專利名稱：固態(tài)發(fā)酵微生物總dna提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA提取方法，具體涉及固態(tài)發(fā)酵中微生物總DNA提取方法。
技術(shù)背景固態(tài)發(fā)酵是指利用自然底物做碳源及能源，或利用惰性底物做固態(tài)支持物，其體系 無水或接近于無水的任何發(fā)酵過程，微生物的生長及所形成的產(chǎn)物均在基質(zhì)的表面。隨 著能源危機與環(huán)境問題的日益嚴(yán)重，固態(tài)發(fā)酵技術(shù)以其特有的優(yōu)點(如無"三廢"排放)引起 人們極大的興趣；同時充分開發(fā)利用固態(tài)發(fā)酵這一技術(shù)來生產(chǎn)人們所需發(fā)酵產(chǎn)品，已受 到世界各國科技工作者的關(guān)注；而微生物在固態(tài)發(fā)酵過程中扮演十分重要的角色。因此， 研究固態(tài)發(fā)酵中微生物的生物多樣性和菌落演替情況，將有助于我們更深入地了解固態(tài) 發(fā)酵發(fā)生的機理，從而更好地實現(xiàn)對其技術(shù)的控制和優(yōu)化。目前，研究固態(tài)發(fā)酵樣中微生物菌落的多樣性以及菌落演替主要運用傳統(tǒng)的顯微鏡 法、平板法和biolog法，而這些方法都借助于微生物培養(yǎng)法，這必將導(dǎo)致失去很多非培 養(yǎng)性物種信息，從而使研究不全面。然而建立在分子生物學(xué)技術(shù)上研究微生物菌落的多 樣性以及菌落演替，克服了微生物的不可培養(yǎng)性，為研究固態(tài)發(fā)酵樣中微生物菌落的多 樣性以及菌落演替提供了新的途徑。在大多數(shù)的分子生物學(xué)技術(shù)的研究中，關(guān)鍵在DNA的提取。目前用于DNA提取的 方法很多，但主要集中于細(xì)菌DNA的提取，相對比較簡單。但是可以同時提取細(xì)菌、放 線菌、真菌DNA的方法卻比較罕見。因此，尋找一種可以同時提取細(xì)菌、放線菌、真菌 DNA的方法，對于固態(tài)發(fā)酵樣中全面了解這三種菌的菌落變化是非常必要的。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種可以同時提取細(xì)菌、放線 菌、真菌DNA的方法，以全面了解固態(tài)發(fā)酵樣中微生物的多樣性，從而更好的發(fā)揮微生 物資源在固態(tài)發(fā)酵中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過以下方案實現(xiàn)一種固態(tài)發(fā)酵微生物總DNA提取方法，包括以下步驟a. 樣品的洗滌固態(tài)發(fā)酵樣須用O.IM磷酸鹽緩沖液洗滌三次；b. DNA的提取往上述洗滌后的固態(tài)發(fā)酵樣中加入異丙醇，用超聲波冰浴超聲，樣 品破碎以后，高速離心至樣品完全沉淀，去上清液；往沉淀中加入十六垸基三甲基溴化 胺(CTAB)抽提液，65'C水浴完全反應(yīng)后，加入等體積的氯仿一異戊醇，高速離心至沉 淀完全，并回收水相；在回收水相中加入1/10體積的CTAB-NaCl溶液，65'C水浴待完 全反應(yīng)后，加入等體積的氯仿一異戊醇，再高速離心至沉淀完全，并回收水相；在回收 水相中加入0.6倍體積的預(yù)冷異丙醇，并在-2(TC放置待充分反應(yīng)后，再高速離心至沉淀 完全，去上清液；沉淀用預(yù)冷的乙醇重復(fù)洗滌和干燥，干燥后的沉淀溶于TE緩沖液中， 得到粗提DNA;c. DNA的純化上述粗提的DNA經(jīng)純化試劑盒純化以后，在其純化產(chǎn)物中加入核 糖核酸酶，37'C水浴消化，以除去RNA 。所述每lg固態(tài)發(fā)酵樣中加入異丙醇4mL，所述超聲過程中破碎5.2s，停2.4s，振幅 45%，所述氯仿一異戊醇體積比為24 : 1，所述每lg沉淀中加入CTAB抽提液1000nL， 所述加入的CTAB抽提液中還含有體積百分?jǐn)?shù)為2%的p-巰基乙醇，所述CTAB-NaCl溶 液組成為10mg/mLCTAB; 0.7mol/LNaCl，所述異丙醇、氯仿、異戊醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)均>99%， 所述加入的核糖核酸酶終濃度為0.5pg/mL。本發(fā)明的優(yōu)點是目前，對于環(huán)境樣品的分子生態(tài)學(xué)的研究主要集中于細(xì)菌的DNA 提取以及后續(xù)的研究。而環(huán)境樣品中微生物種類是非常豐富的，僅對其中的細(xì)菌菌落進(jìn) 行多樣性分析是不夠的，也要對其他幾類菌以及相互作用進(jìn)行分析。因此有必要尋找一 種能獲得真實反映原環(huán)境樣品中微生物實際組成狀況的總DNA的方法，并隨后可利用于 酶切、連接、PCR和梯度凝膠電泳以及建立克隆文庫和DNA序列測序，從而獲得全面的 微生物遺傳信息。本發(fā)明針對固態(tài)發(fā)酵過程是多類微生物共同作用的過程，提供了一種 可以同時、全面研究真菌、細(xì)菌、放線菌的動態(tài)變化以及其種類多樣性的途徑。此方法 可同時成功的提取固態(tài)發(fā)酵樣中細(xì)菌、放線菌、真菌的總DNA并能獲得較高、較純的DNA 產(chǎn)量，且均能成功的擴增出細(xì)菌、放線菌、真菌的目的條帶和獲得相當(dāng)高產(chǎn)量的PCR產(chǎn) 物，并可用于后續(xù)遺傳多樣性等分析。是一種快捷、比較經(jīng)濟適用的固態(tài)發(fā)酵樣微生物 總DNA提取的方法。此外本法不需要特別的儀器，實驗成本相對較低。因此本方法為研 究固態(tài)發(fā)酵樣的分子生態(tài)學(xué)研究提供了一種快捷，經(jīng)濟的方法。


圖1:粗提以后和純化以后的固態(tài)發(fā)酵樣總DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中Marker從生物公司購買的DNA分子量標(biāo)記(XDNA/Hind111)， 1， 2， 3分別代表 平行樣，數(shù)字為DNA的大小，單位為bp。圖2: PCR擴增純化DNA真菌18SrDNA產(chǎn)物和放線菌、細(xì)菌的16SrDNA產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中Marker從生物公司購買的DNA分子標(biāo)記(100bp DNA ladder), Fl-F3分別代表 真菌PCR產(chǎn)物的平行樣，Al-A3分別代表放線菌PCR產(chǎn)物的平行樣，Bl-B3分別代表細(xì) 菌PCR產(chǎn)物的平行樣，數(shù)字為DNA的大小，單位為bp。
具體實施方式
實施例1:使用本發(fā)明所述的方法對固態(tài)發(fā)酵樣進(jìn)行微生物總DNA的提取1、 固態(tài)發(fā)酵樣固態(tài)發(fā)酵樣取自5L裝實驗室規(guī)模的固態(tài)發(fā)酵罐，主要材料是洗凈、烘干后切成10 20mm長稻草180g，取自岳麓山的非污染土壤90g，以及液體基質(zhì)650ml，使其原含水率在 70% 80%之間。固態(tài)發(fā)酵罐放置于3(TC恒溫箱中，其他條件自然，培養(yǎng)30天后取樣。采 樣點位于樣品下方3cm， 一共取三個樣分別設(shè)為l， 2， 3。所述液體基質(zhì)的組成成分為KH2PO4 2.0g'I/1， MgSO4'7H2O0.5g丄"，酒石酸銨0.2 g-L'1，微量元素液70mL丄'1 ， pH自然；其中，微量元素液的成分為NaCl 1.0 g七—、 CoCl2-6H2O0.18g.L_1， Na2MoO4.2H2O0.01 g.U1 ， ZnS04.7H20 0.1 g.L_1， CaCl20.1g.I/ 、CuS。4 .5H20 0.01 g'L-、MnS04.H20 0.5 g.L" ，F(xiàn)eS04-7H20 O.lg.L-1， A1K(S04) 2.12H20 O.Olg.L"， MgSO4.7H2O3.Og-L-1 ， HBO30.01 g.L"， NTA1.5g丄隱1。2、 樣品的洗滌在提取DNA之前，對樣品進(jìn)行洗滌，以減少胞外DNA和可溶性有機物尤其是腐殖酸 類物質(zhì)的污染。將0.5g樣品加入3mL100mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH8.0)中，振蕩器以180 r/min勻速震蕩30min，然后以5500r/min離心10 min;沉淀再次洗滌后用于后續(xù)實驗。所述100訓(xùn)ol/L pH8.0磷酸鹽緩沖液為5.3 ml 0.2mol/ L KH2P04與94.7mL 0.2mol/ L K2HPO4混合后用超純水定容至200mL所得。3、 DNA的提取
在洗滌過的樣品中加入2mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99%的異丙醇，混勻后用Model450超聲波破 碎儀(Branson， USA)冰浴破碎10 min (破碎5.2 s，停2.4s，振幅45 %);破碎后的固態(tài)發(fā) 酵樣樣品以13000 r/ min，離心15min去上清液。沉淀中加入500pL CTAB抽提液(所述 CTAB抽提液組成為20mg/mL CTAB; 100mmol/L Tris-Cl， pH8.0; 20mmol/L乙二胺 四乙酸二鈉(EDTA)， pH8.0; 1.4mol/LNaCl)，所述500pLCTAB抽題液中還添加了 10pL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99%的P-巰基乙醇，在65。C水浴2個小時后，再加入500jiL體積比為24 : 1 的氯仿(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99%) —異戊醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù)〉98.5%)混合溶液，再以10000r/min，離心 10min并回收水相。在水相中加入l/10體積的CTAB-NaCl溶液(所述CTAB-NaCl溶液 組成為10mg/mL CTAB;0.7mol/LNaCl)，在65'C水浴1小時后，再加入等體積的24:1(V/V) 氯仿-異戊醇，再以10000r/min，離心10min并回收水相。水相中加入0.6倍體積-20'C預(yù) 冷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99%的異丙醇，在-20。C放置沉淀1.5h，再以10000r/min離心15min，去上 清液。沉淀用-20。C預(yù)冷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的乙醇重復(fù)洗滌和干燥。干燥后的沉淀溶于 30(^L的TE緩沖液(所述TE緩沖液含有10mMTris-Cl， pH8.0; lmMEDTA)，得到 粗提DNA。粗提DNA經(jīng)純化試劑盒純化以后(所述純化試劑盒為北京天跟生化有限公 司的普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒)，在其純化產(chǎn)物中加入終濃度為0.5 pg/mLRNaseA， 在37'C水浴消化2h,以除去RNA。4、 粗提與純化DNA片段大小的瓊脂糖凝膠電泳檢測粗提與純化DNA片段大小的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用含0.5pg/mL溴化乙淀(EB)， 瓊脂糖濃度為10mg/mL的凝膠，所用的DNA分子量標(biāo)記(Marker)為北京天跟生化有限公 司的XDNA/HindlII，所用的電泳緩沖液為1*TAE電泳緩沖液，以100V的電壓電泳25min。 電泳結(jié)束以后的凝膠在美國BIORAD公司的Gd Doc2000凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測，結(jié)果 見圖1，可以看到粗提與純化后的DNA片段的長度均約為23kb。其中1*TAE電泳緩沖液40mM Tris堿，20mM乙酸，2 mM EDTA;所述含0.5ng/mL 溴化乙淀的10mg/mL瓊脂糖凝膠lg瓊脂糖，加入100ml 1*TAE電泳緩沖液加熱溶解， 待冷卻以后，加入5pL的lOpg/mL溴化乙淀。5、 18SrDNA真菌和16SrDNA放線菌和細(xì)菌PCR擴增及產(chǎn)物檢測(1)選擇真菌的18S rDNA擴增通用引物對NU-SSU-0817(5'-TTA GCA TGG AAT AAT RRA ATA GGA-3')和NU-SSU-1196 (3'-TCT GGA CCT GGT GAG TTT CC-5')作為引
物對，擴增出18SrDNA序列的長度約為422bp。50nL的PCR反應(yīng)體系為4pL已純化DNA， 4 dNTP混合溶液(終濃度為lpmol/nL)， 引物各1.5fiL(濃度為10nM)， 10xBuffer6pL， Tag DNA聚合酶(Promege， USA)lpL(酶活 力單位2.5U)，加無菌去離子水補足至50pL。擴增條件為94 。C預(yù)變性3min;接下來是94 'C 變性30s， 55。C退火20s， 72t:延伸40s， 35個循環(huán)；72。C延伸8min，停止于4。C。(2) 選擇放線菌的16SrDNA擴增通用引物對F243(5'-GGA TGA GCC CGC GGC CTA-3')和R531(5'-CGG CCG CGG CTG CTG GCA CGT A-3')作為PCR擴增引物，該引物 對分別對應(yīng)于五lco//的16SrDNA的226 243位堿基和513 528位堿基，擴增產(chǎn)物大小 約為308bp。50nL的PCR反應(yīng)體系為8pL已純化DNA， 4 nLdNTP混合溶液(終濃度為lpmol/nL)， 引物各1.5pL(濃度為10nM)， 10 xBuffer6nL， ExT呵DNAHS熱啟動聚合酶(Promege， USA) 0.5pL(酶活力單位2.5U)，加無菌去離子水補足至50nL.擴增條件為94 。C變性30 s， 63'C退火lmin， 72'C延伸2min， 35個循環(huán)；72。C延伸10min，停止于4。C。(3) 選擇細(xì)菌16SrDNA擴增通用引物對341F(5'-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3')和 907R(5'-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3')作為引物對，該引物對分別對應(yīng)于五l co/f的 341位堿基至927位堿基，擴增長度約為586bp。50pL的PCR反應(yīng)體系為4pL己純化DNA， 4 dNTP混合溶液(終濃度為lpmol/nL)， 引物各1.5pL(濃度為l(HiM)， 10 xBuffer6pL， 7bg DNA聚合酶(Promege, USA) lnL(酶活 力單位2.5U)，加無菌去離子水補足至50pL。擴增條件為94 'C預(yù)變性5min;接下來是94 °C 變性30s， 53。C退火30s， 72'C延伸60s， 35個循環(huán)；72。C延伸8min，停止于4。C。PCR擴增產(chǎn)物都同樣采用10mg/mL瓊脂糖凝膠電泳，除所用DNA分子量標(biāo)記為北京 天跟生化有限公司的100bpDNA ladder Marker以外，其余同方法4。結(jié)果見圖2，從圖中 可以看出，真菌，放線菌細(xì)菌通用引物對均能PCR出各自的目的條帶，且擴增特異性強， 說明此法可以同時研究固態(tài)發(fā)酵樣中三大類微生物的多樣性研究以及相互演替情況。
權(quán)利要求
1、一種固態(tài)發(fā)酵微生物總DNA提取方法，包括以下步驟a.樣品的洗滌固態(tài)發(fā)酵樣須用0.1M磷酸鹽緩沖液洗滌三次；b.DNA的提取往上述洗滌后的固態(tài)發(fā)酵樣中加入異丙醇，用超聲波冰浴超聲，樣品破碎以后，高速離心至樣品完全沉淀，去上清液；往沉淀中加入十六烷基三甲基溴化胺抽提液，65℃水浴，完全反應(yīng)后，加入等體積的氯仿-異戊醇，高速離心至沉淀完全，并回收水相；在回收水相中加入1/10體積的CTAB-NaCl溶液，65℃水浴待完全反應(yīng)后，加入等體積的氯仿-異戊醇，再高速離心至沉淀完全，并回收水相；在回收水相中加入0.6倍體積的預(yù)冷異丙醇，并在-20℃放置待充分反應(yīng)后，再高速離心至沉淀完全，去上清液；沉淀用預(yù)冷的乙醇重復(fù)洗滌和干燥，干燥后的沉淀溶于TE緩沖液中，得到粗提DNA；c.DNA的純化上述粗提的DNA經(jīng)純化試劑盒純化以后，在其純化產(chǎn)物中加入核糖核酸酶，37℃水浴消化，以除去RNA。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固態(tài)發(fā)酵微生物總DNA提取方法，其特征在于所述步驟 b中每lg固態(tài)發(fā)酵樣中加入異丙醇4mL。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的固態(tài)發(fā)酵微生物總DNA提取方法，其特征在于所述 步驟b中，超聲過程中破碎5.2s，停2.4s，振幅45%。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的固態(tài)發(fā)酵微生物總DNA提取方法，其特征在于所述 步驟b中，氯仿一異戊醇體積比為24: 1。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的固態(tài)發(fā)酵微生物總DNA提取方法，其特征在于所述 步驟b中，每lg沉淀中加入CTAB抽提液1000nL，所述加入的CTAB抽提液中還含有 體積百分?jǐn)?shù)為2%的p-巰基乙醇。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的固態(tài)發(fā)酵微生物總DNA提取方法，其特征在于所述 步驟b中，異丙醇、氯仿、異戊醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)均>99%。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的固態(tài)發(fā)酵微生物總DNA提取方法，其特征在于所述 步驟b中，CTAB-NaCl溶液組成為10mg/mLCTAB， 0.7mol/LNaCl。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的固態(tài)發(fā)酵微生物總DNA提取方法，其特征在于所述 步驟c中，加入的核糖核酸酶終濃度為0.5pg/mL。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種固態(tài)發(fā)酵微生物總DNA的提取方法，包括以下幾個步驟先用磷酸鹽緩沖液洗滌樣品，再結(jié)合超聲波破碎和CTAB抽提液抽提固態(tài)發(fā)酵微生物細(xì)胞，粗提DNA經(jīng)預(yù)冷異丙醇沉淀和70％預(yù)冷乙醇洗滌，最后經(jīng)純化試劑盒純化，并用核糖核酸酶除去RNA；本發(fā)明方法能得到高產(chǎn)量的DNA，且可以同時提取細(xì)菌、放線菌、真菌DNA，從而可快捷、全面的了解固態(tài)發(fā)酵樣中微生物的多樣性。
文檔編號C12N15/10GK101148664SQ20071003567
公開日2008年3月26日 申請日期2007年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月3日
發(fā)明者宋琳玲, 曾光明, 王仁佑, 范長征, 陳耀寧 申請人:湖南大學(xué)