中低溫油藏采油功能菌快速檢測基因芯片及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種快速檢測中低溫油藏采油功能菌基因芯片及其用途，屬于基因芯 片領(lǐng)域和資源環(huán)境微生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著微生物采油技術(shù)在石油天然氣勘探開發(fā)和環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，相關(guān) 微生物的檢測鑒定及群落分析也成為重要的研究內(nèi)容。目前油田微生物檢測的常用分子生 態(tài)方法有構(gòu)建克隆文庫、變性梯度凝膠電泳（DGGE)、實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)等方法。
[0003] (1)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)
[0004]實(shí)時(shí)焚光定量PCR (real-time fluorescent quantitative polymerasechain reaction)，是在常規(guī)PCR反應(yīng)過程中加入熒光染料或者熒光探針，利用PCR過程中熒光的 變化指示模板中特定DNA序列的數(shù)量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的重復(fù)性好，靈敏度和特異性也 比較高，整個(gè)過程耗時(shí)短，從提取模板到結(jié)果分析，只需要8個(gè)小時(shí)左右，缺點(diǎn)是檢測DNA 種類比較單一。
[0005] (2)克隆文庫分析
[0006] 克隆文庫是通過PCR擴(kuò)增基因序列，通過基因與載體連接和感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，制 作基因單克隆文庫，然后對文庫中基因序列進(jìn)行多樣性分析的方法。該方法成本較低，能夠 在一定程度上反應(yīng)出群落的多態(tài)性，但是檢測耗時(shí)，操作繁瑣。
[0007] 上述分子生態(tài)學(xué)方法應(yīng)用于油藏大量檢測工作時(shí)往往操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不利 于對油藏現(xiàn)場樣品進(jìn)行及時(shí)快速的檢測。相比之下，基因芯片技術(shù)具有高通量、快速檢測、 靈活度高等特點(diǎn)，借助基因芯片技術(shù)，建立油田微生物檢測新方法，有助于研究微生物變化 規(guī)律與油藏微生物激活之間的關(guān)系，揭示采油功能菌定向激活機(jī)理，為內(nèi)源激活技術(shù)的應(yīng) 用提供系統(tǒng)的理論基礎(chǔ)。
[0008]油藏內(nèi)源微生物按功能劃分，主要包括烴氧化菌、好氧腐生菌、厭氧發(fā)酵菌、硝 酸鹽還原菌、硫酸鹽還原菌和產(chǎn)甲烷菌等。其中烴氧化菌是油藏環(huán)境中普遍存在的一類 菌，也是微生物提高石油采油率技術(shù)中非常重要的功能菌，無論在外源微生物采油還是 內(nèi)源微生物采油中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用。相反，硫酸鹽還原菌能夠腐蝕管道，影響生產(chǎn)安 全是微生物采油中需要嚴(yán)格抑制的有害菌。根據(jù)報(bào)道，兩類微生物發(fā)揮作用的關(guān)鍵基因 為經(jīng)氧化菌解經(jīng)關(guān)鍵基因alkB(alkanehydroxylaseB)和硫酸鹽還原菌關(guān)鍵功能基因 dsrB(dissimilatorysulfitereductaseB)。勝利油田目前已針對油藏水體基因組16S rDNA序列開發(fā)出針對中高溫油藏的細(xì)菌種群檢測基因芯片，該芯片包含樣品測序檢測到的 109個(gè)細(xì)菌屬的429條16SrDNA探針，覆蓋范圍廣，但是針對中高溫油藏，且對功能微生物 的針對性不強(qiáng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明目的是提供一種中低溫油藏采油功能菌快速檢測基因芯片及其使用方法， 彌補(bǔ)上述微生物生態(tài)技術(shù)以及現(xiàn)有油藏微生物檢測芯片存在的操作費(fèi)時(shí)，不夠簡便，針對 性不強(qiáng)的缺點(diǎn)，同時(shí)芯片涉及中低溫油藏功能微生物檢測探針，填補(bǔ)此領(lǐng)域的空白，另外芯 片上的功能基因探針使得芯片不僅能夠用于快速檢測采油過程及環(huán)境樣品中烴氧化功能 菌，還能夠反映烴氧化、硫酸鹽還原功能基因的分布及變化規(guī)律。應(yīng)用該芯片能夠指示油藏 中是否存在常見的功能微生物，初步了解目標(biāo)油藏的主要微生物結(jié)構(gòu)，更重要的是能夠進(jìn) 一步對油井使用微生物采油技術(shù)的效果進(jìn)行評價(jià)，為微生物技術(shù)研究水平和現(xiàn)場實(shí)施效果 提尚提供方法基礎(chǔ)。
[0010] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0011] 中低溫油藏采油功能菌快速檢測基因芯片，該基因芯片在固相載體上固定有三類 探針：針對6種中低溫油藏采油功能細(xì)菌屬的16SrDNA探針；針對15種中低溫油藏采油功 能細(xì)菌種的ITS探針；針對2種功能基因的探針；以上探針的序列如下表1_表2 :
[0012] 表I16SrDNA探針和功能基因alkB及dsrB探針
[0013]

[0017] 第1步、設(shè)計(jì)功能菌及功能基因特異性探針
[0018]檢測屬的 16SrDNA序列來源于從RDPRelase11 數(shù)據(jù)庫（http://rdp.cme.msu. edu/hierarchy/hb_intro.jsp);檢測種的ITS序列來源于NCBIGenome數(shù)據(jù)庫（http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/ ?term=)，同時(shí)使用ITS通用引物對檢測種及其近緣 種ITS基因進(jìn)行擴(kuò)增測序，測序結(jié)果作為補(bǔ)充序列；功能基因alkB和dsrB序列來源于 Fungene數(shù)據(jù)庫（http://fungene.cme.msu.edu/)。依據(jù)收集序列，設(shè)計(jì)針對目的基因的屬 特異性探針組，種特異探針和功能基因特異探針，探針序列如SEQIDNO. 1-71所示。針對 16SrDNA的探針以邏輯"與"的方式設(shè)計(jì)成探針組，組內(nèi)探針作為一個(gè)整體提高檢測的特異 性。
[0019] 第2步、合成特異性探針
[0020] 探針的結(jié)構(gòu)通式：NH2-POly(T)-探針條碼序列，見12表示探針5'端經(jīng)過氨基修飾， poly(T)-探針條碼序列長度為40nt;按照探針的結(jié)構(gòu)通式合成探針；
[0021] 第3步、制備基因芯片：
[0022] 使用BioDotAD5000芯片點(diǎn)樣儀將探針以設(shè)定的矩陣固定到醛基化修飾的玻片 上，紫外交聯(lián)12小時(shí)，制備好的芯片避光保存；其中，每張芯片上包含8個(gè)相同的芯片矩陣。 芯片矩陣由針對6個(gè)細(xì)菌屬、15個(gè)細(xì)菌種和2個(gè)功能基因的共71條探針，陰性質(zhì)控探針NC 和陽性質(zhì)控探針PC組成的陣列和熒光定位探針FP組成，每個(gè)探針設(shè)置三個(gè)重復(fù)。
[0023]NC是一段氨基修飾的寡核昔酸探針，與雜交液中的所有待檢測序列不會(huì)雜交，可 以指示芯片質(zhì)量的可靠性，避免假陽性；PC是一段氨基修飾的寡核昔酸探針，可以與熒光 標(biāo)記的目的片段上的保守序列雜交，用于雜交過程的質(zhì)控，避免假陰性；FP為3'端經(jīng)過Cy3 修飾的NC探針，能夠紫外激發(fā)熒光，用來定位探針在矩陣中的位置；
[0024]NC序列為nh2-ttttttttttttttttttttttttttttttttttttttt;
[0025]PC序列為nh2-tttttttttttttttttgtacacaccgcccgtcacaccat。
[0026] 本發(fā)明同時(shí)提供了上述中低溫油藏采油功能菌快速檢測基因芯片的使用方法，包 括以下步驟：
[0027] 第1步、目的片段擴(kuò)增
[0028] 根據(jù)檢測目標(biāo)不同，以樣品基因組DNA為模板，選用不同的通用引物擴(kuò)增不同的 目的片段。
[0029] 第I. 1步、檢測功能菌屬時(shí)，16SrDNA全長基因分成片段1 (約前800bp)和片段 2(約后700bp)兩個(gè)部分?jǐn)U增，分別用通用引物27f/802r和783f/1492r進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0030]引物 27f序列為 5' -AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3' ；
[0031]引物 802r序列為 5' -GACTACCAGGGTATCTAATCC-3' ；
[0032]引物 783f序列為 5' -GGATTAGATACCCTGGTAGTCCA-3' ；
[0033]引物 1492r序列為 5' -TACGGCTACCTTGITACGACTT-3' ；
[0034] PCR程序?yàn)?5 °C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸1分鐘， 變性到延伸循環(huán)35次，72°C后延伸10分鐘；PCR體系如下表3 ;
[0035] 表3 16S rDNA目的基因片段1和片段2擴(kuò)增體系
[0036]
[0037] 第I. 2步、檢測功能菌種時(shí)，ITS片段使用通用引物783f/5794r進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0038]引物783f序列為5' -GGATTAGATACCCTGGTAGTCCA-3'；
[0039]引物5794r序列為5' -GGTACTTAGATGTITCAGITC-3'；
[0040] PCR程序?yàn)?5°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性45秒，50°C退火45秒，72°C延伸90秒， 變性到延伸循環(huán)32次，72°C后延伸10分鐘；PCR體系如下表4 ;
[0041] 表4 ITS目的基因擴(kuò)增體系
[0042]
[0043] 第1. 3步、檢測功能基因時(shí)，功能基因dsrB和alkB分別用引物dsrlf/dsr4r和 alkwf/alkwr進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0044]引物dsrlf序列為5' -ACSCACTGGAAGCACG-3'；
[0045]引物dsr4r序列為5' -GTGTAGCAGTTACCGCA-3'；
[0046]引物alkwf序列為5' -AAYACNGCNCAYGARCTNGGNCAYAA-3,；
[0047]引物alkwr序列為5' -GCRTGRTGRTCNGARTGNCGYTG-3'；
[0048] dsrB擴(kuò)增PCR程序?yàn)?5 °C預(yù)變性5分鐘，94°C變性45秒，55 °C退火60秒，72 °C延 伸2分鐘，變性到延伸循環(huán)30次，72°C后延伸10分鐘；alkB擴(kuò)增PCR程序?yàn)?5°C預(yù)變性5 分鐘，94°C變性30秒，55°C退火50秒，72°C延伸40秒，變性到延伸循環(huán)30次，72°C后延伸 10分鐘；PCR體系如下表5 ;
[0049] 表5功能基因dsrB和alkB擴(kuò)增體系
[0050]
[0051] 第2步、PCR產(chǎn)物標(biāo)記
[0052]PCR擴(kuò)增用柱式純化試劑盒進(jìn)行純化；標(biāo)記過程利用各自的下游引物進(jìn)行單鏈擴(kuò) 增，體系中摻入Cy3_UTP，擴(kuò)增得到的單鏈能夠在紫外下激發(fā)熒光；各目標(biāo)片段的標(biāo)記程序 同目標(biāo)片段的擴(kuò)增程序，標(biāo)記體系如下表6 ;
[0053] 表6目的基因標(biāo)記體系
[0054]
[0055] 第3步、基因芯片雜交
[0056] 標(biāo)記產(chǎn)物60°C烘箱烘干，避光條件下用雜交液回溶，檢測16SrDNA時(shí)將片段1和 片段2的標(biāo)記產(chǎn)物回溶到一起；回溶產(chǎn)物點(diǎn)樣到芯片雜交區(qū)，置于雜交倉中密封42°C反應(yīng) 16小時(shí)；雜交結(jié)束后，在洗脫液中按洗液A1. 5分鐘-洗液B1. 5分鐘-洗液C1分鐘的 順序進(jìn)行洗脫；
[0057] 洗液配方如下：
[0058]洗液A:1XSSC，