分子標(biāo)志物在診治食管鱗癌中的應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種分子標(biāo)志物在食管鱗癌診治中的應(yīng)用，該分子標(biāo)志物為MYOC基因，本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了MYOC基因在食管鱗癌組織中存在差異表達(dá)，可以作為早期診斷食管鱗癌的指標(biāo)。本發(fā)明同時(shí)證明了通過(guò)調(diào)高M(jìn)YOC基因的表達(dá)水平可以抑制食管鱗癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，可以作為食管鱗癌的潛在治療靶標(biāo)，用于指導(dǎo)新藥的研發(fā)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
分子標(biāo)志物在診治食管鱗癌中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種分子標(biāo)志物在診治食管鱗癌中的應(yīng)用，具體 地該分子標(biāo)志物為MY0C基因。
【背景技術(shù)】
[0002] 食管癌是人類(lèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，主要包括兩大類(lèi)，食管鱗癌和食管腺癌，而 中國(guó)主要以食管鱗癌為主。目前食管鱗癌的發(fā)病率呈逐年增加的趨勢(shì)，轉(zhuǎn)移率高，預(yù)后不 良。由于食管鱗癌在發(fā)病早期病人沒(méi)有明顯的癥狀，就診時(shí)一般都處于中晚期，5年生存率 僅為18-30%。在我國(guó)，尤其是食管鱗癌的高發(fā)地區(qū)，食管鱗癌已成為危害人民群眾生命安 全的重要原因。
[0003] 食管鱗癌的癌變過(guò)程是一個(gè)多階段的演進(jìn)過(guò)程，其一般演進(jìn)模式為:正常食管鱗 癌上皮一食管上皮基底細(xì)胞過(guò)度增生一不典型增生一原位癌一食管鱗癌。食管鱗癌的發(fā)生 和發(fā)展是一個(gè)涉及多因素多步驟的復(fù)雜的病理過(guò)程，其由包括遺傳、環(huán)境、生活方式等多因 素綜合作用而致。誘發(fā)食管癌的危險(xiǎn)因素有遺傳易感性、吸煙、飲酒、喜食燙食等生活習(xí)慣， 亞硝胺類(lèi)化合物攝入，低水平社會(huì)經(jīng)濟(jì)條件，癌前病變等。
[0004] 目前，手術(shù)治療是食管鱗癌的主要有效治療手段之一，但食管鱗癌就診時(shí)多處于 中晚期，相當(dāng)部分的病人已不能進(jìn)行手術(shù)治療，總體5年生存率低于10%，如果早期食管鱗 癌病人進(jìn)行有效的手術(shù)治療，10年生存率可達(dá)95%以上。因此，早期診斷，早期治療，在食管 鱗癌的治療中顯得格外重要。上消化道內(nèi)鏡檢查仍是現(xiàn)階段發(fā)現(xiàn)早期食管鱗癌的最常見(jiàn)的 手段，但是由于其價(jià)格昂貴及有創(chuàng)性，限制了大規(guī)模的高危人群篩查。與肝癌、前列腺癌、腸 癌等腫瘤相比，食管鱗癌的診斷和監(jiān)測(cè)缺乏相對(duì)有效的腫瘤標(biāo)志物。盡管臨床上已經(jīng)應(yīng)用 了諸如SCC、CEA、CA724和CA199等的標(biāo)志物，但上述分子標(biāo)志物在食管鱗癌的臨床診斷的應(yīng) 用價(jià)值有限。因此尋找一種有效、可靠的腫瘤標(biāo)志物對(duì)于食管鱗癌的診斷和治療都有著比 較重要的臨床意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種可用于診治食管鱗癌的 MY0C基因。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供了檢測(cè)MY0C基因表達(dá)的產(chǎn)品在制備診斷食管鱗癌的工具中的應(yīng)用。
[0008] 進(jìn)一步，所述產(chǎn)品包括:通過(guò)RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、dPCR、免疫檢測(cè)、原位雜交或芯 片檢測(cè)MY0C基因的表達(dá)水平以診斷食管鱗癌的產(chǎn)品。
[0009] 進(jìn)一步，所述用RT-PCR診斷食管鱗癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增MY0C基因的引 物;所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷食管鱗癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增MY0C基因的引物;所述 用dPCR診斷食管鱗癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增MY0C基因的引物;所述用免疫檢測(cè)診斷 食管鱗癌的產(chǎn)品包括:與MY0C蛋白特異性結(jié)合的抗體;所述用原位雜交診斷食管鱗癌的產(chǎn) 品包括:與MYOC基因的核酸序列雜交的探針;所述用芯片診斷食管鱗癌的產(chǎn)品包括:蛋白芯 片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括與MY0C蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因芯片包括與MY0C基 因的核酸序列雜交的探針。
[0010]進(jìn)一步，所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷食管鱗癌的試劑至少包括的一對(duì)特異擴(kuò)增MY0C 基因的引物如SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示。
[0011 ] 本發(fā)明中針對(duì)MY0C基因的探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其它衍生 物。所述探針的長(zhǎng)度沒(méi)有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合，任何 長(zhǎng)度都可以。所述探針的長(zhǎng)度可短至25、20、15、13或10個(gè)堿基長(zhǎng)度。同樣，所述探針的長(zhǎng)度 可長(zhǎng)至60、80、100、150、300個(gè)堿基對(duì)或更長(zhǎng)，甚至整個(gè)基因。由于不同的探針長(zhǎng)度對(duì)雜交效 率、信號(hào)特異性有不同的影響，所述探針的長(zhǎng)度通常至少是14個(gè)堿基對(duì)，最長(zhǎng)一般不超過(guò)30 個(gè)堿基對(duì)，與目的核苷酸序列互補(bǔ)的長(zhǎng)度以15-25個(gè)堿基對(duì)最佳。所述探針自身互補(bǔ)序列最 好少于4個(gè)堿基對(duì)，以免影響雜交效率。
[0012] 本發(fā)明提供了一種診斷食管鱗癌的工具，所述工具能夠通過(guò)檢測(cè)食管組織中MY0C 基因的表達(dá)水平來(lái)診斷食管鱗癌，MY0C基因在食管鱗癌組織中表達(dá)下調(diào)。
[0013] 進(jìn)一步，所述工具包括芯片、或試劑盒；其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯 片;所述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒、蛋白免疫檢測(cè)試劑盒。所述基因芯片包括固相載體以 及固定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測(cè)MY0C基因轉(zhuǎn)錄水平的 針對(duì)MY0C基因的寡核苷酸探針;所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體的MY0C 蛋白的特異性抗體;所述基因檢測(cè)試劑盒包括用于檢測(cè)MY0C基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑;所述蛋 白免疫檢測(cè)試劑盒包括MY0C蛋白的特異性抗體。
[0014] 所述基因芯片可用于檢測(cè)包括MY0C基因在內(nèi)的多個(gè)基因（例如，與食管鱗癌相關(guān) 的多個(gè)基因）的表達(dá)水平。所述蛋白質(zhì)芯片可用于檢測(cè)包括MY0C蛋白在內(nèi)的多個(gè)蛋白質(zhì)（例 如與食管鱗癌相關(guān)的多個(gè)蛋白質(zhì)）的表達(dá)水平。通過(guò)將多個(gè)與食管鱗癌的標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)， 可大大提高食管鱗癌診斷的準(zhǔn)確率。所述基因檢測(cè)試劑盒可用于檢測(cè)包括MY0C基因在內(nèi)的 多個(gè)基因（例如，與食管鱗癌相關(guān)的多個(gè)基因）的表達(dá)水平。所述蛋白免疫檢測(cè)試劑盒可用 于檢測(cè)包括MY0C蛋白在內(nèi)的多個(gè)蛋白質(zhì)(例如與食管鱗癌相關(guān)的多個(gè)蛋白質(zhì)）的表達(dá)水平。 將食管鱗癌的多個(gè)標(biāo)志物同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，可大大提高食管鱗癌診斷的準(zhǔn)確率。
[0015] 在本發(fā)明中，所述MY0C蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述MY0C 蛋白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾，例如，嵌合抗體、scFv、 Fab、F(ab'）2、Fv等。只要所述片段能夠保留與MY0C蛋白的結(jié)合能力即可。用于檢測(cè)蛋白質(zhì) 水平的抗體的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本發(fā)明可以使用任何方法來(lái)制備所述抗 體，如所述的片段可以通過(guò)化學(xué)法從頭合成或利用重組DNA技術(shù)合成。
[0016] 本發(fā)明提供了MY0C基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物在制備治療食管鱗癌的藥物組合物中的 應(yīng)用。
[0017] 進(jìn)一步，所述藥物組合物包括增加 MY0C基因表達(dá)、增強(qiáng)MY0C表達(dá)功能、和/或增強(qiáng) MY0C表達(dá)產(chǎn)物活性的試劑。
[0018] 進(jìn)一步，所述試劑包括:含有能編碼功能性MY0C蛋白的核酸的試劑、MY0C蛋白的激 活劑、含有MY0C蛋白質(zhì)的試劑。
[0019] 其中，所述含有能編碼功能性MY0C蛋白的核酸的試劑可以是在有利條件下翻譯成 活性形式的MYOC蛋白的單鏈核酸(如mRNA)或雙鏈核酸(如DNA)，所述的核酸可以連接在表 達(dá)載體上或重組到宿主細(xì)胞里，只要能編碼成活性MY0C蛋白，任何一種MY0C基因的攜帶方 式均可。所述的MY0C蛋白激活劑是指刺激MY0C蛋白活性、增加 MY0C蛋白活性、促進(jìn)MY0C蛋白 活性、增強(qiáng)MY0C蛋白激活、使MY0C蛋白活性敏感化或上調(diào)MY0C蛋白活性的試劑，如去甲基化 試劑、MY0C啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子特異性的轉(zhuǎn)錄激活劑、MY0C蛋白的激動(dòng)劑(如激活抗體)等。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種治療食管鱗癌的藥物組合物，所述藥物組合物包括增加 MY0C 基因表達(dá)、增強(qiáng)MY0C表達(dá)功能、和/或增強(qiáng)MY0C表達(dá)產(chǎn)物活性的試劑。
[0021] 進(jìn)一步，上述藥物組合物還包括藥學(xué)上可接受的載體，這類(lèi)載體包括（但并不限 于）：稀釋劑、賦形劑如乳糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、淀粉、水等、填充劑如淀粉、蔗糖等;粘合 劑如單糖漿、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮;濕潤(rùn) 劑如甘油；崩解劑如干淀粉、海藻酸鈉、海帶多糖粉末、瓊脂粉末、碳酸鈣和碳酸氫鈉;吸收 促進(jìn)劑季銨化合物、十二烷基硫酸鈉等;表面活性劑如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二 烷基硫酸鈉、硬脂酸單甘油酯、十六烷醇等;致濕劑如甘油、淀粉等;吸附載體如淀粉、乳糖、 斑脫土、硅膠、高嶺土和皂粘土等;潤(rùn)滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣和鎂、聚乙二醇、硼酸粉末等。
[0022] 所述的藥物組合物可以使用不同的添加劑進(jìn)行制備，例如緩沖劑、穩(wěn)定劑、抑菌 劑、等滲劑、螯合劑、pH控制劑及表面活性劑。
[0023] 所述緩沖劑可以包括硼酸、磷酸、乙酸、檸檬酸、谷氨酸及相應(yīng)的鹽(它們的堿金屬 或堿性稀土金屬鹽，例如鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽及鎂鹽）。
[0024]穩(wěn)定劑包括人類(lèi)血清蛋白、L-氨基酸、糖及纖維素衍生物。L-氨基酸還可以包括甘 氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一個(gè)。糖類(lèi)包括單糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖 等;糖醇，例如甘露醇、纖維醇、木糖醇等;二糖，例如蔗糖、麥芽糖、乳糖等;多聚糖，例如葡 聚糖、羥丙基淀粉、硫化軟骨素、透明質(zhì)酸等及它們的衍生物。纖維素衍生物包括甲基纖維 素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙甲基纖維素及羥甲基纖維素鈉。
[0025] 抑菌劑包括但不限于有效濃度(例如〈1 % w/v)的芐醇、苯酚、間甲酚、氯丁醇、對(duì)羥 基苯甲酸甲酯和/或?qū)αu基苯甲酸丙酯。
[0026]表面活性劑包括離子或非離子表面活性劑，例如聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖單 ?；ァ⒅舅岣视王?。
[0027]等滲劑包括氯化鉀、氯化鈉、糖及甘油。螯合劑包括乙二胺四乙酸鈉及檸檬酸。
[0028] 本發(fā)明的藥物還可包括藥學(xué)上可接受的涂層材料包括(但不限于），快速分解涂層 材料、染色劑、腸溶性聚合物、增塑劑、水溶性聚合物、水不溶性聚合物、染料、色素、其他崩 散劑。常見(jiàn)快速分解涂層材料包括0PADRY;腸溶性聚合物包括甲基內(nèi)烯酸聚合物、磷羥丙甲 基纖維素苯二甲酸酯、羥丙甲基纖維素乙酸酯、羥丙甲基纖維素琥珀酸酯、羥甲乙基纖維 素、乙酰磷苯二甲酸纖維素;增塑劑包括聚乙二醇(PEG)、丙二醇等。
[0029] 本發(fā)明的藥物可以用于補(bǔ)充內(nèi)源性的MY0C蛋白缺失或不足，通過(guò)提高M(jìn)Y0C蛋白的 表達(dá)或增強(qiáng)MY0C蛋白的功能，從而治療因 MY0C蛋白減少導(dǎo)致的食管鱗癌。
[0030] 本發(fā)明所述攜帶基因的載體是本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體、包括質(zhì)粒、 粘粒、噬菌體、病毒等。
[0031] 本發(fā)明藥物的單位劑型可以是多種形式，代表性的劑型包括固體劑型如片劑、丸 劑、粉劑、干粉劑、顆粒、膠囊等;液態(tài)劑型如溶液、懸浮液、乳狀液、糖漿、酏劑等。
[0032] 本發(fā)明所述藥物可以通過(guò)任何途徑給予受體，只要能達(dá)到目標(biāo)組織，其可通過(guò)口 服或非口服的多種途徑，如口服給藥、鼻內(nèi)給藥、腹腔內(nèi)給藥、肌內(nèi)給藥、皮下給藥、皮內(nèi)給 藥、肺內(nèi)給藥、直腸內(nèi)給藥、靜脈內(nèi)給藥。
[0033]本發(fā)明中MY0C蛋白或編碼MY0C蛋白的核酸可以通過(guò)脂質(zhì)體給予，所述脂質(zhì)體的作 用是將藥物靶向于特定的組織，以及增加藥物的半衰期。脂質(zhì)體包括乳化劑、起泡劑、液態(tài) 脂質(zhì)、固態(tài)脂質(zhì)、不溶性單層、磷脂分散劑、表面活性劑等。所述的脂質(zhì)體中還可以包括能與 靶向的細(xì)胞中的受體分子結(jié)合或其他治療性或免疫原性組合物。
[0034] 本發(fā)明的藥物導(dǎo)入組織或者細(xì)胞的方式可以分為體外或者體內(nèi)的方式。體外方式 包括將含有MY0C基因的藥物或者含有MY0C蛋白質(zhì)的藥物導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植或回輸 到體內(nèi)。體內(nèi)方式包括直接將含有MY0C基因的藥物或者含有MY0C蛋白質(zhì)的藥物注入體內(nèi)組 織中。
[0035] 本發(fā)明的藥物還可與其他治療食管鱗癌的藥物聯(lián)用，其他治療性化合物可以與主 要的活性成分(例如，MY0C蛋白或編碼所述蛋白的核酸）同時(shí)給藥，甚至在同一組合物中同 時(shí)給藥。還可以以單獨(dú)的組合物或與主要的活性成分不同的劑量形式單獨(dú)給予其它治療性 化合物。主要成分(如MY0C蛋白或編碼所述蛋白的核酸)的部分劑量可以與其它治療性化合 物同時(shí)給藥，而其它劑量可以單獨(dú)給藥。
[0036] 在疾病治療過(guò)程中，可以根據(jù)癥狀的嚴(yán)重程度、復(fù)發(fā)的頻率和治療方案的生理應(yīng) 答，調(diào)整本發(fā)明藥物組合物的劑量。
[0037]在本發(fā)明的上下文中，"MY0C基因"包括人MY0C基因以及人MY0C基因的任何功能等 同物的多核苷酸。MY0C基因包括與目前國(guó)際公共核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)GeneBank中MY0C基因（NC_ 000001.11 )DNA序列具有70%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；
[0038] 優(yōu)選地，MY0C基因的編碼序列包括以下任一種DNA分子：
[0039] (1)序列表中SEQ ID N0.1所示的DNA序列；
[0040] (2)在嚴(yán)格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列； [0041] (3)與（1)或(2)限定的DNA序列具有70%、優(yōu)選地，90%以上同源性，且編碼相同功 能蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0042]在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述MY0C基因的編碼序列是SEQ ID N0.1所示的DNA 序列。
[0043] 在本發(fā)明的上下文中，MY0C基因表達(dá)產(chǎn)物包括人MY0C蛋白以及人MY0C蛋白的部分 肽。所述MY0C蛋白的部分肽含有與食管鱗癌相關(guān)的功能域。
[0044] "MY0C蛋白"包括MY0C蛋白以及MY0C蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括 MY0C蛋白保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段，或其活性衍生物，等位變異體、天然突變體、誘 導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與人MY0C的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白質(zhì)。
[0045] 優(yōu)選地，MY0C蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白質(zhì)：
[0046] (1)由序列表中SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0047] (2)將SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且與SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID N0.2所示的氨 基酸序列衍生的蛋白質(zhì)。取代、缺失或者添加的氨基酸的個(gè)數(shù)通常為1-50個(gè)，較佳地1-30 個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)。
[0048] (3)與SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性(又稱(chēng)為序列同一性）， 優(yōu)選地，與SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列至少約90%至95%的同源性，常為96%、97%、 98 %、99 %同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
[0049]在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述MY0C蛋白是具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序 列的蛋白質(zhì)。
[0050]通常，一個(gè)蛋白質(zhì)中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的修飾不會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能。本領(lǐng)域技 術(shù)人員會(huì)認(rèn)可改變單個(gè)氨基酸或小百分比的氨基酸或?qū)Π被嵝蛄械膫€(gè)別添加、缺失、插 入、替換是保守修飾，其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能相似的氨基 酸的保守替換表是本領(lǐng)域公知的。
[0051 ]通過(guò)添加一個(gè)氨基酸或多個(gè)氨基酸殘基修飾的蛋白質(zhì)的例子是MY0C蛋白的融合 蛋白。對(duì)于與MY0C蛋白融合的肽或者蛋白質(zhì)沒(méi)有限制，只要所得的融合蛋白保留MY0C蛋白 的生物學(xué)活性即可。
[0052]本發(fā)明的MY0C蛋白也包括對(duì)SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列的非保守修飾，只要 經(jīng)過(guò)修飾的蛋白質(zhì)仍然能夠保留MY0C蛋白的生物學(xué)活性即可。在此類(lèi)修飾蛋白質(zhì)中突變的 氨基酸數(shù)目通常是10個(gè)或者更少，例如6個(gè)或者更少，例如3個(gè)或者更少。
[0053]在本發(fā)明的上下文中，"治療食管鱗癌"包括能消除、減輕、緩解、逆轉(zhuǎn)或預(yù)防或延 遲病癥的任何癥狀的發(fā)生和復(fù)發(fā)，即包括對(duì)疾病的治療性干預(yù)和預(yù)防性干預(yù)，也可以包括 抑制食管鱗癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的凋亡。
[0054]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的 例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物 細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CH0細(xì)胞、C0S細(xì)胞等。
[0055]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
[0056]本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了MY0C基因在食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，通過(guò)檢測(cè) 受試者食管組織中MY0C的表達(dá)水平，可以判斷受試者是否患有食管鱗癌，從而指導(dǎo)臨床醫(yī) 師給受試者提供個(gè)性化預(yù)防方案或者治療方案，同時(shí)本發(fā)明的研究為揭示食管鱗癌的發(fā)病 機(jī)理提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【附圖說(shuō)明】
[0057]圖1顯示利用QPCR檢測(cè)MY0C基因在食管鱗癌組織中的表達(dá)情況；
[0058]圖2顯示利用QPCR檢測(cè)MY0C基因在食管鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)情況；
[0059] 圖3顯示利用MTT檢測(cè)MY0C基因表達(dá)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖能力的影響；
[0060] 圖4顯示利用軟克隆瓊脂形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MY0C基因表達(dá)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖能力的 影響。
[0061] 具體的實(shí)施方式
[0062]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件，例如Sambrook等人，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0063]實(shí)施例1篩選與食管鱗癌相關(guān)的基因標(biāo)志物
[0064] 1、樣品收集
[0065] 各收集6例食管鱗癌癌旁組織和食管鱗癌組織樣本。上述所有標(biāo)本的取得均通過(guò) 組織倫理委員會(huì)的同意。
[0066] 2、RNA樣品的制備(利用E.Z.N.A.^miRNA kit進(jìn)行操作）
[0067] 上述獲得的組織剪碎后投入液氮中并研磨至粉末狀，按照試劑盒中的說(shuō)明書(shū)提取 分離RNA。具體如下：
[0068] 1)RNA 的分離：
[0069] A.組織勻漿或細(xì)胞中加入RNA-Sok_:Reagent II 1ml;
[0070] Β·室溫放置3min，加入0.2ml氯仿后劇烈搖動(dòng)15s;
[0071] C.置于冰上防止lOmin;
[0072] D. 1200(^，4。〇離心 15min;
[0073] E.轉(zhuǎn)移80%的水相進(jìn)入新的2ml EP管中，加入1/2量的無(wú)水乙醇，振搖；
[0074] F.將小于700μ1的上述液體轉(zhuǎn)移至HiBind3iRNA Mini column，振搖后lOOOOg室溫 離心60s 〇
[0075] 2)RNA 純化：
[0076] Α·向 HiBindji.RNA Mini column加入500μ1 RWC Wash Buffer，10000g離心30s;
[0077] B.加入500μ1 RWB Wash Buffer，10000g離心30s，重復(fù)兩次后米取最大離心完全 干燥HiBincUi.RNA Mini column;
[0078] C.向柱子加入15μ1預(yù)熱至70°C的DEPC水，室溫放置2min后全速離心。
[0079] 3、高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
[0080] l)RNA_seq 讀段定位
[0081 ]首先將低質(zhì)量的讀段去除得到清潔讀段，然后利用TopHat vl. 3.1將清潔片段與 UCSC H. sapiens參考基因組(hgl9)進(jìn)行匹配，H. sapiens UCSC hgl9版的預(yù)先構(gòu)建的索引 從TopHat主頁(yè)下載，并作為參考基因組，利用TopHat與基因組匹配時(shí)，允許每個(gè)讀段(默認(rèn) 到20)有多個(gè)匹配位點(diǎn)，最多2次錯(cuò)配。TopHat根據(jù)外顯子區(qū)域和GT-AG剪切信號(hào)建立可能的 剪切位點(diǎn)庫(kù)，根據(jù)這些剪切位點(diǎn)庫(kù)將沒(méi)有定位到基因組的讀段定位到基因組上。我們使用 TopHat方法的系統(tǒng)默認(rèn)參數(shù)。
[0082] 2)轉(zhuǎn)錄豐度評(píng)估
[0083] 匹配上的讀段文件通過(guò)Cufflinks vl.0.3處理，Cufflinks vl.0.3將RNA-seq片 段數(shù)目進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)豐度。FPKM值指的是每一百萬(wàn)測(cè)序片段中匹配到特定 基因 lkb長(zhǎng)的外顯子區(qū)域的片段數(shù)目。通過(guò)貝葉斯推理方法計(jì)算FPKM估計(jì)值的置信區(qū)間。 Cufflinks使用的參考的GTF注釋文件從Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)下載（Homo_ sapiens.GRCh37·63·gtf)〇
[0084] 3)差異表達(dá)基因的檢測(cè)
[0085] 將下載的Ensembl GTF文件和通過(guò)TopHat匹配的原始文件傳輸?shù)紺uffdiff， Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)豐度，檢測(cè)差異表 達(dá)。在Cuff idff輸出中只有q值<0.01，測(cè)試顯示成功的比較才被認(rèn)為是差異表達(dá)。
[0086] 4、結(jié)果
[0087] RNA-seq結(jié)果顯示，MY0C基因在食管鱗癌組織中的表達(dá)量顯著低于正常垂體組織 中的表達(dá)量。
[0088] 實(shí)施例2QPCR測(cè)序驗(yàn)證MY0C基因的差異表達(dá)
[0089] 1、對(duì)MY0C基因差異表達(dá)進(jìn)行大樣本QPCR驗(yàn)證。按照實(shí)施例1中的樣本收集方式選 擇食管鱗癌癌旁組織和食管鱗癌組織各50例。
[0090] 2、RNA提取步驟同實(shí)施例1。
[0091] 3、逆轉(zhuǎn)錄:使用TAKARA公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行操作。具體步驟如下：
[0092] (1)取總RNA lyg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，加入01igo(dT)2yl，充分混勻。70°C水浴5min后立即 冰浴2min。
[0093] (2)構(gòu)建25μ1反應(yīng)體系，其中包括5X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液5yl，dNTP(2.5mM)5yl，RNasin 4〇υ/μ1，M-MLV 20〇υ/μ1，補(bǔ)無(wú)核酸酶水至預(yù)期體積。
[0094] (3)42°C水浴 60min 后，95°C水浴 5min 以滅活 M-MLV。
[0095] (4)-2(TC 儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br>[0096] 4、QPCR 擴(kuò)增 [0097] (1)引物設(shè)計(jì)
[0098] 根據(jù)Genebank中MY0C基因和β-actin基因的編碼序列設(shè)計(jì)QPCR擴(kuò)增引物，由上海 生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。具體引物序列如下：
[0099] β-actin的引物序列：
[0100] 正向引物：5'-CCTGGGCATGGAGTCCTGTG-3'（SEQ ID N0.3)
[0101] 反向引物：5'-TCCTTCTGCATCCTGTCG-3'（SEQ ID N0.4)
[0102] MY0C的引物序列：
[0103] 正向引物：5'-ATTGTCCTCTCCAAACTGA-3'（SEQ ID N0.5)，
[0104] 反向引物：5'-TGACTGCTTACGGATGTT-3'（SEQ ID N0.6)
[0105] 以SYBR Green作為熒光標(biāo)記物，在Light Cycler熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行PCR反 應(yīng)，通過(guò)融解曲線分析和電泳確定目的條帶，A ACT法進(jìn)行相對(duì)定量。
[0106] (2)按照表1配制PCR反應(yīng)體系：
[0107] 其中，SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系購(gòu)自Invitrogen公司。
[0108] 表1PCR反應(yīng)體系
[0110] (3)PCR反應(yīng)條件：95°C lOmin，（95°C30s，60°C60s) X 40個(gè)循環(huán)。以SYBR Green作為 熒光標(biāo)記物，在Light Cycler熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過(guò)融解曲線分析和電泳確 定目的條帶，△△ CT法進(jìn)行相對(duì)定量。
[0111] 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0112] 實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來(lái)完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示， 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P〈0.05時(shí)具 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0113] 6、結(jié)果
[0114] 結(jié)果如圖1所示，與食管鱗癌癌旁組織相比，MYOC基因在食管鱗癌組織中下調(diào)，差 異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Ρ〈〇·〇5)，同RNA-sep結(jié)果一致。
[0115] 實(shí)施例3MYOC基因的過(guò)表達(dá)
[0116] 1、細(xì)胞培養(yǎng)
[0117] 人食管鱗癌細(xì)胞株KYSE 150,以含10%胎牛血清和1%P/S的培養(yǎng)基DMEM在37°C、 5 % C02、相對(duì)濕度為90 %的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0 · 25 %含EDTA的胰蛋白酶常 規(guī)消化傳代。
[0118] 2、MY0C基因的過(guò)表達(dá)
[0119] 2.1MY0C基因表達(dá)載體的構(gòu)建
[0120] 根據(jù)MYOC基因的編碼序列（如SEQ ID NO. 1所示)設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，引物序列如下：
[0121] 正向引物：5'-CCGAAGCTTGCCACCATGAGGTTCTTCTGTGCACGT-3'（SEQ ID N0.7)
[0122] 反向引物：5'-CGGGCGGCCGCCATCTTGGAGAGCTTGATGTCATA-3'（SEQ ID N0.8)
[0123] 從成人胎腦的cDNA文庫(kù)（clontech公司，貨號(hào)：638831)中擴(kuò)增全長(zhǎng)的MYOC基因的 編碼序列，上述cDNA序列經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶Hindlll和Notl雙酶切后插入到經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶 Hindlll和Notl雙酶切的真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1中，連接獲得的重組載體pcDNA3.1-MY0C用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0124] 2.2 轉(zhuǎn)染
[0125] 將食管鱗癌細(xì)胞分為三組，分別為KYSE 150組、空載組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體）、和 MY0C過(guò)表達(dá)組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MY0C)。使用脂質(zhì)體2000進(jìn)行載體的轉(zhuǎn)染，具體轉(zhuǎn)染方法按照 說(shuō)明書(shū)的指示進(jìn)行。pcDNA3.1空載體和pcDNA3.1-MY0C的工作濃度均為0.5μg/ml。
[0126] 2.3RT-PCR 檢測(cè)
[0127] 具體步驟同實(shí)施例2。
[0128] 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0129] 實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來(lái)完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示， 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P〈0.05時(shí)具 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0130] 4、結(jié)果
[0131] 如圖2所示，與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MY0C的細(xì)胞中 MY0C的含量顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)。
[0132] 實(shí)施例4MY0C基因?qū)κ彻荀[癌細(xì)胞增殖的影響
[0133] 采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MY0C基因?qū)κ彻荀[癌細(xì)胞增殖能力影響。
[0134] 1、細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染步驟同實(shí)施例3。
[0135] 2、步驟：
[0136] (1)將對(duì)數(shù)增殖期的KYSE 150細(xì)胞接種于96孔板中，每孔約4X103個(gè)。
[0137] (2)設(shè)三個(gè) pcDNA3.1-MY0C 組，分別是 pcDNA3.1-MY0C 組、空載和 KYSE 150 對(duì)照組， 每組細(xì)胞設(shè)三個(gè)復(fù)孔，其中pcDNA3.1-MY0C組、pcDNA3.1組進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。
[0138] (3)分別在轉(zhuǎn)染后24h，48h，72h，在各組細(xì)胞中加入20μ1 MTT溶液(5mg/L)，室溫下 靜置4h后，停止培養(yǎng)，吸棄培養(yǎng)基。
[0139] (4)往各孔中加入150μ1 DMS0,輕輕晃動(dòng)96孔板，充分溶解殘留的甲瓚結(jié)晶。
[0140] (5)在570nm處記錄吸光值，注意設(shè)置含培養(yǎng)基和ΜΤΤ但不含細(xì)胞的調(diào)零孔。
[0141] 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0142] 實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來(lái)完成的，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩者之 間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P〈0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0143] 4、結(jié)果
[0144] 圖3所示的結(jié)果顯示:KYSE 150組同空載組無(wú)明顯差異，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MY0C組 的細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯低于轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體組的細(xì)胞生長(zhǎng)速度，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 〈0.05)，上述結(jié)果表明MY0C的表達(dá)能夠抑制食管鱗癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。
[0145] 實(shí)施例5MY0C基因?qū)κ彻荀[癌細(xì)胞凋亡的影響
[0146] 使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MY0C基因?qū)?xì)胞凋亡的影響。
[0147] 1、細(xì)胞培養(yǎng)步驟同實(shí)施例3。
[0148] 2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟同實(shí)施例3。
[0149] 3、步驟
[0150] 細(xì)胞轉(zhuǎn)染72h后，使用預(yù)冷roS洗滌細(xì)胞，然后用0.25%胰酶消化細(xì)胞，中止消化， 將離心收集的細(xì)胞使用PBS重懸，將細(xì)胞定量為IX 106個(gè)/ml，取200μ1上述細(xì)胞懸液放置到 Eppendorf管中，加入10μ1 Annexin-V-FITC混勾，室溫暗處孵育染色15min，上機(jī)前5min加 入10mg/L碘化丙錠(PI)染色5μ1。未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞分別用Annexin-V-FITC和PI染色用于 標(biāo)準(zhǔn)定量。用FACS流式細(xì)胞儀進(jìn)行雙色熒光細(xì)胞流式計(jì)數(shù)，觀察凋亡細(xì)胞百分比。
[0151] 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0152]實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來(lái)完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示， 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用的t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P〈0.05時(shí) 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0153] 4、結(jié)果：
[0154] 轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-MY0C組的細(xì)胞凋亡率為（27.19±0.007)%，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體 組的細(xì)胞凋亡率為(6.78 ±0.004) %，上述差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)，上述結(jié)果表明， MY0C基因的過(guò)表達(dá)促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的凋亡。
[0155] 實(shí)施例6軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)
[0156] 1、用0.25 %胰蛋白酶消化經(jīng)轉(zhuǎn)染的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，輕輕吹打使之成為單 細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞沉淀。
[0157] 2、用含20 %胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基重懸，適當(dāng)稀釋后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5 Xl〇MVml〇
[0158] 3、制備兩個(gè)濃度分別為1.2%和0.7 %的低溶點(diǎn)瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40 °(：水浴中。
[0159] 4、1.2%的瓊脂糖和2 X DMEM培養(yǎng)基1:1混合，加入2 X抗生素和20%的小牛血清， 取3ml混合液注入直徑6cm平皿中放置5min冷卻凝固，作為底層瓊脂置于C02溫箱中備用。
[0160] 5、在無(wú)菌試管中1:1混合0.7 %的瓊脂糖和2 X DMEM培養(yǎng)基，再向管中加入0.2ml濃 度為5X 103個(gè)/ml的穩(wěn)定感染細(xì)胞懸液，充分混勻，注入上述平皿中，逐漸形成雙瓊脂層，每 個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)4個(gè)樣本。
[0161 ] 6、待上層瓊脂凝固后，置入37 °C 5 % C02溫箱中培養(yǎng)，每3天加培養(yǎng)基1.5ml。
[0162] 7、培養(yǎng)14天后取出培養(yǎng)皿，用lml濃度為0.005%的龍膽紫染色90min。把平皿放置 在倒置顯微鏡下觀察，每組細(xì)胞隨機(jī)選取10個(gè)低倍視野，鏡下技術(shù)形成的細(xì)胞克隆數(shù)。
[0163] 8、結(jié)果
[0164] 結(jié)果如圖4所示，與其他組相比，pcDNA3.1-MY0C組單細(xì)胞克隆集落形成數(shù)顯著降 低，說(shuō)明MYOC的過(guò)表達(dá)抑制了食管鱗癌細(xì)胞的增殖。
[0165] 上述實(shí)施例的說(shuō)明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn) 和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 檢測(cè)MYOC基因表達(dá)的產(chǎn)品在制備診斷食管鱗癌的工具中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述產(chǎn)品包括:通過(guò)RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、 dPCR、免疫檢測(cè)、原位雜交或芯片檢測(cè)MYOC基因的表達(dá)水平以診斷食管鱗癌的產(chǎn)品。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用RT-PCR診斷食管鱗癌的產(chǎn)品至少包 括一對(duì)特異擴(kuò)增MYOC基因的引物;所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷食管鱗癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì) 特異擴(kuò)增MYOC基因的引物;所述用dPCR診斷食管鱗癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增MYOC基 因的引物;所述用免疫檢測(cè)診斷食管鱗癌的產(chǎn)品包括:與MYOC蛋白特異性結(jié)合的抗體;所述 用原位雜交診斷食管鱗癌的產(chǎn)品包括:與MYOC基因的核酸序列雜交的探針;所述用芯片診 斷食管鱗癌的產(chǎn)品包括:蛋白芯片和基因芯片;其中，蛋白芯片包括與MYOC蛋白特異性結(jié)合 的抗體，基因芯片包括與MYOC基因的核酸序列雜交的探針。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷食管鱗癌的產(chǎn)品 至少包括的一對(duì)特異擴(kuò)增MYOC基因的引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。5. -種診斷食管鱗癌的工具，其特征在于，所述工具能夠通過(guò)檢測(cè)食管組織中MYOC基 因的表達(dá)水平來(lái)診斷食管鱗癌。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的工具，其特征在于，所述工具包括芯片、試劑盒和/或試紙。 7. MYOC基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物在制備治療食管鱗癌的藥物組合物中的應(yīng)用。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物組合物包括增加 MYOC基因表達(dá)、 增強(qiáng)MYOC表達(dá)功能、和/或增強(qiáng)MYOC表達(dá)產(chǎn)物活性的試劑。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述試劑包括:含有能編碼功能性MYOC蛋 白的核酸的試劑、MYOC蛋白的激活劑、含有MYOC蛋白質(zhì)的試劑。10. -種治療食管鱗癌的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包括8或9所述的試 劑。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK105886629SQ201610282187
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年4月29日
【發(fā)明人】常鵬, 劉中勝, 楊承剛
【申請(qǐng)人】北京泱深生物信息技術(shù)有限公司