一種基于納米金探針結合基因芯片可視化檢測microRNA的生物傳感器的制造方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物傳感器領域，特別涉及一種基于納米金探針結合基因芯片可視化 檢測mi croRNA的生物傳感器。
【背景技術】
[0002]MicroRNAs(miRNAs)是一類長度約21-25個核苷酸的內源性、高保守非編碼小分子RNA，它們主要通過與祀mRNA的3 ' -UTR互補配對來調芐基因的表達。MiRNAs表達水平的改變 與多種疾病密切相關，尤其是腫瘤。MiRNAs的檢測對于疾病的早期診斷以及發(fā)現(xiàn)藥物新靶 標具有重要作用。然而，由于miRNAs分子序列短小，在體液中豐度較低以及miRNA家族成員 之間的同源性高，使得miRNAs的分析具有挑戰(zhàn)性。Northernblotting是用于miRNAs檢測的 經典方法。然而，它具有靈敏度較低、操作繁瑣和耗時的缺點，從而限制了在臨床研究中的 應用。實時定量PCR(Real-timePCR，RT-PCR)具有線性范圍寬和靈敏度高的優(yōu)點，但是它需 要精確的溫控條件，并且miRNAs的序列短小使得引物設計比較復雜。基于電化學的檢測方 法具有很高的靈敏度，但是這種方法很難實現(xiàn)多個miRNAs靶標的同時檢測。因此，發(fā)展一種 具有高靈敏、操作簡單并且成本低的miRNAs檢測方法十分必要。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種基于納米金探針結合基因芯片可視化檢 測microRNA的生物傳感器，該生物傳感器對臨床樣本的檢測具有良好適用性，整個分析時 間不超過lh，并且可以用肉眼觀察反應結果；這種分析方法具有費用低、快速及便捷的優(yōu) 點，有望用于臨床樣本中miRNAs的超靈敏和可視化檢測。
[0004] 本發(fā)明的一種基于納米金探針結合基因芯片可視化檢測microRNA的生物傳感器， 所述生物傳感器包括：固定在基因芯片上的靶標miRNA特異性捕獲探針、miRNA特異性報告 探針和納米金探針以及信號增強液;其中，納米金探針表面的檢測探針序列為：
[0005]SH-TTTTTTTTTTGCACAGGAGCAACAG、SH-TTTTTTTTTTCTGTTGCTCCTGTGC中的一種或兩 種。
[0006] 所述靶標miRNA特異性捕獲探針的序列為：
[0007]miR-125a-5p捕獲探針：NH2-TTTTTTTTTTTTTTTTTCACAGGTTAAA;
[0008]miR-126捕獲探針：NH2-TTTTTTTTTTTTTTTTCGCATTATTAC。
[0009] 所述靶標miRNA特異性報告探針的序列為：
[0010] miR-125a-5p報告探針：GGGTCTCAGGGA(T)i5GTCGTCTGTTGCTCCTGTGC;
[0011]miR-126報告探針：TCACGGTACGA(T)15GTCGTCTGTTGCTCCTGT。
[0012] 采用兩種納米金探針時濃度為0·134nmol/L和6.7nmol/L。
[0013]miRNA特異性報告探針的濃度為lnmol/L。
[0014] 所述信號增強液為25mmol/L的MES緩沖液、30%的H2O2和100mm〇l/L的HA11CI4溶液 按照體積比5:3:2混勻而得。
[0015] 本發(fā)明提供了一種基于納米金探針結合基因芯片用于miRNA檢測的高靈敏度和便 攜式生物傳感器，如圖1所示。氨基修飾的核苷酸(捕獲探針)通過希夫堿反應固定在醛基化 的芯片上，接著，在反應體系中加入靶標miRNAs、報告探針和納米金探針，它們可以通過堿 基互補配對結合在芯片上。最后，加入由四氯金酸&61：抑(3111〇1'03111'；[(3(111)3(^(1，撤11(]14)、 過氧化氫（hydrogenperoxide，H2〇2)和2-嗎啉乙橫酸（2-(N-Morpholino)ethanesuIfonic acid，MES)組成的增強反應液，H2〇2可以在MES緩沖液中還原HAuCl4為AuQ。增強反應的過程 可以視為一個自催化反應:納米金作為成核位置催化金離子還原成為金原子，還原反應的 產物沉積在芯片上，并且反應結果肉眼可見。
[0016] 本發(fā)明利用單個納米金探針結合基因芯片可以檢測到10pmol/L的革E1標miRNAs，測 得miR-126在胎牛血清中的回收率為81.5%-109.1%，并用這種生物傳感器檢測肺癌組織 樣本總RNA中的miR-126,其結果與定量PCR具有一致性。雙納米金探針的使用進一步提高檢 測靈敏度，可以檢測到lfmol/L的miR-125a_5p。
[0017] 有益效果
[0018] 本發(fā)明對臨床樣本的檢測具有良好適用性，整個分析時間不超過lh，并且可以用 肉眼觀察反應結果;這種分析方法具有費用低、快速及便捷的優(yōu)點，有望用于臨床樣本中 miRNAs的超靈敏和可視化檢測。
【附圖說明】
[0019] 圖1為本發(fā)明基于納米金探針結合基因芯片檢測miRNAs示意圖；
[0020] 圖2為本發(fā)明基于單納米金探針結合基因芯片檢測miR-125a-5p結果圖；其中，A為 miR-125a-5p濃度從100nmol/L-10pmol/L的檢測結果圖及空白對照;B為miR-125a-5p濃度 與灰度值之間的關系圖；
[0021] 圖3為本發(fā)明基于單納米金探針結合基因芯片檢測miR-126結果圖；其中，A為miR-126濃度從100nm〇l/L-10pm〇l/L的檢測結果圖及空白對照;B為miR-126濃度與灰度值之間 的關系圖；
[0022]圖4為本發(fā)明基于雙納米金探針結合基因芯片檢測miR-125a-5p結果圖；其中，A為miR-125a-5p濃度從100nmol/L-10pmol/L的檢測結果圖及空白對照;B為miR-125a-5p濃度 與灰度值之間的關系圖；
[0023]圖5為本發(fā)明基于雙納米金探針結合基因芯片檢測miR-125a-5p的探針優(yōu)化測試 結果圖；其中，A為納米金探針2，B為納米金探針1，C為報告探針。
【具體實施方式】
[0024]下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內容之后，本領域技術人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定 的范圍。
[0025] 實施例1 [0026] 1材料與方法
[0027] 1.1試劑和儀器
[0028] 四氯金酸三水合物(HAuCl4· 3H20)購自比利時Acros公司；2-嗎啉乙磺酸(MES)購 自美國Sigma公司；15nm的納米金溶液購自上海水源生物公司；RNA酶抑制劑購自美國ABI公 司.實驗所需核苷酸均在Takara公司合成(表1)。所用試劑均為分析純，實驗用水為去離子 水(電阻率大于18.3ΜΩcnf1)。
[0029] ProSys-5510型芯片點樣儀(美國CartesianTechnology公司）用于將捕獲探針點 到芯片上;JascoV-670型紫外-可見光光譜儀（日本）用于測定紫外-可見吸收光譜;實驗圖 片用連有DP-70數(shù)碼相機和DPcontroller軟件（日本Olympus公司）的BX51型倒置顯微鏡 (日本Olympus公司）拍攝。
[0030]表1實驗中所用序列
[0032] 1.2納米金探針的制備
[0033] 納米金粒子的形態(tài)用透射電子顯微鏡（TransmissionElectronMicroscopy, TEM)進行觀察。用0.2mol/LK2CO3將納米金溶液的pH調至8.2-8.5dOOOr/min，離心50min， 棄上清，加入檢測探針至其終濃度為3ymol/L，體系總體積為100yL。在4°C靜置16h后，分3次 加入磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffer，ΡΒ;0 ·lmol/L，pH7.2)和NaCl(lmol/L)至其終濃度 分別為0.01m〇l/L和0.1m〇l/L，每次間隔lh。將溶液充分混勻后室溫放置48h，用lml 0.01mol/LPB和0.1mol/LNaCl組成的緩沖液(pH7