一種溫和氣單胞菌特異性引物及其在大菱鲆養(yǎng)殖過程中的應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種溫和氣單胞菌特異性引物及其在大菱鲆養(yǎng)殖過程中的應用。本發(fā)明所提供的溫和氣單胞菌特異性引物由上游引物F：GCTGATTTTGGTGATGCGTTCA和下游引物R：TACGTACAGATCCCCAGCCC構成。本發(fā)明設計的溫和氣單胞菌特異性引物，能有效從各常見致病菌株中區(qū)分出溫和氣單胞菌，表現(xiàn)出很強的特異性和靈敏性。本發(fā)明所提供的在大菱鲆養(yǎng)殖過程中溫和氣單胞菌的PCR檢測方法，使得養(yǎng)殖過程中溫和氣單胞菌的檢測更為簡便，為今后大菱鲆養(yǎng)殖過程中高發(fā)致病菌的檢測和分析提供了必要的理論依據(jù)和完善的方法體系為促進我國養(yǎng)殖產業(yè)的規(guī)?；】蛋l(fā)展奠定了基礎。
【專利說明】
一種溫和氣單胞菌特異性引物及其在大菱鲆養(yǎng)殖過程中的 應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于病原微生物檢測領域，具體涉及一種大菱鲆養(yǎng)殖過程中常見的致病 菌:溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)的PCR檢測方法。
【背景技術】
[0002] 有"多寶魚"之稱的大菱鲆已被引進我國長達10年之久，憑借其優(yōu)良的苗種，先進 的創(chuàng)新模式和工業(yè)化養(yǎng)殖的潮流，逐漸成為全國引人注目的重要養(yǎng)魚工業(yè)。這一全新產業(yè) 的發(fā)展，對我國的水產經濟拉動均有很大作用，并為我國北方沿海城市工業(yè)化養(yǎng)魚的縱向 發(fā)展奠定了雄厚的理論和實踐基礎。然而隨著養(yǎng)殖規(guī)模的快速增長，養(yǎng)殖密度的增加，以及 水體環(huán)境的惡化，一系列的疾病也隨之而來。近年來在大菱鲆養(yǎng)殖過程中細菌性疾病的急 劇爆發(fā)嚴重影響并制約了我國大菱鲆養(yǎng)殖產業(yè)的健康發(fā)展，給養(yǎng)殖戶帶來了巨大的經濟損 失。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種對溫和氣單胞菌具有特異性強且靈敏性高的特異性引 物。
[0004] 本發(fā)明的另一目的是提供一種在大菱鲆養(yǎng)殖過程中，可快速鑒定致病源，為養(yǎng)殖 戶挽回經濟損失的大菱鲆養(yǎng)殖過程中溫和氣單胞菌的PCR檢測方法。
[0005] 本發(fā)明采用的技術方案是：一種溫和氣單胞菌特異性引物，所述的溫和氣單胞菌 特異性引物由上游引物F和下游引物R構成；
[0006] 所述的上游引物F的序列為:GCTGATTTTGGTGATGCGTTCA;
[0007] 所述的下游引物R的序列為:TACGTACAGATCCCCAGCCC
[0008] 優(yōu)選的，上述的一種溫和氣單胞菌特異性引物，所述的溫和氣單胞菌為Aeromonas sobria〇
[0009] -種大菱鲆養(yǎng)殖過程中溫和氣單胞菌的PCR檢測方法，方法如下：
[0010] 1)提取大菱鲆病灶部位細菌的總DNA;
[0011] 2)以所提取的DNA為模板，采用上述的溫和氣單胞菌特異性引物，進行PCR擴增；
[0012] 3)根據(jù)PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠呈像結果判斷大菱鲆是否被溫和氣單胞菌感 染;如果瓊脂糖凝膠呈現(xiàn)結果有486bp條帶產生，則大菱鲆被溫和氣單胞菌感染，否則沒有 被感染風險。
[0013] 上述的一種大菱鲆養(yǎng)殖過程中溫和氣單胞菌的PCR檢測方法：
[0015] PCR反應條件:第一階段:94°Clmin;
[0016] 第二階段：94°C 30s，60 °C lmin，72 °C 30s; 30 循環(huán)；
[0017] 第三階段:72°C2min;
[0018] 第四階段:4°C保存。
[0019] 本發(fā)明的有益效果是：
[0020] 1.本發(fā)明，設計的溫和氣單胞菌特異性引物，能有效從各常見致病菌株中區(qū)分出 溫和氣單胞菌，表現(xiàn)出很強的特異性。
[0021] 2.本發(fā)明，設計的溫和氣單胞菌特異性引物，靈敏性高，可有效檢出養(yǎng)殖過程中的 溫和氣單胞菌，其最低檢測濃度可達到l〇_4ng/ul。
[0022] 3.本發(fā)明，所提供的在大菱鲆養(yǎng)殖過程中溫和氣單胞菌的PCR檢測方法，使得養(yǎng)殖 過程中溫和氣單胞菌的檢測更為簡便。在大菱鲆養(yǎng)殖過程中，一旦有被溫和氣單胞菌感染 的風險，即能夠做到快速鑒定致病源，為養(yǎng)殖戶挽回大量損失。本發(fā)明的檢測方法可有效檢 出大菱鲆養(yǎng)殖過程中的高危致病菌溫和氣單胞菌，經驗證此檢測方法特異性強，靈敏度高。 該檢測方法的確立為今后大菱鲆養(yǎng)殖過程中高發(fā)致病菌的檢測和分析提供了必要的理論 依據(jù)和完善的方法體系，不僅為今后大菱鲆養(yǎng)殖產業(yè)的健康發(fā)展做出了貢獻，同時為促進 我國養(yǎng)殖產業(yè)的規(guī)模化健康發(fā)展奠定了基礎。
【附圖說明】
[0023] 圖1是溫和氣單胞菌特異性引物S的PCR反應條件優(yōu)化；
[0024] 其中，M:Marker DL2000，l-6:退火溫度分別為55,56,57,58,59,6(TC。
[0025] 圖2是溫和氣單胞菌特異性引物S的特異性驗證；
[0026] 其中，1 · Aeromonas bi val vium；2.Aeromonas caviae；3-4.Aeromonas hydrophila；
[0027] 5.Aeromonas jandaei；6.Aeromonas salmonicida；7.Aeromonas schubertii；
[0028] 8.Aeromonas sobria；9.Aeromonas veronii；10.Pseudomonas aeruginosa；
[0029] 11.Pseudomonas fragi；12.Pseudomonas gessardii；
[0030] 13.Pseudomonas helmanticensis；14.Pseudomonas kilonensis；
[0031 ] 15. Pseudomonas marginalis；16.Vibrio alginolyticus；17.Vibrio cyclitrophicus；
[0032] 18.Vibrio gigantis；M:Marker DL2000〇
[0033] 圖3是溫和氣單胞菌特異性引物S的PCR反應靈敏性驗證。
[0034] 其中，M:Marker DL2000，l-5:模板濃度分別為 10°，10-SlO-2，10-3，10-4ng/ul。
【具體實施方式】
[0035] 下面的實施例將對本發(fā)明予以進一步的說明，但并不因此而限制本發(fā)明。
[0036] 實施例1 一種溫和氣單胞菌特異性引物 [0037](一)溫和氣單胞菌特異性引物的設計
[0038] 本實施例針對菌種溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)的dnaj基因，利用MEGA6軟 件，設計出對溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)具有特異性強且靈敏性高的一對特異性引 物S，該溫和氣單胞菌特異性引物的具體信息如表1所示。
[0039] 表 1
[0040]
[0041 ](二)溫和氣單胞菌特異性引物最佳PCR反應條件的探索 [0042] 1、待試菌株DNA的提取
[0043] 使用Ezup柱氏基因組DNA抽提試劑盒（細菌），提取溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria)菌種的DNA，具體步驟如下：
[0044] 1.1)取lml過夜培養(yǎng)的含有菌種溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)的菌液，加入 1.5ml離心管中，室溫8000rmp離心lmin，棄上清，收集菌體，加入180ul Buffer Digestion， 再加入20ul Proteinase K溶液，震蕩混勻。56°C水浴lh至細胞完全裂解。水浴過程中，每10 分鐘顛倒混勻一次，促進細胞裂解。
[0045] 1.2)加入200ul Buffer BD，充分顛倒混勻。加入Buffer BD后，如有沉淀產生，可 70 °C水浴10分鐘。
[0046] 1.3)加入200ul的無水乙醇，充分顛倒混勻。加入無水乙醇后可能產生半透明纖維 狀懸浮物，不影響DNA的提取和應用。
[0047] 1.4)將吸附柱放入收集管中，用移液器將步驟1.3)獲得的溶液和半透明纖維狀懸 浮物全部加入吸附柱中，靜置2min，在12000rmp室溫離心lmin，倒掉收集管中的廢液。
[0048] 1.5)將吸附柱放回收集管，加入500ul PW Solution，10000rmp離心30s，倒掉濾 液。
[0049] 1.6)將吸附柱放回收集管，加入500ul Wash Solution，10000rmp離心30s，倒掉濾 液。
[0050] 1.7)將吸附柱重新放回收集管中，于12000rmp室溫離心2min，棄去殘留的Wash Solution。將吸附柱打開蓋子于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘留的Wash Solution，Wash Solution的殘留會影響基因組DNA的產量和后續(xù)的實驗。
[0051 ] 1.8)取出吸附柱，放入一個新的1.5ml離心管中，加入50-100ul CE Buffer靜置 3min，12000rmp室溫離心2min，收集DNA溶液，即為溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria)的 DNA。提取的DNA可立即進行下一步實驗或-20 °C保存。
[0052] 2、溫和氣單胞菌特異性引物最佳退火溫度的探索
[0053]以溫和氣單胞菌的DNA為模板做PCR擴增，并將目的引物的退火溫度范圍分別設置 為55-60°C，PCR擴增產物在2%瓊脂糖lXTAE緩沖系統(tǒng)中電泳，每孔加樣5ul，用凝膠成像系 統(tǒng)觀察并攝影記錄，根據(jù)PCR后的凝膠電泳結果確定各引物最佳退火溫度。具體PCR反應條 件和體系如表2所示，結果如圖1。
[0054]表2目的引物最佳PCR反應探索條件 [0055]
[0056]由圖1可見，在溫度為55-5%~時，雖然特異性引物S與目的菌株有特異性目的條帶 產生，但同時也有不明顯非特異性條帶產生，但將溫度提升至60°C時，非特異性條帶消失， 故確定最佳退火溫度為60 °C。
[0057](三)溫和氣單胞菌特異性引物的特異性探索 [0058] 1、待試菌株DNA的提取
[0059]使用Ezup柱氏基因組DNA抽提試劑盒（細菌），分別提取如表3所示的不同菌種的 DNA，具體步驟如上述(二）中步驟1。
[0060] 2、特異性探索
[0061 ]分別以表3中，不同菌種的DNA為模板做PCR擴增，具體PCR反應條件和體系如表4所 示，PCR后的凝膠電泳結果如圖2所示。
[0062] 表3待試菌株如下：
[0064] 表4目的引物最佳PCR反應條件
[0065]
[0066] 由圖2可見，該特異性引物在氣單胞菌屬內，以及假單胞菌和弧菌屬內均表現(xiàn)出很 強的特異性，只能和目的菌株溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)產生特異性擴增，而未和 非目的菌株產生特異性擴增。故可見其表現(xiàn)出很強的特異性。
[0067] (四)溫和氣單胞菌特異性引物的靈敏性的探索 [0068] 1、待試菌株DNA的提取
[0069] 使用Ezup柱氏基因組DNA抽提試劑盒（細菌），提取溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria)菌種的DNA，具體步驟如上述(二）中步驟1。
[0070] 2、靈敏性的探索
[0071] 將溫和氣單胞菌的DNA濃度調至10ng/ul，并且依次稀釋為10°、10-1、10-2、10- 3、10- 4ng/ul，分別取2ul DNA作為PCR反應模板，具體PCR反應條件和體系如表5所示，PCR后的凝 膠電泳結果如圖3所示。
[0072]表5目的引物最佳PCR反應探索條件
[0073]
[0074]由圖3可見，該引物在溫和氣單胞菌DNA濃度為10Q、10-\10-2、10- 3、10-4ng/ul時均 可產生特異性擴增，其最低檢測濃度可達到l(T4ng/Ul。
[0075] 實施例2-種大菱鲆養(yǎng)殖過程中溫和氣單胞菌的PCR檢測方法
[0076] 方法如下：
[0077] 1、提取大菱鲆病灶部位細菌的總DNA;
[0078]將其病灶處組織用lml無菌水反復沖洗，至少三次，然后收集液體，使用Ezup柱氏 基因組DNA抽提試劑盒(細菌），提取大菱鲆病灶部位細菌的總DNA，具體步驟如上述實例1中 (二)的步驟1。
[0079] 2、以DNA為模板，采用實施例1所述的溫和氣單胞菌特異性引物，利用PCR方法擴 增，得到PCR產物；
[0080]上游引物F: GCTGATTTTGGTGATGCGTTCA [0081 ]下游引物R: TACGTACAGATCCCCAGCCC
[0083] PCR反應條件:第一階段:94°Clmin;
[0084] 第二階段：94°C 30s，60 °C lmin，72 °C 30s; 30 循環(huán)；
[0085] 第三階段：72°C2min;
[0086] 第四階段:4°C保存。
[0087] 3、PCR擴增產物在2%瓊脂糖1 X TAE緩沖系統(tǒng)中電泳，每孔加樣5ul，用凝膠成像系 統(tǒng)觀察并攝影記錄。
[0088] 4、判斷標準:根據(jù)PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠呈像結果判斷大菱鲆是否被溫和氣 單胞菌感染;如果瓊脂糖凝膠呈現(xiàn)結果有486bp條帶產生，則大菱鲆被溫和氣單胞菌感染， 否則沒有被感染。
[0089]驗證:制作感染溫和氣單胞菌的大菱鲆模型，然后對該特異性引物進行多次測試， 測試結果表明使用該引物進行溫和氣單胞菌結果準確性高;其中感染溫和氣單胞菌的18尾 大菱鲆檢測率為100%，未感染溫和氣單胞就的12尾大菱鲆的未檢出率也為100%，綜上所 述，該特異性引物可準確檢出溫和氣單胞菌，檢測結果準確率達到100%。
【主權項】
1. 一種溫和氣單胞菌特異性引物，其特征在于:所述的溫和氣單胞菌特異性引物由上 游引物F和下游引物R構成； 所述的上游引物F的序列為:GCTGATTTTGGTGATGCGTTCA; 所述的下游引物R的序列為:TACGTACAGATCCCCAGCCC。2. 根據(jù)權利要求1所述的一種溫和氣單胞菌特異性引物，其特征在于:所述的溫和氣單 胞菌是Aeromonas sobria。3. 權利要求1或2所述的溫和氣單胞菌特異性引物在大菱鲆養(yǎng)殖過程中的應用。4. 一種大菱鲆養(yǎng)殖過程中溫和氣單胞菌的PCR檢測方法，其特征在于方法如下： 1) 提取大菱鲆病灶部位細菌的總DNA; 2) 以所提取的DNA為模板，采用權利要求1或2所述的溫和氣單胞菌特異性引物，進行 PCR擴增； 3) 根據(jù)PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠呈像結果判斷大菱鲆是否被溫和氣單胞菌感染;如 果瓊脂糖凝膠呈現(xiàn)結果有486bp條帶產生，則大菱鲆被溫和氣單胞菌感染，否則沒有被感 染。5. 根據(jù)權利要求4所述的一種大菱鲆養(yǎng)殖過程中溫和氣單胞菌的PCR檢測方法，其特征 在 于:PCR反應體系為?： 25μL體系：Estaq 12.5ul 上游引物F Iul 下游引物R Iul 樣品DNA 2ul ddH：0 S 5ul； PCR反應條件:第一階段:94 °C Imin; 第二階段:94 °C 30s，60 °C Imin，72 °C 30s; 30 循環(huán)； 第三階段:72°C2min; 第四階段:4°C保存。
【文檔編號】C12Q1/04GK105886637SQ201610311622
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月11日
【發(fā)明人】劉宏生, 顧穎, 張新剛, 張力, 趙健
【申請人】遼寧大學