一種蘭州百合pr5基因定量檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】一種蘭州百合病程相關(guān)蛋白PR5基因定量檢測的試劑盒及其檢測方法，該試劑盒主要包括特異性引物、第一鏈cDNAs合成試劑、熒光定量PCR反應試劑以及陽性對照品和陰性對照品；特異性引物由蘭州百合PR5基因和內(nèi)參18S rRNA基因的特異性引物組成；陽性對照品為蘭州百合PR5基因標準品以及內(nèi)參18S rRNA基因標準品；陰性對照品為DEPC水；本發(fā)明針對蘭州百合PR5基因提供了一種快速、敏感、特異的定量檢測試劑盒和檢測方法，為蘭州百合PR5基因的表達及檢測診斷提供了技術(shù)支持。
【專利說明】
-種蘭州百合PR5基因定量檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設及一種蘭州百合病程相關(guān)蛋白PR5基因定量檢測的試劑盒及檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 百合是一種集觀賞、食用和藥用于一體的重要經(jīng)濟作物，長期無性繁殖使病毒不 斷積累，嚴重影響了產(chǎn)量和品質(zhì)；其中百合斑駁病毒(LMoV)、黃瓜花葉病毒(CMV)和百合隱 癥病毒化SV)是最常見的S種病毒，感染率高達70%。病毒病造成百合種源嚴重退化，已是制 約百合產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素，如何對病毒實現(xiàn)有效防治是百合產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展急需解決的關(guān) 鍵問題；目前，百合病毒防治技術(shù)非常落后，病毒防治主要采用殺滅傳播介體曬蟲的方法， 盡管能一定程度阻止病毒傳播，然而已侵染的病毒仍會在百合上復制增殖;百合作為世界 著名的球根花弁，至今還未開發(fā)出有效的百合病毒抑制劑，關(guān)于病毒抑制劑抗百合病毒作 用機制的研究鮮有報道，使得現(xiàn)階段對百合病毒病的防治非常盲目。
[0003] 通常病毒抑制劑抗植物病毒的作用方式有:抑制病毒侵染、抑制病毒增殖或誘導 寄主產(chǎn)生抗性;誘導抗性作為一種有效的抗病手段，已在許多病害體系中得到應用，已有研 究發(fā)現(xiàn)，某些病毒抑制劑可W誘導寄主產(chǎn)生抗病毒物質(zhì)，提高寄主對病毒的抵抗力;江山等 ( 1996)發(fā)現(xiàn)病毒抑制劑可W誘導寄主產(chǎn)生病程相關(guān)蛋白（pathogenesis-related proteins，PRs);PRs是植物體內(nèi)的一類蛋白質(zhì)，受病原體或其他外界因子的脅迫而誘導表 達，在植物抵御疾病、響應外界壓力W及適應不良環(huán)境方面發(fā)揮著重要作用;根據(jù)病程相關(guān) 蛋白家族成員的氨基酸組成、結(jié)構(gòu)及生物學功能等特點，將其分為17類，即PR1~PR17,其中 PR5蛋白，也被稱為類甜蛋白（thaumatin like proteins),是病程相關(guān)蛋白中非常重要的 蛋白之一;PR5蛋白絕大多數(shù)成簇存在，結(jié)構(gòu)相似，分子量為25~28 kD，大多呈堿性，能誘 導植物的細胞程序性死亡，增加植物抗逆境能力，是SAR常用的分子標記基因；目前已經(jīng)從 很多植物中發(fā)現(xiàn)了 PR5蛋白，例如憲菁，玉米，楊樹等;通常，PRs蛋白在健康植株中表現(xiàn)微 弱，當被不同的誘導因子誘導時迅速產(chǎn)生并積累，其與植物誘導抗性之間有密切的關(guān)聯(lián);因 而研究病毒抑制劑對PR蛋白的誘導能力，是了解抗病毒制劑對植物是否具有誘導抗性作用 的一個重要內(nèi)容。
[0004] 在我們對百合抗病毒技術(shù)的開發(fā)研究中，初步篩選了2種適用于大田的百合病毒 抑制劑，其對蘭州百合主要病毒CMV的復制均有較好的抑制作用；同時，從病毒感染的蘭州 百合植株中也檢測到了PR5基因的表;為了進一步明確病毒抑制劑對PR5基因表達的影響， 本研究建立了 一種蘭州百合病程相關(guān)蛋白PR5基因定量檢測的試劑盒及檢測方法。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明提供一種蘭州百合PR5基因定量檢測的試劑盒及檢測方法。
[0006] 技術(shù)方案如下： 一種蘭州百合PR5基因定量檢測的試劑盒，主要包括特異性引物、第一鏈cDNAs合成試 劑W及巧光定量PCR反應試劑，特異性引物由蘭州百合PR5基因和內(nèi)參18S rRNA基因的特異 性引物組成，特異性引物的序列如下： 蘭州百合PR5基因上游引物Pl:5'- CGGCTGAACTGAAGGTAG -3' 蘭州百合PR5基因下游引物P2:5' -TAGAGGTGGCATCATCGTA -3' 內(nèi)參 18S rRNA基因上游引物P3:5'- GGGGAAACTTACCAGGTCCA -3' 內(nèi)參 18S rRNA基因下游引物P4:5' -CAGACAAATCGCTCCACCAA -3' 其中，擴增蘭州百合PR5基因的片段長度為19化P，擴增內(nèi)參18S rRNA基因片段長度為 mbp。
[0007] 本發(fā)明的關(guān)鍵在于擴增引物的設計。
[0008] 為達到定量檢測的要求，所述試劑盒還包括陽性對照品和陰性對照品，陽性對照 品為蘭州百合PR5基因標準品W及內(nèi)參18S rRNA基因標準品，陰性對照品為DEPC水；陽性對 照品序列如下： 蘭州百合PR5基因標準品： cggctgaactgaaggtagtaatgtcaagtgagagcgttgcttgcaagagcgcttgtgatgcgtttggatcgcc tg過gt過ttgctgt過過過gg過g過tt過tggc過過ttct過過C過tttgc過ggccg過ccgtgt過etc過g過gttcttt過過過過過tg cttgcccgagggcgtacagttatgcttacgatgatgccacctcta; 內(nèi)參18S rRNA基因標準品： gggg過過過ett過CC過ggtcc過g過C過t過gt過過gg過ttg過C過g過ctg過g過gctctttcttg過ttct過tgggtggtg gtgcatggccgttcttagttggtggagcgatttgtctg。
[0009] 可將上述陽性對照品序列構(gòu)建到質(zhì)粒載體中，測定質(zhì)粒濃度后換算為拷貝數(shù)，然 后用雙蒸水將該陽性質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋，W10倍系列稀釋的質(zhì)粒溶液作為模板進行巧 光定量PCR擴增，根據(jù)拷貝數(shù)的對數(shù)值與標準品Ct值的關(guān)系可繪制得到標準曲線，測得待測 樣品cDNAs的Ct值后，對照標準曲線即可獲得待測樣品起始cDNAs的精確拷貝數(shù)，再經(jīng)過內(nèi) 參校正后最終獲得待測樣品PR5基因的標準拷貝數(shù)。
[0010] 本發(fā)明還設及W上所述的檢測蘭州百合PR5基因表達的試劑盒的檢測方法，其包 括的步驟如下： 步驟① W蘭州百合葉片、莖桿或種球為待測樣品，提取總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄RT反應合成 cDNAs; 步驟②巧光定量PCR: W待測樣品cDNAs作為模板，用檢巧UPR5基因表達的上下游引物、 檢測內(nèi)參基因18S rRNA表達的上下游引物分別進行巧光定量PCR擴增；WDEPC水為陰性對 照于相同條件下進行PCR擴增； 步驟③數(shù)據(jù)采集與分析:上述步驟②反應結(jié)束后，利用計算機分析軟件自動獲得擴增 曲線和溶解曲線，W闊值線剛好超過正常陰性對照的最高點設定闊值線，若待測樣品巧光 增長曲線超過闊值線，并呈良好的對數(shù)增長，且溶解曲線形成單一的溶解峰，則判斷為陽 性。
[0011] 定量檢測時，所述檢測方法同時W10倍系列稀釋的蘭州百合PR5基因和18S rRNA 基因標準品的質(zhì)粒溶液進行巧光定量PCR檢測，分別根據(jù)拷貝數(shù)的對數(shù)值與各標準品Ct值 的關(guān)系繪制得到標準曲線，測得待測樣品cDNAs的Ct值后，對照相應標準曲線獲得待測樣品 起始cDNAs中PR5基因和18S rRNA基因的精確拷貝數(shù)，按照W下公式得到經(jīng)過內(nèi)參歸一化校 正后的待測樣品PR5基因的標準拷貝數(shù)： 其中，所述標準品序列如下：
蘭州百合PR5基因標準品： C邑邑ct邑曰曰ct邑曰曰邑邑t曰邑t曰曰t邑tc曰曰邑t邑曰邑曰邑C邑tt邑Ctt邑C曰曰邑曰邑C邑ctt邑t邑曰t邑C邑ttt邑邑曰tc邑CC tg曰gt曰ttgctgt曰曰曰gg曰g曰tt曰tggc曰曰ttct曰曰C曰tttgc曰ggccg曰ccgtgt曰etc曰g曰gttcttt曰曰曰曰曰tg cttgcccgagggcgtacagttatgcttacgatgatgccacctcta; 內(nèi)參18S rRNA基因標準品： gggg曰曰曰ctt曰CC曰ggtcc曰g曰C曰t曰gt曰曰gg曰ttg曰C曰g曰ctg曰g曰gctctttcttg曰ttct曰tgggtggtg 邑t邑C曰t邑邑CC邑ttett曰邑tt邑邑t邑邑曰邑C邑曰ttt邑tet邑。
[0012]優(yōu)選的，所述①中反轉(zhuǎn)錄RT程序為：待測樣品總RNA與PR5基因下游引物P2和18S rRNA基因下游引物P4混合后，70°C變性lOmin，迅速置冰上急冷2min;再加入反轉(zhuǎn)錄RT緩沖 液、dNTP混合物和反轉(zhuǎn)錄酶等，于42°C水浴化，70°C保溫15min，制成待測樣品cDNAs，置冰 上待用。
[OOU] 優(yōu)選的，所述②中巧光定量PCR反應程序為：95°C 30sec，95°C 5sec，55°C 30sec，72°C 15sec，35個循環(huán);95°C Imin，55°C 30sec，95°C 30sec;上述反應結(jié)束后，利 用計算機分析軟件自動獲得標準曲線、擴增曲線和溶解曲線。
[0014]本發(fā)明針對蘭州百合PR5基因提供了一種快速、敏感、特異的定量檢測試劑盒和檢 測方法，為蘭州百合PR5基因的表達及檢測診斷提供了重要的技術(shù)支持。
【附圖說明】
[001引圖1:蘭州百合PR5基因標準品巧光定量PCR擴增曲線圖；1-5分別對應:8.81Xl0s copies/]iL、8.81Xl〇7 copies/]iL、8.81Xl〇6 copies/]iL、8.81Xl〇5 copies/]iL、8.81Xl〇4 copies/yL 標準品。
[0016] 圖2: 18S rRNA基因標準品巧光定量PCR擴增曲線圖；1-5分別對應：7.36 Xl〇8 copies/]iL、7.36Xl〇7 copies/]iL、7.36Xl〇6 copies/]iL、7.36Xl〇5 copies/]iL、7.36Xl〇4 copies/yL 標準品。
[0017]圖3:蘭州百合PR5基因標準品巧光定量PCR標準曲線圖。
[001引圖4:蘭州百合18S rRNA基因標準品巧光定量PCR標準曲線圖。
[0019]圖5:蘭州百合PR5基因標準品巧光定量PCR溶解曲線圖。
[0020] 圖6:蘭州百合18S rRNA基因標準品巧光定量PCR溶解曲線圖。
【具體實施方式】
[0021] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，W使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可W更好的 理解本發(fā)明并能予W實施，但所舉實施例不作為對本發(fā)明的限定。
[0022] 標準品的獲得 1、總RNA的提取 將50mg感染CMV和LSV的蘭州百合葉片在液氮中研磨，用植物總RNA提取試劑盒(天根生 化科技(北京)有限公司)進行感病組織總RNA的提取。
[0023] 2、引物設計與合成 根據(jù)中國科學院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所皋蘭生態(tài)與農(nóng)業(yè)綜合試驗站微生物實驗 室首次從蘭州百合上克隆的PR5基因序列，W及GenBank上登錄的百合18S rRNA基因序列 (GenBank登錄號：D29775)設計了2對特異性引物P1、P2及P3、P4,由生工生物工程(上海） 股份有限公司合成。
[0024] 3、陽性標準品的制備 1)RT反應 利用蘭州百合PR5下游引物P2、內(nèi)參18S rRNA下游引物P4 W及M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進行RT反 應，合成cDNAs第一鏈。
[0025] 10化RT反應體系如下：2化總RNA，PR5下游引物P2、18S rRNA下游引物P4(各lOy mol/L)各化L，化L DEPC-出0，70°C變性10 min,迅速置冰上急冷2 min;再加入化L M-MLV buffer 巧 X)，化 L dNTP混合物（各 lOmmol/L ),0.34 化 RNase 抑制劑（3011/化），0.3 扣L M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（200U /化）和0.31化DEPC-出0;混合后42°C水浴化，70°C保溫15 min,置冰 上待用。
[0026] 2)PCR 反應 利用上述cDNAs為模板，在TagDNA聚合酶作用下分別進行PR5和18S rRNA基因的PCR 擴增。
[0027] PCR反應體系為25化，包括：1化cDNAs(約50ng)，0.化L r a g DNA聚合酶巧U/ 化），2.5化10XPCRbuffer，化LdNTP混合物（各2.5mmol/L)，0.5化上游引物Pl或P3(10 皿ol/L)，0. 下游引物P2或P4( 10皿ol/L)，18.3化 dd出0。
[002引 PCR擴增條件為：94°C預變性4min; 94 °C變性30s，55 °C退火45s，72 °C延伸Imin，循 環(huán)擴增30次，最后72°C延伸7min。
[0029] PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收目的片段，按照克隆載體試劑盒(大 連寶生物(TaKaRa)工程有限公司）的說明將目的片段連接在PMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化D冊a感受 態(tài)細胞，進行藍白斑平板篩選;隨機挑取3個白斑菌落分別接種在氨節(jié)LB培養(yǎng)基上，37 °C搖 菌12~16h;使用（大連寶生物(TaKaRa)工程有限公司）的質(zhì)粒微量抽提試劑盒提取質(zhì)粒； 分別取化L質(zhì)粒，在與上述PCR反應體系相同的條件下進行PCR擴增;將PCR檢測得到的陽性 重組質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序；測序證實序列完全正確的陽性質(zhì) 粒，即為標準品，蘭州百合PR5和18S rRNA基因?qū)钠伍L度分別為19加 P和111 bp;用 NanoDrop ND-1000核酸/蛋白分析儀測定標準品的0〇26日nm和0〇28日加1值，根據(jù)0〇26日加1和 OD28〇nm值計算質(zhì)粒濃度，換算為拷貝數(shù)/體積，然后用雙蒸水將標準品進行10倍梯度稀釋。
[0030] 4、結(jié)果： 經(jīng)測序，上述設計的標準品與預期完全相符，10倍系列稀釋的PR5基因標準品的濃度范 圍為:8.81X104~8.81Xl〇s copies/化；18S rRNA基因標準品的濃度范圍為:7.36X 104~ 7.36X 108 copies/化;回收的標準品片段序列如下： 蘭州百合PR5基因標準品序列： C邑邑ct邑曰曰ct邑曰曰邑邑t曰邑t曰曰t邑tc曰曰邑t邑曰邑曰邑C邑tt邑Ctt邑C曰曰邑曰邑C邑ctt邑t邑曰t邑C邑ttt邑邑曰tc邑CC tg過gt過ttgctgt過過過gg過g過tt過tggc過過ttct過過C過tttgc過ggccg過ccgtgt過etc過g過gttcttt過過過過過tg cttgcccgagggcgtacagttatgcttacgatgatgccacctcta; 蘭州百合18S rRNA基因標準品序列： gggg曰曰曰ctt曰CC曰ggtcc曰g曰C曰t曰gt曰曰gg曰ttg曰C曰g曰ctg曰g曰gctctttcttg曰ttct曰tgggtggtg 邑t邑cat邑邑CC邑ttctta邑tt邑邑t邑邑a邑C邑attt邑tct邑。
[0031 ]巧光定量PCR檢測蘭州百合PR5基因表達方法的建立 1、待測樣品總RNA提取及cDNAs合成 采用天根生化科技(北京)有限公司的植物總RNA提取試劑盒，按照說明書提取待測蘭 州百合葉片的總RNA，根據(jù)標準品的獲得中RT第一鏈cDNAs合成體系，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNAs。
[0032] 2、巧光定量PCR反應 W上述cDNAs為模板，用蘭州百合PR5上下游引物P1、P2及內(nèi)參18S rRNA上下游引物P3、 P4分別在Stra化gene公司的Mx3000p巧光定量PCR儀上進行PCR擴增。
[0033] PCR反應液組成如下： 上述cDNAs模板 化1 SYBR P remix Ex Taq^^2X) lOyL 上游引物(PI或P3) 0.化L 下游引物（P2或P4) 0.化L Rox Reference Dye II (50X ) 0.化1 PCR-grade water 6.8yL PCR反應條件為:95°C 30sec，95°C 5sec，55°C 30sec，72°C 15sec，35個循環(huán);95°C lmin，55°C 30sec，90°C 30sec。上述反應結(jié)束后，利用計算機分析軟件自動獲得待測樣品 PR5基因和18S rRNA基因的擴增曲線和溶解曲線。
[0034] WDEPC水為陰性對照于相同條件下進行PCR擴增，若待測樣品cDNAs模板巧光增長 曲線超過闊值線，并呈良好的對數(shù)增長，且溶解曲線形成單一的溶解峰，則判斷為陽性。
[0035] 同時在相同條件下W10倍系列稀釋的PR5標準品和18S rRNA標準品進行擴增，并 分別繪制標準曲線。
[0036] 測得待測樣品cDNAs的Ct值后，分別對照相應的標準曲線獲得待測樣品起始cDNAs 中PR5基因 W及18S rRNA基因的精確拷貝數(shù)，按照W下公式得到經(jīng)過內(nèi)參歸一化校正后的 待測樣品PR5基因的標準拷貝數(shù)：
[0037] 檢測結(jié)果 蘭州百合PR5基因和18S rRNA基因標準品的巧光定量PCR擴增曲線結(jié)果參見圖1和圖2， PR5基因標準品濃度分別為l:8.81X108copiesA^L、2:8.81X107copiesA^L、3:8.81X106 copies/]iL、4:8.81Xl〇5 copies/]iL、5:8.81Xl〇4 copies/uLlSS rRNA基因標準品濃度分 別為1:7.36 X 1〇8 copies/]iL、2:7.36 X 1〇7 copies/]iL、3:7.36 X l〇6copies/]iL、4:7.36 X 1〇5 copies/]iL、5:7.36X 1〇4 copies/uL。
[003引圖3和圖4分別為PR5基因和18S rRNA基因?qū)幕貧w方程，其中PR5基因回歸方 程:￥=-3.237禮06(乂)+37.00，1?59:1.000，口0?的擴增效率為103.7%;188誠魁基因回歸 方程:Y =-3.281*L0G(X)+ 43.88，RSq: 0.996，PCR 的擴增效率為 101.7%dY:對應的 Ct 值;X: 基因的精確拷貝數(shù)。
[0039] 圖5和圖6分別為PR5基因和18S rRNA基因的溶解曲線，其中PR5基因和18S rRNA基 因的目的產(chǎn)物溶解溫度分別在85°C和82°C左右，擴增產(chǎn)物單一，形成特異的溶解峰，沒有雜 峰出現(xiàn)，且峰值較為一致，說明本發(fā)明定量結(jié)果準確、可靠。
[0040] 根據(jù)巧光檢測的Ct值W及擴增曲線和溶解曲線，判斷待測樣品PR5基因是否有表 達;若巧光檢測結(jié)果呈典型的擴增曲線和溶解曲線，如圖1和圖5所示，判斷為陽性，所測樣 品中PR5基因有表達;若沒有典型的擴增曲線和溶解曲線，判斷為陰性，所測樣品中PR5基因 無表達;若判斷陽性待測樣品之間PR5基因表達量的差異，可根據(jù)PR5基因的標準拷貝數(shù)公 式得到相應結(jié)果。
【主權(quán)項】
1. 一種蘭州百合PR5基因定量檢測試劑盒，包括特異性引物、第一鏈cDNAs合成試劑以 及熒光定量PCR反應試劑，所述特異性引物由蘭州百合PR5基因和內(nèi)參18S rRNA基因的特異 性引物組成，所述特異性引物的序列如下： 蘭州百合PR5基因上游引物Pl:5'_ CGGCTGAACTGAAGGTAG -3' 蘭州百合PR5基因下游引物P2:5' -TAGAGGTGGCATCATCGTA -3' 內(nèi)參 18S rRNA基因上游引物P3:5'_ GGGGAAACTTACCAGGTCCA -3' 內(nèi)參 18S rRNA基因下游引物P4:5' -CAGACAAATCGCTCCACCAA -3' 其特征在于所述試劑盒還包括陽性對照品和陰性對照品，所述陽性對照品為蘭州百合 PR5基因標準品以及內(nèi)參18S rRNA基因標準品，所述陰性對照品為DEPC水;所述陽性對照品 序列如下： 蘭州百合PR5基因標準品：內(nèi)參18S rRNA基因標準品：其特征在于將上述陽性對照品序列構(gòu)建到質(zhì)粒載體中，測定陽性質(zhì)粒濃度后換算為拷 貝數(shù)，然后用雙蒸水將上述陽性質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋，以10倍系列稀釋的陽性質(zhì)粒溶液 作為模板，應用上述特異性引物P1、P2及P3、P4分別進行熒光定量PCR擴增，根據(jù)拷貝數(shù)的對 數(shù)值與標準品Ct值的關(guān)系可繪制得到PR5基因和18S rRNA基因的標準曲線；同時將待測樣 品提取總RNA后進行反轉(zhuǎn)錄RT反應，以合成的cDNAs為模板，應用上述特異性引物P1、P2及 P3、P4在相同條件下進行熒光定量PCR擴增，測得待測樣品cDNAs的Ct值后，對照標準曲線即 可獲得待測樣品起始cDNAs中PR5基因和18S rRNA基因的精確拷貝數(shù)，再經(jīng)過內(nèi)參校正后最 終獲得待測樣品PR5基因的標準拷貝數(shù)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘭州百合PR5基因定量檢測試劑盒，其中蘭州百合PR5基因標 準品質(zhì)粒濃度為8.81X108 copies/yL;內(nèi)參18S rRNA基因標準品質(zhì)粒濃度為7.36X108 copies/yLo3. -種如權(quán)利要求1所述的蘭州百合PR5基因定量檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于 包括如下步驟： 步驟①以蘭州百合葉片、莖桿或種球為待測樣品，提取總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄RT反應合成 cDNAs; 步驟②熒光定量PCR:以待測樣品cDNAs作為模板，用蘭州百合PR5基因和內(nèi)參18S rRNA基因的特異性引物P1、P2以及P3、P4分別進行熒光定量PCR擴增；以DEPC水為陰性對照 于相同條件下進行熒光定量PCR擴增;所述檢測方法同時以10倍系列稀釋的PR5基因和18S rRNA基因的標準品進行熒光定量PCR擴增； 步驟③數(shù)據(jù)采集與分析:上述步驟②反應結(jié)束后，分別根據(jù)拷貝數(shù)的對數(shù)值與各標 準品Ct值的關(guān)系繪制得到PR5基因和18S rRNA基因的標準曲線;利用計算機分析軟件自動 獲得待測樣品PR5基因和18S rRNA基因的擴增曲線以及溶解曲線，若待測樣品PR5基因熒光 增長曲線超過閾值線，并呈良好的對數(shù)增長，且溶解曲線形成單一的溶解峰，則判斷為陽 性，所測樣品中PR5基因有表達； 若沒有典型的擴增曲線和溶解曲線，則判斷為陰性，所測樣品中PR5基因無表達； 若判斷陽性樣品中PR5基因的表達量，可將測得的陽性樣品cDNAs的Ct值分別對照相應 的標準曲線獲得cDNAs中PR5基因以及18S rRNA基因的精確拷貝數(shù)，按照以下公式得到經(jīng)過 內(nèi)參歸一化校正后的陽性樣品PR5基因的標準拷貝數(shù)：
【文檔編號】C12Q1/68GK106048068SQ201610673546
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月16日 公開號201610673546.2, CN 106048068 A, CN 106048068A, CN 201610673546, CN-A-106048068, CN106048068 A, CN106048068A, CN201610673546, CN201610673546.2
【發(fā)明人】張玉寶, 王亞軍, 謝忠奎, 王樂, 楊果, 王若愚, 郭志鴻
【申請人】中國科學院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所