專利名稱：簡單快速的mRNA層析芯片檢測技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種簡單快速mRNA層析檢測芯片的檢測技術(shù)，具體地說指游離mRNA在層析遷移過程中被固定的cDNA探針俘獲并被原位顯色的檢測方法，包括膜條探針陣列制作、RNA快速提取、層析雜交和信號分析等。該技術(shù)簡單快速、可靠，可用于基因表達(dá)譜的實驗室研究和臨床診斷。
隨著人類基因組計劃的進(jìn)展，全部DNA序列的排序已被基本破譯。結(jié)構(gòu)基因組學(xué)產(chǎn)生的巨量數(shù)據(jù)正在被有效的利用，功能基因組學(xué)面臨一個富有挑戰(zhàn)性的大發(fā)展階段，基因組學(xué)還是蛋白組學(xué)都強(qiáng)調(diào)從器官組織的整體水平上對基因的活動規(guī)律進(jìn)行研究，即對mRNA或蛋白產(chǎn)物進(jìn)行規(guī)?；芯浚ㄟ^基因活動的差別和其產(chǎn)物之間的相互作用了解某范圍內(nèi)的生命活動規(guī)律。從而加速了解碼生命的進(jìn)程。其中常用的方法有2-D電泳結(jié)合質(zhì)譜分析的方法，另一種極有前途的方法就是DNA芯片，DNA芯片是一種集微型化，并行化，比較研究于一體的研究手段。
DNA芯片技術(shù)于1995年正式問世，是一種高度集成的DNA檢測技術(shù)。首先采用專用自動化設(shè)備將幾個、幾十、幾千甚至幾萬個已知DNA寡核苷酸探針或全序列基因探針排列在玻片、硅片或膜質(zhì)材料上，然后將待檢測樣本中的所有DNA成分與芯片探針雜交，有相對應(yīng)的靶DNA就會出現(xiàn)相應(yīng)的雜交信號。理論上可以做到一次實驗檢測細(xì)胞或組織內(nèi)所有基因或可以表達(dá)的基因。因此這種技術(shù)對胚胎發(fā)育控制的研究、疾病發(fā)生發(fā)展的研究、以及生理病理的研究提供了最佳的研究手段。主要用途有1)基因表達(dá)差異的研究用數(shù)千甚至數(shù)萬個cDNA/mRNA片段點樣或固定于玻璃或硅芯片上，通過對特定條件下(發(fā)育，生長，外界因素等)組織中的mRNA進(jìn)行隨機(jī)性雜交，通過分析軟件對結(jié)果進(jìn)行分析，進(jìn)而分析特定組織的基因表達(dá)譜。
2)基因藥物的篩選通過分子設(shè)計或模擬將大量由組合化學(xué)法產(chǎn)生的隨機(jī)藥物分子和組織中的多基因進(jìn)行隨機(jī)作用篩選有特異結(jié)合作用的藥物分子，為藥物基因組學(xué)的一種新型有效方法。
3)臨床診斷及預(yù)后檢測用含多種病原微生物基因或致病基因的芯片可同時進(jìn)行多樣本檢測，大大提高了檢測效果。
4)環(huán)境生物學(xué)檢測自然環(huán)境中的許多化學(xué)物質(zhì)對人類及其它生物的生存造成影響。例如，用DNA芯片方法可同時檢測人類各種復(fù)雜疾病(哮喘，糖尿病，高血壓等)的遺傳易感性因素。
5)蛋白質(zhì)芯片以蛋白為探針固定在固體支撐物表面，形成蛋白質(zhì)芯片，可用于檢測蛋白之間的相互作用，而不會互相影響活性。
用于檢測mRNA表達(dá)狀態(tài)的DNA芯片一般以cDNA全部或部分序列作為探針固定于芯片表面，cDNA探針的數(shù)目依目的而定，一般可選擇幾十至幾千，檢測技術(shù)以核酸雜交為基本原理，檢測時先抽提RNA或mRNA，純化后的RNA再進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄并同時標(biāo)記熒光素，然后把標(biāo)記的靶序列與芯片上的大量cDNA探針進(jìn)行雜交，最終通過掃描獲得最佳的雜交信號，由計算機(jī)收集熒光信號，并對每個點的熒光強(qiáng)度數(shù)字化后進(jìn)行分析。
但是這類高集成度cDNA芯片技術(shù)，還存在以下缺陷和不足1.需要專用的檢測設(shè)備現(xiàn)有芯片技術(shù)都是采用高敏感性的熒光標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記被檢測的靶DNA分子，因此芯片的檢測就需要昂貴的專用芯片激光掃描儀。
2.檢測程序復(fù)雜，檢測耗時太長現(xiàn)有DNA芯片檢測技術(shù)只是將DNA探針集成固定進(jìn)行逆向雜交而已，與傳統(tǒng)的雜交技術(shù)相比，檢測程序仍然復(fù)雜，需要經(jīng)過培訓(xùn)的專業(yè)技術(shù)人員操作，一般至少需要2天的時間才能完成。而臨床診斷項目的要求首先是快速和操作簡便，一般性檢查最好能在1～2小時內(nèi)完成并出具報告。
3.檢測成本高由于芯片的制作程序復(fù)雜，一般需要采用特殊修飾的玻片，需要特殊點樣設(shè)備和檢測設(shè)備，同時由于PCR及標(biāo)記的試劑昂貴，增加的檢測成本致使芯片的成本居高不下。并且同時檢測幾百幾千個功能上并不相關(guān)的基因并不是臨床所需要的，臨床上需要的是具有特殊針對型并能解決實際問題的檢測項目，比如，了解腫瘤基因的表達(dá)情況、了解地中海貧血的珠蛋白基因的所有可能突變位點的狀況等等。
4.需要特定的無核酸酶環(huán)境在進(jìn)行RNA操作時需要特殊的無核酸酶的環(huán)境，對操作人員要求較高，甚至要求專職的檢測人員，因為RNA對環(huán)境中污染的核酸酶非常敏感，操作稍有不慎，便影響檢測的結(jié)果。
本發(fā)明的目的是提供一種檢測程序較簡單，可快速進(jìn)行mRNA檢測的芯片方法。
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足和缺陷，本發(fā)明采取一種新的條形芯片設(shè)計和層析檢測方法以達(dá)到本發(fā)明的目的，通過改進(jìn)RNA抽提的方式、cDNA探針固定的載體以及雜交的方式，來達(dá)到快速、簡便的基因表達(dá)譜的檢測。
本發(fā)明涉及mRNA快速層析診斷的技術(shù)和方法，包括探針陣列制作、RNA提取、層析雜交和信號分析等。該方法簡單快速、可靠，可用于實驗室研究和臨床診斷，該技術(shù)步驟包括a.將cDNA探針或含有互補(bǔ)序列的環(huán)狀質(zhì)?；蚬押塑账崽结橁嚵杏谖⒖桌w維膜上，制成膜條陣列芯片；b.將含有mRNA的細(xì)胞或樣本用強(qiáng)烈變性劑溶解，釋放RNA；c.調(diào)節(jié)變性劑溶液的離子濃度；d.在變性液中加入生物素標(biāo)記的Poly(T)和親和素包被的膠體金顆粒；e.將膜條的一端浸入變性劑溶液，一端與吸水纖維相連，層析雜交樣本，顯示信號；f.銀還原信號加強(qiáng)，信號分析。
其中c、f為可選步驟。以下將詳細(xì)描述RNA層析檢測的實現(xiàn)過程。
1.使用cDNA探針作為探針的cDNA可以由相應(yīng)的cDNA克隆擴(kuò)增而來，也可以使用逆轉(zhuǎn)錄加PCR擴(kuò)增的方法獲取探針，然而要獲取大規(guī)模cDNA探針，使用同一質(zhì)粒載體的cDNA克隆庫和相同的擴(kuò)增引物要來得經(jīng)濟(jì)和方便。CDNA可以是全長的，也可以是部分片斷，其cDNA片斷大于200bp即可能獲得正常固定效果和雜交檢測效果。為了獲得最佳效果的雜交效率，采取下列措施(1)增加雜交溶液的體積，由于DNA的復(fù)性與DNA的復(fù)雜性和DNA濃度與雜交的效率有密切關(guān)系，可以通過增加雜交液的體積來減少溶液中DNA的復(fù)性；(2)層析雜交，因為雜交溶液體積的增加，必需采用層析雜交技術(shù)，來增加目標(biāo)DNA與固定探針的接觸的機(jī)會。
(3)強(qiáng)烈變性劑抽提RNA，避免核酸酶對RNA的降解。
2.探針的網(wǎng)絡(luò)立體固定硝酸纖維膜、尼龍膜、PVDF膜等都是帶有微孔的慮膜，其孔徑一般在0.45μm～10μm左右，一般選擇5μm的膜作為層析支撐膜，在顯微鏡下這種膜就是一個立體的纖維網(wǎng)絡(luò)，液體可以在該纖維網(wǎng)絡(luò)之中進(jìn)行自由擴(kuò)散，當(dāng)在膜的一端給以液體擴(kuò)散壓力時，液體將沿一定方向擴(kuò)散，例如沿條狀膜條的單方向擴(kuò)散。因此硝酸纖維膜及其他層析膜，既是立體的網(wǎng)絡(luò)固定載體，又是層析的良好材料，同時又是cDNA探針固定的最佳支撐載體。
正常cDNA探針在膜上的固定技術(shù)涉及到cDNA探針的點樣以及探針與膜的共價連接?？蛇x用陽離子膜，如氨基修飾的尼龍膜、硝酸纖維膜等，可以雇傭固體芯片表面的立體探針固定技術(shù)固定探針，也可以采用噴線或噴點的方法將探針和對照探針噴在5mm左右寬度的硝酸纖維膜或尼龍膜上，形成線型陣列或點狀陣列。干燥后經(jīng)過紫外線照射，促使探針與膜的共價交聯(lián)。
3.強(qiáng)烈變性劑抽提RNA與傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明具有很多優(yōu)勢。本發(fā)明將細(xì)胞樣本直接采用強(qiáng)力變性劑變性，使之釋放核酸，同時抑制RNA酶對RNA的降解，并使操作更為簡便。不需核酸的分離和純化步驟。變性劑是一種能溶解生物樣本中的RNA或DNA，使蛋白質(zhì)從RNA和DNA分子上釋放出來，從而使RNA和DNA分子充分暴露。這些變性劑通過干預(yù)生物樣本中分子間微弱的van derWaal引力，破壞RNA、DNA和蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。這些變性劑幾乎能溶解所有的生物分子如蛋白質(zhì)和核酸。
變性劑的概念是能溶解所有的生物分子，產(chǎn)生一種清晰的透明溶液，1ml變性劑溶液至少可溶解1mg的細(xì)胞或組織，因此不是所有鹽類均能成為變性劑。特殊的變性劑包括三氟醋酸鹽、三氯醋酸鹽、過氯酸鹽、NaI、硫氰酸胍和硫氰酸鉀等。變性劑的濃度依所溶解的樣本有所不同。典型的濃度是5M。
4.層析雜交技術(shù)本發(fā)明主要根據(jù)游離DNA分子在層析遷移過程中被固定的DNA探針俘獲的原理設(shè)計的。cDNA探針陣列固定于膜載體的中間部位。檢測時，將生物素標(biāo)記的poly(dT)片段和親和素包被的膠體金試劑與RNA強(qiáng)烈變性劑溶劑等體積的6×SSC混合，并加到RNA變性劑溶液中，混合，其目的是調(diào)節(jié)雜交液的離子強(qiáng)度同時對強(qiáng)烈變性劑作稀釋以減少對親和素的損傷。當(dāng)RNA抽提溶液與生物素-poly(dT)以及親和素包被的膠體金等混合后，將膜的一端與該混合溶液接觸，另一端與吸水纖維相連，由于層析效應(yīng)，流動相帶動樣品沿膜載體展開，靶RNA-poly(dT)-生物素-親和素-膠體金復(fù)合物會被相應(yīng)固定探針俘獲，并在相應(yīng)的條帶位置呈現(xiàn)陽性檢測信號(紅色膠體金)，達(dá)到快速分離鑒定的目的。具體方法如下1)采用可以讓液體自由擴(kuò)散的薄膜如硝酸纖維素膜、尼龍膜或PVDF膜作為cDNA探針固定的層析載體膜，固定探針排列在載體膜的中央檢測區(qū)域，形成探針陣列；2)強(qiáng)烈變性劑提取RNA，一倍6×SSC稀釋(總體積～1ml)，75℃加熱5分鐘；3)將生物素標(biāo)記的poly(dT)和親和素包被的膠體金試劑混合，加到變性的RNA溶液中；4)將含有探針陣列的載體膜的一端浸于DNA/膠體金溶液，液體沿載體膜展開，膜的另一端與吸水纖維相連，以保證層析過程連續(xù)性。當(dāng)標(biāo)記有示蹤物的靶物質(zhì)與固定探針配對時，便被俘獲固定，在相應(yīng)的條帶位置呈現(xiàn)陽性檢測信號；5)信號的加強(qiáng)、檢測及分析。本發(fā)明與現(xiàn)有的檢測技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點本發(fā)明提供可用于樣本準(zhǔn)備和雜交的硫氰酸鹽溶液，可使樣本準(zhǔn)備、檢測等程序加快、操作簡單、經(jīng)濟(jì)、多用途和自動化提供更先進(jìn)的實驗操作程序。
1.精確性在強(qiáng)烈變性劑溶液中進(jìn)行雜交，其效率可達(dá)到100％，在探針過量的情況下，靶RNA的量與探針的雜交呈線性關(guān)系。在探針數(shù)量較低時，靶核酸與探針的雜交仍呈線性關(guān)系。
2.敏感性可以測到30fg的互補(bǔ)核酸，這種檢測水平可以滿足眾多檢測要求。
3.速度不管靶RNA數(shù)量多少，均可在15分鐘內(nèi)完成DNA-RNA雜交。更重要的是，在這么快速和敏感性的條件下，仍可獲得這么高的檢測速度。
4.簡單本發(fā)明操作僅需三步1)將強(qiáng)烈變性劑溶液加到樣本或組織，1分鐘；2)將生物素標(biāo)記的poly(dT)探針和親和素包被的膠體金和相應(yīng)的SSC稀釋液加進(jìn)去，并孵育5分鐘；3)層析雜交分析。這一程序簡單得足夠讓未受過任何培訓(xùn)的人員操作。
有核酸酶的環(huán)境對該操作程序也沒有多少影響。
5.經(jīng)濟(jì)強(qiáng)烈變性劑抽提程序的費用比所有已知的程序都低。一個手工應(yīng)用強(qiáng)烈變性劑抽提的方法建立的一個RNA檢測，其消耗約為2元。自動化后更低。
6.多用途臨床樣本與研究室樣本均可用該方法診斷，例如大便、血液、尿液等都是高度混雜的，該技術(shù)對這些樣本都有效。而且不降低它的精確性、敏感性、速度和經(jīng)濟(jì)性等指標(biāo)。
7.自動化優(yōu)于操作的簡單化使自動化比量檢測成為可能本發(fā)明可應(yīng)用于基因表達(dá)模型檢測和分析。
基因表達(dá)模型(基因表達(dá)譜)是指細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因的mRNA表達(dá)瞬間狀況，反映了當(dāng)時細(xì)胞活動的信息。分析細(xì)胞基因表達(dá)模型，即可獲知細(xì)胞處于何種狀態(tài)。本發(fā)明可以同時檢測10～100個基因的基因表達(dá)譜檢測方法，使檢測十分簡單、快速，可以在短于1小時的時間內(nèi)完成全部檢測過程。
基因表達(dá)譜條形芯片檢測原理動物類細(xì)胞mRNA在3’端均帶有Poly(A)序列，此序列可作為通用探針雜交的識別序列，通用探針為Poly(dT)，5’標(biāo)記有膠體金或鐵蛋白等有色物質(zhì)，當(dāng)與mRNA溶液混合時，便與mRNA的Poly(A)端多重結(jié)合。當(dāng)此復(fù)合物在層析時可隨著液體在薄膜上的擴(kuò)散，mRNA向另一端移動。當(dāng)mRNA-Poly(dT)雜交復(fù)合物在遷移過程中與固定在薄膜上的cDNA探針相遇時，便被固定的cDNA探針俘獲，原位形成有色信號。不被俘獲的mRNA分子繼續(xù)前移，直到碰到可以俘獲的分子為止。本發(fā)明主要的技術(shù)制作及操作本發(fā)明涉及mRNA快速層析診斷的技術(shù)和方法。該方法簡單快速、可靠，可用于實驗室研究和臨床診斷。當(dāng)用于mRNA表達(dá)檢測時，該技術(shù)步驟包括1)將cDNA探針或含有互補(bǔ)序列的環(huán)狀質(zhì)?；蚬押塑账崽结橁嚵杏谖⒖桌w維膜上，制成膜條陣列芯片；2)將含有mRNA的細(xì)胞或樣本用強(qiáng)烈變性劑溶解，釋放RNA；3)調(diào)節(jié)變性劑溶液的離子濃度；4)在變性液中加入生物素標(biāo)記的Poly(T)和親和素包被的膠體金顆粒；5)將膜條的一端浸入變性劑溶液，一端與吸水纖維相連，層析雜交樣本，顯示信號；6)銀還原信號加強(qiáng)，信號分析。以下將詳細(xì)分步描述RNA層析檢測的實現(xiàn)過程1. 將cDNA探針或含有互補(bǔ)序列的環(huán)狀質(zhì)?；蚬押塑账崽结橁嚵杏谖⒖桌w維膜上，制成膜條陣列芯片a.cDNA探針設(shè)計cDNA探針的種類和數(shù)量主要根據(jù)要求而定，由于膜的長度限制，選擇的探針數(shù)量不宜超過200個。
作為探針的cDNA可以由相應(yīng)的cDNA克隆擴(kuò)增而來，也可以使用逆轉(zhuǎn)錄加PCR擴(kuò)增的方法獲取探針，然而要獲取大規(guī)模cDNA探針，使用同一質(zhì)粒載體的cDNA克隆庫和相同的擴(kuò)增引物要來得經(jīng)濟(jì)和方便。CDNA可以是全長的，也可以是部分片斷，其cDNA片斷大于200bp即可能獲得正常固定效果和雜交檢測效果。為了獲得最佳效果的雜交效率。
b.探針點樣探針的排列方式有線樣排列或點樣陣列。線樣排列類似于條型碼，將變性的探針按次序排列在膜條表面。制作時采用噴線方法將探針(不多于50個)和對照探針噴在5mm-10mm寬的硝酸纖維膜或尼龍膜上。點樣陣列的制作主要借助于三維機(jī)器人和特殊制作的樣本針，將變性的cDNA探針點到膜的相應(yīng)位置，密度不高于每平方厘米200點，密度主要根據(jù)所采用的膜材料，較致密的材料可以采用較高的密度。
c.探針固定噴線或點樣后的膜條經(jīng)室溫干燥后，用紫外線(254nm)進(jìn)行交聯(lián)。交聯(lián)能量一般為120,000μj/cm2照射20秒，也可以根據(jù)需要調(diào)整照射劑量。另一種方法是加熱固定，80℃烘烤2小時也同樣達(dá)到DNA交聯(lián)的目的。
d.膜的選擇固定探針的膜主要是硝酸纖維膜，如商品BA85(Schleicher and Schull)和HAWP(Millipore)，尼龍膜如Biodyne(trademark of Pall)、Gensscreen(New England Nuclear)，和Zetapore或Zetaprobe(AMF Curio)。膜的孔徑一般在5～10μm。2. 將含有mRNA的細(xì)胞或樣本用強(qiáng)烈變性劑溶解，釋放RNA根據(jù)以下操作可以選擇性的將來自全血細(xì)胞的mRNA加以抽提，其中強(qiáng)烈變性劑以加硫氰酸鹽GuSCN抽提為例。其他操作主要以來于mRNA的特性，用以增加mRNA提取的效果。以下分別加以描述a.生物樣本準(zhǔn)備可采用多種常規(guī)方法過去細(xì)胞，進(jìn)行mRNA提取是要特別小心，以防RNA降解。通常情況下，樣本置于冰上，戴手套，應(yīng)用環(huán)己酰胺加核酸酶抑制劑等。環(huán)己酰胺(cyclohexamide)通過維持mRNA在一種天然結(jié)構(gòu)狀態(tài)以減少降解，核酸酶抑制劑氧礬核糖核苷(vanadylribonucleosides)抑制RNA酶，不影響分子雜交，但是它抑制逆轉(zhuǎn)錄和翻譯。加用0.5mM金精三羧酸(aurin tricarboxylic acid)(Sigma Chemicals)加1mM羥芪巴脒(hydroxystilbamidine isothamine)(Merrell)或者1U/ml RNAsin(Promega Biotech)對逆轉(zhuǎn)錄或翻譯沒有抑制作用，但是其抑制核酸酶的能力不如氧礬核糖核苷。
如果樣本是單個核細(xì)胞或骨髓細(xì)胞，可以采用不連續(xù)Ficoll Hypaque密度梯度離心法分離細(xì)胞，固體組織可以直接用硫氰酸鹽溶液溶解。
b.加入去污劑和硫氰酸鹽去污劑和硫氰酸鹽的加入順序并不嚴(yán)格，先或后加或一起加都無大礙。去污劑可以溶解細(xì)胞，并有助于抑制蛋白質(zhì)和DNA在層析時的共沉淀現(xiàn)象。如果mRNA樣本含有足夠多的蛋白質(zhì)或DNA，將以加入去污劑，適合的去污劑有布里杰(Brij)系列或吐溫Tween系列。弱陰離子去污劑十二烷基肌氨酸鈉(sodium lauryl sarcosinate)和去氧膽酸鈉(sodiumdesoxycholate)效果也不錯。例如，為了破碎細(xì)胞，可加入1/20體積的10％Brij 35(Sigma)與樣本混合，然后加1/20體積的10％去氧膽酸鈉，再次混合。
去污劑加入以后，加入1體積的超飽和的硫氰酸鹽溶液(含2％β-巰基乙醇，10mM Tris-HClpH 7.0，1mM EDTA)，使細(xì)胞能得到飽和的硫氰酸鹽。
強(qiáng)鹽溶液很容易制備。例如NaI，超飽和NaI大約是2.5g NaI溶解于1ml 75℃熱水中，室溫儲存，用前加熱至75℃。使用時加入1體積超飽和NaI到樣本中，形成飽和NaI抽提液，此時應(yīng)看到樣本溶液應(yīng)該是澄清的。其他的變性劑鹽的配制法與此相似。
c.硫氰酸鹽變性劑的配制硫氰酸胍4M
Tris-HCl(pH 7.1)10mM檸檬酸鈉(pH 7.1)25mMEDTA1mMβ-巰基乙醇 2％使用前加入3. 調(diào)節(jié)變性劑溶液的離子濃度加入稀釋劑的目的主要是稀釋變性劑的濃度，降低變性劑對親和素—生物素結(jié)合的影響，同時調(diào)劑液體的離子強(qiáng)度，使之更適合于雜交。稀釋劑成份為6×SSC，10mM Tris-HCl(pH7.4)，1mM EDTA，0.25％SDS。使用時將等體積的稀釋劑加到變性劑抽提的RNA溶液中。
70℃加熱變性5分鐘，使RNA充分變性。4. 在變性液中加入生物素標(biāo)記的Poly(T)和親和素包被的膠體金顆粒向上述混合液體中加入50pmol生物素標(biāo)記Oligo(dT)20-36，加入100μl的10OD親和素包被的膠體金試劑混合，用于步驟5的層析雜交。
第二種標(biāo)記方法是根據(jù)金與巰基能形成穩(wěn)定連接的原理設(shè)計的。當(dāng)應(yīng)用膠體金作為示蹤劑時，由于膠體金的特點，可以與巰基化合物形成穩(wěn)定的復(fù)合物。應(yīng)用巰基標(biāo)記的Poly(dT)第二探針可以減少探針標(biāo)記的成本，并且使操作更為簡便。
由于金的金屬特性，巰基基團(tuán)可以與金表面形成穩(wěn)定的吸附，不需要特殊的共價結(jié)合，因此使金顆粒的標(biāo)記更為簡單。標(biāo)記后的純化可以采用離心分離的方法，一般先以低速離心去除聚集的金顆粒的沉淀，然后再超速離心，標(biāo)記的探針存在于沉淀之中，反復(fù)離心幾次，最后將沉淀于少量10mM PBS緩沖液(pH7.0)中。5. 將膜條的一端浸入變性劑溶液，一端與吸水纖維相連，層析雜交樣本，顯示信號動物類細(xì)胞mRNA在3’端均帶有Poly(A)序列，此序列可作為通用探針雜交的識別序列，通用探針為Poly(dT)，5’標(biāo)記有膠體金或鐵蛋白等有色物質(zhì)，當(dāng)與mRNA溶液混合時，便與mRNA的Poly(A)端多重結(jié)合。當(dāng)此復(fù)合物在層析時可隨著液體在薄膜上的擴(kuò)散，mRNA向上移動。當(dāng)mRNA-Poly(dT)雜交復(fù)合物在遷移過程中與固定在薄膜上的cDNA探針相遇時，便被固定探針俘獲，原位形成有色信號。不被俘獲的mRNA分子繼續(xù)前移，直到碰到可以俘獲的分子為止。
檢測時，經(jīng)變性后的mRNA或RNA溶液與poly(dT)和親和素包被的膠體金溶液混合，離心沉淀不溶性物質(zhì)，注意樣品在孔中的均勻性。然后將膜條芯片的同一端浸于混合液中，另一端與吸水纖維相連，讓液體沿尼龍膜向另一端層析擴(kuò)散，同時驅(qū)動樣本中的mRNA遷移，當(dāng)mRNA到達(dá)相應(yīng)的位置時，便被固定探針俘獲，一般大約需要15分鐘到30分鐘，再經(jīng)過15分鐘的層析，洗去游離物質(zhì)，然后通過肉眼觀察條帶的位置以及信號的有無。芯片雜交的質(zhì)量可以通過內(nèi)置的對照加以控制。
室溫條件下，3～6.5M GuSCN同樣有效，雜交可以進(jìn)行5分鐘，也可以長達(dá)數(shù)小時。操作程序超常簡單。該技術(shù)也可結(jié)合蛋白酶、去污劑、有機(jī)溶劑、還原劑等使用，因為生物樣本中核酸復(fù)雜，有的可能不能直接接觸硫氰酸鹽溶液。6. 銀還原信號加強(qiáng)，信號分析。
可以肉眼直接觀察對比，更適合的是標(biāo)記膠體金顆粒加銀還原加強(qiáng)法的信號可以被一般平板光學(xué)掃描儀掃描獲取，一次掃描可以同時獲取50份以上檢測結(jié)果，通過掃描獲取的圖象再通過圖象分析軟件自動分析和報告及打印，有利于自動分析和臨床大規(guī)模的使用。
mRNA雜交設(shè)置內(nèi)參照可以提供定量參考。雜交時設(shè)置被測管和參照管，結(jié)果以兩管的信號的比率決定。好的參照管是已知mRNA在各種條件下表達(dá)的量作為參照。另一個參照是總mRNA的poly(A)的量。生物素標(biāo)記的poly(dT)檢測poly(A)的量，作為其他mRNA的參照值。
平行的陰性和陽性對照對于定量mRNA或RNA都是必需的，這些對照擁有與被檢測的標(biāo)本相同的探針。
實施例1 造血干細(xì)胞部分結(jié)構(gòu)蛋白基因表達(dá)譜條形芯片的制作與檢測1.cDNA探針的選擇與制作以造血干細(xì)胞部分結(jié)構(gòu)蛋白和一些小蛋白的基因cDNA作為探針固定于載體膜表面，基因如表1所示。這些基因的cDNA均已被克隆出來，有些是全長基因，有些是Poly(A)端的部分基因序列。這些基因克隆在質(zhì)粒內(nèi)，可以用通用的引物將其擴(kuò)增，本實例所使用的克隆來自國家人類基因組南方研究中心，美國I.M.A.G.E和InCyte公司也有供應(yīng)。
表1 部分造血干細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白基因GeneBank No 表達(dá)的蛋白名稱X63432 ACTB mRNA for mutant beta-actin(beta′-actin)U03269 actin capping protein alpha subunit(CapZ)U12026 actin-regulatory protein Cap-G(CAPG)K00558 alpha-tubulinX00351 beta-actinV00599 beta-tubulin.
M80563 CAPL proteinU03851 capping protein alphaU56637 capping protein alpha subunit isoform 1X84075 cardiac myosin binding protein-CV00478 cytoplasmic actinX04098 cytoskeletal gamma-actinX04588 cytoskeletal tropomyosin TM30(nm)X73882 E-MAP-115U62962 Int-6L25941 integral nuclear envelope inner membrane protein(LBR)M63483 maior nuclear matrix proteinM27937 male-enhanced antigen mRNA(Mea)U38291 microtubule-associated protein 1a(MAP1A)Y00764 mitochondrial hinge proteinM22382 mitochondrial matrix protein P1M69066 moesinM31211 myosin light chain 1 slow a(MLC1sa)M31212 myosin light chain 3 non-muscle(MLC3nm)U26162 myosin regulatory light chainX54304 myosin regulatory light chainJ00312 non-muscle(fibroblast)tropomyosin geneL22343 nuclear phosphoproteinM60858 nucleolinX75252 phosphatidylethanolamine binding proteinJ03191 profilinU61734 protein trafficking protein(S31iii125)L03785 regulatory myosin light chain(MYL5)Y00282 ribophorin IIU51586 siah binding protein 1(SiahBP1)S65762 SPTBN1＝beta-fodrinM25077 SS-A/Ro ribonucleoprotein autoantigen 60 kdU26648 syntaxin 5U77942 syntaxin 7M25246 vimentin2.cDNA探針擴(kuò)增合成、純化應(yīng)用Qiagen或Promega公司的PCR試劑盒，根據(jù)操作說明書擴(kuò)增所選cDNA克隆，反應(yīng)過程中，使用質(zhì)粒所附的通用PCR引物作為通用PCR合成引物，質(zhì)粒cDNA克隆作為模板，延伸時間需2分鐘或以上，30個循環(huán)，產(chǎn)物經(jīng)電泳證明后，直接酒精(75％)沉淀即可。沉淀的DNA經(jīng)20μl 3×SSC溶液溶解和高溫變性(98℃5分鐘，隨后迅即冰水冷卻)后可直接用于噴線或劃線。
3.噴線或劃線采用噴線方法(BioDot)將所選探針和對照cDNA探針(Actin和Microglubin以及植物DNA)噴在5mm～10mm寬的尼龍膜上形成條帶陣列，或者用點樣機(jī)(Cartesian)將cDNA探針點于膜的指定位置，形成點狀陣列。噴樣或點樣后，室溫干燥，在80℃真空爐內(nèi)烘烤2小時以使cDNA探針與硝酸纖維膜或尼龍膜形成共價交聯(lián)?；蛘撸瑖娋€或點樣后的膜條經(jīng)室溫干燥后，用交聯(lián)爐紫外線(254nm)進(jìn)行交聯(lián)。交聯(lián)能量一般為120,000μj/cm2照射20秒，也可以根據(jù)需要調(diào)整照射劑量。
4.第二探針標(biāo)記Poly(dT)第二探針的長度可以選擇在15～36個堿基，本實例選擇36個堿基長度。5’端應(yīng)標(biāo)記生物素，并在寡核苷酸和生物素之間帶有6個炭原子的連接臂。并使用親和素包被的膠體金顆粒(40nm)作為顯色試劑。
5.壓膜與切割將上述噴過固定探針的硝酸纖維膜或尼龍膜通過復(fù)合壓膜機(jī)，復(fù)合在PVC塑料薄板上，以增加纖維膜的韌性和可加工性。采用切割機(jī)將復(fù)合好的膜片切成所需的規(guī)格和形狀(一般為2.5mm～5mm寬，50mm～100mm長左右)，即成單份用檢測試劑膜條。將單人分試劑膜條及干燥劑裝入鋁薄膜小袋并封閉?；?qū)稳朔謾z測膜條裝配在小型塑料盒，配以相應(yīng)的層析液小袋和吸水纖維，制成完整的檢測裝置，然后將檢測裝置放置在干燥袋內(nèi)。
6.生物樣本準(zhǔn)備和RNA抽提如果樣本是血細(xì)胞或骨髓細(xì)胞，可以采用不連續(xù)Ficoll Hypaque密度梯度離心法分離細(xì)胞。進(jìn)行mRNA提取是要特別小心，以防RNA降解。通常情況下，樣本置于冰上，戴手套，應(yīng)用環(huán)己酰胺加核酸酶抑制劑等。環(huán)己酰胺(cyclohexamide)通過維持mRNA在一種天然結(jié)構(gòu)狀態(tài)以減少降解，核酸酶抑制劑氧礬核糖核苷(vanadyl ribonucleosides)抑制RNA酶。所有的溶液均需經(jīng)過DEPC處理。如果是培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞，可直接離心取細(xì)胞沉淀。為了更好地破碎細(xì)胞，可加入1/20體積的10％Brij 35(Sigma)與樣本混合。然后加入硫氰酸胍溶液(硫氰酸胍，4M；Tris-HCl(pH 7.1)，10mM；檸檬酸鈉(pH 7.1)，25mM；EDTA，1mM；β-巰基乙醇，2％使用前加入)直接抽提RNA。一般情況下，＜107細(xì)胞，可以加入1ml硫氰酸胍變性劑溶液，抽提后的硫氰酸胍溶液經(jīng)過離子調(diào)整后可以直接用于層析雜交檢測。
7.加入檢測試劑加入稀釋劑的目的主要是稀釋變性劑的濃度，降低變性劑對親和素一生物素結(jié)合的影響，同時調(diào)劑液體的離子強(qiáng)度，使之更適合于雜交。稀釋劑成份為6×SSC，10mM Tris-HCl(pH7.4)，1mM EDTA，0.25％SDS。使用時將等體積的稀釋劑加到變性劑抽提的RNA溶液中。
70℃加熱變性5分鐘，使RNA充分變性。
向上述混合液體中加入50pmol生物素標(biāo)記Oligo(dT)36，加入100μl的10OD親和素包被的膠體金試劑混合，用于層析雜交。
8.層析雜交檢測檢測時，將膜條芯片的一端(末端2mm)浸于層析液(5×SSC溶液)中，另一端與吸水纖維相連，讓液體沿尼龍膜向另一端層析擴(kuò)散，同時驅(qū)動樣本中的mRNA遷移，當(dāng)mRNA到達(dá)相應(yīng)的位置時，便被固定探針俘獲，一般大約需要15分鐘到30分鐘，再經(jīng)過15分鐘的層析，洗去游離物質(zhì)，然后通過肉眼觀察條帶的位置以及信號的有無。芯片雜交的質(zhì)量可以通過內(nèi)置的對照加以控制。
9.信號獲取與分析可以肉眼直接觀察對比，更適合的是標(biāo)記膠體金顆粒加銀還原加強(qiáng)法的信號可以被一般平板光學(xué)掃描儀掃描獲取，一次掃描可以同時獲取50份以上檢測結(jié)果，通過掃描獲取的圖象再通過圖象分析軟件自動分析和報告及打印，有利于自動分析和臨床大規(guī)模的使用。
mRNA雜交設(shè)置內(nèi)參照可以提供定量參考。雜交時設(shè)置被測管和參照管，結(jié)果以兩管的信號的比率決定。好的參照管是已知mRNA在各種條件下表達(dá)的量作為參照。另一個參照是總mRNA的poly(A)的量。生物素標(biāo)記的poly(dT)檢測poly(A)的量，作為其他mRNA的參照值。
平行的陰性和陽性對照對于定量mRNA或RNA都是必需的，這些對照擁有與被檢測的標(biāo)本相同的探針。實施例2.白血病細(xì)胞CD抗原mRNA的定量層析檢測CD抗原也稱白細(xì)胞分化抗原，是白細(xì)胞表達(dá)在細(xì)胞表面的一種特定標(biāo)志物，其中很多可以反映白細(xì)胞分化的進(jìn)程、反映白細(xì)胞激活或失活的狀態(tài)。白細(xì)胞表面分子通常用抗白細(xì)胞的抗體進(jìn)行檢測。應(yīng)用不同組合的CD抗原抗體就可以鑒別出白細(xì)胞的亞型，如B細(xì)胞、輔助T細(xì)胞，細(xì)胞毒T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等，這些細(xì)胞對藥物的反應(yīng)和抗性都不相同。
白血病是一種骨髓造血細(xì)胞克隆性增值，細(xì)胞常停留在細(xì)胞分化的某一階段而不發(fā)育成熟，因而可以帶有某種特殊的標(biāo)志。白血病可以發(fā)生于造血細(xì)胞任何一個系列，其本身也帶有這個系列的特殊標(biāo)志。對于急性白血病，白細(xì)胞的免疫分型可以鑒定白血病細(xì)胞發(fā)生的系列和成熟的程度。然而到目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)對于任何一種白血病都特異的標(biāo)志物，因此白血病細(xì)胞的鑒定通常就是不同CD抗原表達(dá)的組合鑒定。
1.探針選擇到目前為止，已發(fā)現(xiàn)的以CD系列命名的抗血液細(xì)胞的抗原已達(dá)到編號166，加上各種亞型，實際上已經(jīng)接近190個。這些CD抗原物質(zhì)都是識別血液細(xì)胞的某一特定分子，絕大多數(shù)是蛋白質(zhì)或糖蛋白，少數(shù)是粘多糖(5-6種)。為了達(dá)到臨床診斷的實用性，該診斷膜條所使用的CD探針為38個，全部來源于cDNA克隆(質(zhì)粒)，經(jīng)通用PCR引物擴(kuò)增所得。這些探針可函蓋所有白血病類型的診斷，這些探針選擇如表2。
表2.所選探針的CD編號名稱
2.cDNA探針擴(kuò)增合成、純化應(yīng)用Qiagen或Promega公司的PCR試劑盒，根據(jù)操作說明書擴(kuò)增所選cDNA克隆，反應(yīng)過程中，使用質(zhì)粒所附的通用PCR引物作為通用PCR合成引物，質(zhì)粒cDNA克隆作為模板，延伸時間需2分鐘或以上，30個循環(huán)，產(chǎn)物經(jīng)電泳證明后，直接酒精(75％)沉淀即可。沉淀的DNA經(jīng)20μl 3×SSC溶液溶解和高溫變性(98℃5分鐘，隨后迅即冰水冷卻)后可直接用于噴線或劃線。
3.噴線或劃線 參見實例一第三步。
4.第二探針標(biāo)記Poly(dT)第二探針的長度可以選擇在15～36個堿基，本實例選擇36個堿基長度。5’端應(yīng)標(biāo)記生物素，并在寡核苷酸和生物素之間帶有6個炭原子的連接臂。并使用親和素包被的膠體金顆粒(40nm)作為顯色試劑。
5.壓膜與切割參見實例一第四步。
6.血液樣本處理收集15ml外周血，肝素抗凝(50U/ml)，用加有50μg/ml環(huán)己酰胺和10mM核酸酶抑制劑氧礬核糖核苷的Hanks液2倍稀釋，將細(xì)胞懸液Ficoll-Hypaque之上12000g密度梯度離心20分鐘，收集Ficoll表面的單個核細(xì)胞層，用上述Hanks液洗細(xì)胞2次，并細(xì)胞計數(shù)。細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)到107/ml，加10％Brij-35到最終濃度0.5％，混合，然后加等量超飽和變性劑硫氰酸胍溶液，使細(xì)胞溶解，溶液澄清透明。最后加等體積的6×SSC以稀釋變性劑，同時調(diào)節(jié)液體的離子強(qiáng)度，使之適合于雜交，同時降低變性劑對親和素—生物素結(jié)合的影響。稀釋劑成份為6×SSC，10mM Tris-HCl(pH 7.4)，1mM EDTA，0.25％SDS。使用時將等體積的稀釋劑加到變性劑抽提的RNA溶液中。
7.RNA變性將稀釋后的RNA溶液70℃加熱變性5分鐘，使RNA充分變性。
5’生物素標(biāo)記的Poly(T)30由服務(wù)商合成提供，用蒸餾水稀釋至100μM。向上述混合液體中加入50pmol生物素標(biāo)記Oligo(dT)36，加入100μl的10OD親和素包被的膠體金試劑混合，用于層析雜交。
親和素包被膠體金，可以直接購買商用親和素包被的膠體金溶液(華美公司)，也可以自制。
8.層析雜交檢測檢測時，將膜條芯片的一端(末端2mm)浸于層析液(5×SSC溶液)中，另一端與吸水纖維相連，讓液體沿尼龍膜向另一端層析擴(kuò)散，同時驅(qū)動樣本中的mRNA遷移，當(dāng)mRNA到達(dá)相應(yīng)的位置時，便被固定探針俘獲，一般大約需要15分鐘到30分鐘，再經(jīng)過15分鐘的層析，洗去游離物質(zhì)，然后通過肉眼觀察條帶的位置以及信號的有無。芯片雜交的質(zhì)量可以通過內(nèi)置的對照加以控制。
9.信號獲取與分析 參見實例一第九步。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及mRNA快速層析芯片的技術(shù)和方法，可用于基因表達(dá)譜的研究和基因活動狀態(tài)的鑒別，該技術(shù)步驟包括a)將cDNA探針或寡核苷酸探針陣列于微孔纖維膜上，制成膜條陣列芯片；b)將含有mRNA的細(xì)胞或樣本用強(qiáng)烈變性劑溶解，釋放RNA；c)稀釋并調(diào)節(jié)變性劑溶液的離子濃度，75℃加溫變性RNA；d)加入生物素標(biāo)記的Poly(T)和親和素包被的膠體金顆粒溶液；e)將膜條芯片的一端浸入變性劑溶液，另一端與吸水纖維相連，層析雜交樣本，顯示信號；f)銀還原信號加強(qiáng)，信號分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所描述的膜條陣列芯片，其特征在于將cDNA探針或合成的寡核苷酸探針通過畫線或點樣的方式排列并固定在可層析的微孔膜上；膜的材料為硝酸纖維素膜、PVDF膜、尼龍膜和以這些膜為基礎(chǔ)發(fā)展而來的帶有陽離子或陰離子的膜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所描述的膜條陣列芯片，其特征在于芯片呈條形，cDNA探針或寡核苷酸探針陣列固定于膜條的中間區(qū)域，陣列可以為條形碼樣排列或點陣陣列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所描述的強(qiáng)烈變性劑釋放RNA，其特征在于直接采用強(qiáng)力變性劑變性處理細(xì)胞或組織樣本，使之釋放核酸，同時抑制RNA酶對RNA的降解，變性劑包括硫氰酸胍、異硫氰酸胍、硫氰酸鉀、三氟醋酸鹽、三氯醋酸鹽、過氯酸鹽、碘化鈉等，變性劑的濃度依所溶解的樣本有所不同，典型的濃度是3～6M。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所描述的RNA變性劑稀釋和RNA變性，其特征在于，檢測時將生物素標(biāo)記的poly(dT)片段和親和素包被的膠體金試劑與RNA強(qiáng)烈變性劑溶劑等體積的6×SSC混合，并加到RNA變性劑溶液中，混合，其目的是調(diào)節(jié)雜交液的離子強(qiáng)度同時對強(qiáng)烈變性劑作稀釋以減少對親和素的損傷。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所描述的層析雜交技術(shù)，其特征在于當(dāng)RNA抽提溶液與生物素-poly(dT)以及親和素包被的膠體金等混合后，將膜的一端浸入混合溶液，另一端與吸水纖維相連，由于層析效應(yīng)，流動相帶動樣品沿膜載體展開，靶RNA-poly(dT)-生物素-親和素-膠體金復(fù)合物會被相應(yīng)的固定探針俘獲，并在相應(yīng)的條帶位置呈現(xiàn)陽性的紅色膠體金檢測信號。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所描述的銀還原信號加強(qiáng)法，其特征是先進(jìn)行膠體金層析顯色，再通過銀顯影液(乳酸銀顯影液、硝酸銀顯影液)復(fù)染，使其在膠體金部位的銀被還原形成黑色顆粒，使信號加強(qiáng)10～100倍。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種直接快速的mRNA層析雜交芯片檢測技術(shù)。該檢測技術(shù)包括cDNA探針在層析膜上的陣列和固定、被檢樣本用強(qiáng)力變性劑溶解釋放RNA、調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度、加入生物素標(biāo)記第二探針寡核苷酸(dT)和親和素包被的膠體金顆粒溶液、層析雜交檢測和信號分析等步驟。該技術(shù)可用于基因表達(dá)譜的分析研究和根據(jù)基因表達(dá)模型進(jìn)行的臨床診斷。該技術(shù)操作非常簡便,不需要RNA的分離和純化,不需要特制的RNA操作環(huán)境,沒有PCR擴(kuò)增標(biāo)記或其他標(biāo)記操作。整個層析雜交檢測時間少于1小時。此外,該技術(shù)檢測成本低廉,操作人員不需特別培訓(xùn),非常適合于醫(yī)院、基層單位使用。
文檔編號C12Q1/68GK1381589SQ01105979
公開日2002年11月27日 申請日期2001年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月13日
發(fā)明者繆金明 申請人:繆金明