專利名稱：靶向表皮生長因子受體的小干擾rna重組腺病毒及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及重組腺病毒，具體涉及耙向表皮生長因子受體 的小干擾RNA重組腺病毒及其在抑制人肺腺癌細(xì)胞體內(nèi)生長中的作用。
技術(shù)背景表皮生長因子受體(印idermal growth factor rec印tor， EGFR)通過與配 體結(jié)合形成復(fù)合物，引起一系列的生物效應(yīng)，促進(jìn)上皮再生、刺激體內(nèi)多種細(xì)胞 的分裂。EGFR基因的擴(kuò)增及產(chǎn)物的過度表達(dá)與人體腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，人類 多種腫瘤存在EGFR的過度表達(dá)。EGFR過表達(dá)與肺癌的惡性程度、轉(zhuǎn)移、放化療 敏感性及預(yù)后密切相關(guān)，阻滯EGFR通路能有效地抑制腫瘤生長，說明EGFR是 一個非常有前途的肺癌靶向治療的靶點，以此靶點開發(fā)有效的藥物可望使目前效 果不甚理想的肺癌治療有所突破。目前以EGFR為靶點的腫瘤生物治療手段存在有效率低、在延長患者生存期 方面無優(yōu)越性、價格昂貴、轉(zhuǎn)染效率低、表達(dá)不穩(wěn)定等問題，使得調(diào)控EGFR的 腫瘤治療研究尚未有突破性進(jìn)展。RNA干擾是由雙鏈RNA引發(fā)的一種高效基因表達(dá)抑制途徑，是轉(zhuǎn)錄后基因沉 默的重要機(jī)制。近年來這一技術(shù)發(fā)展迅速，目前已經(jīng)在基因組功能研究和疾病的 基因治療研究中取得了巨大進(jìn)展。RNA干擾技術(shù)阻斷基因表達(dá)具有高效率和高特 異的特點，且RNA干擾具有級聯(lián)放大效應(yīng)，甚至其效應(yīng)可傳遞至子代細(xì)胞，是適 合腫瘤基因治療的新手段。目前RNA干擾應(yīng)用于臨床治療的主要難題就是如何增 加小干擾RNA穩(wěn)定性并提高導(dǎo)入效率，以提高RNA干擾的效率并延長RNA干擾效 應(yīng)時間。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種靶向表皮生長因子受體的小干擾RNA重組腺病毒。 本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供上述重組腺病毒在抑制人肺腺癌細(xì)胞體內(nèi)生長 中的用途。本發(fā)明針對肺癌治療和基因調(diào)節(jié)技術(shù)的難點，實現(xiàn)動物體內(nèi)核酸導(dǎo)入，產(chǎn)生 RNA干擾效應(yīng)，下調(diào)EGFR表達(dá)，抑制腫瘤生長。本發(fā)明使用pSilencer adeno 1. 0-CMV腺病毒載體系統(tǒng)(美國Ambion公 司)，構(gòu)建shuttle vector —穿梭載體(圖1)，其中，修飾的CMV啟動子驅(qū)動小 發(fā)夾RNA表達(dá)，由修飾的SV40 polyA signal作為終止子，和backbone vector 一骨架載體在包裝細(xì)胞293細(xì)胞中發(fā)生同源重組，得到預(yù)期的復(fù)制缺陷型重組 腺病毒。本發(fā)明的重組腺病毒通過下述方法制備根據(jù)EGFR基因在GenBank中的序列(NM一005228)設(shè)計對應(yīng)的小干擾RNA。 設(shè)計原則是從啟動子下游75堿基處尋找到第一個AA二聚體；記錄AA下游19 個堿基序列為目的序列；計算目的序列中嘌呤和嘧啶的含量百分比(G/C)。 G/C 比值接近50%為較理想，標(biāo)準(zhǔn)是大于30%小于70%;如果選擇的序列中G/C含量 不能達(dá)到要求，繼續(xù)搜尋下一個AA二聚體，直到獲得滿意結(jié)果；在GenBank表 達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫中用BLAST檢索，確認(rèn)所設(shè)計小干擾RNA序列的唯一性。設(shè)計 的針對EGFR基因的小干擾RNA序列，正義鏈5'-GGAGCUGCCCAUGAGAAAU-3'; 反義鏈5'-AUUUCUCAUGGGCAGCUCC-3';化學(xué)合成小干擾RNA初步驗證了其抑 制EGFR基因表達(dá)的效應(yīng)；以此序列為基礎(chǔ)，設(shè)計靶向EGFR的小干擾RNA DNA表達(dá)模板 5' -TCGAGGGAGCTGCCCATGAGAAATTTCAAGAGAATTTCTCATGGGCAGCTCCTT A-3'3' -CCCTCGACGGGTACTCTTTAAAGTTCTCTT嵐GAGTACCCGTCGAGGAA TGATC-5， 序列進(jìn)行酶切分析保證其中無PacI ， EcoRI， HindIII酶切位點；使用pSilencer adeno 1.0-CMV腺病毒載體系統(tǒng)(美國Ambion公司)，以 穿梭載體的多克隆位點中Xho I和Spe I為插入位點，將上述耙向EGFR的小干擾 RNA DNA表達(dá)模板與穿梭載體連接，即構(gòu)建了靶向EGFR基因的小干擾RNA穿梭 載體，其中，修飾的CMV啟動子驅(qū)動小干擾RNA表達(dá)，由修飾的SV40 polyA signal 作為終止子(圖1);將上述構(gòu)建的靶向EGFR基因的小干擾RNA穿梭載體和骨架載體在293細(xì)胞 中同源重組，得到靶向EGFR的小干擾RNA重組腺病毒Adv-shEGFR。將所得的重組腺病毒擴(kuò)增、純化、鑒定后，測定病毒滴度和感染效率，分析重組腺病毒抑制EGFR表達(dá)的效率。以插入無關(guān)序列表達(dá)模板的重組腺病毒Adv-shNEG作為研究對照。
最后通過體內(nèi)實驗驗證靶向EGFR的小干擾RNA重組腺病毒的抗腫瘤活性。 以上技術(shù)方案中所有基本分子生物學(xué)操作均參照〈分子克隆實驗指南〉。 本發(fā)明構(gòu)建的小干擾RNA病毒表達(dá)載體，不僅可提高小干擾RNA導(dǎo)入效率，還可延長RNA干擾效應(yīng)的時間。


圖1是pSilencer adeno 1.0-CMV腺病毒載體系統(tǒng)的穿梭載體結(jié)構(gòu)圖。以 穿梭載體的多克隆位點中XhoI和SpeI為插入位點，插入DNA表達(dá)模版；修飾 的CMV啟動子驅(qū)動小干擾RNA表達(dá)，由修飾的SV40 polyA signal作為終止子。
圖2是免疫熒光染色檢測感染Adv-shEGFR 3天(d3)和6天(d6)后細(xì)胞 EGFR表達(dá)變化，其中，control:未處理組，AShEGFR:感染Adv-shEGFR組。
圖3是免疫印跡檢測感染Adv-shEGFR 3天(d3)和6天(d6)后，細(xì)胞中 EGFR蛋白水平的抑制，其中，A: A549細(xì)胞，B: SPC-A1細(xì)胞，control:未處理組，AShNEG:感染 Adv-shNEG組，AShEGFR:感染Adv-shEGFR組。
圖4是免疫組織化學(xué)法檢測A549細(xì)胞腫瘤組織中EGFR、 PCNA表達(dá)， 其中，A: EGFR， B: PCNA， control:注射3W蔗糖/PBS對照組，AShNEG:注 射Adv-shNEG組，AShEGFR:注射Adv-shEGFR組。
圖5是免疫組織化學(xué)法檢測SPC-A1細(xì)胞腫瘤組織中EGFR、 PCNA表達(dá)， 其中，A: EGFR， B: PCNA, control:注射3M庶糖/PBS對照組，AShNEG:注 射Adv-shNEG組，AShEGFR:注射Adv-shEGFR組。
圖6是免疫印跡檢測腫瘤組織中EGFR表達(dá)，其中，AShNEG:注射Adv-shNEG組，AShEGFR:注射Adv-shEGFR組。
圖7是裸鼠皮下移植瘤內(nèi)注射重組腺病毒，測量腫瘤體積，其中，AShNEG:注射Adv-shNEG組，AShEGFR:注射Adv-shEGFR組。
具體實施方式
實施例1耙向EGFR的小干擾RNA穿梭載體的構(gòu)建和鑒定 設(shè)計及合成小干擾RNA DNA表達(dá)模板5' -TCGAGGGAGCTGCCCATGAGAAATTTCAAGAGAATTTCTCATGGGCAGCTCCTT A-3' 3， -CCCTCGACGGGTACTCTTTMAGTTCTCTT磁GAGTACCCGTCGAGGAA TGATC-5' 上述寡核苷酸退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)，建立退火反應(yīng)體系如下 正義鏈 2 ul反義鏈 2 Ul1XDNA擬和液 46 ul95'C孵育5分鐘，72'C孵育10分鐘，緩慢降至37t:孵育l小時； 取上步退火溶液5ul加入45 Ul去離子水，終濃度8 ng/ul; 表達(dá)模板與穿梭載體連接反應(yīng)pShEGFR反應(yīng)體系 加入量 去離子水 11.25 ulEGFR表達(dá)模板 1.25 ul10XT4 DNA緩沖液 1.5 u 1穿梭載體 0.5 ulT4 DNA連接酶(5U/u 1) 0. 5 w 1 22t:孵育過夜；65'C變性10分鐘；穿梭載體的轉(zhuǎn)化A、 感受態(tài)細(xì)菌(JM109)放置于冰水浴，使之解凍；B、 取50 ul JM109，加3 ul連接液攪勻后冰育30分鐘；C、 42°C 90秒，冰水中冷卻5分鐘，使質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌；D、 預(yù)溫SOC培養(yǎng)基400 u 1加入上述離心管中，250rpm 37'C振搖菌液2小時；E、 1000rpm離心5分鐘，棄去上清，取上述轉(zhuǎn)化菌菌液50 n l涂布于含 100 ug/ml氨芐青霉素的LB平板上，37。C過夜；F、 根據(jù)形成細(xì)菌克隆的數(shù)量初步判定連接反應(yīng)是否成功； 穿梭載體的測序鑒定挑取陽性克隆，接種于含100ug/ml氨芐青霉素的10mlLB培養(yǎng)液中，37'C振 蕩培養(yǎng)過夜。次日取lml菌液，采用下列測序引物進(jìn)行測序鑒定-上游弓l物5'-ggatttccaagtctccac-3' 下游弓l物5'-agcaccttccagatctgc-3' 公i干擾RNA穿梭載體c使用QIAGEN公司質(zhì)粒抽提試劑盒大量提取穿梭載體，得到靶向EGFR的小實施例2腺病毒的重組及鑒定 穿梭載體和骨架載體的線性化反應(yīng)體系穿梭載體Pac IIOX緩沖液 IOX牛血清白蛋白 去離子水 37'C水浴1. 5小時； 反應(yīng)體系 Lac Z骨架載體 Pac IIOX緩沖液 IOX牛血清白蛋白去離子水 37'C水浴1.5小時； 采用磷酸鈣法將線性化的穿梭載體和骨架載體共轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞中，并發(fā) 生同源重組，得到靶向EGFR的小干擾RNA重組腺病毒。 重組腺病毒的擴(kuò)增A、 10ml 1(^胎牛血清/DMEM培養(yǎng)5X 106 293細(xì)胞；B、 取0.5iU病毒保存液，加入l(^胎牛血清/DMEM至lml，混勻；C、 移去步驟a的培養(yǎng)液，小心加入病毒混合液，十字形慢慢晃動3次;D、 37°C 596C02孵箱中培養(yǎng)120分鐘，加入9ml 1(m胎牛血清/DMEM;加入量U1) 1.0 2. 0 5.0 5.0補(bǔ)足體積至50.0 ul加入量(ul) 8.0 2.0 2.0 2.0補(bǔ)足體積至20.0 ulE、 再培養(yǎng)72小時，收集細(xì)胞，600g離心5分鐘沉淀細(xì)胞；F、 病毒保存溶液重懸細(xì)胞，-2(TC和37'C凍融3次；G、 臺式離心機(jī)上以最大速率離心20分鐘去除細(xì)胞碎片，收集上清；H、 反復(fù)擴(kuò)增至需要病毒量。 重組腺病毒的純化A、 收集細(xì)胞，4'C， 12500g離心30分鐘；B、 棄上清，沉淀充分重懸于5mlCsCl (1.1 g/ml);C、 4°C， 8000g離心5分鐘，取上清；D、 在超速離心管中緩慢加入2mlCsCl (1.4g/ml)， 3mlCsCl (1.3g/ml);E、 4°C， 60000g離心12h，吸出病毒帶；F、 10mM Tris pH8. O稀釋備用。 50%組織培養(yǎng)感染劑量法(TCID50)測定病毒滴度A、 收集一瓶293細(xì)胞，計數(shù)；用2M胎牛血清/DMEM準(zhǔn)備20ml、 1。7ml細(xì)胞；B、 在96孔板中每孔加入100ul細(xì)胞懸液；C、 準(zhǔn)備稀釋病毒液第1管中加入0.9ml2M胎牛血清/DMEM,其余加入 1.8ml;第l管中再加入O. lml病毒保存液，上下吸打5次混勻；換用新吸頭， 從第1管中吸取0.2ml加入第2管中，反復(fù)稀釋至最高稀釋度；用同一管病毒 保存液進(jìn)行第2輪稀釋；最后8個稀釋液加入96孔板，每孔0.1ml，每個稀釋 度10孔，2孔為陰性對照，37t:培養(yǎng)10天；10天后倒置顯微鏡下觀察，計算 每一排中出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的孔數(shù)；D、 Karbers公式計算病毒滴度(T=101+d(s—Q'5)—a7pfU/ml， c^稀釋倍數(shù)的 對數(shù)；S4日性率之和)。重組腺病毒的鑒定采用Qiagen基因組DNA抽提試劑盒提取重組腺病毒DNA， PCR反應(yīng)鑒定。A、 PCR反應(yīng)引物上游弓l物5'-ggatttccaagtctccac-3' 下游弓l物5'-agcaccttccagatctgc-3'B、 PCR反應(yīng)體系c、Adv-shEGFR 上游引物(20pm/"l) 下游引物(20pm/y 1) IOX緩沖液10mM dNTPTaq DNA聚合酶(5U/u 1) 去離子水 PCR反應(yīng)條件95°C， 3分鐘 95°C， 40秒 58°C， 40秒 72。C， 60秒 72°C， 30秒2. 0 1 0. 5 u 1 0. 5 u 1 2.0 u 1 0. 5 ul 0.5 ul 補(bǔ)足體積至20l個循環(huán)35個循環(huán) l個循環(huán)實施例3重組腺病毒感染效率的測定1. 細(xì)胞準(zhǔn)備以5X10V孔的密度將人肺腺癌細(xì)胞A549接種至6孔板，次 日匯合率達(dá)50%左右；2. 使用感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)分別為10、 20、 30、 50、 100的重組腺病毒(使用含2%胎牛血清的培養(yǎng)基稀釋)和細(xì)胞共培養(yǎng)；3. 37°C、 5% C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-8小時，去上清，加入常規(guī)培養(yǎng)基繼 續(xù)培養(yǎng)48-72小時；4. 去除培養(yǎng)基，PBS漂洗；5. 去除PBS， 0.25%戊二醛室溫固定15分鐘；6. 去固定液，PBS漂洗3X5分鐘；7. 使用e -半乳糖苷酶原位染色試劑盒進(jìn)行X-gal染色。 a.染色工作液配制e -半乳糖苷酶染色液A 10. 0 u 1 e-半乳糖苷酶染色液B 10.0 ul e-半乳糖苷酶染色液C 930.0 ulX-gal 50.0 ulb.將上述工作液lml加入上述固定好的細(xì)胞中，37'C孵育20分鐘甚至 更長時間，直至部分細(xì)胞顏色變藍(lán)，孵育時間不超過24小時。使用腺病毒通過不同MOI值感染細(xì)胞，X-gal染色后發(fā)現(xiàn)感染A549、 SPC-Al， MOI值分別為IO， 30時，約90%以上細(xì)胞呈藍(lán)色，而隨著MOI值的 增加，細(xì)胞藍(lán)染數(shù)無明顯增加，細(xì)胞死亡數(shù)增加。實施例4重組腺病毒阻斷EGFR基因表達(dá)效率分析重組腺病毒體外轉(zhuǎn)染人肺腺癌細(xì)胞A549和SPC-Al，分別在轉(zhuǎn)染3天、6天 進(jìn)行EGFR mRNA、蛋白水平的檢測。Adv-shEGFR體外感染肺腺癌細(xì)胞A549和SPC-Al。定量PCR檢測EGFR基因 mRNA表達(dá)變化感染Adv-shEGFR 3天后，對A549, SPC-Al細(xì)胞中EGFR mRNA 水平的抑制率分別達(dá)81. 2%和79. 8%。免疫熒光染色檢測感染Adv-shEGFR前后細(xì) 胞EGFR表達(dá)變化(圖2)。免疫印跡檢測，感染Adv-shEGFR 3天和6天后，與 感染Adv-shNEG組相比，A549細(xì)胞EGFR蛋白水平抑制率分別為52. 3%和80. 2%， SPC-A1細(xì)胞EGFR蛋白水平抑制率分別為45. 5%和85. 8% (圖3)。實施例5體內(nèi)實驗驗證靶向EGFR的小干擾RNA重組腺病毒的抗腫瘤活性 收集對數(shù)生長期細(xì)胞A549, SPC-Al細(xì)胞，PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至1 X 107ml。 消毒裸小鼠右下肢皮膚，細(xì)胞懸液200iU注射入右下肢皮下。待成瘤鼠局部瘤 體生長至5mm時，隔日于瘤體內(nèi)多點注射重組腺病毒10 fu/瘤體(病毒使用 3M蔗糖/PBS稀釋)。隔日測量腫瘤的最長徑(a)和最短徑(b)，按公式求出腫 瘤體積V-ab2/2。根據(jù)公式計算抑瘤率=U-實驗組腫瘤平均體積/對照組腫瘤 體積)X100%。實驗結(jié)束后，處死小鼠，取出腫瘤組織，部分組織中性甲醛固定， 石蠟包埋，制備切片，免疫組織化學(xué)法檢測A549腫瘤組織(圖4)和SPC-Al腫 瘤組織(圖5)中EGFR、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)表達(dá)；部分組織以免疫印跡檢測腫瘤組織中EGFR表達(dá)。免疫印跡測定A549、 SPC-A1腫瘤組織EGFR蛋白表達(dá)的抑制率分別為51. 5% 和44. 8% (圖6)。測量腫瘤體積，計算腫瘤抑制率分別達(dá)62. 8%和52. 4% (圖7)。
權(quán)利要求
1. 靶向表皮生長因子受體的小干擾RNA重組腺病毒，其特征是在腺病毒載體中，插入了靶向表皮生長因子受體的下述小干擾RNA表達(dá)模板5’-TCGAGGGAGCTGCCCATGAGAAATTTCAAGAGAATTTCTCATGGGCAGCTCCTT A-3’3’CCCTCGACGGGTACTCTTTAAAGTTCTCTTAAAGAGTACCCGTCGAGGAA TGATC-5’。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向表皮生長因子受體的小干擾RNA重組腺病毒，其特征是所述的腺病毒載體是pSilencer adeno 1. 0-CMV腺病毒載體系統(tǒng)。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向表皮生長因子受體的小干擾RNA重組腺病毒的制 備方法，其特征是包括下述步驟1) 構(gòu)建和鑒定靶向表皮生長因子受體的小干擾RNA穿梭載體， 包括設(shè)計及合成小干擾RNA DNA表達(dá)模板5' -TCGAGGGAGCTGCCCATGAGAAATTTCAAGAGAATTTCTCATGGGCAGCTCCTT A-3' 3， -CCCTCGACGGGTACTCTTTMAGTTCTCTTAAAGAGTACCCGTCGAGGAA TGATC-5' 所述寡核苷酸退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)； 表達(dá)模板與穿梭載體連接；穿梭載體轉(zhuǎn)化，測序鑒定，提取穿梭載體，得靶向表皮生長因子受體的小干 擾RNA穿梭載體；2) 重組及鑒定腺病毒包括穿梭載體和骨架載體線性化；釆用磷酸鈣法將線性化的穿梭載體和骨 架載體共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，發(fā)生同源重組，得靶向表皮生長因子受體的小干擾RNA 重組腺病毒。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征是所述的步驟1的測序鑒定引物為上游弓l物5'-ggatttccaagtctccac-3' 下游弓l物5'-agcaccttccagatctgc-3'。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征是所述的步驟1的靶向表皮生長因 子受體的小干擾RNA穿梭載體，其中，修飾的CMV啟動子驅(qū)動小干擾RNA表達(dá)， 由修飾的SV40 polyA signal作為終止子。2
6、權(quán)利要求1的靶向表皮生長因子受體的小干擾RNA重組腺病毒在制備抑制腫 瘤生長藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及靶向表皮生長因子受體的小干擾RNA重組腺病毒及其在抑制人肺腺癌細(xì)胞體內(nèi)生長中的作用。本發(fā)明使用腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建shuttle vector-穿梭載體和backbone vector-骨架載體在包裝細(xì)胞293細(xì)胞中發(fā)生同源重組，得到預(yù)期的復(fù)制缺陷型重組腺病毒。本發(fā)明針對肺癌治療和基因調(diào)節(jié)技術(shù)的難點，構(gòu)建小干擾RNA病毒表達(dá)載體，不僅可提高小干擾RNA導(dǎo)入效率，還可延長RNA干擾效應(yīng)的時間。通過動物體內(nèi)實驗驗證了小干擾RNA重組腺病毒能產(chǎn)生RNA干擾效應(yīng)，下調(diào)EGFR表達(dá)，抑制腫瘤生長。
文檔編號C12N15/861GK101225403SQ20071003658
公開日2008年7月23日 申請日期2007年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月17日
發(fā)明者新 張, 莉 白, 白春學(xué), 蓉 祝 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院