專利名稱：：用于基因抑制的不同啟動子的制作方法
技術領域：
：本文公開的是用于基因抑制的重組DNA構(gòu)建體和方法，以及包含使用此類重組DNA構(gòu)建體和方法轉(zhuǎn)移的DNA的轉(zhuǎn)基因植物細胞、轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因種子。背景Redenbaugh等人在"SafetyAssessmentofGeneticallyEngineeredFruitsandVegetablesACaseStudyoftheFlavrSavrTomato",CRCPress,Inc.(1992)中^>開了通過土i裏桿菌轉(zhuǎn)化將反義DNA構(gòu)建體引入番茄基因組內(nèi)，以產(chǎn)生多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因的基因沉默。顯示所需性狀的轉(zhuǎn)基因植物中的轉(zhuǎn)移的DNA(T-DNA)的共同特征是以頭對頭和/或尾對尾排列插入的兩個或更多T-DNA區(qū)或片段，與Jorgensen等人Mol.Gen.Genet.207:471—477(1987)報道的T-DNA的多個拷貝通常轉(zhuǎn)移且整合到單細胞的基因組內(nèi)一致；且當這發(fā)生時，T-DNA在用土壤桿菌轉(zhuǎn)化的植物中主要以反向重復結(jié)構(gòu)組構(gòu)。參照圖1和表1,番茄用包含反義構(gòu)建體(圖la)的質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)化，所迷反義構(gòu)建體包含在"增強的"35SCaMV啟動子與土壤桿菌基因和人工h力標記基因的區(qū)之間的反義方向的全長PGcDNA。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>這種構(gòu)建體用于幾種番茄近交系的商業(yè)規(guī)模轉(zhuǎn)化，作為1994年由Calgene開發(fā)和銷售的FlavrSav,M番茄的部分。命名為501、502、7B、22B和28B的番茄系使用消除毒性的根癌土壤桿菌用pCGN1436進行轉(zhuǎn)化。事件主要基于表型進行選擇，即在成熟水果中的低PG酶活性。每次近交產(chǎn)生約150個轉(zhuǎn)基因事件植物，并且就PG水平測定具有成熟果實的573個植物。在所有番茄系中的那些事件的14-25%具有降低95%或更多的PG活性且導致總共103個事件。在那些植物中，84個具有足夠的種子用于卡那霉素發(fā)芽測定法，以測定分離比率和對于h/基因3:1分離的27個事件(代表關于每個近親交配的3-10個事件)。基于初步DNA分析，具有3:1分離比率的"個事件中僅約40%看起來明顯具有PAGS基因和在單個物理基因座上插入的h/7基因?；诩兒舷档目色@得性，選擇那些事件中的8個用于T-DNA插入結(jié)構(gòu)的詳細分子分析。那些分析的結(jié)果顯示于圖lb-d中，其中發(fā)現(xiàn)在近交系中的所有8個事件具有包含反向重復元件的T-DNA插入片段。數(shù)據(jù)與僅具有單個T-DNA插入片段的事件501-1001—致，但具有如圖lb中舉例說明的作為反向重復存在的/歷/3，區(qū)。6個事件看起來包含如圖lc中舉例說明的以"尾對尾"排列的兩個T-DNA區(qū)，事件501-1035具有以圖Id中舉例說明的方式整合的3個插入片段。8個所選事件的RNA分析證實在PG反義RNA水平和PG基因沉默的效力之間沒有關聯(lián)。觀察到一系列PG反義RM水平，從l個事件中容易檢測的量到多個事件中無法檢測的水平，所有這些都產(chǎn)生延遲成熟的基因沉默性狀。對于標記h/2基因和對于PG反義基因檢測到尺寸大于預期的潛在的讀通轉(zhuǎn)錄物。T-DNA插入片段中的反向重復元件可能比預期RMs更大地轉(zhuǎn)錄(雖然處于低水平)的觀察支持下述理論PGmRNA減少是由于通過產(chǎn)生能夠形成dsRNA的RNA而i秀導了RNAi。圖lb中舉例說明的具有3，^/(有義隨后為反義)的反向重復序列的反義插入片段的結(jié)構(gòu)非常類似于如PlantJournal,33，793-800(2003)中公開的由Brummell等人用于基因沉默的有義構(gòu)建體，其中使用3，元件(反義隨后為有義)作為反向重復。在每種情況下，可以形成3'發(fā)夾環(huán)且用作用于RNA依賴性的RNA聚合酶和革巴RNA的dsRNA序列形成的引物。圖lc中舉例說明和作為圖lc中的元件的插入T-DNA的反向重復序列的發(fā)現(xiàn)，暗示通過用質(zhì)粒中的反向重復序列直接轉(zhuǎn)化，增加用反義DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的效力。然而，當在細菌例如大腸桿菌內(nèi)時，質(zhì)粒中反向重復序列的存在已被認為是有問題的，這干擾質(zhì)粒維持，導致質(zhì)粒不穩(wěn)定性。下文描述的發(fā)明提供了在轉(zhuǎn)化構(gòu)建體中利用反向重復元件的潛在優(yōu)點，而沒有在細菌中鄰近的反向重復序列的缺點。包含來自靶基因的序列的反向重復的單個表達盒對于所需植物組織中的基因抑制可能是無效的。例如，CaMV35S啟動子一般表示為"組成型"，但在花粉中不充分表達。"組成型"稻肌動蛋白1啟動子在花粉中良好表達但在葉中并非如此。下文描述的發(fā)明提供了通過利用具有單個啟動子的單個盒無法提供的在多個植物組織中基因抑制的優(yōu)點。發(fā)明概述本發(fā)明提供了基因抑制的改善方法，其包括用在質(zhì)粒上彼此鄰近定位的多個基因抑制構(gòu)建體轉(zhuǎn)化真核細胞。在本發(fā)明的一個方面，多個基因抑制構(gòu)建體可以是多個鄰近的反義基因抑制構(gòu)建體；在另一個方面，它們可以是多個鄰近的有義(共抑制)基因抑制構(gòu)建體。在一個進一步的方面，它們可以是多個鄰近的有義和反義基因抑制構(gòu)建體。多個鄰近的基因抑制構(gòu)建體可以是重疊或非重疊的。更具體而言，該方法包括將用于從基因表達有義(或反義)DNA的盒插入用于土壤桿菌介導的轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒內(nèi)，所述基因被靶向進行抑制，其與用于表達相同的有義(或反義)DNA的第二種盒鄰近。本發(fā)明進一步提供了在基因組中具有重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因種子，所述重組DM構(gòu)建體包含(a)與至少一個第一種基因抑制元件可操作地連接的植物胚乳特異性啟動子，和(b)與植物胚乳特異性啟動子處于相反方向且位于至少一個第一種基因抑制元件3'的植物胚特異性啟動子。本發(fā)明進一步提供了在基因組中具有重組DNA構(gòu)建體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因植物細胞，其包含(a)與用于使至少一個第一種靶基因沉默的至少一個第一種基因抑制元件可操作地連接的第一種啟動子，和(b)與第一種啟動子處于相反方向且位于至少一個第一種基因抑制元件的第二種啟動子，其中第一種和第二種啟動子具有不同的表達模式，并且其中重組DNA構(gòu)建體在植物細胞中的轉(zhuǎn)錄導致至少一個第一種靶基因沉默。本發(fā)明進一步提供了用于轉(zhuǎn)化真核細胞(例如植物細胞)的構(gòu)建體，關于其使用的方法，和包含此類構(gòu)建體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物細胞。這些構(gòu)建體包括(a)與用于使至少一個第一種靶基因沉默的至少一個第一種基因抑制元件可操作地連接的第一種啟動子，和(b)與第一種啟動子處于相反方向且位于至少一個第一種基因抑制元件3'的第二種啟動子，其中笫一種和第二種啟動子具有不同的表達模式，并且其中重組DNA構(gòu)建體在真核細胞(例如植物細胞)中的轉(zhuǎn)錄導致至少一個第一種靶基因沉默。不同的表達模式包括在空間或時間上不同的表達模式，以及誘導型表達模式。本發(fā)明的特征是盒中的調(diào)節(jié)元件，即啟動子調(diào)節(jié)元件和/或聚腺苷酸化調(diào)節(jié)元件的變化。在使用反義盒的實施方案中，第一種反義表達盒包含處于相反方向的、與被粑向用于抑制的基因的DM可操作地連接的第一種啟動子，隨后為第一個3'元件(例如，包含聚腺苦酸化信號和聚腺香酸化位點)；并且第二種反義RNA表達盒包含處于相反方向的、與被耙向用于抑制的基因的所述DNA可操作地連接的第二種啟動子，隨后為第二個3'元件。第一種和第二種盒以尾對尾構(gòu)型組裝到DNA構(gòu)建體內(nèi)，從而使得啟動子在被靶向用于抑制的基因的組裝的構(gòu)建體結(jié)合的可轉(zhuǎn)錄DNA的末端上，并且當使用3'元件時，3'元件與啟動子和可轉(zhuǎn)錄DM之間或組裝物的末端區(qū)域處的啟動子(a)鄰接或(b)鄰近。最低限度，第一種和第二種啟動子是不同的。第一種和第二種3'元件也可以是不同的。該方法進一步包括通過土壤桿菌介導的轉(zhuǎn)化經(jīng)由轉(zhuǎn)移DM構(gòu)建體來轉(zhuǎn)化真核細胞，所述DNA構(gòu)建體具有來自質(zhì)粒的所述組裝的第一種和第二種盒。轉(zhuǎn)基因生物由用第一種和第二種盒轉(zhuǎn)化的細胞再生；并且，在轉(zhuǎn)基因生物中測量由蛋白質(zhì)水平抑制的性狀，所述蛋白質(zhì)由被靶向用于抑制的基因的所述DSA編碼。在該方法的各方面，啟動子可以包括在植物中起作用的眾所周知的啟動子，包括土壤桿菌胭脂堿合酶(nos)啟動子、土壤桿菌章魚堿合酶(ocs)啟動子、花椰菜花葉病毒啟動子(CaMV35S)、玄參花葉病毒啟動子(FMV)、玉米RS81啟動子、稻肌動蛋白啟動子、玉米RS324啟動子、玉米PR-l啟動子、玉米A3啟動子、y薏苡辛B32胚乳特異性啟動子、玉米L3油質(zhì)蛋白胚特異啟動子、rd29a啟動子、和在植物基因表達中有用的任何其他眾所周知的啟動子。在該方法的各方面，內(nèi)含子是任何可剪接的啟動子。在某些實施方案中，內(nèi)含子優(yōu)選是轉(zhuǎn)錄增強內(nèi)含子，例如"增強子"，例如稻肌動蛋白1和稻肌動蛋白2基因、玉米醇脫氫酶基因、玉米熱休克蛋白70基因和玉米皺縮1基因的內(nèi)含子。在該方法的各方面，3'元件選自眾所周知的3'元件，例如土壤桿菌基因3'元4牛侈寸^(口/20i1J，、/^/J，、^//rJ，、fyT^^T、ocs^r、fr7J，，和植物基因3'元件例如小麥(Triticumaestivum)熱休克蛋白(Z^//7)3，、小麥泛素基因3\小麥果糖-1，6-二磷酸酶基因3'、稻谷蛋白基因3'、稻乳酸脫氫酶基因3'、稻P微管蛋白基因3'、豌豆(Pisumsativum)二磷酸核酮糖羧化酶基因(r&)3，和來自宿主植物內(nèi)的其他基因的3'元件。在該方法的其^f也方面，多個盒中的至少一個包含標記基因，例如提供針對草甘膦(a/"W或i7V/V)或草銨膦(/7〃或^r)的抗性的除草劑標記基因；提供對卡那霉素(/2/7/〃)、慶大霉素J)、潮霉素(m力/。、鏈霉素和壯觀霉素(wW)、或氨千青霉素(s/"/7)的抗性的殺菌劑標記基因；或可篩選標記例如螢光素酶(/"c)或熒光蛋白質(zhì)(^/>)或P葡糖醛酸糖苷酶("/W)。凈皮耙向用于抑制的基因的DNA的長度可以是任何長度，但優(yōu)選長度為至少21個核苷酸。本發(fā)明的另一個方面提供了用于土壤桿菌介導的轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒，其包含與用于表達相同DM的所述第二種盒鄰近的、用于從被靶向用于抑制的基因表達有義(或反義)DNA的第一種盒，其中所述盒的組裝使得不同的3'非翻譯區(qū)是鄰接的。在許多情況下，盒和至少一個標記盒位于質(zhì)粒上的左和右T-DNA邊界之間。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，轉(zhuǎn)基因玉米植物包含具有用于反義抑制賴氨酸酮戊二酸還原酶基因的鄰近盒的DNA構(gòu)建體，在一種盒中使用胚乳特異性啟動子并且在另一種盒中使用胚特異性啟動子。附圖簡述圖1和2舉例說明DNA構(gòu)建體。圖3描述了本發(fā)明的構(gòu)建體的非限制性例子，例如，如實施例3中所述的。胚乳特異性啟動子由"pB32"指出，胚特異性啟動子由"pL3"指出，一個或多個基因抑制元件由"SUP-LKR/SDH"(這表示靶向內(nèi)源性賴氨酸酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氬酶的穩(wěn)定的反義抑制元件)指出，"GSE1"和"GSE2"和終止子由"tHspl7，，、"tGlbl"、"terl"和"ter2"指出。發(fā)明詳述如本文所使用的，"盒"意指通常與從基因表達蛋白質(zhì)相關的DNA元件的組合，并且至少包含(a)用于起始轉(zhuǎn)錄的DNA例如啟動子元件、(b)編碼蛋白質(zhì)的DM例如cDNA或包含外顯子和內(nèi)含子的基因組DM、和(c)在序列編碼和添加polyA尾部后用于從轉(zhuǎn)錄的RM剪接3'RNA的DM，例如包含聚腺苷酸化位點的3'元件。一般地，當編碼蛋白質(zhì)的DNA是有義方向時，轉(zhuǎn)錄的RNA可以翻譯成表達蛋白質(zhì)，或在某些情況下用于有義共抑制。當編碼蛋白質(zhì)的DNA是反義方向時，轉(zhuǎn)錄的RNA可以涉及基因抑制機制。例如，為了促進基因抑制，反義DM—般對應轉(zhuǎn)錄成聚腺苷酸化位點下游的mRNA的DNA。因此，"反義盒"意指DNA元件的組合，其包含與來自被耙向用于抑制的基因的反義定向DNA可操作地連接的啟動子和3'元件。盡管常見，但3'元件包含聚腺苷酸化位點不是關鍵的。在鄰近的有義盒或鄰近的反義盒中重要的是鄰近的3'元件是不同的，即由鄰近的3'元件轉(zhuǎn)錄的RNA不能雜交以形成雙鏈RNA或在大腸桿菌中容易地從質(zhì)粒切離。重組DNA構(gòu)建體例如本發(fā)明的盒，可以由本領域技術人員使用商購可得的材料和眾所周知的公開方法容易地制備。當多基因被靶向用于抑制時，多順反子DNA元件可以如美國專利申請序列號10/465,800中舉例說明和公開的進行構(gòu)建。用于建立DNA構(gòu)建體和載體用于轉(zhuǎn)化的有用技術是GATEWAY克隆技術(可從InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,California獲得)，其使用來自細菌喧菌體入載體構(gòu)建的整合酶<3〃系統(tǒng)的位點特異性重組酶LR克隆反應，而不是限制性核酸內(nèi)切酶和連接酶。LR克隆反應公開于美國專利5，888,732和6,277,608、美國專利申請公開2001283529、2001282319、20020007051和20040115642。同樣由Invitrogen提供的GATEWAY克隆技術指導手冊還提供了用于將任何所需DNA常規(guī)克隆到包含可操作的植物表達元件的載體內(nèi)的簡明指導?？商娲妮d體構(gòu)建法利用如由Aslandis，C.等人，NucleicAcidsRes.,18,6069-6074，1990和Rashtchian,A.等人，Biochem.，206,91-97，1992公開的不依賴于連接的克隆，其中將具有單鏈5'和3'末端的DNA片段連接到所需載體內(nèi)，所述所需載體隨后可以在體內(nèi)進行擴增。在植物細胞中有活性的眾多啟動子已在文獻中得到描述。這些包括存在于植物基因組中的啟動子以及來自其他來源的啟動子，包括攜帶在根癌土壤桿菌的根瘤誘導質(zhì)粒上的胭脂堿合酶(NOS)啟動子和章魚堿合酶(OCS)啟動子，花椰菜花葉病毒啟動子例如花椰菜花葉病毒或玄參花葉病毒啟動子。例如，參見公開了來源于花椰菜花葉病毒的組成型啟動子(CaMV35S)形式的美國專利號5，858，742和5，322，938，公開了玄參花葉病毒(FMV)35S啟動子的美國專利號5,378,619,公開了玉米RS81啟動子的美國專利6，437,217,公開了稻肌動蛋白啟動子的美國專利5,641,876，公開了玉米RS324啟動子的美國專利6，426，446,公開了玉米PR-1啟動子的美國專利6,429,362,公開了玉米A3啟動子的美國專利6,232，526，公開了組成型玉米啟動子的美國專利6,177,611,公開了玉米L3油質(zhì)蛋白啟動子的美國專利6,433,252，公開了稻肌動蛋白2啟動子和內(nèi)含子的美國專利6，429，357，公開了根特異性啟動子的美國專利5，837，848,公開了冷誘導型啟動子的美國專利6，084，089,公開了光誘導型啟動子的美國專利6，294，714,公開了鹽謙導型啟動子的美國專利6，140,078，公開病原體誘導型啟動子的美國專利6，252，138，公開了磷缺乏誘導型啟動子的美國專利6，175，060,公開了了用于設計有效的植物表達載體的5'、3'和內(nèi)含子元件的美國專利申請公開2002/0192813Al，公開了薏苡辛啟動子的美國專利申請序列號09/078,972,公開了玉米葉綠體醛縮酶啟動子的美國專利申請序列號09/757,089,和公開了水缺乏誘導型啟動子的美國專利申請序列號10/739,565。這些和在植物細胞中起作用的眾多其他啟動子是本領域技術人員已知的，并且可用于本發(fā)明的重組多核苷酸中以提供所需基因在轉(zhuǎn)基因植物細胞中的表達。在該方法的各方面，3'元件選自來自根癌土壤桿菌基因的眾所周4口的3'元4牛，例如/osJ，、/^/J'、z^ry、/yz^J，、ocsJ，、"7J，，例如公開于美國專利號6,090,627;來自植物基因的3'元件，例如小麥(Triticumaestivum)熱休克蛋白17(&;77J，)、小麥泛素基因、小麥果糖-1，6-二磷酸酶基因、稻谷蛋白基因、稻乳酸脫氫酶基因和稻卩微管蛋白基因，所有這些公開于美國公開專利申請2002/0192813Al;和豌豆(Pisumsativum)二磷酸核酮糖羧化酶基因()和來自宿主植物內(nèi)的基因的3'元件。此外，啟動子可以進行改變以包含多個"增強子序列"，以幫助提高基因表達。此類增強子是本領域已知的。通過包括增強子序列與此類構(gòu)建體，可以增強所選擇的蛋白質(zhì)的表達。這些增強子通常發(fā)現(xiàn)在真核細胞中起作用的啟動子轉(zhuǎn)錄開始的5',但通常可以以對于編碼序列的正或反方向5'或3'插入。在某些情況下，這些5'增強元件是內(nèi)含子。特別有用的增強子是稻肌動蛋白1(參見美國專利號5，6"，876)和稻肌動蛋白2基因、玉米醛脫氪酶基因、玉米熱休克蛋白70基因(參見美國專利號5，593，874)和玉米皺縮1基因的內(nèi)含子。在本發(fā)明的某些方面，優(yōu)選DNA構(gòu)建體中的啟動子元件在水缺乏條件下能夠引起足夠的表達，以導致有效量的多肽的產(chǎn)生。此類啟動子可以在水缺乏條件下過量表達的植物基因的調(diào)節(jié)區(qū)中得到鑒定和分熱《木克蛋白17,5基因(#5777,"、HVA22基因(#^2",玉米(Zeamays)的Rabl7基因和肉桂酸4-羥化酶(CA4H)基因(的5'調(diào)節(jié)區(qū)，或來源于鑒定為rabl7基因(WW7)、肉桂酸4-羥化酶(基因((^^7)、HVA22基因(#MW),和水稻(Oryzasativa)的熱休克蛋白17.5(#5777,"、22(v^尸Z)和16.9(#577《.夕)的基因的5'調(diào)節(jié)區(qū)。此類水缺乏誘導型啟動子公開于美國專利申請序列號10/739,565和11/066，911。在本發(fā)明的其他方面，在植物種子組織中的足夠表達是所需的，以實現(xiàn)種子組成的改良。用于種子組成修飾用途的示例性啟動子包括來自種子基因的啟動子，例如油菜籽蛋白(美國專利5,420,034)、玉米L3油質(zhì)蛋白(美國專利6，433，252)、玉米醇溶蛋白Z27(Russell等人(1997)TransgenicRes.6(2):157-166)、球蛋白1(Belanger等人(1991)Genetics129:863-872)、谷蛋白1(Russel1(1997)同上)、和過氧化物氧還蛋白(Perl)(Stacy等人(1996)PlantMolBiol.31(6):1205-1216)。在本發(fā)明的另外方面，在植物綠色組織中的優(yōu)先表達是所需的。用于此類用途的目的啟動子包括來自基因，例如SSU(Fischhoff等人(1992)PlantMolBiol.20:81-93)、醛縮酶和丙酮酸正石粦酸二激酶(PPDK)(Taniguchi等人(2000)PlantCellPhysiol.41(1):42-48)的那些。在實踐中，DNA在任何一種轉(zhuǎn)化實驗中僅引入小百分比的革巴細胞內(nèi)。標記基因用于提供用于鑒定的那些細胞的有效系統(tǒng)，所述細胞通過接受轉(zhuǎn)基因DM構(gòu)建體和將轉(zhuǎn)基因DNA構(gòu)建體整合到其基因組內(nèi)進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。優(yōu)選的標記基因提供賦予對選擇劑例如抗生素或除草劑的抗性的選擇標記。本發(fā)明的植物可能對其有抗性的任何除草劑是用于選擇標記的有用試劑。使?jié)撛谵D(zhuǎn)化的細胞暴露于選擇劑。在存活細胞的群體中將是那些細胞，其中一般地，抗性賦予基因以足夠水平整合和表達以允許細胞存活。細胞可以進一步進行測試以證實外源DNA的穩(wěn)定整合。常用的選擇標記基因包括賦予對抗生素例如卡那霉素潮霉素BU/7力/P0和慶大霉素(aacJ和a"W)的抗性，和對除草劑例如草甘膦(bar或pat)和草銨膦(EPSPS)的抗性的那些。此類選擇標記的例子在美國專利5,550,318;5,633,435;5，780，708和6，118，047中得到舉例說明。還可以利用提供肉眼鑒定轉(zhuǎn)化體的能力的可篩選標記，例如，表達有色或熒光蛋白質(zhì)例如螢光素酶或綠色熒光蛋白(GFP)的基因、或各種生色底物已知的表達P葡糖醛酸糖苷酶的基因或w/W基因(GUS)。本發(fā)明提供了在其因組中具有重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因種子，所述重組DNA構(gòu)建體包含(a)與至少一個第一種基因抑制元件可操作地連接的植物胚乳特異性啟動子，和(b)與植物胚乳特異性啟動子處于相反方向且位于至少一個第一種基因抑制元件3'的植物胚特異性啟動子。在某些實施方案中，植物胚特異性啟動子可以轉(zhuǎn)錄至少一個第一種基因抑制元件。在其他實施方案中，植物胚特異性啟動子可以轉(zhuǎn)錄至少一個第二種基因抑制元件(例如，用于沉默由胚乳特異性啟動子耙向的相同基因，或用于沉默不同基因的第二種基因抑制元件)。在轉(zhuǎn)基因種子的一個實施方案中，至少一個第一種基因抑制元件包括用于使氨基酸的分解代謝基因(或氨基酸的生物合成中間產(chǎn)物的分解代謝基因)沉默的基因抑制元件，例如但不限于，賴氨酸分解代謝基因?？梢允蛊渌纸獯x基因沉默，例如涉及脂質(zhì)或碳水化合物分解代謝或其生物合成中間產(chǎn)物分解代謝的基因。在一個特別要求保護的實施方案中，轉(zhuǎn)基因種子是轉(zhuǎn)基因玉米種子，并且氨基酸分解代謝基因是賴氨酸分解代謝基因，例如內(nèi)源性玉米LKR/SDH基因。在轉(zhuǎn)基因種子的某些實施方案中，重組DNA構(gòu)建體進一步包括選自下述的一種或多種元件(a)與植物胚特異性啟動子可操作地連接的至少一個第二種基因抑制元件；(b)與植物胚乳特異性啟動子或植物胚特異性啟動子可操作地連接的氨基酸生物合成基因；和(c)選擇標記基因。在基因抑制元件和另一種基因(例如氨基酸生物合成基因)的表達元件與一個啟動子可操作地連接的某些實施方案中，基因抑制元件可以嵌入內(nèi)含子中，所述內(nèi)含子在許多實施方案中優(yōu)選是轉(zhuǎn)錄增強內(nèi)含子(例如，例如"增強子"，例如稻肌動蛋白1和稻肌動蛋白2基因、玉米醇脫氪酶基因、玉米熱休克蛋白70基因和玉米皺縮1基因的5'內(nèi)含子)。在某些優(yōu)選實施方案中，重組DNA構(gòu)建體進一步包含選自下述的一種或多種元件(a)用于使與植物胚特異性啟動子可操作地連接的賴氨酸分解代謝基因沉默的至少一個第二種基因抑制元件；(b)與植物胚乳特異性啟動子可操作地連接的賴氨酸生物合成(例如，外源性DHDPS或CordapA基因)基因；(c)與植物胚乳特異性啟動子或植物胚特異性啟動子可操作地連接的天冬氨酸激酶基因(例如，lysC基因)；和(d)選擇標記基因。在某些優(yōu)選實施方案中，構(gòu)建體包括天冬氨酸激酶基因(與胚或胚乳特異性啟動子可操作地連接)和用于使內(nèi)源性LKR/SDH沉默的基因抑制元件(優(yōu)選地與胚乳特異性啟動子或?qū)ε吆团呷閮烧叨季哂刑禺愋缘膯幼涌刹僮鞯剡B接)，并且優(yōu)選地還包括外源性DHDPS或CordapA基因(與胚乳特異性啟動子可操作地連接)。標記基因包括選擇標記(例如常用于選擇轉(zhuǎn)化細胞，例如抗生素或除草劑抗性基因)、可檢測標記(例如，螢光素酶、綠色熒光蛋白、GUS)，并且可以包括編碼序列或非編碼序列(例如，抑制內(nèi)源性基因，導致可觀察表型的抑制元件，例如用于使涉及植物色素生產(chǎn)的基因沉默的抑制元件)。圖3描述了用于提供本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因種子的重組DNA構(gòu)建體的非限制性實施方案(a)(參見圖3A)重組DNA構(gòu)建體包括(i)與包括DNA的至少一個第一種基因抑制元件可操作地連接的植物胚乳特異性啟動子，所述DNA轉(zhuǎn)錄成RNA，用于通過形成雙鏈RNA來使賴氨酸分解代謝基因沉默(例如，包括至少一個反義DM區(qū)段和至少一個有義DNA區(qū)段的DNA，所述反義DNA區(qū)段與至少一個第一種靶基因的至少一個區(qū)段是反義的，所述有義DNA區(qū)段是至少一個第一種靶基因的至少一個區(qū)段；或編碼至少一種反式作用miRNA且在兩個轉(zhuǎn)錄方向上轉(zhuǎn)錄成靶向靶基因的雙鏈RNA的DNA)，和(ii)與第一種啟動子處于相反方向且與至少一個第一種基因抑制元件可操作地連接的植物胚特異性啟動子；(b)(參見圖3B)重組DNA構(gòu)建體包括(i)與包括DM的至少一個第一種基因抑制元件可操作地連接的植物胚乳特異性啟動子，所述DNA轉(zhuǎn)錄成RM,用于通過形成雙鏈RNA來使賴氨酸分解代謝基因沉默(例如，包括至少一個反義DNA區(qū)段和至少一個有義DNA區(qū)段的DNA,所述反義DNA區(qū)段與至少一個第一種粑基因的至少一個區(qū)段是反義的，所述有義DNA區(qū)段是至少一個第一種粑基因的至少一個區(qū)段；或在兩個轉(zhuǎn)錄方向上編碼反式作用miRNA的DM)，(ii)與笫一種啟動子處于相反方向且與至少一個第一種基因抑制元件可操作地連接的植物胚特異性啟動子，和(Ui)與第一種或第二種啟動子可操作地連接的至少上)；或、"P、、。、、—、'(c)(參見圖3C)重組DNA構(gòu)建體包括(i)與用于使賴氨酸分解代謝基因沉默的至少一個第一種嵌入內(nèi)含子的基因抑制元件可操作地連接的植物胚乳特異性啟動子、至少一種賴氨酸生物合成基因(優(yōu)選地cordapA或lysC或兩者)、和第一種終止子，(H)與第一種啟動子處于相反方向且與用于使賴氨酸分解代謝基因沉默的至少一個第二種基因抑制元件(其任選嵌入內(nèi)含子中，優(yōu)選地，嵌入轉(zhuǎn)錄增強內(nèi)含子)可操作地連接的植物胚特異性啟動子；或(d)(參見圖3D)重組DNA構(gòu)建體包括(i)第一種基因抑制盒，其包括與用于使賴氨酸分解代謝基因沉默的至少一個笫一種嵌入內(nèi)含賴氨酸生物合成基因(優(yōu)選地cordapA或lysC或兩者)、和第一種終止子，和(ii)第二種基因抑制盒，其包括與用于使賴氨酸分解代謝基因沉默的至少一個第二種基因抑制元件可操作地連接的植物胚特異性啟動子、和第二種終止子，其中第一種和第二種基因抑制盒處于相反方向(任選以使得啟動子在構(gòu)建體的末端上的方式組裝)；或(e)(參見圖犯)重組DM構(gòu)建體包括(i)第一種基因抑制盒，其包括與用于使賴氨酸分解代謝基因沉默的至少一個第一種嵌入內(nèi)含子的基因抑制元件可操作地連接的植物胚乳特異性啟動子、至少一種賴氨酸生物合成基因(優(yōu)選地cordapA或lysC或兩者)、和第一種終止子，和(ii)第二種基因抑制盒，其包括與用于使賴氨酸分解代謝基因沉默的至少一個嵌入內(nèi)含子的第二種基因抑制元件可操作地連接的植物胚特異性啟動子、至少一種賴氨酸生物合成基因(優(yōu)選地cordapA或lysC或兩者)、和第二種終止子，其中第一種和第二種基因抑制盒處于相反方向(任選以使得啟動子在構(gòu)建體的末端上的方式組裝)；或(f)(參見圖3F)重組DNA構(gòu)建體包括(i)第一種基因抑制盒，其包括與用于使賴氨酸分解代謝基因沉默的至少一個第一種基因抑制元件可操作地連接的植物胚乳特異性啟動子、和第一種終止子，和(ii)第二種基因抑制盒，其包括與用于使賴氨酸分解代謝基因沉默的至少一個第二種基因抑制元件可操作地連接的植物胚特異性啟動子、和第二種終止子，其中第一種和第二種基因抑制盒處于相反方向(任選以使得啟動子在構(gòu)建體的末端上的方式組裝)。圖4描述了本發(fā)明的構(gòu)建體的其他具體實施方案。盡管圖3和4描述了某些基因抑制元件包括以穩(wěn)定的反義元件("SUP-LKR/SDH")形式的有義和反義序列，其他基因抑制元件也是有用的，條件是它們通過合適的啟動子轉(zhuǎn)錄成MA分子或能夠抑制一種或多種粑基因的分子。當構(gòu)建體包括兩個非重疊的表達"盒"時(參見例如，圖3D、3E和3F),可替代排列用于彼此鄰近定位且處于相反方向的2種啟動子(導致"趨異"轉(zhuǎn)錄)。一般地，優(yōu)選阻止終止子的"讀通"和例如相反啟動子或與相反啟動子可操作地連接的序列的非有意沉默。因此，在某些實施方案中，可以任選插入內(nèi)含子或其他可剪接元件例如核酶，以阻止任何下游序列的"讀通"(參見例如，圖3B的底部構(gòu)建體)。在基因抑制元件的轉(zhuǎn)錄物無需聚腺苷酸化(例如，當靶位于核中時)的某些實施方案中，可以插入內(nèi)含子或其他可剪接元件例如核酶，以阻止相反啟動子的"讀通，，(參見例如，圖3A的底部構(gòu)建體)。在其他實施方案中，可以排列內(nèi)含子以包括嵌入其內(nèi)的基因抑制元件，以阻止任何下游序列的"讀通"(參見例如，圖3E的底部構(gòu)建體)。本發(fā)明進一步提供了在基因組中具有重組DNA構(gòu)建體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因植物細胞，其包括(a)與用于使至少一個第一種靶基因沉默的至少一個第一種基因抑制元件可操作地連接的第一種啟動子，和(b)與第一種啟動子處于相反方向且位于至少一個笫一種基因抑制元件3'的第二種啟動子，其中第一種和第二種啟動子具有不同的表達模式，并且其中重組DNA構(gòu)建體在植物細胞中的轉(zhuǎn)錄導致至少一個第一種靶基因沉默。"穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因植物細胞，，意指具有穩(wěn)定整合到基因組內(nèi)的外源基因(轉(zhuǎn)基因)的植物細胞。在許多優(yōu)選實施方案中，此類穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因植物細胞對于轉(zhuǎn)基因是純合的。在特別優(yōu)選的實施方案中，整合的轉(zhuǎn)基因是可遺傳的，即可轉(zhuǎn)移至后代植物。不同的表達模式包括在空間或時間上不同的表達模式，以及誘導型表達模式。合適的第一種和第二種啟動子的非限制性例子包括控制在不同細胞器、細胞或組織中的轉(zhuǎn)錄的第一種和第二種啟動子，或控制在不同時間(例如，在晝夜節(jié)律周期的不同點上)或發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄的第一種和第二種啟動子，或通過誘導物不同地誘導或通過不同的誘導物誘導的第一種和第二種啟動子。穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因植物細胞可以是分離的轉(zhuǎn)基因植物細胞，或可以在由轉(zhuǎn)基因植物細胞再生的轉(zhuǎn)基因植物、或此類再生的轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因后代種子或轉(zhuǎn)基因后代植物中。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因植物細胞的一個優(yōu)選實施方案中，第一種和第二種啟動子包含植物胚特異性啟動子和植物胚乳特異性啟動子，并且穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因植物細胞包含農(nóng)作物植物(例如，玉米、稻或具有包含大量胚乳的種子的其他農(nóng)作物植物)的種子胚和胚乳細月包。本發(fā)明進一步提供了用于轉(zhuǎn)化真核細胞(例如植物細胞和動物細胞)的構(gòu)建體、關于其使用的方法、和包含此類構(gòu)建體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因植物細胞。這些構(gòu)建體包括(a)與用于使至少一個第一種靶基因沉默的至少一個第一種基因抑制元件可操作地連接的第一種啟動子，和(b)與第一種啟動子處于相反方向且位于至少一個第一種基因抑制元件3'的第二種啟動子，其中第一種和第二種啟動子具有不同的表達模式，并且其中重組DNA構(gòu)建體在真核細胞(例如植物細月包或動物細胞)中的轉(zhuǎn)錄導致至少一個第一種靶基因沉默。不同的表達模式包括在空間或時間上不同的表達模式，以及誘導型表達模式。因此，在某些實施方案中，第一種和第二種啟動子具有不同的空間表達模式，并且沉默在至少兩個不同的空間位置中發(fā)生。在其他實施方案中，第一種和第二種啟動子具有不同的時間表達才莫式，并且沉默在至少兩個不同的時間或發(fā)育階段(非重疊或重疊的時間段)中發(fā)生。合適的啟動子包括例如，例如控制在不同細胞器(例如，質(zhì)體、核、線粒體)、細胞或組織中的轉(zhuǎn)錄的第一種和第二種啟動子，或控制在不同時間(例如，在晝夜節(jié)律周期的不同點上)或發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄的笫一種和第二種啟動子，或通過誘導物不同地誘導或通過不同的誘導物誘導的第一種和第二種啟動子。在重組DNA構(gòu)建體的某些實施方案中，至少一個基因抑制元件在第一種和第二種啟動子這兩者的轉(zhuǎn)錄控制下。在這些實施方案中，至個不同^間或發(fā)育階段)的至^一種靶基^。^在某些實施方案中，重組DNA構(gòu)建體進一步包括下述中的一種或多種(a)與第二種啟動子可操作地連接的第二種基因抑制元件；(b)用于表達至少一個外源基因的至少一個基因表達元件；(c)至少一個終止子，和U)至少一個T-DM邊界。第二種基因抑制元件以使得第二種基因抑制元件的轉(zhuǎn)錄導致其革巴向的基因的有意沉默的方式排列；因此，在許多實施方案中，第二種基因抑制元件與第一種啟動子處于相反方向。由至少一個基因抑制元件表達的至少一個外源基因可以是任何在天然背景外表達的一種或多種，并且可以包括例如標記基因、密碼子優(yōu)化基因、天然基因的等位置換。在重組DNA構(gòu)建體的某些實施方案中，至少一個第一種基因抑制元件包括選自下述的至少一個元件(a)包括至少一個反義DM區(qū)段的DNA,所述反義DNA區(qū)段與至少一個第一種粑基因的至少一個區(qū)段是反義的；(b)包括至少一個反義DNA區(qū)段的多個拷貝的DM,所述反義DM區(qū)段與至少一個第一種耙基因的至少一個區(qū)段是反義的；(c)包括至少一個有義DNA區(qū)|殳的DM，所述有義DNA區(qū)段是至少一個第一種乾^基因的至少一個區(qū)段；(d)包括至少一個有義DNA區(qū)段的多個拷貝的DNA,所述有義DM區(qū)段是至少一個第一種耙基因的至少一個區(qū)段；(e)DNA,其轉(zhuǎn)錄成RNA,用于通過形成雙鏈RNA而抑制至少一個第一種革巴基因，并且包括與至少一個靶基因的至少一個區(qū)段反義的至少一個反義DNA區(qū)段、和作為至少一個第一種靶基因的至少一個區(qū)段的至少一個有義DNA區(qū)I殳；(f)DNA,其轉(zhuǎn)錄成RNA,用于通過形成單個雙鏈RNA而抑制至少一個第一種靶基因，并且包括與至少一個第一種靶基因的至少一個區(qū)段反義的多個連續(xù)的反義DNA區(qū)段、和作為至少一個第一種耙基因的至少一個區(qū)段的多個連續(xù)的有義DNA區(qū)段；(g)DNA,其轉(zhuǎn)錄成RNA，用于通過形成多個雙鏈RM而抑制至少一個第一種靶基因，并且包括與至少一個第一種靶基因的至少一個區(qū)段反義的多個反義DNA區(qū)段、和作為至少一個第一種靶基因的至少一個區(qū)段的多個有義DNA區(qū)段，并且其中多個反義DNA區(qū)段和多個有義DNA區(qū)段以一系列反向重復排列；(h)包括來源于植物miRNA的核苷酸的DM;(i)包括siRNA的核普酸的DNA;(j)轉(zhuǎn)錄成能夠與配體結(jié)合的RM適體的DNA;和(k)轉(zhuǎn)錄成與配體結(jié)合的RNA適體的DNA,和轉(zhuǎn)錄成能夠調(diào)節(jié)第一種粑基因表達的調(diào)節(jié)RNA的MA,其中調(diào)節(jié)依賴調(diào)節(jié)RNA的構(gòu)象，并且調(diào)節(jié)RNA的構(gòu)象受RNA適體的結(jié)合狀態(tài)的變構(gòu)效應影響。合適的基因抑制元件在美國專利申請?zhí)?1/303,745中得到進一步描述。在重組DNA構(gòu)建體的某些實施方案中，第一種基因抑制元件嵌入內(nèi)含子中。在優(yōu)選實施方案中，內(nèi)含子在一側(cè)或所有兩側(cè)上側(cè)接非蛋白質(zhì)編碼DNA，和更優(yōu)選地是轉(zhuǎn)錄增強內(nèi)含子(例如，"增強子"，例如稻肌動蛋白1和稻肌動蛋白2基因、玉米醇脫氫酶基因、玉米熱休克蛋白70基因和玉米皺縮l基因的5'內(nèi)含子)。在某些實施方案中，重組DNA構(gòu)建體進一步包括與第二種啟動子可操作地連接的第二種基因抑制元件，其中第一種和第二種基因抑制元件嵌入內(nèi)含子中(單個地在分開的內(nèi)含子中或一起在單個內(nèi)含子中)。第二種基因抑制元件以使得第二種基因抑制元件的轉(zhuǎn)錄導致其靶向的基因的有意沉默的方式排列；因此，在許多實施方案中，第二種基因抑制元件與第一種啟動子處于相反方向。在重組DNA構(gòu)建體的一個特別優(yōu)選的實施方案中，第一種和第二、由本發(fā)明進一步提供的是植物中的基因沉默方法其包括(a)用重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細胞，從而提供轉(zhuǎn)基因植物細胞，所述重組DNA構(gòu)建體包括(i)與用于使至少一個第一種耙基因沉默的至少一個第一種基因抑制元件可操作地連接的第一種啟動子，和(ii)與第一種啟動子處于相反方向且位于至少一個第一種基因抑制元件3'的第二種啟動子，其中第一種和第二種啟動子具有不同的表達模式，并且其中重組DNA構(gòu)建體在真核細胞(例如植物細胞或動物細胞)中的轉(zhuǎn)錄導致至少一個第一種靶基因沉默；(b)由轉(zhuǎn)基因植物細胞制備再生的轉(zhuǎn)基因植物、或制備再生的轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因后代種子或轉(zhuǎn)基因后代植物；(c)在再生的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因后代種子或轉(zhuǎn)基因后代植物中轉(zhuǎn)錄重組DNA構(gòu)建體，由此使至少一個笫一種靶基因在再生的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因后代種子或轉(zhuǎn)基因后代植物中沉默。在該方法的優(yōu)選實施方案中，植物是農(nóng)作物植物，例如，谷類作物(例如，玉米、稻、小麥、大麥、黑麥)，豆類(例如，大豆、苜蓿、菜豆、花生)，油料種子(例如，油菜、卡諾拉(canola)、大豆、堅果)，和水果或蔬菜農(nóng)作物植物。在一個優(yōu)選實施方案中，重組DNA構(gòu)建體在具有大量胚乳的轉(zhuǎn)基因后代種子(例如，轉(zhuǎn)基因玉米或稻種子或其他谷類谷粒種子)中進行轉(zhuǎn)錄，并且第一種和第二種啟動子包括植物胚特異性啟動子和植物胚乳特異性啟動子。特別優(yōu)選的是這樣的方法，其中轉(zhuǎn)基因后代種子是轉(zhuǎn)基因后代玉米種子，至少一個第一種靶基因是至少一個賴氨酸分解代謝基因，并且使至少一個賴氨酸分解代謝基因在轉(zhuǎn)基因后代種子的胚和胚乳細胞中沉默。在該方法的另一個特別優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)基因后代種子是轉(zhuǎn)基因后代玉米種子，至少一個第一種粑基因是至少一個賴氨酸分解代謝基因，使至少一個賴氨酸分解代謝基因在轉(zhuǎn)基因后代種子的胚和胚乳細胞中沉默，并且重組DNA構(gòu)建體進一步包括與胚乳特異性啟動子可操作地連接的至少一個賴氨酸生物合成基因。本發(fā)明進一步提供了用于制備具有增加水平的營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)基因玉米種子的方法，該方法包括(a)選擇包含重組DNA構(gòu)建體的第一種轉(zhuǎn)基因玉米植物，所述重組DNA構(gòu)建體包括(i)與用于使至少一個第一種靶基因沉默的至少一個第一種基因抑制元件可操作地連接的第一種啟動子，其中至少一個第一種耙基因是選自氨基酸、脂質(zhì)或碳水化合物的營養(yǎng)物質(zhì)的分解代謝基因，和(ii)與第一種啟動子處于相反方向且位于至少一個第一種基因抑制元件3'的所述第二種啟動子，其中第一種和所述第二種啟動子具有不同的表達^f莫式，和其中重組DNA構(gòu)建體在真核細胞(例如植物細胞或動物細胞)中的轉(zhuǎn)錄導致至少一個第一種粑基因沉默；(b)將重組DM構(gòu)建體基因漸滲到第二種玉米植物內(nèi)；(c)由第二種玉米植物培養(yǎng)種子以產(chǎn)生后代玉米植物群體；(d)在后代玉米植物群體中篩選后代玉米植物，其產(chǎn)生相對于非轉(zhuǎn)基因玉米植物具有增加水平的營養(yǎng)物質(zhì)的玉米種子；(e)從群體中選擇一種或多種后代玉米植物，其產(chǎn)生相對于非轉(zhuǎn)基因玉米植物具有增加水平的營養(yǎng)物質(zhì)的玉米種子；(f)驗證重組DNA構(gòu)建體穩(wěn)定整合到所選擇的后代玉米植物中；(g)驗證相對于缺乏重組DNA構(gòu)建體的玉米植物，營養(yǎng)物質(zhì)的分解代謝基因在所選擇的后代玉米植物中被沉默；(h)收集來自所選擇的后代玉米植物的轉(zhuǎn)基因玉米種子。重組DNA構(gòu)建體任選包括基因表達元件。在該方法的各種實施方案中，待增加的營養(yǎng)物質(zhì)是氨基酸(例如，賴氨酸、甲硫氨酸或色氨酸)，脂質(zhì)(例如，脂肪酸或脂肪酸酯)，或碳水化合物(例如簡單糖或復合糖)。在該方法的一個優(yōu)選實施方案中，營養(yǎng)物質(zhì)是賴氨酸，分解代謝基因是賴氨酸分解代謝基因(例如，玉米賴氨酸酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氬酶)，并且第一種和第二種啟動子包括植物胚特異性啟動子和植物胚乳特異性啟動子；任選地，重組DNA構(gòu)建體還包括用于表達賴氨酸生物合成基因(例如，cordapA或lysC)的基因表達元件。植物轉(zhuǎn)化方法用重組DNA轉(zhuǎn)化植物細胞的眾多方法是本領域已知的，并且可以在本發(fā)明中使用。用于植物轉(zhuǎn)化的2種常用方法是土壤桿菌介導的轉(zhuǎn)化和微粒轟擊。微粒轟擊法在美國專利5，015，580(大豆)；5,550,318(玉米)；5,538,880(玉米)；5，914，451(大豆)；6，160，208(玉米)；6,399,861(玉米)和6,153,812(小麥)中得到舉例說明，土壤桿菌介導的轉(zhuǎn)化在美國專利5,159，135(棉花)；5，824,877(大豆)；5,591，616(玉米)；和6,384，301(大豆)中得到描述。對于基于根癌土壤桿菌的植物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，存在于轉(zhuǎn)化構(gòu)建體上的另外元件包括T-DNA左和/或右邊界序列(一般地左和右邊界序列，但優(yōu)選地至少一個邊界序列，例如至少右邊界序列)，以促進重組多核苷酸摻入植物基因組內(nèi)。一般而言，隨機引入重組DM是有用的，即在靶植物系基因組中的非特異性位置上。在特別情況下，靶重組DNA插入可能是有用的，以便達到位點特異性整合，例如替換基因組中的現(xiàn)有基因，使用植物基因組中的現(xiàn)有啟動子，或在已知對于基因表達有活性的預定位點上插入重組多核苷酸。已知在植物中起作用的現(xiàn)存的幾種位點特異性重組系統(tǒng)包括如美國專利4，959，317中^>開的cre-lox和如美國專利5，527，695中公開的FLP-FRT。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化方法優(yōu)選在培養(yǎng)基上和受控環(huán)境中的組織培養(yǎng)中進行實踐。"培養(yǎng)基"指用于在體外，即在完整活生物外培養(yǎng)細胞的眾多營養(yǎng)物質(zhì)混合物。受體細胞靶包括但不限于，分生組織細胞、愈傷組織、未成熟胚和配子細胞例如小孢子、花粉、精子和卵細胞。預期可以再生可育植物的任何細胞可用作受體細胞。愈傷組織可以由組織來源起始，所述組織來源包括但不限于，未成熟胚、幼苗頂端分生組織、小孢子等。能夠作為愈傷組織繁殖的細胞也是用于遺傳轉(zhuǎn)化的受體細胞。用于制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的實踐轉(zhuǎn)化方法和材料，例如各種培養(yǎng)基和受體靶細胞、未成熟胚的轉(zhuǎn)化和可育轉(zhuǎn)基因植物的后續(xù)再生公開于美國專利6，194，636和6，232，526以及美國專利申請序列號09/757，089。轉(zhuǎn)基因植物的種子可以由可育轉(zhuǎn)基因植物進行收獲，并且用于培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物的后代，包括包含重組DNA構(gòu)建體的雜交植物系，所述重組DNA構(gòu)建體表達用于基因抑制的試劑。除了用重組DNA構(gòu)建體直接轉(zhuǎn)化植物外，轉(zhuǎn)基因植物可以通過使具有重組DNA構(gòu)建體的第一種植物與缺乏構(gòu)建體的第二種植物雜交進行制備。例如，用于基因抑制的重組DNA可以引入第一種植物系內(nèi)，所述第一種植物系容易進行轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生可以與第二種植物系雜交的轉(zhuǎn)基因植物，以使用于基因抑制的重組DNA基因漸滲到第二種植物系內(nèi)。具有實現(xiàn)基因抑制的重組DM的轉(zhuǎn)基因植物可以與具有其他重組DM的轉(zhuǎn)基因植物系進行雜交，所述其他重組DNA賦予另一種性狀，例如產(chǎn)量改善、除草劑抗性或害蟲抗性，以產(chǎn)生具有賦予基因抑制和另一種性狀的重組DM的后代植物。一般地，在用于組合性狀的此類育種中，貢獻另外性狀的轉(zhuǎn)基因植物是雄系，攜帶基礎性狀的轉(zhuǎn)基因植物是雌系。這種雜交的后代將以下述方式分離，即，使得某些植物將攜帶2種親本性狀的DNA,并且某些將攜帶1種親本性狀的DM;此類植物可以通過與親本重組DM相關的標記進行鑒定。攜帶2種親本性狀的DNA的后代植物可以與母系多次回交，例如通常6-8代，以產(chǎn)生除了另一個轉(zhuǎn)基因親本品系的重組DNA夕卜，具有與一個原始轉(zhuǎn)基因親本品系基本上相同的基因型的后代植物。實施例實施例1這個實施例舉例說明了本發(fā)明的方法。參考圖2,制備2種盒用于反義抑制表達愛光素酶的生物中的螢光素酶。第一個螢光素酶反義盒包含與螢火蟲螢光素酶編碼DNA(反義LUC)的反義區(qū)段可操作地連接的CaMV35S啟動子(35S3，)和nos3'元件。第二個螢光素酶反義盒包含與螢火蟲螢光素酶編碼DNA的相同反義區(qū)段可操作地連接的FMV啟動子(FMV5，)和小麥熱休克蛋白3'元件(hsp3')。反義盒在轉(zhuǎn)化質(zhì)粒中彼此反向地組裝，其中各自3'元件是鄰接的。令人驚訝地，當質(zhì)粒插入普通的大腸桿菌菌林內(nèi)時，組裝的盒不易于切割。質(zhì)粒連同能夠表達螢火蟲螢光素酶和腎海鰓(Renilla)螢光素酶基因的兩個質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)化到植物細胞內(nèi)，后者充當螢火蟲螢光素酶表達的基線對照，螢火蟲縈光素酶表達針對其進行標準化。因此，營火蟲螢光素酶與腎海鰓縈光素酶表達的比是螢火蟲螢光素酶基因抑制水平的測量值。與用螢火蟲螢光素酶反義盒的單拷貝轉(zhuǎn)化的植物細胞比較，多種盒顯示轉(zhuǎn)基因植物細胞中更高水平的螢火蟲螢光素酶抑制。實施例2這個實施例舉例說明了用于植物組織中的選擇性基因抑制的構(gòu)建體。制備第一種反義基因抑制構(gòu)建體，其在與有義方向的第二個區(qū)段連接的反義方向的第一個區(qū)段中，包含與可轉(zhuǎn)錄DNA可操作地連接的玉米植物胚乳特異性啟動子B32(Genbank登記號X70153的核苷酸848至1259,還參見Hartings等人(1990)PlantMol.Biol.,14:1031-1040),所述可轉(zhuǎn)錄DNA由玉米賴氨酸酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶基因(LKR/SDH)的LKR結(jié)構(gòu)域的約500個石咸基對組成。因為LKR是賴氨酸分解代謝酶，所以它的抑制導致增加的賴氨酸。制備第二種反義基因抑制構(gòu)建體，其與第一種反義基因抑制構(gòu)建體基本上相同，除了啟動子替換為玉米植物胚特異性啟動子L3油質(zhì)蛋白(參見美國專利號6,433,252)。根據(jù)本發(fā)明的第三種基因抑制構(gòu)建體通過使第一個構(gòu)建體中使用的B32啟動子與第二種構(gòu)建體的3'末端連接進行制備，提供具有與DNA的反義定向區(qū)段可操作地連接的相反啟動子的構(gòu)建體，所述DNA來自被單巴向用于抑制的基因。在一個可替代的實施方案中，本發(fā)明的基因抑制構(gòu)建體由第二種反義基因抑制構(gòu)建體進行制備，其是通過用與在構(gòu)建體的相反末端上的L3啟動子處于相反方向插入的B32啟動子替換提供聚腺苷酸化信號和位點的3'調(diào)節(jié)區(qū)(參見圖3A)而實現(xiàn)的。在另一個可替代的實施方案中，本發(fā)明的構(gòu)建體通過下述進行制備添加3'調(diào)節(jié)區(qū)下游和與在構(gòu)建體的相反末端上的L3啟動子處于相反方向的B32啟動子；任選地第二個3'調(diào)節(jié)區(qū)插入在L3啟動子和可轉(zhuǎn)錄DNA之間。在另外一個實施方案中，本發(fā)明的構(gòu)建體通過使3'調(diào)節(jié)區(qū)位于構(gòu)建體的外側(cè)區(qū)進行制備，其中每個3'調(diào)節(jié)區(qū)定向于在構(gòu)建體的相反末端上的啟動子。在另外一個實施方案中，兩個反義構(gòu)建體以尾對尾方向進行組裝，提供由各自的啟動子結(jié)合的構(gòu)建體。適合于土壤桿菌介導的植物轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒使用下述中的每一個進行制備(a)具有B32啟動子的第一種反義基因抑制構(gòu)建體，(b)具有L3啟動子的第二種反義基因抑制構(gòu)建體，和(c)具有在構(gòu)建體的相反末端上和處于相反方向的B32和L3啟動子的本發(fā)明的基因抑制構(gòu)建體。將每個構(gòu)建體插入用于土壤桿菌介導的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的二元載體的質(zhì)粒內(nèi)的左和右T-DNA邊界之間，且緊靠用于表達來自根癌土壤桿菌的aroA基因的選擇標記盒。通過土壤桿菌介導的轉(zhuǎn)化將每個質(zhì)粒插入玉米愈傷組織內(nèi)。事件作為對草甘膦除草劑的抗性進行選擇，并且生長成轉(zhuǎn)基因玉米植物以產(chǎn)生Fl種子。來自每個事件的成熟種子進行分析，以測定轉(zhuǎn)化的成功和力^的抑制。成熟的轉(zhuǎn)基因種子進行剖析，以提取蛋白質(zhì)用于蛋白質(zhì)分析。與野生型比較，來自轉(zhuǎn)基因玉米植物的種子顯示Z/i的減少和增加的賴氨酸。具有胚乳特異性啟動子的第一種構(gòu)建體提供具有約1000ppm游離賴氨酸的種子；LKR減少基本上僅在胚乳組織中觀察到。具有胚特異性啟動子的第二種構(gòu)建體提供具有約3000ppm游離賴氨酸的種子；LKR減少基本上僅在胚組織中觀察到。因為賴氨酸被認為在胚和胚乳之間移動，所以使用本發(fā)明的構(gòu)建體同時抑制胚和胚乳組織中的LKR提供了具有比來自單獨一個組織抑制的疊加效應更高的游離賴氨酸值的種子，例如大于1300ppm。實施例3于其使用的方法、^本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因玉米種子。在這個具#"實施例中，包括植物胚特異性啟動子和植物胚乳特異性啟動子的重組DNA構(gòu)建體用于提供轉(zhuǎn)基因植物細胞、以及來源于此類轉(zhuǎn)基因植物細胞的轉(zhuǎn)基因后代玉米植物和種子，所述啟動子各自與用于使賴氨酸分解代謝基因沉默的至少一個基因抑制元件可操作地連接，其中轉(zhuǎn)基因后代種子具有增加的賴氨酸。用于例如提供本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細胞、轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因種子的重組DNA構(gòu)建體的一個非限制性實施方案在圖3B中得到舉例說明，并且包括(i)與包括DNA的至少一個第一種基因抑制元件可操作地連接的植物胚乳特異性啟動子，所述DNA轉(zhuǎn)錄成RNA,用于通過形成雙鏈RNA來使賴氨酸分解代謝基因沉默(例如，包括至少一個反義DNA區(qū)段和至少一個有義DNA區(qū)段的DNA,所述反義DNA區(qū)段與至少一個第一種耙基因的至少一個區(qū)段是反義的，所述有義DNA區(qū)段是至少一個第一種靶基因的至少一個區(qū)段；或在兩個轉(zhuǎn)錄方向上編碼反式作用miRNA的DNA),(ii)與第一種啟動子處于相反方向且與至少一個第一種基因抑制元件可操作地連接的植物胚特異性啟動子，和(iii)與第一種或第二種啟動子可操作地連接的至少一個終止子(其中每個終止子可以在處于相反方向的啟動子的任一側(cè)上。在一個具體例子中，重組DM構(gòu)建體(在圖4中舉例說明，從頂部起的第三個構(gòu)建體)通過土壤桿菌介導的轉(zhuǎn)化穩(wěn)定引入玉米植物細胞內(nèi)，并且后代玉米植物如上文"植物轉(zhuǎn)化方法"下所述的進行再生。這種構(gòu)建體包括(a)與穩(wěn)定的反義基因抑制元件和用于表達賴氨酸不敏感性棒狀桿菌(Corynebacterium)腸PS或cordapA("cordapA，，)的基因表達元件(參見美國專利號6,459,019和5，773，691以及美國專利申請發(fā)明者L·吉爾伯森,S·黃,T·M·馬爾瓦申請人:孟山都技術有限公司