專利名稱：基因分型芯片及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物芯片及其制備方法與應用，特別是涉及一種基因分型芯片及其制備方法與其在對基因多態(tài)性位點進行基因型檢測中的應用。
背景技術：
生物芯片(也叫微陣列)技術最近幾年得到飛速發(fā)展(Fodor et al.，Science251767-773(1991)；Marshall et al.，Nat.Biotechnol.1627-31(1998))。應用生物芯片檢測基因表達信息的最主要優(yōu)勢之一就是高通量。例如，廣泛使用的cDNA芯片，能夠同時檢測一個樣品多個基因的表達情況。當多個探針被固定在芯片表面，用于檢測某一樣品中某些特定的靶分子時，這種芯片稱為反向雜交芯片。另一方面，芯片也能用于同時檢測不同樣品中相同的靶分子。當被檢測的多個樣品被固定在芯片表面，用一個或多個探針檢測多個樣品中某些特定的靶分子時，這種芯片稱為正向雜交芯片。
陽性對照和陰性對照的正確選擇對于正向雜交的成功非常關鍵。通常情況下，為了獲得想要的信息，一個典型的正向雜交反應需要多種檢測探針。這就給芯片的設計及其實驗結果的正確分析帶來了困難。此外，由于用于正向雜交的靶分子通常是核酸樣品通過傳統(tǒng)PCR方法擴增獲得的產(chǎn)物，所以正向雜交的敏感性有時會受到傳統(tǒng)PCR方法擴增效率的限制。
“多態(tài)性位點”或“多形性位點”，是指基因座位上特定的核酸位點，這些位點的核酸在不同群體當中可以不同。核酸序列的多態(tài)性也有多種形式。例如，單個或多個堿基的置換或多形性，堿基的缺失或插入?！盎蚍中汀被颉盎蛐蜋z測”，是指鑒定或檢測在多態(tài)性位點上的明確變化(如核酸序列的改變)。
“擴增”是指能夠優(yōu)先增加樣品中含多態(tài)性位點的那一段核酸序列的任意一種方式。核酸“擴增”指的是能導致核酸片段一個或多個拷貝形成的方法，這種方法最好是能使核酸片段呈指數(shù)倍增加。已知的此類方法有DNA特定序列的酶催化擴增反應，其中之一就是普遍應用的聚合酶鏈式反應(PCR)(Saiki et al.，1986，Science2301350-1354.)。
不對稱PCR是一種快速擴增單鏈核酸的方法。不對稱PCR與普通PCR不同，普通PCR反應中所用的一對引物濃度相同，而不對稱PCR中一條引物濃度被升高到另一引物濃度的幾倍乃至幾十倍。這樣低濃度引物首先被耗盡，后續(xù)的PCR反應依靠剩余的高濃度引物進行，繼而產(chǎn)生大量的對應于高濃度引物的DNA鏈。與此類似，在通過溫度控制的不對稱PCR(其代表另一種特定類型的不對稱PCR)中，一對Tm值差異至少10℃的引物被使用。其最初的PCR反應在Tm值低的引物也能進行退火的條件下進行，后面的PCR反應在僅Tm值高的引物才能進行退火的條件下進行。不對稱PCR導致僅互補鏈中的一條鏈被大量擴增。
PCR反應中用到的引物可以是10-50bp不同長度的核酸片段，通常為至少15個核苷酸，從而保證擴增的特異性。一般情況下，雜交引物與特定核酸序列互補的部分(或引物結合位點)需要占到引物核酸序列的90％，最好是95％或100％。通常寡核苷酸引物雜交部分的核酸序列至少為10個核苷酸，理想的最少是15個核苷酸，或20-50個核苷酸，從而盡可能的減少隨機、非特異性雜交反應的發(fā)生。此外，引物5’末端的核酸序列可以含有不與樣品或參考樣品發(fā)生互補雜交的序列，其長度可以是1-60、5-30，或8-30個核苷酸。因為這些序列對所有PCR擴增產(chǎn)物來說是相同的，它們可以作為對雜交信號進行歸一化處理的靶點。
位于人6號染色體短臂的HLA(人白細胞抗原)基因復合體是主要組織相容性復合物(MHC)的一部分。這些基因編碼調(diào)節(jié)細胞間免疫應答的細胞表面蛋白。多種多樣的I類HLA座位編碼HLA抗原，即44000道爾頓的多肽，其與細胞表面β2微球蛋白相連接。這些I類HLA分子參與細胞毒素T淋巴細胞介導的靶細胞識別過程。II類HLA座位編碼細胞表面異源二聚體，分別由29000及34000道爾頓的蛋白組成。這些II類HLA分子參與輔助T淋巴細胞介導的靶細胞識別過程。
I類HLA基因中的HLA-A，HLA-B，HLA-C座位以及II類HLA基因中的HLA-DRB，HLA-DQB，HLA-DQA，HLA-DPB及HLA-DPA座位具有高度多態(tài)性。世界衛(wèi)生組織HLA體系命名委員會認定了25個HLA-A等位基因(HLA-A-0101，A-0201等)、32個HLA-B等位基因、11個HLA-C等位基因、43個HLA-DRB等位基因、13個HLA-DQB等位基因、8個HLA-DQA等位基因、4個HLA-DPA等位基因及19個HLA-DPB等位基因(Marsh andBodmer，Immun.Genetics，31131(1990))。這種高度多態(tài)性被認為與HLA分子的功能有關。HLA基因分型在人組織器官移植、疾病診斷治療、司法鑒定、免疫學和遺傳性研究方面具有重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種對多個核酸樣品的基因多態(tài)性位點的基因型進行檢測的生物芯片。
本發(fā)明所提供的基因分型芯片，包括一套來自待測樣品的核酸片段及另一套來自多個參考樣品的核酸片段；所述核酸片段均是在完全相同的條件下，分別擴增待測樣品與參考樣品中含有多態(tài)性位點的基因片段得到的；核酸片段固定于芯片表面，且每個參考樣品都含有一個已知基因型的多態(tài)性位點。
上述基因分型芯片每個參考樣品都含有一個已知基因型的多態(tài)性位點，以其作為陽性對照來檢測樣品的基因型。并且每個參考樣品所含有的已知基因型的多態(tài)性位點各不相同，因而該芯片能為多種不同的探針提供陽性對照。本發(fā)明的芯片尤其適用于使用多個不同探針對具有不同基因型、不同多態(tài)性位點的多個樣品的檢測。
所述樣品是指預測含有目的核酸序列的材料。待測樣品可以是多種多樣的，包括生物流體，如血、血清、血漿、唾液、淋巴液、精液、陰道液、糞便、尿液、脊髓等；生物組織，如頭發(fā)、皮膚等；以及細胞培養(yǎng)類、植物、食品和法醫(yī)樣品等其它樣品。必要時，可對樣品用常規(guī)方法進行預處理，即用試劑溶解樣品及/或?qū)⑵渲械暮怂後尫懦鰜?。此外，所用樣品也可未?jīng)處理直接從目的材料中獲得，這些材料包括細菌、病毒、植物、哺乳動物(如人、靈長類動物、牛、馬、犬、貓、豬、綿羊等)等。
核酸可以是復雜混合物(如生物樣品)的一小部分，也可以是從生物樣品中分離或通過純化獲得的。“分離”或“純化”核酸分子，是指將自然條件下存在于生物體內(nèi)的核酸分子游離出來，使其呈完全自由的狀態(tài)存在。所述完全自由狀態(tài)指分子中至少有50％，優(yōu)選為70％、80％或90％呈游離狀態(tài)存在。
所述“核酸”等同于“多聚核苷酸”，是指任意核酸，無論是由脫氧核苷還是由核苷組成，無論這些核酸之間是通過磷酸二酯連接還是通過修飾過的分子(如磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸鹽、羧甲基、乙酰酸鹽、氨基甲酸鹽、硫醚、橋氨基磷酸酯、橋甲基磷酸酯、磷酸硫酸鹽、甲基磷酸鹽、二硫代磷酸鹽、橋磷酸硫酸鹽或磺基等)連接都可；此外，還可為經(jīng)至少一個糖基修飾過的，所述糖基可以是阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖或己糖等。所述核酸可以是DNA、RNA、cDNA、DNA-RNA、肽核酸(PNA)、雜合子或混合物，并可以以雙鏈、單鏈或部分雙鏈的形式存在。
所述芯片能夠檢測多個樣品基因多態(tài)性位點的基因型，如至少可用于檢測2、3、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500或1000份樣品中任意一份樣品的基因型。
所述來自樣品的核酸片段只要包括能用于基因分型的多態(tài)性位點即可，其長度是任意的，如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000bp等。所述核酸片段還可包括有多個多態(tài)性位點，如2個、3個、4個、5個或6個等。
所述芯片包含來自樣品的至少10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個核酸片段。這些核酸片段大部分各不相同，如來自不同樣品或同一樣品不同區(qū)域的核酸片段。其中一些核酸片段可能是相同的，如來自同一樣品的同一區(qū)域的擴增產(chǎn)物被固定在芯片上不同的(如2、3、4或5個等)位點上，從而增加檢測的精確度。
所述固定在芯片表面的核酸片段可通過傳統(tǒng)PCR(即對稱PCR)、套式PCR或不對稱PCR的方法擴增得到，優(yōu)選為不對稱PCR的方法。通過傳統(tǒng)或套式PCR擴增得到的核酸片段為典型的雙鏈核酸片段，這些核酸片段在被固定到芯片表面前，需通過變性步驟(如熱變性)使其形成部分單鏈。而采用不對稱PCR的方法，能夠獲得較高濃度的單鏈核酸產(chǎn)物，而高濃度的單鏈核酸產(chǎn)物在芯片雜交時能產(chǎn)生更強的雜交信號和更高的雜交效率，特別適用于基因多態(tài)性位點的基因型檢測。
本發(fā)明的芯片可用于I類或II類HLA(人白細胞抗原)基因多態(tài)性位點基因型的檢測。所述HLA基因包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB、HLA-DQB、HLA-DQA、HLA-DPB及HLA-DPA。包含上述HLA基因中任一基因的核酸片段可用上述方法制備。
為檢測樣品中目標核酸的基因型，可將目標核酸與對照核酸相比較。“對照”指已知其多態(tài)性位點基因型的已知樣品。對照(參考樣品)可以是自然存在的樣品，也可以是自然存在樣品的人工修飾產(chǎn)物。例如，對照可以是以本發(fā)明描述的方法或其它目前已知的方法已經(jīng)作過基因分型的樣品。
作為本發(fā)明的一個方面，所述生物芯片包括來源于多個參考樣品的第二套核酸片段。其典型特征是，第二套核酸片段與部分或全部來源于多個樣品的第一套核酸片段相關。如果核酸片段是同樣的，或不能確定兩序列間(如多態(tài)性位點)的差異，則核酸片段間可以是相關的。
第二套核酸片段用參考樣品制備得到，并采用與制備待測樣品核酸片段相同的擴增方法及條件。例如，相同的引物可用于待測樣品和參考樣品的擴增反應中。擴增反應也可以采用相同的熱循環(huán)。由于第二套核酸片段的制備方法與第一套核酸片段制備方法相同，由整個環(huán)境導致的不同樣品間的變化可以降到最低。因而參考樣品，特別是來源于參考樣品的核酸片段，能夠作為待測樣品的很好的陽性對照。此外，對于每一個用于檢測特定基因型的探針，除了特定基因型的參考樣品(特別是來源于參考樣品的核酸片段)，包含已知基因型的參考樣品(特別是來源于參考樣品的核酸片段)也能夠很好地作為檢測的陰性對照。這樣，所有參考樣品能夠整體地作為一個很好的指示器來監(jiān)測生物芯片體系是否以預期的方式在起作用。
來源于參考樣品的核酸片段只要包括已知基因型所在的多態(tài)性位點即可，其長度是任意的，如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000bp等。通常情況下，參考樣品的核酸片段僅包含一個多態(tài)性位點，但也可包括有多個多態(tài)性位點，如2個、3個、4個、5個或6個等。
所述芯片可包含來源于參考樣品的至少10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000種核酸片段。這些核酸片段大部分各不相同，如來自不同參考樣品或同一參考樣品不同區(qū)域的核酸片段。其中一些核酸片段可能是相同的，如來自同一參考樣品的同一區(qū)域的擴增產(chǎn)物被固定在芯片上不同的(如2、3、4或5個等)位點上，從而增加檢測的精確度。這些核酸片段可以是雙鏈或單鏈的。
所述芯片還可包含來源于多個參考樣品的核酸片段，參考樣品的最少數(shù)目可為10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100。
當本發(fā)明的芯片用于I類或II類HLA(人白細胞抗原)基因多態(tài)性位點基因型的檢測時，參考樣品為不同的HLA標準樣品。多種多樣的HLA標準樣品為目前所知的標準樣品。例如，國際HLA數(shù)據(jù)庫(http//www.ebi.ac.uk/imgt/hla)提供了多種HLA標準樣品的信息。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種上述基因分型芯片的制備方法。
本發(fā)明所提供的制備方法，包括以下步驟1)用PCR方法擴增待測樣品和參考樣品中含有多態(tài)性位點的特定區(qū)域，得到一套核酸片段；2)將步驟1)獲得的核酸片段固定在微陣列基片上，得到基因分型芯片。
所述PCR方法優(yōu)選為不對稱PCR方法。不對稱PCR擴增所用的上游引物及下游引物的摩爾比率可為1∶12.5-100，優(yōu)選的摩爾比率為1∶12.5。不對稱PCR擴增的循環(huán)數(shù)至少為30個，優(yōu)選的循環(huán)數(shù)為30-40個。
本發(fā)明的芯片可用于HLA(人白細胞抗原)基因多態(tài)性位點基因型的檢測，包括I類或II類HLA基因多態(tài)性位點的基因型檢測。所述HLA基因包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB、HLA-DQB、HLA-DQA、HLA-DPB及HLA-DPA。當檢測HLA-DRB基因多態(tài)性位點的基因型時，芯片上固定的核酸片段是HLA基因復合體中的HLA-DRB基因片段，該核酸片段可由下述引物對(序列表中的SEQ ID №1和SEQ ID №2)擴增得到上游引物(PMH_0303047a)5’-GATCCTTCGTGTCCCCACAGCAC-3’下游引物(PMH_0303048d)5’-CGCTGCACTGTGAAGCTCTCAC-3’。
本發(fā)明所提供的芯片還可包括更多的對照。例如，當樣品是核酸樣品時，芯片上可以包括雜交反應的陽性對照。其雜交反應的陽性對照可以是包含探針所對應目標位點的任意核酸。由陽性對照位點產(chǎn)生的陽性信號將顯示出雜交反應是成功的。在這點上，雜交反應的陽性對照不同于來源于對照樣品的核酸片段。因為，來源于對照樣品的核酸片段典型地相關于來源于樣品的核酸片段，而雜交反應的陽性對照可以是任意不相關的分子，只要其能夠被探針識別即可。芯片還可以包括空白對照，如空白緩沖液等，以及針對于固定步驟的質(zhì)量對照，如將一種經(jīng)標記的寡核苷酸探針固定于芯片表面，此探針信號可以作為固定質(zhì)量的指示器。
本發(fā)明的生物芯片可以是目前所知的任一種生物芯片，其形式包括膜生物芯片(如硝化纖維膜，尼龍膜)、過濾器生物芯片、針生物芯片和微珠生物芯片(如在一液體的漿狀物中)等。本質(zhì)上而言，能夠經(jīng)受特定表達分析試驗所需的試劑及反應條件的任意固相支持物都可以被采用。例如，職能化玻璃、硅、二氧化硅、修飾硅、玻璃、石英玻璃、塑料、陶瓷、橡膠、金屬、任意種類聚合體，如(聚)四氟乙烯、偏二氟乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、或其中的聯(lián)合體都可以作為固相芯片的基質(zhì)。
可采用目前已知的多種方法將樣品及對照樣品固定于芯片表面，如可利用化學反應基團或者生物分子將前述的核酸片段固定于芯片基質(zhì)表面。所述化學反應基團，如-CHO、-NH2、-SH、-S-S-、環(huán)氧基和甲苯磺酰基等；生物分子如生物素、鏈霉親和素、親和素、his-tag、strept-tag、組氨酸以及蛋白A等。較為典型的方法是，將核酸樣品與二甲基亞砜等量混合并放入多孔微量滴定板中，滴定板可放置于Gen III芯片點樣儀中并在表面硅烷化的光學玻璃基片上點樣，然后將基片空氣干燥，再經(jīng)紫外線照射即可。用此方法制備的芯片可以立即使用，也可干燥儲存待用。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種應用上述基因分型芯片對多個樣品的基因多態(tài)性位點進行基因型檢測的方法。
本發(fā)明所提供的檢測方法，可包括以下步驟1)制備探針，所述探針至少能夠檢測一個參考樣品多態(tài)性位點的已知基因型；2)將一條經(jīng)標記的探針與上述基因分型芯片雜交；3)將每個待測樣品的雜交信號與至少一個參考樣品的雜交信號進行比較，確定每個待測樣品在某個多態(tài)性位點的基因型。
在上述檢測方法中，通過將待測樣品的雜交信號與參考樣品的雜交信號進行比較確定每個樣品多態(tài)性位點某種基因型的存在與否。例如，如果探針能檢測出已知基因型的參考樣品的核酸片段，同時又檢測出一個待測樣品的核酸片段，那么就可以確定待測樣品與參考樣品具有同樣的基因型。來源于每個待測樣品的核酸片段的雜交信號與至少一個參考樣品核酸片段的檢測信號相比較，通過總體的比較結果確定樣品的基因型。
所述探針可以是能夠檢測多態(tài)性位點基因型的任何分子。這些探針可包括能夠識別多態(tài)性位點的人工合成寡核苷酸、cDNA、RNA、PNA、蛋白或抗體。通常情況下，待測樣品為核酸時，所述探針可為一段單鏈核酸，包含有互補于具有特定基因型的多態(tài)性位點的序列。探針長度可以是適于檢測的任意長度，例如當探針是核酸時，其長度可為10-100bp。
探針被能夠產(chǎn)生可檢測信號的可檢測基團以直接或間接的方式標記。信號在檢測前也可以用現(xiàn)有已知方法進行放大?？蓹z測信號的出現(xiàn)顯示出樣品中相應靶標的存在。對探針進行標記的方式是多種多樣的，如放射標記、化學標記、酶學標記、發(fā)光標記、膠體金標記加銀染放大、磁珠標記、熒光共振能量轉移標記等。雜交信號在檢測前也可以進行進一步的放大。檢測方法為現(xiàn)有已知方法，例如，芯片可以被芯片掃描儀掃描，如被博奧生物公司的LuxScan 10K芯片掃描儀掃描。
當進行不同基因型的檢測時，多個探針(如2、3、4、5、6、7、8、9或10個等)可與芯片同時作用(如在幾分鐘內(nèi))，此時，不同的探針可以被不同的檢測基團直接或間接地標記，從而實現(xiàn)同時檢測；此外，多個探針還可與芯片作用于不同時間(如幾分鐘、幾天、幾周、幾月的時間間隔)，芯片可以被重復利用數(shù)次，即先以一個或一組特定的探針檢測靶標，經(jīng)清洗、裸露、干燥后，再以另外一個或一組探針檢測靶標。
上述檢測方法可用于檢測單核苷酸多態(tài)性(“SNP”)。HLA-B座位一個多態(tài)性位點的基因序列如圖7所示，其中一個單核苷酸序列差異可用上述方法檢測出來。這些序列也可用作探針以檢測其它多態(tài)性位點。
本發(fā)明提供了一種基因分型芯片?？捎帽景l(fā)明的芯片對多個未知樣品的基因多態(tài)性位點進行簡單、精確的基因分型。該芯片制備方法簡便，具有工業(yè)化生產(chǎn)的可行性。本發(fā)明將在未知樣品的基因多態(tài)性位點的基因分型中發(fā)揮重要作用。
下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。


圖1為玻璃基片上HLA樣品(圖中未標記)、HLA標準品(S1-S52)、QC(Hex)、PC和BC的排布樣式圖2為根據(jù)探針序列和HLA標準品的基因型得出的理論雜交圖譜圖3為真實的雜交圖譜圖4為不對稱PCR的反應原理5A為對稱PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖5B為不對稱PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖5C為套式PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖6為三種不同PCR反應產(chǎn)物的雜交信號柱形7為HLA-B座位一個多態(tài)性位點的基因序列具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用引物及核酸序列均由上海博亞生物技術公司合成。
實施例1、對多個HLA樣品進行基因分型的芯片的制備及其檢測用酚-氯仿的方法從血樣抽提，得到85份待測DNA樣品。52份標準HLA樣品是從國際分型組織(也稱國際組織相容性工作組，IHWG)得到的，所述標準HLA樣品如表1所示
表1標準HLA樣品


用于擴增含有HLA-A位點的目的基因片段的引物序列如下HLA-AF(上游引物)5’-GGCCTCCCCAGACGCCGAGGATGGC-3’HLA-AR(下游引物)5’-CGGGTCCCGTGGCCCCTGGTACCC-3’。
然后，分別以待測樣品和標準HLA樣品為模板，在上述引物的引導下，進行常規(guī)不對稱PCR擴增。反應結束后，回收并純化PCR擴增產(chǎn)物，將其固定在表面硅烷化的光學玻璃基片上。此外，點在玻璃基片上的核酸片段還有用于對固定化過程進行質(zhì)量控制的質(zhì)控探針(QC)，其序列為5’-TTTTTTTTTTTGTCTTCCACCAGGAGTCAGCAG-3’(HEX)，用于對雜交過程進行質(zhì)控的陽性質(zhì)控探針(PC)，其序列為5’-TTTTTTTTTTAAAGTTAAAGCAGACCGAAGTGGATTGCGAGTATTTGAAAAGATGTGTTGAGAAATTAACGGAAGAGAA-3’，空白陰性對照(BC)，其成分是50％DMSO。玻璃基片上HLA樣品(圖中未標記)、HLA標準品(S1-S52)、QC(Hex)、PC和BC的排布樣式如圖1所示。
將一條oligo探針(濃度20nM)和上述制備的芯片進行雜交，探針序列為(A07601)5’-CCGAGCGAACCTGGGGACC-3’，根據(jù)探針序列和HLA標準品的基因型得出的理論雜交圖譜如圖2所示，真實的雜交圖譜如圖3所示，所有QC、PC、BC和HLA標準品的真實雜交圖譜都和理論預期的完全一致。另外，在未知樣品中有些樣品顯示出了陽性信號，表明它們和顯示陽性信號的標準HLA樣品含有相同的一段基因序列，基因型相同。
實施例2、對多個HLA樣品的HLA-DRB1位點進行基因分型的芯片的制備及檢測不同PCR方法對檢測結果的影響本實施例主要檢測對稱PCR、不對稱PCR和套式PCR三種不同的PCR方法對本發(fā)明芯片檢測結果的影響。所用標準HLA樣品購自國際分型組織(IHWG)。分別用對稱PCR、不對稱PCR和套式PCR擴增標準HLA樣品的含有HLA-DRB1位點的核酸片段，三種PCR所用的引物序列如下對稱PCR引物PMH-DF(上游引物)5’-GATCCTTCGTGTCCCCACAGCAC-3’PMH-DR(下游引物)5’-CGCTGCACTGTGAAGCTCTCAC-3’；不對稱PCR引物PMH_0303047a(上游引物)5’-GATCCTTCGTGTCCCCACAGCAC-3’PMH_0303048d(下游引物)5’-CGCTGCACTGTGAAGCTCTCAC-3’；套式PCR(NP-PCR)引物PMH-HLA-DF(上游引物)5’-CCGGATCCTTCGTGTCCCCACAGCACG-3’PMH-HLA-DRU(下游引物)5’-TCACTTGCTTCCGTTGAGGCCGCTGCACTGTGAAGCTCT-3’；通用引物PMH-HLA-U15’-TCACTTGCTTCCGTTGAGG-3’。
以標準HLA樣品為模板，并分別在上述不同引物對的引導下，進行PCR擴增。對稱PCR反應體系為(100μl)10×PCR緩沖液10μl，2.5mM dNTP 8μl，10μM上、下游引物各4μl，5U/μl Taq 1μl，模板DNA 1μl，ddH2O 72μl。對稱PCR反應條件為先96℃3分鐘，96℃25秒，66℃30秒，72℃30秒，共30個循環(huán)；然后72℃5分鐘；最后4℃保溫。不對稱PCR反應體系為(100μl)10×PCR緩沖液10μl，2.5mM dNTP 8μl，50μM上游引物4μl，1μM下游引物16μl，5U/μl Taq 1μl，模板DNA 1μl，ddH2O 60μl。不對稱PCR反應條件為先96℃3分鐘，96℃25秒，66℃30秒，72℃30秒，共40個循環(huán)；然后72℃5分鐘；最后4℃保溫。套式PCR反應體系為(100μl)10×PCR緩沖液10μl，2.5mM dNTP 8μl，10μM上、下游引物各3μl，50μM通用引物2μl，5U/μl Taq 1μl，模板DNA 1μl，ddH2O 72μl。套式PCR反應條件為先96℃3分鐘，96℃25秒，66℃30秒，72℃30秒，共25個循環(huán)；然后96℃25秒，50℃30秒，72℃30秒，共15個循環(huán)；最后72℃5分鐘，4℃保溫。不對稱PCR的反應原理圖如圖4所示，在不對稱PCR反應的前20-25個循環(huán)中，上、下游引物(引物A和引物B)產(chǎn)生雙鏈DNA。單鏈DNA一般在25個循環(huán)后的反應中產(chǎn)生，此時限制性的引物B已經(jīng)基本消耗完畢，體系中只剩下引物A，使得單鏈DNA(ssDNA)呈線性快速積累。本實施例不對稱PCR反應中的上、下游引物比例是200pmol∶16pmol，經(jīng)過35-40個循環(huán)有2-6pmol的單鏈DNA產(chǎn)物產(chǎn)生。反應結束后，回收三種PCR反應的擴增產(chǎn)物，并用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(編號03010，Millipore，馬薩諸塞州)進行純化，對純化產(chǎn)物進行的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖5A-圖5C所示(泳道M表示DL2000 DNA marker(Takara，Bio Inc Dalian，China)；圖5A和圖5C中的泳道N表示空白對照；圖5A中的泳道Sym表示對稱PCR擴增產(chǎn)物；圖5B中的泳道4-1，4-2，4-3，4-4表示不對稱擴增的四次重復，泳道4-N表示空白對照；圖5C中的泳道Tao-1和Tao-2表示套式PCR擴增的兩次重復)，檢測結果表明不對稱PCR能顯著提高PCR產(chǎn)物中的單鏈分子的量。將純化的三種PCR產(chǎn)物溶解于50％DMSO中，然后將其固定在氨基修飾的玻片(AminoSlideTM，博奧公司，北京)表面，每種PCR產(chǎn)物分別按100ng/ul、150ng/ul和200ng/ul的濃度進行固定，固定化是通過紫外交聯(lián)儀(Bio-Rad)進行的。然后將一條探針(濃度50nM)和上述制備的芯片進行雜交，探針序列如下通用探針Cy55’-CGACAGCGACGTGGGGGA-3’；特異性探針TAMRA5’-AGaGGAGGCGGGCCGCCGAGG-3’探針在與基因芯片雜交前用熒光素TAMRA和Cy5進行標記(由上海博亞生物技術公司合成)，雜交后的芯片經(jīng)過洗滌后用芯片掃描儀(GSI Lumonics)進行檢測，檢測結果如圖6所示(每一種PCR反應柱形圖中的3條柱分別代表固定在芯片上的三種不同濃度的PCR產(chǎn)物，分別為100ng/ul、150ng/ul和200ng/ul)，表明不對稱PCR產(chǎn)物的雜交信號顯著高于傳統(tǒng)PCR和套式PCR方法得到的PCR產(chǎn)物，故將不對稱PCR定為制備本發(fā)明芯片時優(yōu)選的核酸片段的擴增方式。
序列表<160>2<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1gatccttcgt gtccccacag cac 23<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2cgctgcactg tgaagctctc ac 2權利要求
1.一種基因分型芯片，包括一套來自待測樣品的核酸片段及另一套來自多個參考樣品的核酸片段；所述核酸片段均是在完全相同的條件下，分別擴增待測樣品與參考樣品中含有多態(tài)性位點的基因片段得到的；核酸片段固定于芯片表面，且每個參考樣品都含有一個已知基因型的多態(tài)性位點。
2.根據(jù)權利要求1所述的基因分型芯片，其特征在于所述參考樣品為雙鏈或單鏈核酸。
3.根據(jù)權利要求1所述的基因分型芯片，其特征在于所述參考樣品中至少有一個是自然存在的樣品。
4.根據(jù)權利要求1所述的基因分型芯片，其特征在于所述參考樣品中至少有一個是自然存在樣品的人工修飾產(chǎn)物。
5.根據(jù)權利要求1所述的基因分型芯片，其特征在于所述另一套來自多個參考樣品的核酸片段至少來自于10個參考樣品。
6.根據(jù)權利要求5所述的基因分型芯片，其特征在于所述另一套來自多個參考樣品的核酸片段至少來自于30個參考樣品。
7.根據(jù)權利要求6所述的基因分型芯片，其特征在于所述另一套來自多個參考樣品的核酸片段至少來自于50個參考樣品。
8.根據(jù)權利要求1所述的基因分型芯片，其特征在于所述來自待測樣品的核酸片段及另一套來自多個參考樣品的核酸片段均為包含某個HLA基因的多態(tài)性位點的核酸片段。
9.根據(jù)權利要求8所述的基因分型芯片，其特征在于所述HLA基因包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB、HLA-DQB、HLA-DQA、HLA-DPB和HLA-DPA。
10.根據(jù)權利要求8或9所述的基因分型芯片，其特征在于所述參考樣品為HLA的標準樣品。
11.根據(jù)權利要求1所述的基因分型芯片，其特征在于所述來自多個參考樣品的核酸片段中至少有兩個來自于同一個參考樣品。
12.根據(jù)權利要求1所述的基因分型芯片，其特征在于所述基因分型芯片中的核酸片段是用不對稱PCR方法擴增的。
13.一種權利要求1所述的基因分型芯片的制備方法，包括以下步驟1)用PCR方法擴增待測樣品和參考樣品中含有多態(tài)性位點的特定區(qū)域，得到一套核酸片段；2)將步驟1)獲得的核酸片段固定在微陣列基片上，得到基因分型芯片。
14.根據(jù)權利要求13所述的制備方法，其特征在于所述固定在微陣列基片上的核酸片段還包括一個或多個來自雜交反應陽性對照、雜交反應陰性對照和固定化質(zhì)控對照的核酸片段。
15.根據(jù)權利要求13或14所述的制備方法，其特征在于所述核酸片段是用不對稱PCR方法擴增得到的。
16.根據(jù)權利要求15所述的制備方法，其特征在于所述不對稱PCR擴增所用的上游引物及下游引物的摩爾比率為1∶12.5-100。
17.根據(jù)權利要求16所述的制備方法，其特征在于所述不對稱PCR擴增所用的上游引物及下游引物的摩爾比率為1∶12.5。
18.根據(jù)權利要求15所述的制備方法，其特征在于所述不對稱PCR擴增的循環(huán)數(shù)為30-40個。
19.根據(jù)權利要求15所述的制備方法，其特征在于所述來自待測樣品的核酸片段及來自多個參考樣品的核酸片段為包含某個HLA基因的多態(tài)性位點的核酸片段。
20.根據(jù)權利要求19所述的制備方法，其特征在于所述HLA基因包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB、HLA-DQB、HLA-DQA、HLA-DPB和HLA-DPA。
21.根據(jù)權利要求20所述的制備方法，其特征在于所述HLA基因為HLA-A基因。
22.根據(jù)權利要求21所述的制備方法，其特征在于所述用于擴增待測樣品和參考樣品包含HLA-A基因的多態(tài)性位點的核酸片段的引物為序列表中的SEQ ID №1和SEQ ID №2。
23.一種用權利要求1所述的基因分型芯片對多個樣品的基因多態(tài)性位點進行基因型檢測的方法，包括以下步驟1)制備探針，所述探針至少能夠檢測一個參考樣品多態(tài)性位點的已知基因型；2)將一條經(jīng)標記的探針與上述基因分型芯片雜交；3)將每個待測樣品的雜交信號與至少一個參考樣品的雜交信號進行比較，確定每個待測樣品在某個多態(tài)性位點的基因型。
24.根據(jù)權利要求23所述的檢測方法，其特征在于所述探針的數(shù)目至少為2個。
25.根據(jù)權利要求24所述的檢測方法，其特征在于所述多個探針同時和芯片進行雜交。
26.根據(jù)權利要求24所述的檢測方法，其特征在于所述多個探針先后連續(xù)地和芯片進行雜交。
27.根據(jù)權利要求23所述的檢測方法，其特征在于所述探針為單鏈核酸。
28.根據(jù)權利要求23所述的檢測方法，其特征在于所述探針是用不對稱PCR方法擴增得到的。
29.根據(jù)權利要求28所述的檢測方法，其特征在于所述不對稱PCR擴增所用的上游引物及下游引物的摩爾比率為1∶12.5-100。
30.根據(jù)權利要求29所述的檢測方法，其特征在于所述不對稱PCR擴增所用的上游引物及下游引物的摩爾比率為1∶12.5。
31.根據(jù)權利要求28或29或30所述的檢測方法，其特征在于所述不對稱PCR擴增的循環(huán)數(shù)為30-40個。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基因分型芯片及其制備方法與應用。其目的是提供一種基因分型芯片及其制備方法與其在對基因多態(tài)性位點進行基因型檢測中的應用。該芯片包括一套來自待測樣品的核酸片段及另一套來自多個參考樣品的核酸片段；所述核酸片段均是在完全相同的條件下，分別擴增待測樣品與參考樣品中含有多態(tài)性位點的基因片段得到的；核酸片段固定于芯片表面，且每個參考樣品都含有一個已知基因型的多態(tài)性位點。本發(fā)明將在未知樣品的基因多態(tài)性位點的基因分型中發(fā)揮重要作用。
文檔編號C12Q1/68GK1834261SQ200510123228
公開日2006年9月20日 申請日期2005年11月15日 優(yōu)先權日2005年11月15日
發(fā)明者高華方, 李澤, 王棟, 劉彥華, 劉湘, 江揚洲, 趙傳贊, 李麗, 蘭更欣, 過濤, 蔡斌, 邢婉麗, 周玉祥, 程京 申請人:北京博奧生物芯片有限責任公司, 清華大學