一種微陣列生物芯片及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物芯片技術領域，尤其涉及一種微陣列生物芯片及其制備方法和應 用。
【背景技術】
[0002] 研宄小分子藥物與蛋白靶標的相互作用，對基礎科學研宄和藥物開發(fā)具有重要意 義。但在實際應用中，存在一種藥物針對多靶標相互作用的情況，如對藥物雜泛性和副作用 的研宄、先導化合物的優(yōu)化以及舊藥新用等。因此，開發(fā)一種高效的小分子-靶標相互作用 檢測方法將對靶標活性評價及藥物篩選等具有推動作用。
[0003] 在分子生物學層面，藥物開發(fā)往往需要對先導化合物/藥物與蛋白靶標之間的相 互作用信息（如動力學和親和力）進行采集和評價。近年來，表面等離子共振生物傳感器 (surfaceplasmonresonance，SPR)以免標記、高靈敏和實時監(jiān)測等優(yōu)勢，迅速發(fā)展成為研 宄小分子與蛋白靶標相互作用動力學和親和力的重要工具。目前，SPR檢測技術主要為基 于角度檢測的方法（以BIAcore系列產品為主），該方法將蛋白固定在芯片表面，流通小分 子藥物，對光學信號進行實時監(jiān)測。然而，隨著檢測樣品的多樣性以其相互作用網絡的復雜 性，要求檢測手段具有高通量和高效率的特征，這種傳統(tǒng)的"一對一"的檢測方法已經無法 滿足應用需求。
[0004] 表面等離子共振成像技術（SPRimaging，SPRi)的出現(xiàn)很好地解決了以上的通量 問題。SPRi技術采用微陣列格式和平行光檢測，可以一次性地獲得芯片表面在檢測區(qū)域內 的相互作用信息，具有"一對多"甚至"多對多"的高通量檢測優(yōu)勢。利用SPRi技術，研宄 者們開發(fā)出了高通量檢測蛋白-蛋白、多肽-多肽以及DNA-DNA相互作用的方法。然而，對 于小分子在蛋白陣列上的檢測，依舊存在著挑戰(zhàn)：①由于當前基于強度檢測的SPRi技術的 靈敏度低于角度檢測技術，加之小分子檢測時，由于其分子量低產生信號響應本身很小，使 得高通量SPRi儀器的檢測能力較低；②SPRi的數(shù)據(jù)質量與采集面積有關，通量越高會導致 樣品點面積減小，噪音增加，使得檢出困難；③當前SPRi芯片表面多采用硫醇修飾，蛋白固 定量較低，使得與之相互作用的小分子藥物也較少，信號自然很難檢出。
[0005] 針對以上問題，研宄者們主要針對儀器改良和芯片化學修飾兩個方面增強SPRi 的檢測靈敏度，以獲得在蛋白微陣列上檢測小分子的能力。例如，N.J.Tao等利用SPRi和 電化學阻抗結合，提高了SPRi的檢測靈敏度，成功在P38激酶陣列上檢測到SB203580小 分子的結合，并獲得了動力學和親和力常數(shù)（Anal.Chem. 2014, 86, 9860-9865);但該方 法只是適用于該團隊開發(fā)的儀器，在SPRi主流儀器上沒有通用性。另外，在芯片化學修 飾方面，Y.M.Wang等人在SPRi芯片表面構建了三維的聚丙烯酸（PAA)高分子刷，并采 用微接觸印刷調控高分子間的空間距離，獲得較高的蛋白固定量（App1iedSurfaceScien ce266 (201) 313-318) ;H.W.Ma等利用表面引發(fā)聚合的方法在SPR芯片表面構建了三維高分 子表面，并獲得優(yōu)化的抗原-抗體檢測信號（Chem.Commun.，2011，47,1190-1192)。但是，以 上針對芯片化學修飾的方法均未在蛋白陣列上成功檢測小分子藥物。因此，開發(fā)出在SPRi 儀器上高通量檢測小分子-蛋白相互作用的方法具有極其重要的意義。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種應用于表面等離子共振系統(tǒng)的微陣列生物芯片及其 制備方法、利用其制備的蛋白微陣列以及利用所述蛋白微陣列進行檢測的方法和在小分子 藥物檢測方面的應用。
[0007] 為達到以上目的，本發(fā)明采用如下技術路線：
[0008] 第一方面，本發(fā)明提供一種微陣列生物芯片，包括玻璃芯片基底和修飾層，所述修 飾層包括依次疊加在所述玻璃芯片基底表面的鉻層、銀和/或金層、自組裝單分子層、光交 聯(lián)劑和高分子層。
[0009] 表面等離子共振成像技術是利用光波與金屬（金和/或銀）中自由電子波產生的 共振，通過檢測共振信號來確定金屬表面生物分子相互作用情況（結合或解離），因此金和 /或銀在表面是必要條件。在玻璃芯片基底與金和/或銀之間鍍一層鉻是由于金和/或銀 與玻璃芯片基底的粘附性不好，鉻起到粘附緩沖層作用。
[0010] 另外，芯片的修飾方法大致可以分為兩類：物理層（玻璃-鉻-金和/或銀），主 要作用是激發(fā)表面等離子激元共振；化學層（自組裝單分子層-光交聯(lián)劑-高分子），其主 要用于生物分子的固定和對金屬基底的保護。其中，物理層為SPRi傳感芯片的常規(guī)技術手 段；而化學層是本發(fā)明的重點，經過本發(fā)明的方法修飾的芯片，可以有效提高生物分子在生 物芯片表面的固定量，使原來很難檢測到的小分子藥物能夠檢測出來。
[0011] 在本發(fā)明中，小分子藥物檢測的實現(xiàn)主要通過提高蛋白分子固定量，而蛋白分子 固定量主要依靠三維高分子表面的修飾，自組裝單分子層用于保護基底和提供末端活性基 團，光交聯(lián)劑起到橋連單分子層和高分子的作用。
[0012] 優(yōu)選地，所述絡層的厚度為0?l_9nm，例如可以是0?lnm、lnm、2nm、3nm、4nm、5nm、 6nm、7nm、8nm或9nm，優(yōu)選為3nm。對于絡層的厚度，本領域的技術人員可根據(jù)金屬與玻璃的 粘附性進行適當?shù)倪x擇。如果粘附性良好，也可以不加鉻層；但現(xiàn)有的技術中，二者的粘附 性一般還未達到可以省去鉻層的程度；因此，鉻層不宜太薄，以保證成膜，增加粘附性；如 果鉻層厚度太大，則不利于光波的傳導。
[0013] 優(yōu)選地，所述銀和/或金層的厚度為40_60nm，例如可以是40nm、41nm、42nm、43nm、 44nm、45nm、46nm、47nm、48nm、49nm、50nm、51nm、52nm、53nm、54nm、55nm、56nm、57nm、58nm、 59nm或60nm，優(yōu)選為47_50nm。如果厚度超過此范圍（大于60nm或小于40nm)，會導致靈 敏度下降，影響對于小分子藥物檢測的靈敏度。
[0014] 優(yōu)選地，所述自組裝單分子層的試劑為末端功能化的硫醇。
[0015] 優(yōu)選地，所述末端功能化的硫醇為單硫醇和/或雙硫醇。
[0016] 優(yōu)選地，所述末端功能化的硫醇為烷硫醇和/或帶有PEG嵌段的硫醇。
[0017] 優(yōu)選地，所述末端功能化的基團為羥基、羧基、氨基、醛基、環(huán)氧基或甲氧基。
[0018] 硫醇的通式為：HS-R1_R2 ;
[0019] 其中，R1為烷烴鏈，R2 -般為末端功能化的PEG鏈。例如，硫醇在金表面自組裝主 要依靠Au-S鍵以及R1之間的范德華力，以形成致密單層膜；R2為生物相容性分子，主要用 于抗非特異性吸附，降低背景信號。硫醇的末端功能化基團主要用于進一步的化學修飾，如 連接光交聯(lián)劑等，不同末端基團可以有不同的化學修飾方法，但反應原理都是基本的化學 共價結合。
[0020] 優(yōu)選地，所述光交聯(lián)劑為含有光敏感基團，在特定波長（能量）光照下可以進行 化學反應的試劑，優(yōu)選為吖丙因、重氮、乙酰苯、二苯甲酮或蒽醌類中的任意一種或者至少 兩種的混合物，例如可以是吖丙因，重氮，乙酰苯和二苯甲酮的混合物，或吖丙因、乙酰苯、 二苯甲酮和蒽醌類的混合物。光敏感基團，即光交聯(lián)基團，為在光照下會產生反應的化學基 團。本發(fā)明主要利用光化學反應活化光敏感基團，使其快速、非選擇性且共價地將高分子結 合在其表面。
[0021] 優(yōu)選地，所述高分子指具有生物相容性且具有活性端基的功能高分子，包括但不 限于具有良好抗非特異性結合性能的合成高分子，例如可以是聚乙二醇及其衍生物、含氟 聚合物、聚丙烯酸及其衍生物、聚甲基丙烯酸及其衍生物、聚苯乙烯、聚乳酸、兩性甜菜堿類 聚合物等；還可以是具有良好生物相容性的天然高分子，如硝化纖維、殼聚糖或葡聚糖及其 衍生物等。
[0022] 第二方面，本發(fā)明提供如第一方面所述的微陣列生物芯片的制備方法，包括以下 步驟：
[0023] (1)在玻璃芯片基底鍍上鉻層，再在鉻層的表面鍍上銀和/或金層；
[0024] (2)完成步驟（1)后清洗芯片，在表面形成自組裝單分子層；
[0025] (3)將光交聯(lián)劑共價結合于自組裝單分子層的表面；
[0026] (4)將高分子溶液旋涂在完成步驟（3)的芯片表面；
[0027] (5)待步驟（4)所述高分子溶液的溶劑揮發(fā)后，用紫外光照射使所述高分子接枝 在芯片表面；
[0028] 任選地，進行步驟（6):
[0029] (6)將接枝在芯片表面的高分子進行功能化。
[0030] 優(yōu)選地，步驟（1)所述鍍上鉻層及銀和/或金層的方法為金屬熱蒸和/或離子濺 射；采用以上方法形成的鍍層顆粒較小且厚度均勻，有利于成像傳感的應用。
[0031] 其中，步驟（2)所述清洗的方式為溶劑清洗、超聲清洗以及等離子體清洗方法中 的任意一種或至少兩種的組合，例如可以是溶劑清洗，超聲清洗，等離子清洗和超聲清洗的 組合，或溶劑清洗、超聲清洗和等離子清洗的組合。所述溶劑清洗所用溶劑為去離子水、乙 醇、丙酮或N，N-二甲基甲酰胺中的任意一種或至少兩種的混合，例如可以是去離子水，乙 醇和丙酮的混合物，去離子水和N，N-二甲基甲酰胺的混合物，或乙醇、丙酮和N，N-二甲基 甲酰胺的混合物。
[0032] 優(yōu)選地，步驟（3)所述共價結合的方