.2)9000r/min離心50min清洗兩次，棄 上清，用lOOyL上述緩沖液重懸，4°C儲存?zhèn)溆?。制備的納米金探針用紫外-可見光光譜儀和 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證。
[0034] 1.3基因芯片的制備
[0035]將終濃度為50ymol/L的捕獲探針通過ProSys-5510型點(diǎn)樣儀固定在醛基化修飾的 芯片上，點(diǎn)樣量為〇.7nL，點(diǎn)直徑為100μπι，點(diǎn)間距為500μπι。將芯片放在37°C固定48h，未結(jié)合 的探針用去離子水沖洗，然后浸泡于40mmol/L的疏基琥珀酸溶液中30min以鈍化其余結(jié)合 位點(diǎn)。最后，以去離子水沖洗三次，4°C備用。
[0036] 1.4增強(qiáng)液的配制
[0037] 將25mmol/L的MES緩沖液，30%的H2〇2和100mmol/L的HAuCl4溶液按照體積比5:3:2 的比例混勻以配制增強(qiáng)液。增強(qiáng)液應(yīng)避光配制，并且現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0038] 1.5RNA提取
[0039] 使用TRIzol試劑（美國Invitrogen公司），根據(jù)說明書從8例肺癌組織樣本中提取 總RNA。利用超微量分光光度計(jì)(德國Bertho1d公司）測定RNA的濃度。
[0040] 1.6基因芯片檢測miRNA
[0041 ] 取2yL靶標(biāo)miRNA和2yL報(bào)告探針，用雜交緩沖液（10mmol/LTris-HCl，pH7.2， lmol/LNaCl;預(yù)混有RNA酶抑制劑)將體系補(bǔ)足至30yL，混勻，均勻滴入芯片點(diǎn)陣區(qū)，室溫下 雜交30min。以0.2XSSC(含0.1 %SDS)洗液清洗芯片3min，氮?dú)獯蹈纱?。取納米金探針1和 2各2yL，與雜交液混勻后滴入芯片點(diǎn)陣區(qū)，室溫下雜交30min。將芯片用上述洗液清洗后，氮 氣吹干。在每個點(diǎn)陣加30此增強(qiáng)液，避光反應(yīng)5min后置于去離子水中以終止反應(yīng)，顯微鏡下 觀察結(jié)果。
[0042] 2 結(jié)果
[0043] 2.1基于單納米金探針結(jié)合基因芯片檢測miRNAs
[0044] 首先利用一個納米金探針（納米金探針1)來檢測miR-125a-5p和miR-126。根據(jù)朗 伯比爾定律估算得到納米金探針的濃度為13.4nmol/L，將納米金探針1的濃度固定為 13.4nmol/L，報(bào)告探針濃度固定為100nmol/L，對濃度100應(yīng)〇1凡-1(^1]1〇1凡的革[11標(biāo)111丨1?嫩8進(jìn) 行檢測，結(jié)果如圖2和3所示。通過增強(qiáng)反應(yīng)，肉眼可以看到灰色的點(diǎn)陣，并用顯微鏡觀察記 錄結(jié)果。由圖2A和3A可以看出，檢測信號的強(qiáng)度與靶標(biāo)miRNAs的濃度具有一致性。圖2B和3B 表明灰度值與靶標(biāo)miRNAs的濃度之間具有相關(guān)性。從圖中曲線可以看出，miR-125a-5p和 miR-126 的線性范圍為 10pmol/L-100nmol/L(miR-125a-5p和miR-126 的R2 值分別為0.999 和 0.995)0
[0045] 2.2單納米金探針檢測體系的準(zhǔn)確性
[0046]為了考察單納米金探針檢測體系的準(zhǔn)確性，將三個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品miR-126加 入到胎牛血清中（預(yù)混有RNA酶抑制劑)并進(jìn)行分析。如表2所示，測得miR-126的回收率為 81.5%-109.1%，表明這種傳感器具有一定的準(zhǔn)確性。
[0047] 表2基于單納米金探針結(jié)合基因芯片檢測miR-126的準(zhǔn)確性
[0049] 2.3臨床樣本分析
[0050]為了考察這種方法的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，收集肺癌組織樣本，利用這種傳感器分析肺 癌組織總RNA中miR-126的含量，同時(shí)用定量PCR分析同一個樣本。從表3可以看出，用這種傳 感器對樣本分析得到的結(jié)果與定量PCR具有一致性，說明這種傳感器對臨床樣本的檢測具 有良好的適用性。
[0051] 表3基于單納米金探針結(jié)合基因芯片及定量PCR檢測組織樣本中miR-126的結(jié)果
[0053] 2.4基于雙納米金探針結(jié)合基因芯片檢測miR-125a-5p
[0054] 2.4.1探針的優(yōu)化
[0055]為了進(jìn)一步提高檢測靈敏度，使用兩個納米金探針來檢測miR-125a_5p，并將納米 金探針的濃度和報(bào)告探針濃度進(jìn)行優(yōu)化。首先，將靶標(biāo)miR-125a-5p的濃度固定為lnmol/L， 報(bào)告探針濃度固定為l〇〇nmol/L，納米金探針1的濃度固定為13.4nmol/L，將納米金探針2稀 釋成一系列不同的濃度并進(jìn)行雜交。如圖5A所示，納米金探針2的最佳濃度為6.7nmol/L。然 后，將納米金探針2的濃度固定為6.7nmol/L并優(yōu)化納米金探針1的濃度。由圖5B可以看出， 當(dāng)納米金探針1的濃度為〇.134nmol/L時(shí)，雜交信號達(dá)到平臺期。最后，將納米金探針1和2的 濃度分別固定為〇.134nmol/L和6.7nmol/L，并對報(bào)告探針的濃度進(jìn)行優(yōu)化。圖5C表明，報(bào)告 探針的最佳濃度為1nmo1/L〇
[0056] 2.4.2 檢測miR-125a-5p
[0057] 配制從10pmol/L到lfmol/L-系列不同濃度的miR-125a_5p標(biāo)準(zhǔn)品并用于芯片檢 測。由圖4A可以看出。隨著miRNA濃度的降低，檢測信號逐漸減弱，最終可以檢測到lfmol/L的靶標(biāo)miR-125a-5p。圖4B表明miR-125a-5p的濃度與灰度值之間具有相關(guān)性，檢測的線性 范圍是1伽〇1凡-10卩111〇1/1^(1? 2 = 0.996)〇
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于納米金探針結(jié)合基因芯片可視化檢測mi croRNA的生物傳感器，其特征在 于:所述生物傳感器包括:固定在基因芯片上的靶標(biāo)miRNA特異性捕獲探針、miRNA特異性報(bào) 告探針和納米金探針以及信號增強(qiáng)液;其中，納米金探針表面的檢測探針序列為： SH-TTTTTTTTTTGCACAGGAGCAACAG、SH-TTTTTTTTTTCTGTTGCTCCTGTGC中的一種或兩種。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于納米金探針結(jié)合基因芯片可視化檢測microRNA的生 物傳感器，其特征在于:所述靶標(biāo)miRNA特異性捕獲探針的序列為： miR-125a-5p捕獲探針：NH2-TTTTTTTTTTTTTTTTTCACAGGTTAAA; miR-126捕獲探針：NH2-TTTTTTTTTTTTTTTTCGCATTATTAC。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于納米金探針結(jié)合基因芯片可視化檢測microRNA的生 物傳感器，其特征在于:所述靶標(biāo)miRNA特異性報(bào)告探針的序列為： miR-125a-5p報(bào)告探針：GGGTCTCAGGGA(T)i5GTCGTCTGTTGCTCCTGTGC; miR-126 報(bào)告探針：TCACGGTACGA(T)i5GTCGTCTGTTGCTCCTGT。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于納米金探針結(jié)合基因芯片可視化檢測microRNA的生 物傳感器，其特征在于:采用兩種納米金探針時(shí)濃度為〇· 134nmol/L和6.7nmol/L〇5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種基于納米金探針結(jié)合基因芯片可視化檢測microRNA的生 物傳感器，其特征在于:miRNA特異性報(bào)告探針的濃度為lnmol/L。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于納米金探針結(jié)合基因芯片可視化檢測microRNA的生 物傳感器，其特征在于:所述信號增強(qiáng)液為25mmol/L的MES緩沖液、30 %的H2〇2和100mm〇l/L 的HAuC14溶液按照體積比5:3:2混勻而得。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于納米金探針結(jié)合基因芯片可視化檢測microRNA的生物傳感器，所述生物傳感器包括：固定在基因芯片上的靶標(biāo)miRNA特異性捕獲探針、miRNA特異性報(bào)告探針和納米金探針以及信號增強(qiáng)液。本發(fā)明對臨床樣本的檢測具有良好適用性，整個分析時(shí)間不超過1h，并且可以用肉眼觀察反應(yīng)結(jié)果；這種分析方法具有費(fèi)用低、快速及便捷的優(yōu)點(diǎn)，有望用于臨床樣本中miRNAs的超靈敏和可視化檢測。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105463077
【申請?zhí)枴緾N201510894463
【發(fā)明人】毛紅菊, 王萍, 趙建龍, 金慶輝, 胡斌, 李三強(qiáng), 劉慧穎
【申請人】中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2015年12月7日