一株攜帶tp53突變的hpv陰性陰莖鱗癌細(xì)胞系及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物動(dòng)物細(xì)胞系領(lǐng)域，特別涉及一株攜帶TP53突變的HPV陰性陰莖 鱗癌細(xì)胞系及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 陰莖癌是一種少見(jiàn)的男性惡性腫瘤，晚期預(yù)后極差。陰莖癌在非洲、亞洲和南美部 分國(guó)家，發(fā)病率高達(dá)4/10萬(wàn)，可達(dá)男性惡性腫瘤的10%，而在西歐和美國(guó)，僅占惡性腫瘤的 0.4%-0.6%。我國(guó)陰莖癌占男性惡性腫瘤的0.07%，與西歐和美國(guó)相近。陰莖癌的危險(xiǎn) 因素包括低衛(wèi)生水平、包皮包莖、未行包皮環(huán)切術(shù)、吸煙和高危人乳頭狀瘤病毒（hrHPV)感 染。2014年版歐洲泌尿協(xié)會(huì)（EAU)最新指南中首次明確HPV是發(fā)病的危險(xiǎn)因素，與其他未 知因素共同作用導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。
[0003] 陰莖癌的轉(zhuǎn)移規(guī)律為由腹股溝區(qū)域淋巴結(jié)的逐步轉(zhuǎn)移至盆腔淋巴結(jié)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移少 見(jiàn)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是決定陰莖癌預(yù)后和治療的關(guān)鍵因素，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，特別是盆腔 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，目前手術(shù)結(jié)合化療綜合治療的5年生存率低于10%?；煹姆磻?yīng)率有 限，但仍是晚期病人的主要治療方式，國(guó)內(nèi)外抗表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR)靶向治療的報(bào)道 尚少，多為化療失敗后的病例，其療效有待多中心大量病例的研究。因陰莖癌的發(fā)病率低且 病例分散，聯(lián)合多中心臨床研究難以開(kāi)展，且缺乏其發(fā)病和轉(zhuǎn)移的機(jī)制及治療的體外研究， 臨床治療沒(méi)有明顯進(jìn)展。
[0004] 永久細(xì)胞系作為腫瘤研究必不可少的研究工具，在肺癌、乳腺癌、前列腺癌和宮頸 癌等常見(jiàn)腫瘤研究中被廣泛使用，在腫瘤的發(fā)生機(jī)制、腫瘤生長(zhǎng)凋亡等生物學(xué)行為和開(kāi)發(fā) 抗腫瘤藥物中發(fā)揮重要的作用。目前全世界報(bào)道的陰莖癌細(xì)胞系少，尚無(wú)中國(guó)人群來(lái)源陰 莖癌細(xì)胞系，且因細(xì)胞系在體外反復(fù)傳代后丟失原始腫瘤細(xì)胞特性和陰莖癌的地區(qū)差異， 在細(xì)胞水平深入的基礎(chǔ)研究少。因此，針對(duì)我國(guó)陰莖癌特別是預(yù)后差的晚期轉(zhuǎn)移病例，建立 我國(guó)人群的陰莖癌細(xì)胞模型對(duì)于陰莖癌的深入研究和開(kāi)發(fā)新的抗腫瘤治療方式具有重要 的科學(xué)意義和社會(huì)意義。
[0005] 腫瘤細(xì)胞系模型的建立主要通過(guò)臨床新鮮腫瘤組織直接培養(yǎng)或經(jīng)動(dòng)物皮下接種 新鮮腫瘤組織或細(xì)胞后富集純化腫瘤細(xì)胞后體外培養(yǎng)。前者建立過(guò)程中?；祀s非腫瘤細(xì) 胞，如間質(zhì)細(xì)胞，成功率較低，而后者需要依賴(lài)動(dòng)物成瘤，過(guò)程復(fù)雜難以推廣使用，既往國(guó)外 報(bào)道的兩種方法聯(lián)合建立細(xì)胞系的成功率約為10%。本發(fā)明陰莖癌細(xì)胞系建立通過(guò)直接體 外培養(yǎng)獲得，并通過(guò)體外成瘤建立動(dòng)物模型驗(yàn)證腫瘤接近于臨床的生物學(xué)特性，細(xì)胞腫瘤 特異性的TP53突變以及細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞外膜蛋白EGFR和腎足突細(xì)胞膜蛋白（PDPN)可作 為腫瘤監(jiān)測(cè)、診斷和靶向治療的靶點(diǎn)，是研究陰莖癌發(fā)生分子機(jī)制、生物學(xué)行為和抗腫瘤藥 物篩選的理想實(shí)驗(yàn)材料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對(duì)目前報(bào)道的人陰莖癌少長(zhǎng)期傳代后細(xì)胞特性改變且無(wú)法反 映我國(guó)人群特點(diǎn)，提供一種新的中國(guó)人群的、長(zhǎng)期體外培養(yǎng)傳代和性質(zhì)穩(wěn)定的人陰莖癌細(xì) 胞系。該細(xì)胞系經(jīng)全面的細(xì)胞系身份鑒定并確定HPV陰性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)TP53突變。
[0007] 本發(fā)明的人陰莖癌細(xì)胞系，其于2015年6月17日保藏細(xì)胞及備份其STR信息在 中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，地址：湖北省武漢市武漢大學(xué)校內(nèi)，郵編：430072,培養(yǎng)物 名稱(chēng)為人陰莖鱗癌細(xì)胞系Penll，保藏編號(hào)為CCTCCN0:C201585。細(xì)胞系檢測(cè)已存活。
[0008] 本發(fā)明的細(xì)胞系來(lái)源的臨床標(biāo)本為一位41歲中國(guó)男性陰莖癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)標(biāo)本， 經(jīng)體外直接培養(yǎng)和篩選后成功獲得穩(wěn)定傳代的一株新的人陰莖癌細(xì)胞系，命名為Penll。
[0009] 本發(fā)明人陰莖癌細(xì)胞系Penll具有以下生物學(xué)特性：
[0010] 1.細(xì)胞系在高糖DMEM含10%胚牛血清培養(yǎng)基中呈貼壁生長(zhǎng)，無(wú)接觸抑制，生長(zhǎng)方 式為鱗癌常見(jiàn)的成團(tuán)生長(zhǎng)；
[0011] 2.細(xì)胞形態(tài)為典型上皮樣形態(tài)，透射電子顯微鏡下可見(jiàn)到細(xì)胞間上皮間連接的超 微結(jié)構(gòu)，細(xì)胞中間絲結(jié)構(gòu)蛋白為上皮角蛋白；
[0012] 3.細(xì)胞系經(jīng)PCR檢測(cè)無(wú)支原體和HPV感染，測(cè)序TP53基因的全外顯子發(fā)現(xiàn)兩個(gè)突 變，P72R和R283P，細(xì)胞系指紋不與國(guó)際細(xì)胞數(shù)據(jù)庫(kù)重合；
[0013] 4?細(xì)胞表達(dá)pan_CK、CK5和desmoplakin等上皮表面標(biāo)志，不表達(dá)vimentin間質(zhì) 標(biāo)記，無(wú)HPV16/18E6和pl6核特異性陽(yáng)性染色，但有p53核陽(yáng)性染色，同時(shí)表達(dá)膜蛋白即 表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR)和腎足突細(xì)胞膜蛋白（PDPN)，流式細(xì)胞術(shù)顯示高達(dá)98. 5%的細(xì) 胞EGFR陽(yáng)性但僅有93 %的細(xì)胞CK5陽(yáng)性；
[0014] 5.細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示倍增時(shí)間約27小時(shí)，體外培養(yǎng)第5天可在培養(yǎng)基中檢測(cè)到鱗 癌相關(guān)抗原且其水平隨培養(yǎng)時(shí)間而升高，貼壁接種效率僅27. 12%，與喉癌細(xì)胞系Hep-2相 比稀釋克隆形成能力弱且克隆集落小；
[0015] 6?與宮頸腺癌細(xì)胞系HeLa相比，細(xì)胞的橫向迀移能力較強(qiáng)但侵襲力弱，體外細(xì)胞 系2.5106接種重度聯(lián)合免疫小鼠（SCID)可成瘤，成瘤能力弱于H印-2細(xì)胞系，組織切片提 示移植瘤與原發(fā)腫瘤同為中分化鱗癌病理形態(tài)，免疫組化檢測(cè)兩者的蛋白表達(dá)譜相同；
[0016] 7.細(xì)胞系進(jìn)行藥物敏感性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與Hep-2 -樣對(duì)順鉑敏感，同時(shí)發(fā)現(xiàn)一種臨 床少用的化療藥表柔比星也能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯毒性作用。
[0017] 本發(fā)明進(jìn)一步的目的是人陰莖癌細(xì)胞系Penll可提供體外研究陰莖癌發(fā)生、發(fā)展 轉(zhuǎn)移分子機(jī)制、開(kāi)發(fā)新的臨床診斷手段、建立體外動(dòng)物模型和尋找新的抗腫瘤治療方式的 用途。
[0018] 本發(fā)明的人陰莖癌細(xì)胞系Penll可長(zhǎng)期體外培養(yǎng)傳代，性質(zhì)穩(wěn)定，細(xì)胞呈現(xiàn)鱗狀 上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系生長(zhǎng)的成團(tuán)生長(zhǎng)特點(diǎn)，經(jīng)電鏡、細(xì)胞化學(xué)染色、PCR及基因測(cè)序、細(xì)胞指紋 和蛋白表達(dá)、體外成瘤實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞生物學(xué)特性驗(yàn)證腫瘤細(xì)胞的身份并與原腫瘤特征比較，確 定細(xì)胞系可反映人體來(lái)源陰莖鱗癌的特性，并初步探討了細(xì)胞系對(duì)化療藥物順鉑和表柔比 星的敏感性。本發(fā)明的人陰莖癌細(xì)胞系Penll為陰莖鱗癌提供了代表臨床上HPV陰性的陰 莖鱗癌的細(xì)胞研究工具。該細(xì)胞系及基于細(xì)胞系建立的動(dòng)物模型可用于研究陰莖癌發(fā)生、 發(fā)展、轉(zhuǎn)移機(jī)制的基礎(chǔ)研究，診斷陰莖癌和淋巴轉(zhuǎn)移的輔助檢查手段的臨床前研究，探索發(fā) 現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)抗腫瘤藥物等用途。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1.本發(fā)明人陰莖鱗癌細(xì)胞Penll的光鏡下（200X)形態(tài)學(xué)；
[0020] 圖2.本發(fā)明人陰莖鱗癌細(xì)胞Penll的免疫細(xì)胞化學(xué)染色形態(tài)學(xué)；
[0021] 圖3.本發(fā)明人陰莖鱗癌細(xì)胞Penll的超微結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)；
[0022] 圖4.本發(fā)明人陰莖鱗癌細(xì)胞Penll的移植瘤標(biāo)本形態(tài)學(xué)；
[0023] 圖5.本發(fā)明人陰莖鱗癌細(xì)胞Penll的DNA含量；
[0024] 圖6.本發(fā)明人陰莖鱗癌細(xì)胞Penll的支原體和HPV的PCR檢測(cè)；
[0025] 圖7.本發(fā)明人陰莖鱗癌細(xì)胞Penll的TP53基因全外顯子測(cè)序突變結(jié)果；
[0026] 圖8?本發(fā)明人陰莖鱗癌細(xì)胞Penll的蛋白表達(dá)westernblot結(jié)果；
[0027] 圖9.本發(fā)明人陰莖鱗癌細(xì)胞Penll的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果；
[0028] 圖10.本發(fā)明人陰莖鱗癌細(xì)胞Penll的免疫組化形態(tài)學(xué)；
[0029] 圖11.本發(fā)明人陰莖鱗癌細(xì)胞Penll的生長(zhǎng)曲線及SCC-RA水平；
[0030] 圖12.本發(fā)明人陰莖鱗癌細(xì)胞Penll的種板效率和稀釋克隆效率；
[0031] 圖13.本發(fā)明人陰莖鱗癌細(xì)胞Penll的迀移及侵襲實(shí)驗(yàn)；
[0032] 圖14.本發(fā)明人陰莖鱗癌細(xì)胞Penll的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述和分析（以下實(shí)施例中實(shí) 驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法）。
[0034] 本發(fā)明的人陰莖鱗癌細(xì)胞，于2015年6月17日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC)(地址：湖北省武漢市武漢大學(xué)校內(nèi)，郵編：430072)，培養(yǎng)物名稱(chēng)為人陰莖鱗癌細(xì) 胞系Penll，保藏編號(hào)為CCTCCN0:C201585。
[0035] 實(shí)施例1.細(xì)胞系的建立
[0036] 1. 1原代培養(yǎng)
[0037] 標(biāo)本來(lái)自中山大學(xué)腫瘤防治中心，獲取自41歲男性陰莖鱗癌患者的腹股溝轉(zhuǎn)移 淋巴結(jié)，術(shù)中淋巴結(jié)標(biāo)本離體后，分離成5mm左右組織小塊，立即浸入裝有無(wú)血清高糖DMEM 培養(yǎng)基（添加200U/ml青霉素、200yg/ml鏈霉素）的EP管。在實(shí)驗(yàn)室的細(xì)胞專(zhuān)用生物安 全柜中，腫瘤標(biāo)本用磷酸鹽緩沖液（PBS)漂洗3次，無(wú)菌眼科剪將腫瘤標(biāo)本剪成1-3_直徑 的小塊，均勻分布地置于25cm2的組織培養(yǎng)瓶中，加入約l-3ml高糖DMEM培養(yǎng)基（添加10% 進(jìn)口胎牛血清（FBS)、200U/ml青霉素、200yg/ml鏈霉素，作為生長(zhǎng)培養(yǎng)基使用），保證小 塊濕潤(rùn)同時(shí)不飄起于培養(yǎng)基上方，小心翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，放入37度水浴和5%C02的培養(yǎng)箱