雙內(nèi)參基因檢測(cè)紅景天苷合成酶基因表達(dá)活性的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種利用雙內(nèi)參基因校正檢測(cè)紅景天苷關(guān)鍵合成酶基因表達(dá)的方法。具體是利用設(shè)計(jì)、篩選獲得的引物，擴(kuò)增獲得甘油醛磷酸脫氫酶和植物螯合肽合成酶基因，并作為雙內(nèi)參基因校正檢測(cè)大花紅景天組培苗中合成紅景天苷的三個(gè)關(guān)鍵酶：酪氨酸脫羧酶、酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶和苯丙氨酸解氨酶基因表達(dá)活性的方法。步驟為：提取大花紅景天植物總RNA，合成cDNA第一鏈，利用熒光定量PCR技術(shù)，采用給定引物擴(kuò)增獲得以GAPDH和PCS雙內(nèi)參基因校正檢測(cè)大花紅景天組培苗中合成紅景天苷關(guān)鍵酶基因TyDC，TAT，PAL的表達(dá)活性。該方法對(duì)大花紅景天組培苗、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、毛狀根培養(yǎng)等生產(chǎn)的質(zhì)量控制、產(chǎn)物活性檢測(cè)等方面，具有快速、準(zhǔn)確、實(shí)用、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。CGMCC No.934720140710
【專利說(shuō)明】
雙內(nèi)參基因檢測(cè)紅景天苷合成酶基因表達(dá)活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于植物中活性化合物的關(guān)鍵酶活性檢測(cè)，具體的說(shuō)是涉及采用雙內(nèi)參基 因組合校正檢測(cè)大花紅景天中苯丙氨酸解氨酶、酪氨酸脫羧酶和酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因表達(dá)活 性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 大花紅景天（Rhodiola crenulata)隸屬于景天科（Crassulaceae)紅景天屬 (Rhodiola)的珍稀藥用植物，為多年生肉質(zhì)草本，主要分布于中國(guó)西南部海拔超過(guò)3000m的 強(qiáng)紫外、溫差大、干旱、高寒、缺氧的山區(qū)，是中華人民共和國(guó)《藥典》收錄的中藥紅景天指定 的唯一基源植物，也是我國(guó)高山人民使用近千年的民間植物藥。主要用于治療高原反應(yīng)和 缺氧癥，被譽(yù)為"高原人參"。其主要活性成分是紅景天苷，具有適應(yīng)原活性，在抗疲勞、抗輻 射、抗氧化等方面具有良好的療效，被廣泛應(yīng)用于化妝品、特殊功能保健品、食品等的生產(chǎn)。 [0003] 紅景天和紅景天苷的市場(chǎng)需求量逐年上升，野生資源供不應(yīng)求，人們嘗試多種生 產(chǎn)方法提高紅景天苷的生產(chǎn)量。人們?cè)谌斯ぴ耘?、組織培養(yǎng)、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)、真菌促生等方 面開展了大量研究，取得了較大進(jìn)步。
[0004] 目前人們采用改變環(huán)境條件、添加前體或中間物改變紅景天苷的積累能力，對(duì)紅 景天苷代謝物檢測(cè)的主要方法是采用HPLC檢測(cè)紅景天苷產(chǎn)量;也有學(xué)者通過(guò)克隆、轉(zhuǎn)基因， 單純提高紅景天中某些關(guān)鍵酶基因的辦法提高紅景天產(chǎn)量，之后通過(guò)HPLC等方法檢測(cè)紅景 天苷的產(chǎn)量等等。但這些方法存在耗時(shí)長(zhǎng)、效果不顯著、定量不精確等缺點(diǎn)。另外，對(duì)于利用 內(nèi)生真菌資源與宿主共生，通過(guò)重建微生物或其群落的辦法促進(jìn)紅景天植物中紅景天苷的 積累的實(shí)踐，是新興的解決問(wèn)題的方法，尚沒有代謝途徑關(guān)鍵酶活性檢測(cè)的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于為紅景天代謝途徑研究提供5個(gè)紅景天基因的擴(kuò)增引物，其中 包括2個(gè)內(nèi)參基因[甘油醛磷酸脫氫酶(GAPDH)、植物螯合肽合成酶(PCS)]和3個(gè)關(guān)鍵酶基因 [苯丙氨酸解氨酶(PAL)、酪氨酸脫羧酶(TyDC)和酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶(TAT)]的引物。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于采用上述引物擴(kuò)增，進(jìn)而獲得以GATOH和PCS雙內(nèi)參基因 校正檢測(cè)紅景天苷三個(gè)紅景天苷合成關(guān)鍵酶基因 TyDC，TAT，PAL表達(dá)活性的方法。
[0007] 本發(fā)明提供的引物，具體見表1。
[0008] 表1.紅景天中2個(gè)內(nèi)參基因和3個(gè)紅景天苷關(guān)鍵合成酶基因的PCR引物
[0009]
[0010] 本發(fā)明提供的一種雙內(nèi)參基因檢測(cè)紅景天苷合成酶基因表達(dá)活性的方法，步驟如 下：
[0011] 1)采用組織培養(yǎng)方法獲得大花紅景天組培苗。接種真菌誘導(dǎo)子，溫室培養(yǎng)(光照強(qiáng) 度30μπιο1 · m-2 · s-S光培養(yǎng)14h，溫度28°C;暗培養(yǎng)10h，溫度22°C;濕度70%~75%)，定期 (4d，6d，8d，10d，12d，14d，16d)采集紅景天組培苗;不接種的組培苗作為對(duì)照(CK)。
[0012] 2)總RNA提取:采用常規(guī)方法提取大花紅景天組培苗的總RNA，并合成cDNA第1鏈。
[0013] 3)以表1提供的引物，以cDNA第1鏈為模板，定量PCR擴(kuò)增5個(gè)基因。擴(kuò)增反應(yīng)程序 為:94 °C預(yù)變性30s，95 °C變性5s，56 °C退火15s，72 °C延伸10s，45個(gè)循環(huán)。
[0014] 4)米用geNorm，Normf ider，Bestkeeper軟件分析2個(gè)內(nèi)參基因 GAPDH、PCS表達(dá)的穩(wěn) 定性和CT值等，結(jié)果表明，GAPDH和PCS穩(wěn)定性好，可以作為雙內(nèi)參基因組合校正檢測(cè)紅景天 苷三個(gè)紅景天苷合成關(guān)鍵酶基因 TyDC，TAT，PAL表達(dá)活性。
[0015] 5)關(guān)鍵酶基因表達(dá)活性分析:利用excel軟件分別計(jì)算每個(gè)樣品TyDC，TAT，PAL的 相對(duì)表達(dá)量，并以GATOH和PCS作為雙內(nèi)參，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)誤差矯正。利用2^Λετ[ Δ ACT=(待測(cè) 組關(guān)鍵酶基因的ct值一待測(cè)組內(nèi)參基因的ct值）一（對(duì)照組關(guān)鍵酶基因的ct值一對(duì)照組內(nèi) 參基因的ct值）]的方法計(jì)算共生苗的TyDC，TAT，PAL基因表達(dá)活性。結(jié)果表明該方法能穩(wěn) 定、精確、高效的檢測(cè)紅景天苷三個(gè)關(guān)鍵酶基因表達(dá)活性。
[0016] 所述步驟1)中的真菌為保藏號(hào)為CGMCC心.9347的真菌？1^31〇〇6?1^13 fortinii。該菌種的保藏單位：中國(guó)微生物菌種管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏 地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏時(shí)間：2014年7月10 曰。
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的有益效果：本專利采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，用 geNorm，NormFinder，Bestkeeper軟件對(duì)紅景天中的一系列內(nèi)參基因進(jìn)行評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，最 終選擇確定建立以GAPDH和PCS二個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行雙基因組合校正檢測(cè)三個(gè)紅景天苷合成 關(guān)鍵酶基因 TyDC，TAT，PAL的表達(dá)活性，這對(duì)大花紅景天組培苗、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、毛狀根培養(yǎng) 等生產(chǎn)的質(zhì)量控制、產(chǎn)物活性檢測(cè)等方面，具有快速、準(zhǔn)確、實(shí)用、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，是一種具有 良好應(yīng)用前景的新技術(shù)。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1.雙內(nèi)參基因 GAPDH和PCS對(duì)TyDC基因表達(dá)活性校正檢測(cè)活性結(jié)果圖
[0019] 圖2.雙內(nèi)參基因 GAPDH和PCS對(duì)TAT基因表達(dá)活性校正檢測(cè)活性結(jié)果圖
[0020] 圖3.雙內(nèi)參基因 GAPDH和PCS對(duì)PAL基因表達(dá)活性校正檢測(cè)活性結(jié)果圖
【具體實(shí)施方式】
[0021] 實(shí)施例中用到的真菌為保藏編號(hào)為CGMCC心.9347的真菌？1^&1〇〇6?11&1 & fortinii 真菌。
[0022] 實(shí)施例1
[0023] 1)采用組織培養(yǎng)方法獲得大花紅景天組培苗。接種真菌CGMCC No. 9347，溫室培養(yǎng) (光照強(qiáng)度30μπιο1 · m-2 · s-1;光培養(yǎng)14h，溫度28°C;暗培養(yǎng)10h，溫度22°C;濕度70%~ 75%)，定期(4(1，6(1，8(1，10(1，12(1，14(1，16(1)采集紅景天組培苗;采集不接種的組培苗作為對(duì) 照(ck)。
[0024] 2)總RNA提取:采用常規(guī)方法提取大花紅景天組培苗的總RNA，并合成cDNA第1鏈。
[0025] 3)以表1提供的引物，以cDNA第1鏈為模板，定量PCR擴(kuò)增5個(gè)基因。擴(kuò)增反應(yīng)程序 為:94 °C預(yù)變性30s，95 °C變性5s，56 °C退火15s，72 °C延伸10s，45個(gè)循環(huán)。
[0026] 4)采用2個(gè)內(nèi)參基因 GAH)H、PCS組合校正檢測(cè)紅景天苷合成關(guān)鍵酶基因 TyDC的表 達(dá)活性。
[0027]圖1表明，內(nèi)生真菌與大花紅景天組培苗互作4d和6d時(shí)，TyDC基因的相對(duì)表達(dá)量與 對(duì)照組的差異不顯著(*P>〇.〇5);互作8d~12d時(shí)，其相對(duì)表達(dá)量顯著升高(*P〈0.05);第12d 時(shí)處理組的表達(dá)量最大，為對(duì)照組的2.9倍，而后開始下降，第14d和第16d，TyDC基因的相對(duì) 表達(dá)降低為對(duì)照的〇. 7倍左右。這表明編號(hào)為CGMCC No. 9347的真菌在不同的時(shí)間段，對(duì)宿 主大花紅景天中紅景天苷等活性成分積累的調(diào)控的效果不同。這顯示出雙內(nèi)參基因?qū)﹃P(guān)鍵 酶TyDC基因表達(dá)活性的良好效果。
[0028] 實(shí)施例2
[0029] 1)采用組織培養(yǎng)方法獲得大花紅景天組培苗。接種真菌CGMCC No. 9347，溫室培養(yǎng) (光照強(qiáng)度30μπιο1 · m-2 · s-1;光培養(yǎng)14h，溫度28°C;暗培養(yǎng)10h，溫度22°C;濕度70%~ 75%)，定期(4(1，6(1，8(1，10(1，12(1，14(1，16(1)采集紅景天組培苗;采集不接種的組培苗作為對(duì) 照(ck)。
[0030] 2)總RNA提取:采用常規(guī)方法提取大花紅景天組培苗的總RNA，并合成cDNA第1鏈。
[0031] 3)以表1提供的引物，以cDNA第1鏈為模板，定量PCR擴(kuò)增5個(gè)基因。擴(kuò)增反應(yīng)程序 為:94 °C預(yù)變性30s，95 °C變性5s，56 °C退火15s，72 °C延伸10s，45個(gè)循環(huán)。
[0032] 4)采用GAPDH、PCS雙內(nèi)參基因組合校正檢測(cè)紅景天苷關(guān)鍵酶基因 TAT的表達(dá)活性。 [0033]圖2表明，內(nèi)生真菌沒有顯著地提高紅景天TAT基因的表達(dá)量?；プ?d，14d，16d時(shí)， TAT的相對(duì)表達(dá)量顯著地低于對(duì)照(*P〈0.05);互作6d~12d，TAT的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照沒有 顯著性差異，表明真菌對(duì)大花紅景天中紅景天苷合成途徑中酪氨酸解氨酶合成方向沒有影 響。這顯示出雙內(nèi)參基因?qū)﹃P(guān)鍵酶TAT基因表達(dá)活性的良好檢測(cè)效果。
[0034] 實(shí)施例3
[0035] 1)采用組織培養(yǎng)方法獲得大花紅景天組培苗。接種真菌CGMCC No. 9347，溫室培養(yǎng) (光照強(qiáng)度30μπιο1 · m-2 · s-1;光培養(yǎng)14h，溫度28°C;暗培養(yǎng)10h，溫度22°C;濕度70%~ 75%)，定期(4(1，6(1，8(1，10(1，12(1，14(1，16(1)采集紅景天組培苗;采集不接種的組培苗作為對(duì) 照(ck)。
[0036] 2)總RNA提取:采用常規(guī)方法提取大花紅景天組培苗的總RNA，并合成cDNA第1鏈。
[0037] 3)以表1提供的引物，以cDNA第1鏈為模板，定量PCR擴(kuò)增5個(gè)基因。擴(kuò)增反應(yīng)程序 為:94 °C預(yù)變性30s，95 °C變性5s，56 °C退火15s，72 °C延伸10s，45個(gè)循環(huán)。
[0038] 4)采用GAPDH、PCS雙內(nèi)參基因組合校正檢測(cè)紅景天苷三個(gè)紅景天苷合成關(guān)鍵酶基 因 PAL的表達(dá)活性。
[0039] 圖3表明，相比于對(duì)照，大花紅景天PAL基因的表達(dá)量經(jīng)歷了先升高，達(dá)到峰值，而 后下降的趨勢(shì)，具有顯著性變化結(jié)果(，〈〇.05)。其中，互作6d~14d時(shí)，內(nèi)生真菌能顯著提 高了宿主紅景天PAL基因的表達(dá)量，而互作16d時(shí)，處理組降低到對(duì)照組的0.52倍。這顯示出 雙內(nèi)參基因?qū)﹃P(guān)鍵酶PAL基因表達(dá)活性的良好檢測(cè)效果。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種雙內(nèi)參基因引物對(duì)，是核苷酸序列為SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2的甘油醛磷酸 脫氫酶基因引物對(duì)和核苷酸序列為SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的植物螯合肽合成酶基因 引物對(duì)。2. -種紅景天苷合成關(guān)鍵酶基因引物對(duì)，是核苷酸序列為SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6 的酪氨酸脫羧酶引物對(duì)、核苷酸序列為SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8的酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶引物對(duì) 或核苷酸序列為SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10的苯丙氨酸解氨酶引物對(duì)。3. -種采用雙內(nèi)參基因檢測(cè)紅景天苷合成酶基因表達(dá)活性的方法，包括如下步驟： 1) 采用組織培養(yǎng)方法獲得大花紅景天組培苗，接種真菌誘導(dǎo)子，溫室培養(yǎng)，采集紅景天 組培苗;不接種的組培苗作為對(duì)照； 2) 采用常規(guī)方法提取大花紅景天組培苗的總RNA，并合成cDNA第1鏈； 3) 以權(quán)利要求1所述的雙內(nèi)參基因引物對(duì)和權(quán)利要求2所述的關(guān)鍵酶基因引物對(duì)為引 物，以cDNA第1鏈為模板，分別定量PCR擴(kuò)增GATOH基因、PCS基因、TyDC基因、TAT基因和PAL基 因；擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94 °C預(yù)變性30s，95 °C變性5s，56 °C退火15s，72 °C延伸IOs，45個(gè)循環(huán)； 4) 采用geNorm, Normfider ,Bestkeeper軟件分析GAF1DH基因、PCS基因表達(dá)的穩(wěn)定性和 CT值等； 5) 利用excel軟件分別計(jì)算每個(gè)樣品TyDC，TAT，PAL基因的相對(duì)表達(dá)量，并以GAPDH和 PCS基因表達(dá)作為雙內(nèi)參，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)誤差矯正；利用2_ΛΛετ[Δ ACT=(待測(cè)組關(guān)鍵酶基因的 ct值一待測(cè)組內(nèi)參基因的ct值）一（對(duì)照組關(guān)鍵酶基因的ct值一對(duì)照組內(nèi)參基因的Ct值）] 的方法計(jì)算共生苗的TyDC，TAT，PAL基因表達(dá)活性。4. 如權(quán)利要求3所述的采用雙內(nèi)參基因檢測(cè)紅景天苷合成酶基因表達(dá)活性的方法，所 述步驟1)中的真菌為保藏標(biāo)號(hào)為CGMCC No.9347的真菌Phialocephala fortinii。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK105886638SQ201610316147
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年5月12日
【發(fā)明人】崔晉龍, 王雅楠, 王夢(mèng)亮
【申請(qǐng)人】山西大學(xué)