā)明檢測(cè)靈敏度高，經(jīng)過(guò)本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)，得到肝臟糖代謝的關(guān)鍵基因表達(dá)以及相關(guān)通路的驗(yàn)證，為臨床上患者的個(gè)體化治療、預(yù)后判斷和預(yù)防干預(yù)提供便利。
【專利說(shuō)明】
一種LGR4基因檢測(cè)試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于2型糖尿病領(lǐng)域，特別涉及一種LGR4基因檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，由于肥胖、不健康的飲食和生活方式以及人口老齡化等原因，世界各國(guó)糖 尿病的發(fā)病率急劇增加，死亡率僅次于癌癥和心血管疾病，成為威脅人類健康的第三大類 疾病。根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（International Diabetes Federation,IDF)的最新數(shù)據(jù)顯示， 2014年全世界糖尿病患者已經(jīng)達(dá)到3.8億;預(yù)計(jì)到2035年，全球糖尿病患者將達(dá)到5.9億，這 其中，90%-95%是2型糖尿病患者。在我國(guó)，糖尿病發(fā)病率也日益增高，而且發(fā)病人群有年 輕化的趨勢(shì)。2型糖尿病已成為嚴(yán)重威脅人類生命健康和生活質(zhì)量的重要疾病之一。
[0003] 肝臟的胰島素抵抗是導(dǎo)致2型糖尿病的一個(gè)重要推動(dòng)因素，尤其是肝臟的脂肪異 位沉積、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及炎癥都可能使肝臟發(fā)生胰島素抵抗，進(jìn)而影響全身的胰島素敏感 性。有報(bào)道給予小鼠或大鼠3天的高脂飲食，在未出現(xiàn)肥胖等全身代謝紊亂的癥狀之前，即 可誘導(dǎo)出肝臟的胰島素抵抗，而且肝臟發(fā)生胰島素抵抗之后，會(huì)通過(guò)肝-脂肪、肝-骨骼肌的 組織對(duì)話來(lái)影響外周組織的胰島素敏感性，進(jìn)而加劇全身的胰島素抵抗，多項(xiàng)研究表明改 善肝臟的胰島素抵抗則可以改善這種狀況。
[0004] LGRs(Leucine-rich-repeat-containing G-protein-coupled Receptors)，是一 類特別的G蛋白偶聯(lián)受體家族，是因?yàn)槠鋼碛刑貏e大的胞外結(jié)構(gòu)域來(lái)識(shí)別配體。LGR4又稱 GPR48，LGR4基因位于染色體11ρ13-14區(qū)段，全長(zhǎng)約106kb，含18個(gè)外顯子，編碼951氨基酸， 其中胞外548個(gè)氨基酸殘基，富含亮氨酸，有5個(gè)糖基化位點(diǎn)，又屬于糖蛋白激素受體。近年 來(lái)，LGR4得到越來(lái)越多的重視和研究，LGR4在腫瘤發(fā)生、干細(xì)胞及組織發(fā)育過(guò)程中的作用已 開(kāi)始被逐漸研究和揭示。遺憾的是，目前很少有研究組對(duì)LGR4在營(yíng)養(yǎng)、代謝等方面的功能進(jìn) 行研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種LGR4基因檢測(cè)試劑盒，該試劑盒檢測(cè)靈敏 度高，經(jīng)過(guò)本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)，得到肝臟糖代謝的關(guān)鍵基因表達(dá)以及相關(guān)通路的驗(yàn)證，為 臨床上患者的個(gè)體化治療、預(yù)后判斷和預(yù)防干預(yù)提供便利。
[0006] 本發(fā)明的一種LGR4基因檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒含有下列引物對(duì)：

[0009] 所述試劑盒還包括DNA提取試劑、R0X染料和PCR緩沖液。
[0010] 所述試劑盒的PCR反應(yīng)條件為：95°(：158,95°(：158,601€308，共40個(gè)循環(huán)；95 1€ 5min〇
[0011] 所述試劑盒的PCR反應(yīng)結(jié)束后1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠染色，紫外燈下觀察 并確認(rèn)條帶位置。
[0012] 抽提組織總RNA后先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄再使用試劑盒。
[0013] 有益效果
[0014] 本發(fā)明檢測(cè)靈敏度高，經(jīng)過(guò)本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)，得到肝臟糖代謝的關(guān)鍵基因表 達(dá)以及相關(guān)通路的驗(yàn)證，為臨床上患者的個(gè)體化治療、預(yù)后判斷和預(yù)防干預(yù)提供便利。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1(a)為給予腹腔注射葡萄糖后，小鼠血糖濃度變化；（b)為肝臟中糖異生相關(guān)基 因的表達(dá)；
[0016] 圖2(a)為小鼠肝臟甘油三酯含量；（b)為肝臟組織透射電鏡；（c)為肝臟中脂質(zhì)合 成相關(guān)基因的表達(dá)；
[0017] 圖3 (a)為體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)水平波動(dòng)時(shí)，肝臟內(nèi)LGR4表達(dá)；（b)、（c)、（d)為不同代謝紊亂動(dòng) 物模型中，肝臟LGR4表達(dá)；
[0018] 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤表示，*P〈0 · 05，**Ρ〈0 · 01，· 001。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定 的范圍。
[0020] 實(shí)施例1
[0021] 1.組織總RNA抽提
[0022] (1)組織勻漿:每份肝臟約取20-30mg加入lmLTRIZOL試劑裂解。在冰浴條件下用勻 衆(zhòng)儀勾衆(zhòng)，將樣品轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管，室溫放置5min。
[0023] (2)液相分離：在RNA提取專用通風(fēng)櫥內(nèi)操作，按0.2mL/mL Trizol的比例加入氯 仿，劇烈振蕩混勾后放置于室溫2_3min，然后以12000g的轉(zhuǎn)速4°C離心15min。
[0024] (3)RNA沉淀:小心轉(zhuǎn)移上層水相至新的1.5mL離心管，按照1:1的比例加入異丙醇， 放置于室溫l〇min后，12000g，4°C，離心15min。
[0025] (4)RNA漂洗：離心后管底出現(xiàn)白色沉淀，去上清，以75 %乙醇（DEPC水配置)漂洗 RNA沉淀，7500g，4°C，離心5min。
[0026] (5)RNA重溶:去除乙醇后，干燥5-10min，將RNA重新溶解于RNase-free的DEPC去離 子水中。
[0027] (6)檢測(cè)RNA純度及RNA定量:取lyL樣品檢測(cè)A260和A260/A280。
[0028] 2.逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
[0029] (1)按照測(cè)定的RNA濃度，計(jì)算后取一定體積RNA，使RNA總量達(dá)到lOOOng，再加入 DEPC水將總體積補(bǔ)至1 OyL，70 °C預(yù)變性1 Omin。
[0030] (2)按照下表配制反應(yīng)體系
[0032] (3)將上述混合液按照42 °C 60min，95 °C 5min的程序逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。cDNA放置于-20 °C保存。
[0033] 3.Real time PCR
[0034] 反應(yīng)體系如下：

[0036]將上述體系加入96孔PCR板中，然后放入ABI 7300熒光定量PCR儀中開(kāi)始熒光定 量。
[0037]反應(yīng)條件為：
[0039]所有引物序列如下，引物均根據(jù)NCBI提供序列設(shè)計(jì)，并由sangon上海公司合成：
[0042] 4.結(jié)果
[0043] (1)全身性敲除LGR4改善小鼠的胰島素抵抗，抑制肝臟糖異生。
[0044] 通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不論是在正常飲食條件下，還是給予高脂喂養(yǎng)，與野生型小鼠相 比，全身LGR4K0小鼠與肝臟糖代謝相關(guān)的指標(biāo)都得到顯著改善:腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn) (IPGTT)顯示其胰島素抵抗?fàn)顩r得到改善（圖la)，對(duì)LGR4K0小鼠肝臟進(jìn)行分子生物學(xué)初步 分析的結(jié)果顯示，與野生型小鼠相比，LGR4K0小鼠的肝臟中PEPCK、G6pas e、HNF4a等糖異生 相關(guān)基因受到顯著抑制（圖lb)。
[0045] (2)全身敲除LGR4減少小鼠肝臟脂質(zhì)沉積，抑制肝臟脂質(zhì)合成的基因表達(dá)。
[0046] 通過(guò)對(duì)LGR4K0小鼠與野生型小鼠肝臟組織甘油三酯含量的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是正常 飲食還是高脂喂養(yǎng)情況下，LGR4K0小鼠肝臟內(nèi)TG含量都顯著低于野生型小鼠（圖2a)，說(shuō)明 其肝臟脂質(zhì)沉積減少，透射電鏡結(jié)果也顯示肝細(xì)胞內(nèi)線粒體增多，脂滴變少（圖2b)。 Rea 11 ime PCR結(jié)果也顯示，與野生型小鼠相比，LGR4K0小鼠的肝臟中ChREBP、SREBP1 c、FAS、 SCD1等脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)受到顯著抑制（圖2c)。
[0047] (3)機(jī)體營(yíng)養(yǎng)水平及代謝紊亂狀況對(duì)肝臟LGR4的影響。
[0048]在分析上述結(jié)果的同時(shí)，綜合LGR4K0小鼠的各代謝指標(biāo)，認(rèn)為L(zhǎng)GR4在肝臟的糖脂 代謝過(guò)程中可能發(fā)揮了重要的生物學(xué)作用。
[0049]進(jìn)一步分析了體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)水平充足或缺乏時(shí)LGR4在肝臟中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)正常喂 食的老鼠經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間禁食(Fasting)以及禁食后再進(jìn)食6小時(shí)(Refed)后，LGR4在肝臟中的 表達(dá)發(fā)生了非常劇烈的變化（圖3a)，這一結(jié)果表明LGR4的表達(dá)變化與體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)水平的波 動(dòng)存在某種程度的一致性。
[0050] 其次，利用了幾種經(jīng)典的胰島素抵抗和2型糖尿病的動(dòng)物模型分析了 LGR4在肝臟 組織中的表達(dá)情況。不論是高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠，還是在遺傳性肥胖的db/db、ob/ob小 鼠中，與對(duì)照組或野生型相比，LGR4在肝臟中的表達(dá)水平都是顯著升高的（圖3b，c，d)。
[0051] 本實(shí)施例發(fā)現(xiàn)，全身敲除LGR4能改善肝臟胰島素抵抗引起的一系列代謝紊亂的癥 狀:LGR4K0小鼠胰島素敏感性增加，肝糖異生減少;肝臟脂肪沉積減少，脂質(zhì)合成相關(guān)的基 因表達(dá)下調(diào)。這種改善在高脂喂養(yǎng)引起的代謝紊亂的小鼠模型中表現(xiàn)得尤為明顯。這些發(fā) 現(xiàn)都提示LGR4可能在肝臟的糖脂代謝中起到重要的調(diào)控作用，而肝臟是機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝 的重要器官。此外，對(duì)于代謝紊亂的動(dòng)物模型肝臟中LGR4表達(dá)的分析，也證實(shí)了機(jī)體代謝狀 態(tài)可能影響肝臟內(nèi)LGR4的表達(dá)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種LGR4基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述試劑盒含有下列引物對(duì)： m36b4 F:5 '-AAGCGCGTCCTGGCATTGTCT-3 '； R:5，-CCGCAGGGGCAGCAGTGGT-3，； mPEPCK F:5 '-ATGAAAGGCCGCACCATGTA-3 '； R:5 '-GCACAGATATGCCCATCCGA-3 '； mG6pase F:5 '-GCTGGAGTCTTGTCAGGCAT-3 '； R:5 '-ATCCAAGCGCGAAACCAAAC-3 '； mHNF4a F:5 '-ATGCGACTCTCTAAAACCCTTG-3 '； R:5 '-ACCTTCAGATGGGGACGTGT-3 '； mChREBP F:5 '-AGATGGAGAACCGACGTATCA-3 '； R:5 '-ACTGAGCGTGCTGACAAGTC-3 '； mSREBP1c F:5 '-CGGAAGCTGTCGGGGTAG-3 '； R:5，-GGGAAGTCACTGTCTTGGTTG-3，； mFAS F:5 '-AGAGATCCCGAGACGCTTCT-3 '； R:5，-GCCTGGTAGGCATTCTGTAGT-3，； mSCD1 F:5 '-TTCTTGCGATACACTCTGGTGC-3 '； R:5 '-CGGGATTGAATGTTCTTGTCGT-3 '； mLGR4 F:5 '-TTGTGGGTAACTTCCAGCTGA-3 '； R:5 '-GTGGCATTTGCTGCATCTGTA-3 '。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種LGR4基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括 DNA提取試劑、ROX染料和PCR緩沖液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種LGR4基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述試劑盒的PCR反 應(yīng)條件為：95°(：158,95°(：158,60 1€308，共40個(gè)循環(huán)；951€511^11。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種LGR4基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述試劑盒的PCR反 應(yīng)結(jié)束后1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠染色，紫外燈下觀察并確認(rèn)條帶位置。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種LGR4基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于：抽提組織總RNA后先 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄再使用試劑盒。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105936942SQ201610527682
【公開(kāi)日】2016年9月14日
【申請(qǐng)日】2016年7月6日
【發(fā)明人】寧光, 張翼飛, 張志國(guó), 姚霜霜, 王計(jì)秋
【申請(qǐng)人】上海市內(nèi)分泌代謝病研究所, 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院