用于輔助診斷原發(fā)性高血壓的檢測試劑盒及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于輔助診斷原發(fā)性高血壓的檢測試劑盒，所述的檢測試劑盒內(nèi)包括一對ACE2基因啟動子區(qū)甲基化特異性擴(kuò)增引物及一個甲基化特異性測序引物：甲基化特異性上游引物的核苷酸序列：5'?GGGTAGATTAAGAGGTTAGAAG?3'；甲基化特異性下游引物的核苷酸序列：5'?Biotin?ATTCACCCCATTCTCCTA?3'；甲基化特異性測序引物的核苷酸序列：5'?TTATTAAAAATATAAAAATATTAG?3'；其優(yōu)點是能夠方便快捷地在分子水平上實現(xiàn)對原發(fā)性高血壓的檢測，檢測效率高，針對性強(qiáng)。
【專利說明】
用于輔助診斷原發(fā)性高血壓的檢測試劑盒及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及原發(fā)性高血壓的輔助診斷技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及用于輔助診斷原發(fā)性高 血壓的檢測試劑盒及其應(yīng)用，尤其指一種能用于檢測與原發(fā)性高血壓相關(guān)的血管緊張素轉(zhuǎn) 換酶幻基因啟動子區(qū)甲基化程度的檢測試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 原發(fā)性高血壓(Essential hypertension，EH)是一種常見的慢性非傳染性疾病。 由于其發(fā)病率、患病率高，并且能夠?qū)е滦哪X腎等重要臟器病變的發(fā)生和發(fā)展，因此原發(fā)性 高血壓已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康的三大殺手之一。高血壓患者在長期治療疾病的過程中 承擔(dān)著很大的經(jīng)濟(jì)壓力，許多國家也為高血壓及其并發(fā)癥的治療付出了高昂的費用，但 每年仍然出現(xiàn)許多致殘者。根據(jù)2015年世界衛(wèi)生統(tǒng)計報告顯示，我國18歲以上居民高血壓 患病率為37.4%，加之較低的知曉率和血壓控制率，高血壓防治工作一直不容樂觀。由于高 血壓受環(huán)境和遺傳多重因素的影響，同時缺乏特異性病變組織，針對這些特點，研究高血壓 具體發(fā)病機(jī)制尚在探索之中，并且逐漸成為近年來國內(nèi)外心血管疾病領(lǐng)域?qū)＜液蛯W(xué)者探討 的熱點。
[0003] 腎素血管緊張素醛固酮(RAAS)系統(tǒng)是機(jī)體進(jìn)行血壓調(diào)控的主要機(jī)制。同時血管緊 張素2是其中重要的血管收縮劑，而血管緊張素轉(zhuǎn)換酶可通過降解血管緊張素2從 而調(diào)節(jié)機(jī)體血壓變化。國內(nèi)外已經(jīng)有大量研究報道了基因單核苷酸多態(tài)性與原發(fā)性高 血壓發(fā)病之間的關(guān)系，且研究多集中于rsW陽洲外C) 7V位點。
[0004] 目前，國內(nèi)外還沒有公開任何關(guān)于用于檢測與原發(fā)性高血壓相關(guān)的血管緊張素轉(zhuǎn) 換酶2基因啟動子區(qū)域甲基化程度的試劑盒相關(guān)研究報道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀，提供檢測效率高，針對性強(qiáng) 的用于輔助診斷原發(fā)性高血壓的檢測試劑盒及其應(yīng)用，其中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2基因啟動 子區(qū)甲基化水平與原發(fā)性高血壓的患病率呈正相關(guān)。
[0006] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為： 用于輔助診斷原發(fā)性高血壓的檢測試劑盒，所述的檢測試劑盒內(nèi)包括一對ACE2基因啟 動子區(qū)甲基化特異性擴(kuò)增引物及一個甲基化特異性測序引物： 甲基化特異性上游引物的核苷酸序列： 5 '-GGGTAGATTAAGAGGTTAGAAG-3，； 甲基化特異性下游引物的核苷酸序列： 5 '-Biotin-ATTCACCCCATTCTCCTA-3 '； 甲基化特異性測序引物的核苷酸序列： 5 '-TTATTAAAAATATAAAAATATTAG-3 '。
[0007] 用于輔助診斷原發(fā)性高血壓的檢測試劑盒的應(yīng)用，所述的檢測試劑盒能用于原發(fā) 性高血壓輔助診斷、檢測或篩查。
[0008] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于:本發(fā)明的用于輔助診斷原發(fā)性高血壓的檢 測試劑盒公開了用于檢測與原發(fā)性高血壓相關(guān)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2基因啟動子區(qū)域甲基 化程度的試劑盒及其應(yīng)用，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因啟動子區(qū)域的高甲基化水平導(dǎo) 致基因的低表達(dá)，從而影響原發(fā)性高血壓的發(fā)生和發(fā)展。因此，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2基 因啟動子區(qū)域甲基化水平與原發(fā)性高血壓的患病率呈正相關(guān)。以檢測冗堪因啟動子區(qū)域 甲基化水平為基礎(chǔ)的檢測試劑盒能夠方便快捷地在分子水平上實現(xiàn)對原發(fā)性高血壓的檢 測，檢測效率高，針對性強(qiáng)，特異性強(qiáng)；同時，以dCEJ?基因啟動子區(qū)域甲基化為靶點的藥物有 望成為原發(fā)性高血壓輔助診斷、檢測和篩選的一種新技術(shù)方法。
【附圖說明】
[0009] 圖1為被檢測序列所在區(qū)域(具體位置為ChrX: 15568896-15630451)，以及所檢測 的5個CPG位點之間的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果(例如CPG1與CpG2的Person相關(guān)系數(shù)為-0.035，CpG2 與CpG3的Person相關(guān)系數(shù)為0 · 005); 圖2為甲基化水平檢測結(jié)果示例（圖中所示百分?jǐn)?shù)為對應(yīng)CpG位點的甲基化程度，如圖 示有CpGl到CpG5的甲基化程度分別為73%、35%、20%、100%、12%)。
【具體實施方式】
[0010]以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0011] 用于輔助診斷原發(fā)性高血壓的檢測試劑盒，所述的檢測試劑盒內(nèi)包括一對ACE2基 因啟動子區(qū)甲基化特異性擴(kuò)增引物及一個甲基化特異性測序引物： 甲基化特異性上游引物的核苷酸序列： 5 '-GGGTAGATTAAGAGGTTAGAAG-3，； 甲基化特異性下游引物的核苷酸序列： 5 '-Biotin-ATTCACCCCATTCTCCTA-3 '； 甲基化特異性測序引物的核苷酸序列： 5 '-TTATTAAAAATATAAAAATATTAG-3 '。
[0012] 用于輔助診斷原發(fā)性高血壓的檢測試劑盒的應(yīng)用，所述的檢測試劑盒能用于原發(fā) 性高血壓輔助診斷、檢測或篩查。
[0013] 1、研究對象的收集 從寧波市第七醫(yī)院收集原發(fā)性高血壓患者，高血壓的診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)世界衛(wèi)生組織的國 際疾病分類第10版(ICD-10)，原發(fā)性高血壓(EH)診斷標(biāo)準(zhǔn)采用2013歐洲高血壓學(xué)會歐洲心 臟病學(xué)會高血壓管理指南的標(biāo)準(zhǔn)。排除糖尿病、繼發(fā)性高血壓、心肌梗死、冠心病、腦卒中、 腎臟疾病、藥物成癮或者其他嚴(yán)重的疾病后，最后確定原發(fā)性高血壓病人96例作為病例組 (56.72 ± 8.71)，同時收集年齡（±3歲）、性別匹配且無原發(fā)性高血壓家族史的96名正常 者作為對照組（56.32 ± 8.23)。對所有研究對象在知情同意的前提下，抽血檢測載脂蛋 白、同型半胱氨酸等一般生化指標(biāo)，同時抽取靜脈血3ml入EDTA抗凝管中，迅速于超低溫(-80° C)保存血樣，以備用于標(biāo)本統(tǒng)一提取基因組DNA。
[0014] 2、基因組DNA的提取 應(yīng)用Lab-Aid 820全自動核酸提取儀（中國廈門，致善生物科技)提取上述步驟得到的 樣本的全血基因組DNA，再通過NanoDrop2000超微量分光光度計（美國，Thermo Fisher Scientific)檢測所得DNA的濃度，以供ACE2基因啟動子區(qū)域DNA甲基化水平的檢測。
[0015] 3、DNA甲基化水平測定 本研究采用焦磷酸測序技術(shù)對ACE2基因啟動子區(qū)域的5個CpG位點（如圖1)進(jìn)行了 DNA 甲基化水平分析。此技術(shù)的基本原理：用重亞硫酸鹽處理DNA樣品后，再應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)擴(kuò)增，可使發(fā)生甲基化的胞嘧啶(C)堿基保持不變，而使未發(fā)生甲基化的C轉(zhuǎn)變成了尿 嘧啶(U)，然后通過測序引物進(jìn)行PCR測序，從而得到哪個位點發(fā)生了甲基化。本次研究采用 PyroMark Assay Design軟件進(jìn)行引物設(shè)計，用于實驗的PCR擴(kuò)增引物和測序引物如下： (1) 甲基化特異性上游引物(Forward primer): 5,-GGGTAGATTAAGAGGTTAGAAG-3, (SEQ ID N0.1)； (2) 甲基化特異性下游引物(Reverse primer): 5'-Biotin-ATTCACCCCATTCTCCTA-3' （SEQ ID N0.2); (3) 甲基化特異性測序引物(Sequencing primer): 5'-TTATTAAAAATATAAAAATATTAG-3' （SEQ ID N0.3)。
[0016] 具體實驗步驟： A、采用EZ DNA甲基化試劑盒-Gold(EZ DNAMethylation-GoldTMKit; ZYMO RESEARCH) 對樣本DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。
[0017] B、取步驟A中轉(zhuǎn)化過的DNA樣本20ng加入到Zymo TaqTM PreMix酶（Zymo TaqTM PreMix, ZYMO RESEARCH)，并加入上述一對ACE2基因啟動子區(qū)域甲基化特異性擴(kuò)增引物， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件:首先95°C 10min的變性;接著95°C 30s，Tm 52.8 °C 40s，72°C 50s，共45個循環(huán)的退火反應(yīng);然后延伸反應(yīng)72° C 7min。（注:Tm在實驗中根據(jù)跑PCR梯度溫 度確定） C、焦磷酸測序的前期準(zhǔn)備:在PSQ96板中預(yù)先加入45μ1含有0.3μΜ上述甲基化特異性測 序引物的退火緩沖液(PyroMark Annealing Buffer; Qiagen);將需要使用的混勾的瓊脂 糖珠總量（每樣本3yl)轉(zhuǎn)移到一個Eppendorf管中；在瓊脂糖珠中加入結(jié)合緩沖液 (PyroMark Binding Buffer; Qiagen)，使得平均每個樣品約有50μ1的體積，將混合物混 勻;將以上混合物加入PCR產(chǎn)物(50μ1反應(yīng)體積）中，每樣本50μ1;將PCR產(chǎn)物在常溫下混勻10 分鐘，使得磁珠與生物素結(jié)合;在真空預(yù)備工作站中，四個樣品板中依次加入180ml的高純 水、70%乙醇、洗滌緩沖液（PyroMark Wash Buffer; Qiagen;)和120ml的變性緩沖液 (PyroMark Denaturation Solution; Qiagen);打開真空預(yù)備工作站的栗，將真空準(zhǔn)備工 具在高純水中清洗30秒;然后將真空準(zhǔn)備工具(PyroMark Vacuum Prep Filter Probes; Qiagen)移到PCR板中，抓取瓊脂糖珠(在磁珠與PCR產(chǎn)物結(jié)合后三分鐘內(nèi)完成此操作）；拿起 PCR板，檢查是否大部分磁珠都被吸附在了真空準(zhǔn)備工具上;將真空準(zhǔn)備工具放入70%乙醇 中5秒;然后移到變性緩沖液中5秒;再移到洗滌緩沖液中清洗5 -10秒;關(guān)掉栗;將真空準(zhǔn)備 工具放入含有測序引物的板中，搖動，釋放瓊脂糖珠(測序引物也可最后加入）；使用高純水 清洗真空準(zhǔn)備工具;將放有樣品的PSQ96板放在加熱板上加熱到80° C 2分鐘，再冷卻到室 溫，即可進(jìn)行焦磷酸測序反應(yīng)。
[0018] D、焦磷酸測序:在PyroMark Q24焦磷酸測序儀上，采用Pyromark Gold Q24試劑盒 (Pyromark Gold Q24 Reagents; Qiagen)對步驟C中的PSQ96板中的樣本進(jìn)行測序，然后應(yīng) 用PyroMark CpG軟件對結(jié)果進(jìn)行甲基化分析（甲基化水平檢測結(jié)果示例見圖2)。
[0019] 4、數(shù)據(jù)分析 本次研究采用SPSS 18.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，我們發(fā)現(xiàn):被檢測的5個CpG位點之間大 部分不存在顯著的關(guān)聯(lián)(相關(guān)系數(shù)r〈 0.436, P〈 0.05,見圖1)(注:P〈 0.05時表示有統(tǒng) 計學(xué)意義，下同）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)病例組和對照組之間的ACE2基因啟動子區(qū)域CpG4(調(diào)整 的P = 0.020)和CpG5(調(diào)整的P = 0.036)的甲基化水平存在顯著差異。隨后我們運用廣義 多因子降維法分析了 5個CpG位點之間的交互作用，檢測到5個CpG位點之間的顯著的交互作 用(01? = 7.33，調(diào)整的？ = 0.011，見表2)。1?0(：曲線顯示0?65位點的甲基化水平能很好的預(yù) 測原發(fā)性高血壓的發(fā)病。
[0020] 本發(fā)明能夠用于檢測與原發(fā)性高血壓相關(guān)的ACE2基因啟動子區(qū)域甲基化程度的 檢測試劑盒具有準(zhǔn)確可靠，靈活快速和經(jīng)濟(jì)節(jié)約的優(yōu)點。本發(fā)明采用上述試劑盒對ACE2基 因啟動子區(qū)域甲基化水平進(jìn)行檢測，能夠快速可靠地為原發(fā)性高血壓的輔助診斷、檢測或 篩查藥物提供借鑒。
[0021] 表1:病例組與對照組間的比較（n=192)
注:表1中，η為樣本數(shù)量;表格數(shù)據(jù)中，/7值小于0.05，具有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0022] 表2: JCE?基因啟動子5個CpG位點之間高階交互作用的GMDR模型
本發(fā)明的最佳實施例已被闡明，由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員做出的各種變化或改型都不會 脫離本發(fā)明的范圍。
【主權(quán)項】
1. 用于輔助診斷原發(fā)性高血壓的檢測試劑盒，其特征是:所述的檢測試劑盒內(nèi)包括一 對JCE?基因啟動子區(qū)甲基化特異性擴(kuò)增引物及一個甲基化特異性測序引物： 甲基化特異性上游引物的核苷酸序列： 5 '-GGGTAGATTAAGAGGTTAGAAG-3，； 甲基化特異性下游引物的核苷酸序列： 5 '-Biotin-ATTCACCCCATTCTCCTA-3 '； 甲基化特異性測序引物的核苷酸序列： 5 '-TTATTAAAAATATAAAAATATTAG-3 '。2. -種如權(quán)利要求1所述的用于輔助診斷原發(fā)性高血壓的檢測試劑盒的應(yīng)用，其特征 在于:所述的檢測試劑盒能用于原發(fā)性高血壓輔助診斷、檢測或篩查。
【文檔編號】C12Q1/37GK105886641SQ201610338152
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月20日
【發(fā)明人】顧天倫, 張莉娜, 毛書奇, 范瑞
【申請人】寧波大學(xué)