專利名稱：：調(diào)節(jié)肌細(xì)胞增殖和分化的microrna的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般性涉及調(diào)節(jié)肌細(xì)胞中基因表達(dá)的方法和組合物。本發(fā)明更特別涉及使用microRNAs(miRNA)調(diào)節(jié)肌細(xì)胞中基因表達(dá)水平的方法，并涉及包含miRNA的組合物。
背景技術(shù)：
：了解調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化的分子機(jī)制是發(fā)育生物學(xué)的核心問(wèn)題。MicroRNA(miRNA)是近年來(lái)揭示的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)的大約22類核苷酸調(diào)節(jié)性RNA中的一類u。越來(lái)越多的證據(jù)表明miRNA在多種生物學(xué)進(jìn)程中的關(guān)鍵作用3'8。然而，本領(lǐng)域仍長(zhǎng)期且持續(xù)需要鑒別miRNA在生物學(xué)進(jìn)程中的作用。本發(fā)明專注于本領(lǐng)域的這種及其它需要。發(fā)明概述本發(fā)明概述列出了本發(fā)明的一些實(shí)施方案，以及在許多情況中這些實(shí)施方案的變化和改變。本發(fā)明概述只是例證了多個(gè)不同的實(shí)施方案。同樣只是例證了指定實(shí)施方案的一或多個(gè)特征。這種實(shí)施方案可以典型地具有或不具有所提及的特征；同樣，那些特征可以用于本發(fā)明概述中列出或未列出的本發(fā)明的其它實(shí)施方案。為了避免重復(fù)，本發(fā)明概述未列出或提出這種特征的所有可能的組合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種治療對(duì)象中肌損傷的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括給予對(duì)象中的肌損傷部位有效量的miRNA或者編碼miRNA的載體或者miRNA的抑制劑，其中所述miRNA耙向于肌損傷部位的肌細(xì)胞中的基因。在一些實(shí)施方案中，miRNA的抑制劑能與靶miRNA雜交；在一些實(shí)施方案中，所述靶miRNA選自miR陽(yáng)l、miR誦133、miR畫206、miR-208、miR畫22、miR-26、miR-29、miR-30、miR-128、miR-143和miR-145組成的組。在一些特殊的實(shí)施方案中，首先將miRNA-133和miRNA-1的抑制劑組合給予肌損傷部位，其次將miRNA-1和miRNA-133的抑制劑組合給予肌損傷部位，從而治療所述肌損傷。在一些實(shí)施方案中，所述肌損傷是由于機(jī)械性肌組織創(chuàng)傷(mechanicalmuscletrauma)、肌退行性病變(musculardegenerativedisorder)、心肌損傷(cardiacinsult)或者這些原因的組合所致。在一些實(shí)施方案中，所述對(duì)象是哺乳動(dòng)物。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種調(diào)節(jié)肌細(xì)胞分化、增殖或者這兩者的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括將肌細(xì)胞與靶向于所述肌細(xì)胞中基因的可調(diào)節(jié)肌細(xì)胞分化、增殖或這二者的miRNA或者編碼所述miRNA的載體接觸。在一些實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)是抑制，且在一些實(shí)施方案中，所述miRNA抑制基因的翻譯。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種調(diào)節(jié)肌細(xì)胞中的基因表達(dá)的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括將肌細(xì)胞與耙向于所述肌細(xì)胞中基因的miRNA或者編碼miRNA的載體接觸。在一些實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)是抑制，且在一些實(shí)施方案中，所述miRNA抑制所述基因的翻譯。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種抑制肌細(xì)胞中的基因表達(dá)的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括用編碼miRNA分子的載體轉(zhuǎn)化所述肌細(xì)胞，其中所述miRNA分子包含與所述基因的17個(gè)-24個(gè)連續(xù)核苷酸的亞序列至少70%相同的核苷酸序列，除外的是所述miRNA包含尿嘧啶代替在所述基因中發(fā)現(xiàn)的任何胸腺嘧啶。在一些實(shí)施方案中，所述miRNA抑制所述基因的翻譯。在本發(fā)明揭示的方法的一些實(shí)施方案中，所應(yīng)用的miRNA包含選自由SEQIDNO:1-11中任一序列及與SEQIDNO:1-11至少70%相同的任一核苷酸序列組成的組。在一些實(shí)施方案中，所述miRNA選自miR-l、miR-133、miR-206、miR隱208、miR-22、miR-26、miR-29、miR-30、miR隱128、miR-143和miR-145組成的組。另外，在一些實(shí)施方案中，所述miRNA靶向于所述基因的3'未翻譯區(qū)域。另外，在所述方法的一些實(shí)施方案中，由所述miRNA耙向的基因選自肌細(xì)胞分化基因(例如編碼組蛋白脫乙酰酶4(HDAC4)多肽的基因，或者編碼甲狀腺激素受體蛋白240(TRAP240)的基因)、肌細(xì)胞增殖基因(例如編碼血清應(yīng)答因子(SRF)多肽的基因)及激素相關(guān)蛋白(例如編碼甲狀腺激素相關(guān)蛋白的基因l(Thrapl》。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了編碼miRNA的載體。在一些實(shí)施方案中，所述載體包含與編碼所述miRNA分子的核酸分子可操縱地連接的啟動(dòng)子，及包含轉(zhuǎn)錄終止序列。另外，在一些實(shí)施方案中，所述載體摻入一個(gè)試劑盒中，該試劑盒進(jìn)一步包含將所述載體導(dǎo)入肌細(xì)胞中的至少一種試劑。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包含將所述載體導(dǎo)入肌細(xì)胞中的說(shuō)明書。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種使用miRNA介導(dǎo)的方法操縱肌細(xì)胞中基因表達(dá)的方法。通過(guò)本發(fā)明可以全部或部分實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的。本發(fā)明的一個(gè)目的在上文已經(jīng)闡述，本領(lǐng)域技術(shù)人員在研究了如9下發(fā)明描述和非限制性實(shí)施例之后將顯而易見(jiàn)本發(fā)明的其它目的。附圖簡(jiǎn)述圖la-le描述了miR-l和miR-133在發(fā)育期間的心肌和骨骼肌中的表達(dá)數(shù)據(jù)。圖la示出了在生長(zhǎng)培養(yǎng)基(GM)或者在分化培養(yǎng)基(DM)中分別培養(yǎng)0、1、3和5天的C2C12肌細(xì)胞的miRNA陣列表達(dá)數(shù)據(jù)。歸一化的log(以2為底)數(shù)據(jù)由基因分級(jí)聚類，并繪圖為熱圖(heatmap)。信號(hào)范圍為^倍至+4倍。黃色表示相對(duì)于中值高水平表達(dá)，藍(lán)色表示相對(duì)于中值低水平表達(dá)，并示出了在分化培養(yǎng)基中被上調(diào)的唯一miRNA節(jié)。圖lb描述了miR-l和miR-133表達(dá)的Northern印跡分析，使用分離自在GM或DM中分別培養(yǎng)O、1、3和5天的C2C12肌細(xì)胞的總RNA。tRNA用作加樣對(duì)照。圖lc描述了miR-l和miR-133在成年小鼠中表達(dá)的Northern印跡分析。圖Id描述了miR-l和miR-133在胚胎期第13.5(E13.5)和16.5(E16.5)天的小鼠組織中表達(dá)的Northern印跡分析。圖le描述了miR-l和miR-133在新生小鼠組織中表達(dá)的Northern印跡分析。將來(lái)自成年小鼠心肌和骨骼肌的相同量的總RNA加樣于印跡中，以與胚胎和新生兒RNA進(jìn)行對(duì)比(圖ld和le)。圖2a-2j描述了顯示出miR-l和miR-133調(diào)節(jié)肌細(xì)胞增殖和分化的數(shù)據(jù)。將在生長(zhǎng)培養(yǎng)基(GM)中培養(yǎng)的C2C12肌細(xì)胞用miR-l、miR-133的雙鏈miRNA雙鏈體電穿孔，GFP作為對(duì)照。圖2a-2e示出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在GM中連續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，然后移至分化培養(yǎng)基(DM)中培養(yǎng)12小時(shí)或36小時(shí)之后分別對(duì)肌形成蛋白(myogenin)(圖2a)或MHC(圖2b)免疫染色。將在GM中培養(yǎng)的C2C12肌細(xì)胞用miR-l、miR-133(或其指定突變體)或者作為對(duì)照的miR-208和GFP的雙鏈miRNA雙鏈體電穿孔，在培養(yǎng)24小時(shí)之后使用指定抗體進(jìn)行Western印跡(圖2c)，將細(xì)胞移至DM中培養(yǎng)24小時(shí)，對(duì)指定基因進(jìn)行RT-PCR(圖2d);或者將細(xì)胞移至DM中培養(yǎng)24小時(shí)，使用指定抗體進(jìn)行Western印跡(圖2e)。圖2f-2h示出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中將在GM中培養(yǎng)的C2C12肌細(xì)胞用針對(duì)miR-l、miR-133或者作為對(duì)照的miR-208和GFP的2'-0-甲基反義寡核苷酸抑制劑電穿孔。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在GM中培養(yǎng)24小時(shí)，然后移至DM中進(jìn)行如下步驟12小時(shí)后用磷酸-組蛋白H3免疫染色(圖2f);24小時(shí)之后對(duì)指定基因進(jìn)行RT-PCR(圖2g);或者24小時(shí)之后用指定抗體進(jìn)行Western印跡(圖2h)。圖2i和2j示出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中將在GM中培養(yǎng)的C2C12肌細(xì)胞用指定的miRNA雙鏈體或者2'-0-甲基反義寡核苷酸抑制劑電穿孔。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在GM中培養(yǎng)24小時(shí)，然后移至DM中培養(yǎng)12小時(shí)后用肌形成蛋白(圖2i)或者磷酸-組蛋白H3(圖2j)免疫染色。計(jì)數(shù)陽(yáng)性染色的細(xì)胞，并將數(shù)據(jù)以相對(duì)于GFP對(duì)照組的表達(dá)水平(100%)表示。圖3a-3k描述了miR-l和miR-133在體內(nèi)控制心肌和骨骼肌發(fā)育的數(shù)據(jù)。圖3a-3h示出得自義e"o;^胚胎實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。義ewo;w胚胎得自未注射的(圖3a和3b)、注射對(duì)照GFPRNA的(圖3c和3d)、注射miR-l的(圖3e和3f)或者注射miR-133的(圖3g和3h)抗原肌球蛋白染色的胚胎，并示出在亮視野(圖3a、3c、3e和3g)或者熒光(圖3b、3d、3f和3h)下的第32階段。注意心肌組織無(wú)染色(圖3b和3d，H箭頭)及節(jié)段的體節(jié)破壞(圖3f和3h，S箭頭)。圖3i-3k示出Ze"o/w胚胎的橫切面。胚胎的橫切面相應(yīng)于第32階段胚胎的心臟的位置，所述胚胎為未注射的(圖3i)、注射miR-l的(圖3j)或者注射miR-133的(圖3k)胚胎，并用抗原肌球蛋白染色以觀測(cè)體節(jié)(S箭頭)和心肌組織(H箭頭)并用抗磷酸-組蛋白H3(紅色)染色以觀測(cè)S期細(xì)胞。每組注射單獨(dú)進(jìn)行至少兩次，在至少90%的最少50個(gè)胚胎中通過(guò)全標(biāo)本包埋免疫染色評(píng)分觀測(cè)表型。圖4a-4i示出骨骼肌中miR-l和miR-133靶基因的鑒別。圖4a示出miR-133和miR-l對(duì)SRF和HDAC43'UTR的抑制。將含有來(lái)自小鼠SRF3，UTR(SRF-3，-UTR)的miR-133互補(bǔ)位點(diǎn)、小鼠HDAC43，UTR(HDAC4-3，-UTR)的miR-l互補(bǔ)位點(diǎn)或者miR-133(miR-133-luc)或miR-l(miR-l-luc)的完全反義序列的螢光素酶報(bào)道基因與指定的miRNA表達(dá)載體或者其突變體共轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后確定螢光素酶活性。數(shù)據(jù)以來(lái)自一式兩份進(jìn)行的至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。P〈0.05)。圖4b示出轉(zhuǎn)染進(jìn)C2C12肌細(xì)胞中的SRF-3'-UTR、HDAC4-3'-UTR和MCK-luc螢光素酶報(bào)道基因的結(jié)果。細(xì)胞在GM中培養(yǎng)24小時(shí)，或者移至DM中培養(yǎng)1天(DM1)或3天(DM3)，之后確定螢光素酶活性。圖4c-4e示出在GM中培養(yǎng)的并且用指定的雙鏈miRNA雙鏈體(或其突變體)或者作為對(duì)照的miR-208和GFP電穿孔的C2C12肌細(xì)胞的結(jié)果數(shù)據(jù)。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在GM中培養(yǎng)24小時(shí)，之后進(jìn)行如下步驟使用抗-SRF和抗-HDACM抗體進(jìn)行Western印跡(圖化)；將細(xì)胞移至DM中培養(yǎng)24小時(shí)并對(duì)指定基因進(jìn)行RT-PCR(圖4d);將細(xì)胞移至DM中培養(yǎng)24小時(shí)并使用指定抗體進(jìn)行Western印跡。將在GM中培養(yǎng)的C2C12肌細(xì)胞用指定的2，-0-甲基反義寡核苷酸抑制劑電穿孔(圖4e)。圖4f和4g示出將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在GM中培養(yǎng)24小時(shí)，然后移至DM中培養(yǎng)24小時(shí)，之后針對(duì)指定基因進(jìn)行RT-PCR(圖4f)及使用指定抗體進(jìn)行Western印跡的結(jié)果C圖4g)。12圖4h示出在GM中培養(yǎng)且用指定的雙鏈miRNA雙鏈體或者/和指定的SRF或HDAC4的表達(dá)質(zhì)粒電穿孔的C2C12肌細(xì)胞的結(jié)果。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在GM中培養(yǎng)24小時(shí)。在移至DM中之后使用指定抗體進(jìn)行Western印跡。圖4i示出在GM或DM中培養(yǎng)0、1、3或5天的C2C12肌細(xì)胞的結(jié)果。使用指定抗體進(jìn)行Western印跡。圖5示出miR-l和miR-133介導(dǎo)的調(diào)節(jié)骨骼肌增殖和分化的模型。圖6示出在生長(zhǎng)培養(yǎng)基(GM)或分化培養(yǎng)基(DM)中分別培養(yǎng)0、1、3和5天的C2C12肌細(xì)胞的miRNA陣列表達(dá)數(shù)據(jù)的分析資料。歸一化的1og(以2為底)數(shù)據(jù)是基因分級(jí)聚類數(shù)據(jù)，并且繪制為熱圖。信號(hào)范圍是從~4倍至+4倍。淡陰影表示相對(duì)于中值的高水平表達(dá)，濃陰影表示相對(duì)于中值的低水平表達(dá)。圖7a-7d示出miR-l、miR-133和骨骼肌分化標(biāo)記基因在C2C12細(xì)胞中的表達(dá)。圖7a和7b示出對(duì)miR-1(圖7a)和miR-133(圖7b)的表達(dá)進(jìn)行的Northem印跡分析，使用分離自在GM或者在分化培養(yǎng)基(DM)中分別培養(yǎng)0、1、3和5天的C2C12肌細(xì)胞的總RNA進(jìn)行所述分析。成熟的miRNA及其前體(Pre)被指明。tRNA用作加樣對(duì)照。圖7c示出骨骼肌分化標(biāo)記基因的半定量RT-PCR分析。GAPDH用作等量加樣的對(duì)照。圖7d示出骨骼肌分化標(biāo)記基因的表達(dá)。將C2C12肌細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基(GM)或者在分化培養(yǎng)基(DM)中培養(yǎng)O、1、3和5天，使用指定抗體對(duì)細(xì)胞提取物進(jìn)行Westem印跡分析。P-微管蛋白用作加樣對(duì)照。圖8a-8f示出miR-l和miR-133在成年小鼠及發(fā)育中小鼠的心肌和骨骼肌中的表達(dá)。圖中示出了miR-l(圖8a)和miR-133(圖8d)在成年小鼠組織中表達(dá)的Northern印跡分析。圖中示出了miR-1(圖8b)和miR-133(圖8e)在胚胎第13.5天(E13.5)和16.5天(E16.5)小鼠組織中表達(dá)的Northern印跡分析。另外將等量的成熟心肌和骨骼肌的總RNA加樣于所述印跡中以進(jìn)行對(duì)比。圖中示出了miR-l(圖8c)和miR-133(圖8f)在新生小鼠組織中表達(dá)的Northern印跡分析。另外將等量的成熟心肌和骨骼肌的總RNA加樣于所述印跡中以進(jìn)行對(duì)比。成熟miRNA及其前體(Pre)被指明。tRNA用作加樣對(duì)照。圖9a-9e示出miR-l和miR-133初級(jí)轉(zhuǎn)錄物在心肌和骨骼肌中的表達(dá)。圖9a示出在小鼠染色體2和18上聚集的miR-l和miR-133基因。圖中示出了用于圖9b-9e中Northem印跡的探針。圖9b-9e示出對(duì)來(lái)自染色體2(圖9d和9e)和染色體18(圖9b和9c)的miR-l(圖9c和9e)及miR-133(圖9b和9d)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)進(jìn)行的Northern印跡分析。使用來(lái)自指定成年小鼠組織的20嗎總RNA。圖10a-10g示出miR-l和miR-133增強(qiáng)子可以指導(dǎo)心肌和骨骼肌中報(bào)道基因表達(dá)。圖10a示出與dsRed連接的小鼠miR-l和miR-133基因組序列的轉(zhuǎn)基因的J^"opw/"ev&的數(shù)據(jù)，顯示第28階段的體節(jié)(S，箭頭)表達(dá)。圖10b在明視野下第46階段的具有miR-l和miR-133轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因(Tg)Xe"o/^/"eW(下面的胚胎)及陰性對(duì)照組(非轉(zhuǎn)基因，Ct，上面的胚胎)。圖10c是圖10b中相同胚胎在熒光下的照片。圖10d是圖10b中所述轉(zhuǎn)基因胚胎在明視野中的高倍顯微照片，示出所述轉(zhuǎn)基因在心肌(H，箭頭)和鰓弓(BA，箭頭)中的表達(dá)。圖10e是圖10b中所述轉(zhuǎn)基因胚胎在熒光下的高倍顯微照片，示出所述轉(zhuǎn)基因在心肌(H，箭頭)和鰓弓(BA，箭頭)中的表達(dá)。圖10f是第46階段轉(zhuǎn)基因胚胎的高倍顯微照片，示出所述轉(zhuǎn)基因在體節(jié)中的表達(dá)(S，箭頭)。圖10g示出小鼠染色體2的miR-l/133增強(qiáng)子的基因組DNA序列(SEQIDNo:82)。圖中標(biāo)出了推定的MEF2位點(diǎn)和CArGbox，并且示出了導(dǎo)入這些位點(diǎn)中的突變。圖lla-llh示出在C2C12細(xì)胞中miR-133對(duì)miR-133感應(yīng)器(sensor)的抑制。將穩(wěn)定表達(dá)miR-133感應(yīng)器的C2C12細(xì)胞用GFP(對(duì)照)、野生型miR-133(miR-133)、其中"種子"序列已經(jīng)被突變的突變的miR-133(miR-133mut)的表達(dá)載體或者miR-133表達(dá)載體與2，-0-甲基反義寡聚體的組合(miR-133+2，-0-甲基)轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞移至分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時(shí)，使用相襯(P/C)(圖lla-lld)或熒光成像獲得圖像，示出dsRed報(bào)道基因的表達(dá)(圖lle-llh)。收獲每種條件下培養(yǎng)的細(xì)胞，使用FACS分析量化dsRed報(bào)道基因的表達(dá)(下組)。線下開(kāi)放(Open)區(qū)表示細(xì)胞的自身熒光素，線下劃線區(qū)表示ds-Red表達(dá)。圖12示出/7iX4C^和S^基因的3，UTR中miR-l和miR-133耙位點(diǎn)的序列。上面一組是來(lái)自保守的脊椎動(dòng)物人(SEQIDNO:24)、黑猩猩(SEQIDNO:25)、小鼠(SEQIDNO:26)、大鼠(SEQIDNO:27)、狗(SEQIDNO:28)和雞(SEQIDNO:29)的//^40/3，UTR序列，及其與miR-l(SEQIDNO:l)和miR-206(SEQIDNO:3)的排列對(duì)比。下面一組是人(SEQIDNO:30和31)和大鼠(SEQIDNO:32和33)的S^F3，UTR序列及其與miR-133的排列對(duì)比。保守的核苷酸序列以大寫字體示出。圖13描述了miRNA生物學(xué)發(fā)生的模型。(A)pri-miRNA通過(guò)RNA聚合酶n在細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄，(B)通過(guò)Drosha加工為含有莖一環(huán)的pre-miRNA。(C)Exportin-5識(shí)別Drosha左側(cè)的3，突出端，并將pre-miRNA輸出到細(xì)胞質(zhì)中，在此(D)Dicer裂解莖一環(huán)下面的pre-miRNA，產(chǎn)生22個(gè)核苷酸的雙鏈體。(E)將單鏈摻入RISC中，其中(F)識(shí)別mRNA的3'非翻譯區(qū)內(nèi)的互補(bǔ)序列并通過(guò)翻譯抑制或mRNA裂解而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。圖14a-14c描述了miR-208基因組。圖14a示出小鼠前體miR-208序列(SEQIDNO:34)被折疊，使用mFold及成熟miR-208(SEQIDNO:4)序列向右折疊。圖14b示出小鼠(SEQIDNO:35)、大鼠(SEQIDNO:36)和人(SEQIDNO:37)前體miR-208序列的序列排列對(duì)比。成熟miR-208序列在圖14A的右上方示出。星號(hào)表示完全的序列保守。圖14c示出源自a-MZ/C內(nèi)含子的miR-208。小鼠miR-208位于a-MFC的內(nèi)含子29內(nèi)相似地，人miR-208位于a-M/C的內(nèi)含子28內(nèi)。圖15a-15c示出證實(shí)miR-208受發(fā)育調(diào)節(jié)的資料。對(duì)不同小鼠組織的總RNA進(jìn)行印跡并且用與miR-208互補(bǔ)的5'-放射性標(biāo)記的寡脫氧核苷酸探查。凝膠上總RNA的等量加樣通過(guò)在轉(zhuǎn)移之前進(jìn)行溴化乙啶染色而核實(shí)。圖15a示出證實(shí)了miR-208是心肌特異性的資料。上面的信號(hào)是pre-miR-208轉(zhuǎn)錄物，下面的信號(hào)是成熟的22個(gè)核苷酸形式。圖15b示出相對(duì)于miR-208在成熟心肌和骨骼肌中的表達(dá)miR-208在新生小鼠組織中的表達(dá)。圖15c示出相對(duì)于miR-208在成熟心肌和骨骼肌中表達(dá)miR-208在E13.5和E16.5小鼠不同組織中的表達(dá)。圖16a和16b示出miR-208在心肌細(xì)胞中的異位表達(dá)。圖16a示出使用放射性標(biāo)記的miR-208反義寡核苷酸探查的Ad-GFP或Ad-208感染的心肌細(xì)胞的Northern印跡。圖16b示出MOI為1和10感染的心肌細(xì)胞外熒光(epifluorescent)顯微圖。圖17示出本發(fā)明揭示的條件轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)的圖示。利用兩個(gè)單獨(dú)的轉(zhuǎn)基因小鼠品系一種在a-MHC啟動(dòng)子的控制下表達(dá)tTA-VP16融合蛋白，另一種具有在CMV最小啟動(dòng)子控制下的mz7^朋轉(zhuǎn)基因。所述CMV最小啟動(dòng)子具有位于立即上游的四環(huán)素操縱子(tetO)的幾個(gè)重復(fù)。交配所述兩個(gè)品系(推測(cè)是孟德?tīng)栠z傳模式)，4只小鼠中產(chǎn)生1只雙重轉(zhuǎn)基因小鼠。如果將強(qiáng)力霉素(DOX)給予雙重轉(zhuǎn)基因小鼠，則tTA-VP16蛋白由DOX結(jié)合，且肌7W朋的轉(zhuǎn)錄被抑制。如果不16存在DOX，則tTA蛋白結(jié)合tetO多聯(lián)體，使得VP16結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)m/i-^^從CMV最小啟動(dòng)子中轉(zhuǎn)錄。心肌特異性靶基因表達(dá)可以通過(guò)加入或除去DOX而被開(kāi)啟或關(guān)閉。James""/AmJPhysiol273:H2105-H2118在此并入作參考。圖18A-18C是示出miR-208耙向Thrap1的圖示和序列排列對(duì)比。具有反義mW-2朋序列(mir-208感應(yīng)器)或者i/emog/o^"-卩(Hbb)的3，UTRs及甲狀腺激素相關(guān)蛋白l(Thmpl)(圖18A)或者從Thrap13，UTR中推定的miR-208結(jié)合位點(diǎn)的四個(gè)拷貝(圖18B)的螢光素酶報(bào)道基因附著于所述螢光素酶基因的立即下游，在293T細(xì)胞中與增加量的pCDNA3.1miR-208共轉(zhuǎn)染。miR-208感應(yīng)器、Thrapl和4xThrapl報(bào)道基因均以劑量依賴性形式被抑制，而陰性對(duì)照CSNK未明顯改變。圖18C示出成熟miR-208序列(SEQIDNO:4)結(jié)合推定的人(SEQIDNO:38)和小鼠(SEQIDNO:39)Thrapl基因的3，UTR中miR-208靶位點(diǎn)。注意到這兩個(gè)推定的靶位中完全保守的耙種子區(qū)域(在miR-208的5'末端在第2-8位核苷酸)。圖19示出miR-208調(diào)節(jié)心肌肌球蛋白重鏈同種型轉(zhuǎn)變的模型。甲狀腺激素核受體(TR)結(jié)合a-MHC和p-MHC基因的啟動(dòng)子中甲狀腺受體元件(TREs)序列。所述a-MHC啟動(dòng)子含有由兩個(gè)TR結(jié)合的全長(zhǎng)TRE，而(3-MHC在TRE的一半處由單個(gè)TR結(jié)合。TR單體和二聚體均能與TRAP復(fù)合物(一種TR輔因子)形成異源二聚體。甲狀腺激素(T3)結(jié)合TR并抑制p-MHC的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)誘導(dǎo)a-MHC表達(dá)。miR-208與a-MHC蛋白同時(shí)表達(dá)，推測(cè)其調(diào)節(jié)Thrapl(TRAP復(fù)合物的最大亞基)。確信miR-208是負(fù)反饋環(huán)的成分，通過(guò)抑制T3信號(hào)化而調(diào)節(jié)心肌肌球蛋白重鏈同種型表達(dá)。圖20A和20B示出損傷的/再生的骨骼肌的miRNA陣列分析。圖20A示出在損傷的肌細(xì)胞中負(fù)調(diào)節(jié)的miRNA。圖20B示出在損傷的肌細(xì)胞中上調(diào)的miRNA。圖21列出了SEQIDNO:6-9的序列。圖22示出使用miRNA感應(yīng)器miR-1在分化的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中的表達(dá)。通過(guò)將穩(wěn)定表達(dá)miR-1感應(yīng)器(dsRed::miR-l)或突變的感應(yīng)器(dsRed::miR-l-Mut)的衛(wèi)星細(xì)胞移至除去了bFGF的分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化，使用熒光成像獲得圖像，示出dsRed報(bào)道基因(dsRed::miR-l)或者肌細(xì)胞分化標(biāo)記基因肌球蛋白重鏈(MF20)的表達(dá)。dsRed在感應(yīng)器表達(dá)的分化細(xì)胞中的低水平表達(dá)表示這些細(xì)胞中miR-1的表達(dá)。DAPI染色細(xì)胞核。圖23A和23B示出miR-1/206表達(dá)系統(tǒng)(圖23A)和miR-1/206感應(yīng)器(圖23B)的確立。圖23A示出表達(dá)miR-1/206和GFP蛋白(圖23A，左側(cè))的表達(dá)構(gòu)建體。Northern印跡分析示出miR-1的表達(dá)(圖23a，右側(cè))。圖23B示出在293細(xì)胞中miR-1抑制miR-1/206感應(yīng)器。將穩(wěn)定表達(dá)miR-1/206感應(yīng)器的293細(xì)胞用miR-l/206(SDSA::miR-l)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，使用相襯(293細(xì)胞)或熒光成像獲得圖像，以示出dsRed報(bào)道基因(dsRed::miR-l)或者miRNA::GFP(SDSA::miR-l)或者這二者的Overlay的表達(dá)。注意到dsRed感應(yīng)器和miR-1的表達(dá)是唯一的，表明miR-1特異性抑制感應(yīng)器報(bào)道基因的表達(dá)。圖24A和24B示出miR-1/206對(duì)Pax7和BDNF3'UTRs的抑制。圖24A是小鼠Pax7UTR(SEQIDNO:40-41)與MiR-l(SEQIDNO:l)和miR-206(SEQIDNO:3)的序列排列對(duì)比。圖24B示出含有小鼠Pax73，UTR(Luc-Pax7::UTR)或其突變體(Luc-Pax7::UTR-M)或者BDNF3，UTR(Luc-BDNF::UTR)或其突變體(Luc-BDNF::UTR-M)的螢光素酶報(bào)道基因與指定的miRNA表達(dá)載體的共轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后確定螢光素酶活性。數(shù)據(jù)以一式兩份進(jìn)行的至少三個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。注意到miR-1/206顯著抑制Pax7和BDNF3，UTR報(bào)道基因的表達(dá)。圖25A-25C示出miR-1/206抑制衛(wèi)星細(xì)胞中Pax7的表達(dá)，但是不抑制Pax3的表達(dá)。圖25A是對(duì)Pax7表達(dá)進(jìn)行的Northern印跡分析，表明Pax7mRNA的轉(zhuǎn)錄水平不被3，UTR抑制。圖25B是Western印跡分析，表明在miR-1/206過(guò)表達(dá)的衛(wèi)星細(xì)胞中是Pax7而非Pax3蛋白質(zhì)水平較低。圖25C示出使用相襯(Phase/Contrastpanels)或者熒光成像獲得的圖像，示出骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中Pax7或Pax3蛋白(Pax7和Pax3組)或者miRNA::GFP(SDSA::miR-1/206組)或者overlay(overlaypanels)的表達(dá)。注意到是Pax7而不是Pax3的表達(dá)被miR-1/206抑制。圖26示出miR-1/206抑制衛(wèi)星細(xì)胞中BDNF的表達(dá)，但是不抑制GDNF的表達(dá)。使用相襯(Phase/Contrastpanels)或熒光成像獲得圖像，以示出骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中BDNF或者GDNF蛋白(BDNF和GDNF組)或者miRNA::GFP(SDSA::miR-1/206組)或者overlay(overlaypanels)的表達(dá)。注意到是BDNF的表達(dá)而不是GDNF的表達(dá)被miR-1/206抑制。圖27A和27B示出miR-1/206抑制衛(wèi)星細(xì)胞增殖。圖27A示出使用相襯或熒光成像獲得的衛(wèi)星細(xì)胞圖像，以示出細(xì)胞增殖指數(shù)，以BrdU(BrdU組)或者miRNA::GFP(SDSA::miR-1+206組)表示。在miR-1/206過(guò)表達(dá)的衛(wèi)星細(xì)胞中觀測(cè)到較少的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞。圖27B示出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中計(jì)數(shù)對(duì)照組及miR-1/206過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中的BrdU陽(yáng)性染色的細(xì)胞，數(shù)據(jù)以BrdU陽(yáng)性細(xì)胞與總細(xì)胞的比率表示。圖28A和28B示出miR-1/206增強(qiáng)衛(wèi)星細(xì)胞分化。圖28A和28B示出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中衛(wèi)星細(xì)胞穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-l/206(SDSA-miR-l+206)或GFP(對(duì)照)，然后將其移至除去了bFGF的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)(圖28A)或者48小時(shí)(圖28B)，之后用肌球蛋白重鏈(MyHC)免疫染色。注意到在miR-1/206過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中增強(qiáng)的MyHC染色。DAPI標(biāo)示細(xì)胞核。圖29示出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中miR-1/206的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)衛(wèi)星細(xì)胞分化動(dòng)力學(xué)。將過(guò)表達(dá)miR-l/206—)或者GFP(對(duì)照，"的衛(wèi)星細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)(O、12、24、36和48小時(shí))在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，或者移至其中除去了bFGF的分化培養(yǎng)基中，對(duì)肌球蛋白重鏈(MyHC)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行評(píng)分。結(jié)果以MyHC陽(yáng)性細(xì)胞與總細(xì)胞的比率表示。圖30示出miR-l/206調(diào)節(jié)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化的模型。附表簡(jiǎn)述表1列出了本文所用單字母表示的核苷酸縮寫。表2示出了miR-l和miR-133對(duì)肌原性(myogenic)增殖和分化的作用。將在生長(zhǎng)培養(yǎng)基(GM)中培養(yǎng)的C2C12肌細(xì)胞用miR-l、miR-133或作為對(duì)照的GFP的雙鏈miRNA雙鏈體或者2'-0-甲基反義寡聚體電穿孔。36小時(shí)后，用分化培養(yǎng)基(DM)取代GM培養(yǎng)8、12和24小時(shí)，固定細(xì)胞以使用肌形成蛋白、磷酸組蛋白H3和肌球蛋白重鏈(MHC)的抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。在隨機(jī)選擇的視野中從5000個(gè)DAPI染色的細(xì)胞中計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞。使用可比的結(jié)果進(jìn)行三次單獨(dú)測(cè)定。表3列出了本發(fā)明揭示的寡核苷酸的名稱和序列。序列表簡(jiǎn)述所述序列表示出了各種miRNA、特別是miR-l、miR-133、miR-206、miR-208、miR-22、miR-26、miR畫29、miR-30、miR-128、miR-143和miR-145(分別為SEQIDNO:l-ll)的序列，以及本發(fā)明揭示的另外的多核苷酸序列。在一些情況中，RNA序列以DNA形式存在(即以胸腺嘧啶代替尿嘧啶)，應(yīng)理解這些序列也相應(yīng)于這些DNA序列的RNA轉(zhuǎn)錄物(即每個(gè)T均由U取代)。發(fā)明詳述本發(fā)明揭示了可以調(diào)節(jié)肌細(xì)胞中影響所述肌細(xì)胞分化和/或增殖的特異基因表達(dá)的特定miRNA的確定。如本文所揭示，這種發(fā)現(xiàn)具有治療性應(yīng)用，包括治療各種原因所致的肌損傷，例如機(jī)械性肌創(chuàng)傷、肌組織退行性疾病和心肌損傷。本發(fā)明揭示的發(fā)現(xiàn)的應(yīng)用進(jìn)一步包括利用對(duì)于所述基因具有特異性的miRNA調(diào)節(jié)肌細(xì)胞中一或多個(gè)特異基因的表達(dá)，由此調(diào)節(jié)所述肌細(xì)胞的功能性，例如所述肌細(xì)胞的分化和/或增殖?？捎糜诒景l(fā)明揭示目的的非限制性miRNA的例子包括miRNA-l、miRNA-133、miRNA-206和miRNA-208。例如，聚集在相同染色體基因座上的miRNA-l(miR-l)和miRNA-133(miR-133)在發(fā)育期間以組織特異性方式一起轉(zhuǎn)錄。miR-l和miR-133在體外培養(yǎng)的肌細(xì)胞和在體內(nèi)^^o;^胚胎中調(diào)節(jié)骨骼肌增殖和分化中均發(fā)揮獨(dú)特作用。miR-l通過(guò)耙向肌細(xì)胞基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄抑制劑-組蛋白脫乙酰酶4(HDAC4)而促進(jìn)肌生成。相反，miR-133過(guò)抑制血清應(yīng)答因子(SRF)而增強(qiáng)肌細(xì)胞增殖。這個(gè)結(jié)果首次揭示了衍生自相同miRNA多順?lè)醋硬⒁黄疝D(zhuǎn)錄的兩個(gè)成熟miRNA可發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。本發(fā)明因此提供了這樣的分子學(xué)機(jī)制，即其中miRNA參與轉(zhuǎn)錄循環(huán)，控制肌細(xì)胞基因表達(dá)和胚胎發(fā)育。另一個(gè)非限制性例子是Thrapl表達(dá)很可能由miR-208調(diào)節(jié)。Thrapl的3'UTR含有兩個(gè)預(yù)測(cè)的miR-208結(jié)合位點(diǎn)(圖18)。所述兩個(gè)靶位于Thrapl終止密碼子的80bp下游，且彼此僅間隔50bp。這兩個(gè)靶與miR-208的種子區(qū)域完全互補(bǔ)。7Tzm;;7基因編碼TRAP240，這是遍在表達(dá)的TRAP(甲狀腺激素受體蛋白)復(fù)合物的一個(gè)240kd亞基。TRAP是一種多亞基蛋白質(zhì)復(fù)合物，是核受體的共激活物，且TRAP家族成員對(duì)于適當(dāng)發(fā)育很重要。因此，miR-208可以調(diào)節(jié)TRAP240的產(chǎn)生并促進(jìn)激素依賴性心肌細(xì)胞分化。I:總則第一個(gè)描述的miRNA，/&一基因，其控制C.e/eg"m幼體發(fā)育的時(shí)間進(jìn)程，發(fā)現(xiàn)其出乎意料地產(chǎn)生長(zhǎng)度為21個(gè)核苷酸的非編碼RNA，抑制/Zw-W蛋白質(zhì)表達(dá)而不顯著影響//w-WmRNA水平。發(fā)現(xiàn)這個(gè)小RNA靶向//"-W的3'非翻譯區(qū)(UTR)中的互補(bǔ)位點(diǎn)49'5()。盡管這種現(xiàn)象最初被作為遺傳奇特現(xiàn)象進(jìn)行處理且實(shí)際上被忽略，但是現(xiàn)在意識(shí)到目前稱作miRNA的幾百個(gè)小RNA與不同物種的基因組中存在的lin-4相似，且調(diào)節(jié)互補(bǔ)mRNA的翻譯。雖然近來(lái)的報(bào)道提示少許miRNA在明顯不同的生物學(xué)進(jìn)程中的作用，但是大多數(shù)miRNA在很大程度上仍未鑒定。LA:miRNA生物學(xué)發(fā)生及機(jī)制miRNA生物學(xué)發(fā)生的一般模型示于圖13。成熟miRNA的長(zhǎng)度為~22個(gè)核苷酸(nt)，是從較長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄物中加工的51，52。原始的miRNA(pri-miRNA)可以作為單獨(dú)的轉(zhuǎn)錄單位由RNAPolII轉(zhuǎn)錄，或者可以源自宿主基因的剪接內(nèi)含子53。miRNA加工途徑可以從RNAseIII核酸內(nèi)切酶Drosha使pri-miRNA核裂解開(kāi)始，產(chǎn)生一個(gè)長(zhǎng)度為70個(gè)核苷酸的中間前體-miRNA(pre-miRNA)，其具有莖一環(huán)結(jié)構(gòu)54。Exportin-5識(shí)別由Drosha裂解的交錯(cuò)切口并以Ran-GTP依賴性方式將pre-miRNA輸出至細(xì)胞質(zhì)中5"Q。一旦輸出至細(xì)胞質(zhì)中，所述pre-miRNA的兩個(gè)鏈均可以由另一種RNAseIII酶Dicer裂解，大約兩個(gè)螺旋從莖一環(huán)的基底部旋轉(zhuǎn)分離61—63。所得22merRNA雙鏈體由Dicer釋放，且單鏈的莖一臂(stem-arm)可以摻入RISC(RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物)。RISC是一種核糖核蛋白復(fù)合物，含有Argonaute蛋白質(zhì)家族成員和輔因子，以及miRNA和mRNA靶位。據(jù)認(rèn)為所述莖一臂雙鏈體的相對(duì)熱穩(wěn)定性決定哪個(gè)鏈摻入RISC中進(jìn)入RISC的鏈通常是5'末端不太穩(wěn)定的鏈64，65。翻譯抑制由互補(bǔ)于耙mRNA的3，UTR內(nèi)的靶序列的miRNA通過(guò)仍未知的機(jī)制介導(dǎo)66'67。通常，不完全的互補(bǔ)導(dǎo)致翻譯抑制，而完全或接近完全的互補(bǔ)導(dǎo)致mRNA裂解2268。關(guān)于miRNA的生物發(fā)生、通訊、RISC裝配及RISC的功能機(jī)制尚未明了，然而特異性miRNA的功能研究及miRNA途徑成分的遺傳和生物化學(xué)分析已經(jīng)揭示了miRNA在不同生物學(xué)過(guò)程中起重要作用。I.B:發(fā)育中的miRNA多細(xì)胞生物體的發(fā)育需要遺傳途徑的空間和時(shí)間控制。有人提出miRNA通過(guò)耙基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)控制或調(diào)整這些復(fù)雜的遺傳途徑。一種確定miRNA在動(dòng)物發(fā)育中的必需性的方法已經(jīng)在Dicer中產(chǎn)生突變，這是miRNA加工為其成熟活性形式所需要的上游酶。確信脊椎動(dòng)物僅具有一個(gè)Dicer拷貝，其很可能是充分處理所有脊椎動(dòng)物miRNA所需要的62'63'69。在小鼠中，Dicer功能的消除導(dǎo)致(E)7.5天胚胎致死69。Dicernull小鼠不表達(dá)原條標(biāo)記7T6rac/^wo^，表示在原腸胚形成期間機(jī)體成形之前發(fā)育很可能被阻抑。由于在小鼠肢體中胚層中發(fā)揮特異性功能的Dicer的條件喪失，導(dǎo)致肢體長(zhǎng)度減小及細(xì)胞凋亡增加7Q。在斑馬中通過(guò)產(chǎn)生母系合子Dz'cw突變體而完全阻斷miRNA形成，表明miRNA的喪失不影響胚胎軸(axis)的形成或者胚胎中許多類型細(xì)胞的式樣。然而，在原腸胚形成、腦形成、體質(zhì)發(fā)生和心臟發(fā)育期間的形態(tài)發(fā)生均被證實(shí)是異常的，導(dǎo)致致死性71?？傊瑢?duì)Dicer功能的遺傳分析提示成熟miRNA為適當(dāng)?shù)陌l(fā)育所需要。除去所有miRNA功能的研究是有教益的，然而其也是鈍工具，未提供關(guān)于特異性miRNA的精確功能的見(jiàn)識(shí)。I.C-特異性miRNA的生物學(xué)作用越來(lái)越多的證據(jù)提示miRNA參與種種生物學(xué)過(guò)程。在胰島細(xì)胞中，miR-375的過(guò)表達(dá)抑制葡萄糖胰島的胰島素分泌，同時(shí)抑制內(nèi)源性miR-375增強(qiáng)胰島素分泌72。相似的過(guò)表達(dá)和抑制策略鑒別了miR-143通過(guò)調(diào)節(jié)ERK5蛋白質(zhì)表達(dá)而在脂肪細(xì)胞分化中的作用73。在另一個(gè)例子中，編碼5個(gè)miRNA的多順?lè)醋有詍iRNA基因與腫瘤發(fā)生相關(guān)聯(lián)74。已經(jīng)提出了miRNA在造血作用75、神經(jīng)元分化7677和//ox基因表達(dá)的調(diào)節(jié)78，79中的其它功能。目前有超過(guò)300種已知的人miRNA，但是僅少數(shù)具有已知的生物學(xué)功能。對(duì)于特異性miRNA的研究為理解miRNA介導(dǎo)的發(fā)育調(diào)節(jié)和病理學(xué)的普遍性和重要性所需要。本發(fā)明首次提供了miRNA在調(diào)節(jié)肌細(xì)胞分化和增殖中的作用。I.D:miRNA在心臟發(fā)育中的作用心臟的發(fā)生需要不同遺傳程序的精確控制，因此探索不同表達(dá)的心臟中富集的miRNA也許幫助調(diào)節(jié)這些復(fù)雜途徑。本發(fā)明揭示了一些miRNA的這種組織特異性表達(dá)模式。miR-1和miR-133在骨骼肌和心肌組織中均表達(dá)，而miR-208僅在心肌組織中檢測(cè)到。在本發(fā)明之前，這些肌細(xì)胞特異性miRNA的功能還不清楚。I.E:miRNA靶的鑒別鑒別特異性miRNA的靶便于理解其在調(diào)節(jié)途徑中的精確作用。大多數(shù)動(dòng)物miRNA與其靶位點(diǎn)不完全互補(bǔ)，阻礙了使用簡(jiǎn)便的同源性檢索來(lái)鑒別動(dòng)物miRNA靶位點(diǎn)。為了克服這個(gè)障礙，已經(jīng)揭示了一些計(jì)算方法，其中摻入已知miRNA靶的序列保守性和特征作為標(biāo)準(zhǔn)，以預(yù)測(cè)新的動(dòng)物miRNAi靶8^85。例如，一些算法考慮到大多數(shù)miRNA在確證的靶位點(diǎn)內(nèi)的第2和第8位核苷酸之間呈現(xiàn)高互補(bǔ)性，將其稱作"種子"區(qū)。其它算法則不是這樣，因?yàn)樵谝恍┣闆r中，在miRNA的3'末端的互補(bǔ)性可以補(bǔ)償較弱的5，末端結(jié)合。這些算法也分級(jí)預(yù)測(cè)兩或多個(gè)物種之中相對(duì)于側(cè)翼區(qū)的耙序列保守。這些類型的計(jì)算方法已經(jīng)成功地預(yù)測(cè)出一些哺乳動(dòng)物miRNA耙位點(diǎn)。對(duì)于任何特定miRNA產(chǎn)生的預(yù)測(cè)幾乎均含有假陽(yáng)性。然而，所述預(yù)測(cè)非常適用作為假說(shuō)生成元。任何預(yù)測(cè)均可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)核實(shí)并置于相關(guān)的生物學(xué)環(huán)境中。I.F:重要性目前在miRNA研究中有一些活躍領(lǐng)域，試圖去理解在miRNA指導(dǎo)的抑制之后的精確分子學(xué)機(jī)制、揭示分析miRNA表達(dá)和鑒別耙位點(diǎn)的更好的工具，及確定調(diào)節(jié)途徑內(nèi)特異性miRNA的生物學(xué)相關(guān)作用。心臟發(fā)育和病理學(xué)與復(fù)雜遺傳途徑的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，在試圖理解這些途徑中已經(jīng)盡力而為。大多數(shù)研究針對(duì)于為心臟基因轉(zhuǎn)錄需要的轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)節(jié)增強(qiáng)子序列的作用。已經(jīng)證實(shí)心臟基因表達(dá)的調(diào)節(jié)是非常復(fù)雜的，各個(gè)心臟基因由多個(gè)獨(dú)立的增強(qiáng)子控制，在心臟中以非常受限的表達(dá)模式表達(dá)。潛在地，miRNA顯著增加這種復(fù)雜性，甚至在轉(zhuǎn)錄后水平加入另一層調(diào)節(jié)。本發(fā)明在某種程度上提供了關(guān)于心肌和骨骼肌基因表達(dá)怎樣被調(diào)節(jié)的新認(rèn)識(shí)，并揭示了基于這種認(rèn)識(shí)的治療和研究性應(yīng)用。另外，本發(fā)明關(guān)于miRNA控制肌細(xì)胞分化和增殖的揭示作為理解miRNA在其它途徑中功能的模型。II:定義為方便起見(jiàn)，在此收集了本說(shuō)明書、實(shí)施例和所附權(quán)利要求書中應(yīng)用的某些術(shù)語(yǔ)。雖然確信本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知如下術(shù)語(yǔ)的含義，但是為了便于解釋本發(fā)明而闡述了如下定義。除非另有陳述，本文所用所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常已知的含義。盡管與本發(fā)明所述相似或相同的方法、設(shè)備和材料均可用于實(shí)施或檢測(cè)本發(fā)明，但是在此仍描述了代表性的方法、設(shè)備和材料。根據(jù)長(zhǎng)期存在的專利法規(guī)，術(shù)語(yǔ)"一個(gè)"當(dāng)用于本說(shuō)明書、包括權(quán)利要求書中時(shí)是指"一或多個(gè)"。因此，本文中"一個(gè)"是指一或多個(gè)(即至少一個(gè))對(duì)象。例如，"一個(gè)元件"是指一或多個(gè)元件。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"大約"當(dāng)指數(shù)值或者質(zhì)量、重量、時(shí)間、體積、濃度或百分比時(shí)是指在一些實(shí)施方案中與指定量具有±20%或±10%、±5%、土1%、±0.5%及±0.1%的偏差，這種偏差適于實(shí)踐本發(fā)明。除非另有陳述，則本說(shuō)明書和權(quán)利要求書中使用的表示成分、反應(yīng)條件等的量的所有數(shù)字均應(yīng)理解為是"大約值"。因此，除非相反陳述，則本說(shuō)明書和所附權(quán)利要求書中陳述的值可以根據(jù)希望獲得的性質(zhì)而變化。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"氨基酸"和"氨基酸殘基"可互換應(yīng)用，是指任何20種天然發(fā)生的氨基酸以及其類似物、衍生物和同源物，以及具有變體側(cè)鏈的氨基酸類似物，及前述任何氨基酸的所有立體異構(gòu)體。因此，術(shù)語(yǔ)"氨基酸"是指包含具有氨基功能性和酸功能性且能包含在天然發(fā)生的氨基酸的聚合物中的所有分子，無(wú)論是天然還是合成的分子。氨基酸可以基于多肽在其肽鍵處的化學(xué)消化(水解)而形成。本文描述的氨基酸殘基在一些實(shí)施方案中是L異構(gòu)體形式。然而，D異構(gòu)體形式的殘基也可以取代任何L-氨基酸殘基，只要所述多肽保留希望的功能性即可。NH2是指在多肽的氨基末端存在的游離氨基基團(tuán)。COOH是指在多肽的羧基末端存在的游離羧基基團(tuán)。在標(biāo)準(zhǔn)多肽命名法中，氨基酸殘基的縮寫在上文以表格形式示出。注意本文的所有氨基酸殘基序列均以常規(guī)的從左至右表示從氨基末端至羧基末端的方式列出。另外，短語(yǔ)"氨基酸"和"氨基酸殘基"廣義包括修飾的和非尋常的氨基酸。再者，注意在氨基酸殘基序列的開(kāi)始或結(jié)束處的破折號(hào)表示與一或多個(gè)氨基酸殘基的進(jìn)一步序列的肽鍵連接，或者與氨基末端基團(tuán)如NH2或者酰基或者與羧基末端基團(tuán)如COOH的共價(jià)鍵連接。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞"是以其通常的生物學(xué)含義使用。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞在生物體例如脊椎動(dòng)物對(duì)象中存在。細(xì)胞可以是真核細(xì)胞(例如肌細(xì)胞，如骨骼肌細(xì)胞或心肌細(xì)胞)或者原核細(xì)胞(例如細(xì)菌)。細(xì)胞可以是體細(xì)胞或者種系來(lái)源，全能細(xì)胞，多能細(xì)胞，或者分化為任何程度，分裂或未分裂。細(xì)胞也可以衍生自或者可以包含生殖細(xì)胞或胚胎、干細(xì)胞、或者完全分化的細(xì)胞。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"和"重組宿主細(xì)胞"可互換應(yīng)用，是指其中可以導(dǎo)入本發(fā)明的組合物(例如編碼miRNA的表達(dá)載體)的細(xì)胞(例如肌細(xì)胞)。此外，該術(shù)語(yǔ)不僅是指其中最初導(dǎo)入了表達(dá)構(gòu)建體的特定細(xì)胞，而且也包括這種細(xì)胞的后代或者潛在后代。由于突變或者環(huán)境影響可以在隨后的世代中出現(xiàn)某些修飾，事實(shí)上這種后代可以與親代細(xì)胞不相同，但是仍包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"基因"是指編碼RNA的核酸，例如包括但非限于編碼多肽的結(jié)構(gòu)基因。術(shù)語(yǔ)"基因"也廣泛用于描述生物功能相關(guān)的DNA節(jié)段。如此，術(shù)語(yǔ)"基因"涵蓋了包括但非限于如下的序列編碼序列；啟動(dòng)子區(qū)域；轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列；是調(diào)節(jié)性蛋白的特異性識(shí)別序列的非表達(dá)的DNA節(jié)段；有助于基因表達(dá)的非表達(dá)的DNA節(jié)段，例如可以轉(zhuǎn)錄為mRNA的3'非翻譯區(qū)的DNA節(jié)段，其隨之由本發(fā)明的miRNA耙向和結(jié)合；設(shè)計(jì)為具有希望的參數(shù)的DNA節(jié)段；或者這些序列的組合?；蚩梢酝ㄟ^(guò)多種方法獲得，包括從生物學(xué)樣本克隆、基于已知或預(yù)測(cè)的序列信息合成、及衍生自一或多個(gè)現(xiàn)有序列的重組序列。正如本領(lǐng)域所已知，基因典型包含一個(gè)編碼鏈和一個(gè)非編碼鏈。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"編碼鏈和"有義鏈"可互換使用，是指與從中基因產(chǎn)物被翻譯的mRNA具有相同核苷酸序列的核酸序列。也正如本領(lǐng)域所已知，當(dāng)編碼鏈和/或有義鏈用于描述DNA分子時(shí)，所述編碼/有義鏈包含胸腺嘧啶代替在相應(yīng)mRNA中發(fā)現(xiàn)的尿嘧啶。另外，當(dāng)該術(shù)語(yǔ)用于描述DNA分子時(shí)，所述編碼/有義鏈也可以包含在所述mRNA中未發(fā)現(xiàn)的另外的元件，包括但非限于啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和內(nèi)含子。相似地，術(shù)語(yǔ)"模板鏈"和"反義鏈"可互換使用，是指與所述編碼/有義鏈互補(bǔ)的核酸序列。然而，應(yīng)注意對(duì)于不編碼多肽產(chǎn)物的27那些基因例如miRNA而言，術(shù)語(yǔ)"編碼鏈"用于描述包含所述miRNA的鏈。在這個(gè)用法中，包含所述miRNA的鏈對(duì)于miRNA前體是有義鏈，但是對(duì)于其靶RNA則是反義鏈(即所述miRNA與靶RNA雜交，因?yàn)槠浒瑢?duì)于靶RNA是反義的序列)。在這個(gè)用法中，包含所述miRNA的鏈對(duì)于所述miRNA前體是有義鏈，但是對(duì)于其耙RNA是反義鏈。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"互補(bǔ)性"和"互補(bǔ)"是指核酸通過(guò)傳統(tǒng)Watson-Crick或者其它非傳統(tǒng)類型的相互作用可以與另一核酸序列形成一或多個(gè)氫鍵。在一些實(shí)施方案中，關(guān)于本發(fā)明的核酸分子，與具有其互補(bǔ)序列的核酸分子的結(jié)合自由能足以使得所述核酸的相關(guān)功能發(fā)揮核糖核酸酶活性。例如，miRNA前體的有義和反義鏈之間的互補(bǔ)程度與miRNA前體的含有miRNA的鏈與靶核酸序列之間的互補(bǔ)程度可以相同或不同。核酸分子的結(jié)合自由能的確定為本領(lǐng)域所熟知。見(jiàn)例如FreierW198631;Turneraa/.，198732所述。如本文所用，短語(yǔ)"互補(bǔ)性百分比"、"相同性百分比"與"相同百分比"可互換使用，是指一個(gè)核酸分子中可以與另一個(gè)核酸序列形成氫鍵(例如Watson-Crick堿基配對(duì))的連續(xù)殘基的百分?jǐn)?shù)(例如10個(gè)殘基中有5、6、7、8、9或10個(gè)互補(bǔ)為50°/。、60%、70%、80%、90%和100%互補(bǔ))。術(shù)語(yǔ)"100%互補(bǔ)"、"完全互補(bǔ)"是指一個(gè)核酸序列的所有連續(xù)殘基均可以與另一個(gè)核酸序列中相同數(shù)目的連續(xù)殘基形成氫鍵。由于miRNA為大約17-24個(gè)核苷酸，且在miRNA指導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)節(jié)中典型容許至多5個(gè)錯(cuò)配(例如1、2、3、4或5個(gè)錯(cuò)配)，因此miRNA與其靶向的RNA之間至少為70%的互補(bǔ)性應(yīng)足以使得所述miRNA調(diào)節(jié)從所述靶RNA中衍生的基因的表達(dá)。術(shù)語(yǔ)"基因表達(dá)"通常是指細(xì)胞過(guò)程，通過(guò)這種過(guò)程生物學(xué)活性多肽從DNA序列中產(chǎn)生，且在細(xì)胞中呈現(xiàn)生物學(xué)活性。正是如此，基因表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，但是也包括可影響基因或基因產(chǎn)物的生物學(xué)活性的轉(zhuǎn)錄后和翻譯后過(guò)程。這些過(guò)程包括但非限于RNA合成、加工和轉(zhuǎn)運(yùn)，以及多肽合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和多肽的翻譯后修飾。另外，影響細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的過(guò)程也可以影響所述基因表達(dá)。然而，在不編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的基因例如miRNA基因的情況中，術(shù)語(yǔ)"基因表達(dá)"是指前體miRNA從所述基因中產(chǎn)生的過(guò)程。典型地，這個(gè)過(guò)程是指轉(zhuǎn)錄，盡管與蛋白質(zhì)編碼基因的RNA聚合酶II指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄不同，但是miRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不被翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)。盡管如此，成熟miRNA從miRNA基因中的產(chǎn)生仍涵蓋在本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)"基因表達(dá)"的含義中。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"分離"是指基本上沒(méi)有其它核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物和/或其通常相關(guān)聯(lián)的其它材料的分子，這種相關(guān)聯(lián)的材料是細(xì)胞材料或合成培養(yǎng)基中的材料。因此，術(shù)語(yǔ)"分離的核酸"是指天然的或者合成的或者其一些組合的核糖核酸分子或者脫氧核糖核酸分子(例如基因組DNA、cDNA、mRNA、miRNA等)，其(l)與在其中天然發(fā)現(xiàn)所述"分離的核酸"的細(xì)胞不相關(guān)聯(lián)，或者(2)與其天然不連接的多核苷酸可操縱地連接。相似地，術(shù)語(yǔ)"分離的多肽"在一些實(shí)施方案中是指從重組DNA或RNA中制備的、或者合成的、或者其一些組合的多肽，其(l)與天然發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)不相關(guān)，(2)分離自其通常出現(xiàn)在其中的細(xì)胞，(3)經(jīng)分離而基本上沒(méi)有相同細(xì)胞來(lái)源中的其它蛋白質(zhì)，(4)由不同物種的細(xì)胞表達(dá)，或者(5)非天然發(fā)生。術(shù)語(yǔ)"分離的"當(dāng)用于描述"分離的細(xì)胞"時(shí)，是指已經(jīng)從其天然環(huán)境例如器官、組織或生物體的一部分中分離。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記"和"標(biāo)記的"是指能通過(guò)分光法、放射性方法或其它方法檢測(cè)到的一種組分與探針?lè)肿拥母街?。因此，術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記"或者"標(biāo)記的"是指將一種可檢測(cè)的標(biāo)記任選通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)方式摻入或者附著于分子如多肽。本領(lǐng)域已知且可以利用多種標(biāo)記多肽的方法。多肽的標(biāo)記的例子包括但非限于放射性同位素、熒光標(biāo)記、重原子、酶標(biāo)記或報(bào)道基因、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、生物素?；?、由二級(jí)報(bào)道子(例如亮氨酸拉鏈對(duì)序列、抗體結(jié)合位點(diǎn)、金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域、表位標(biāo)記)識(shí)別的預(yù)定的多肽表位。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記通過(guò)各種長(zhǎng)度的間隔臂附著，以降低潛在的位阻。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)"是指增加、降低或者以其它方式改變生物化學(xué)實(shí)體的任何或全部化學(xué)和生物學(xué)活性或性質(zhì)。例如，術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)"可以是指基因表達(dá)水平或者編碼一或多種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞基的RNA分子或等效RNA分子水平的改變；或者一或多種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞基的活性被上調(diào)或負(fù)調(diào)節(jié)，由此其表達(dá)水平或活性高于或低于在沒(méi)有所述調(diào)節(jié)物的情況中觀測(cè)到的水平或活性。例如，術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)"可以意味著"抑制"和"阻抑"，但是非限于這個(gè)含義。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)"是指對(duì)應(yīng)答的上調(diào)(即激活或刺激)和負(fù)調(diào)節(jié)(即抑制或阻抑)。因此，術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)"當(dāng)用于描述功能性質(zhì)或者生物學(xué)活性或過(guò)程(例如酶活性或受體結(jié)合)時(shí)，是指上調(diào)(例如激活或刺激)、負(fù)調(diào)節(jié)(例如抑制或阻抑)或者以其它方式改變這種性質(zhì)、活性或過(guò)程的品質(zhì)的能力。在某些情況中，這種調(diào)節(jié)可以隨特定事件的發(fā)生而定，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活，和/或可以僅在特定細(xì)胞類型中出現(xiàn)。術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)物"是指能導(dǎo)致調(diào)節(jié)作用的多肽、核酸、大分子、復(fù)合物、分子、小分子、化合物、物質(zhì)(species)等(天然發(fā)生或者非天然發(fā)生的)，或者從生物學(xué)材料如細(xì)菌、植物、真菌或動(dòng)物細(xì)胞或組織中產(chǎn)生的提取物?？梢酝ㄟ^(guò)測(cè)定評(píng)估調(diào)節(jié)物作為功能性質(zhì)、生物學(xué)活性或過(guò)程或者其組合的抑制劑或墩活物(直接或間接)的潛在活性(例如激動(dòng)劑、部分拮抗劑、部分激動(dòng)劑、反向激動(dòng)劑、拮抗劑、抗微生物制劑、微生物感染或增殖的抑制劑等)。在這種測(cè)定中，可以一次篩選許多調(diào)節(jié)物。調(diào)節(jié)物的活性可以是已知、未知或者部分已知的。調(diào)節(jié)物可以是選擇性或非選擇性的。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"選擇性"當(dāng)用于描述調(diào)節(jié)物(例如抑制劑)時(shí)，是指在所述調(diào)節(jié)物與一種分子(例如感興趣的RNA)及與另一種相似但不相同的分子(例如衍生自與所述感興趣的靶RNA相同的基因家族成員的RNA)相互作用方式中的可測(cè)的或者另外生物學(xué)相關(guān)差異。必須理解對(duì)于據(jù)認(rèn)為是選擇性調(diào)節(jié)物的調(diào)節(jié)物而言，其與靶RNA的相互作用的性質(zhì)不需要完全排除其與所述靶RNA相關(guān)的其它分子(例如除了靶RNA自身之外的家族成員的轉(zhuǎn)錄物)的相互作用。換句話說(shuō)，術(shù)語(yǔ)"選擇性調(diào)節(jié)物"不限于僅結(jié)合感興趣的基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的那些分子及相關(guān)家族成員的那些分子。該術(shù)語(yǔ)還包括可以與感興趣的基因及相關(guān)家族成員的轉(zhuǎn)錄物相互作用的調(diào)節(jié)物，但是為此可以設(shè)計(jì)一些條件，在這些條件下與靶RNA及與所述家族成員的不同的相互作用具有生物學(xué)相關(guān)結(jié)果。這種條件可包括但非限于所述調(diào)節(jié)物與所述家族成員的序列相同性程度的不同，及所述調(diào)節(jié)物在表達(dá)一些但非全部家族成員的特定組織或細(xì)胞類型中應(yīng)用。在后者的條件下，如果調(diào)節(jié)物與靶相互作用導(dǎo)致生物學(xué)相關(guān)事件，則可以認(rèn)為調(diào)節(jié)物對(duì)于指定的組織中的指定靶是選擇性的，盡管在表達(dá)另外的家族成員的另外的組織中所述調(diào)節(jié)物和所述靶根本不相互作用以產(chǎn)生生物學(xué)作用，因?yàn)樗稣{(diào)節(jié)物由于其它家族成員的存在而被組織"浸出"。當(dāng)鑒別了選擇性調(diào)節(jié)物后，所述調(diào)節(jié)物以與結(jié)合另一種分子(例如與感興趣的基因相關(guān)的基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物)不同的方式(例如較強(qiáng)的方式)結(jié)合一種分子(例如感興趣的基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物)。如本文所用，所述調(diào)節(jié)物與所述分子的結(jié)合比與所述調(diào)節(jié)物可以結(jié)合的一些其它可能的分子的結(jié)合更強(qiáng)，則稱作"選擇性結(jié)合"或者"優(yōu)先結(jié)合"。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"抑制"、"阻抑"、"負(fù)調(diào)節(jié)"等可互換使用，是指基因產(chǎn)物(例如多肽)的活性、基因表達(dá)、多核苷酸例如miRNA活性或者編碼一或多種基因產(chǎn)物的RNA的水平被降低，低于在未執(zhí)行本發(fā)明的方法的情況中觀測(cè)到的結(jié)果。在一些實(shí)施方案中，用miRNA分子抑制導(dǎo)致靶RNA的穩(wěn)定表達(dá)水平的降低。在一些實(shí)施方案中，用miRNA分子抑制導(dǎo)致靶基因的表達(dá)水平低于在存在不能負(fù)調(diào)節(jié)耙基因表達(dá)水平的失活或弱化的分子的情況中觀測(cè)到的水平。在一些實(shí)施方案中，用本發(fā)明的miRNA分子對(duì)基因表達(dá)的抑制在存在所述miRNA分子的情況中高于不存在所述miRNA分子的情況。在一些實(shí)施方案中，基因表達(dá)的抑制與所述基因編碼的mRNA的降解速度增強(qiáng)相關(guān)(例如miRNA-介導(dǎo)的基因表達(dá)抑制)。在一些實(shí)施方案中，用本發(fā)明的miRNA分子抑制導(dǎo)致靶基因的基因產(chǎn)物的表達(dá)水平低于在不存在所述miRNA的情況中觀測(cè)到的表達(dá)水平。在一些實(shí)施方案中，miRNA例如內(nèi)源性miRNA可以由miRNA抑制劑抑制，導(dǎo)致由所述miRNA耙向的基因的表達(dá)與所述miRNA未被抑制時(shí)基因表達(dá)(例如基因產(chǎn)物的產(chǎn)生)水平相比增加。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"miRNA抑制劑"和"miRNA的抑制劑"可互換應(yīng)用，是指抑制miRNA活性的分子。在一些實(shí)施方案中，miRNA抑制劑是在指定條件下與特定的耙miRNA雜交、從而抑制所述耙miRNA活性的一種多核苷酸。所述miRNA抑制劑可以與耙miRNA雜交的條件包括例如生理?xiàng)l件。所述miRNA抑制劑基于所述miRNA抑制劑多核苷酸序列與所述耙miRNA多核苷酸的互補(bǔ)性而可以與耙miRNA較高或較低程度雜交。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員通常已知的特定應(yīng)用或在特異性的需要，所述miRNA可以與所有或部分革巴miRNA完全互補(bǔ)，或者不完全互補(bǔ)，包括例如與所述耙miRNA具有99Q/。、98%、97%、96%、95%、90%、80%或70%互補(bǔ)性。所述miRNA抑制劑僅需要與所述靶miRNA具有互補(bǔ)性，因?yàn)檫@是在特定系列條件下抑制耙32miRNA活性的需要量所必需的?？捎糜诒景l(fā)明中的miRNA抑制劑的例子包括但非限于修飾的多核苷酸如2'-0-甲基多核苷酸。代表性的非限制性例子在表2和表3中列出，包括2'-0-甲基-miR-l、2'-(9-甲基-miR-133和2'-(9-甲基-miR-208，其可分別特異性抑制miR-l、miR-133或miR-208的活性。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"突變"具有其傳統(tǒng)的含義，是指核酸或多肽序列中通過(guò)繼承、天然發(fā)生或者導(dǎo)入的變化，在本文以其本領(lǐng)域技術(shù)人員通常已知的含義應(yīng)用。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"肌細(xì)胞"廣義是指在所有發(fā)育階段的所有類別的肌細(xì)胞。因此，"肌細(xì)胞"涵蓋了未分化的肌細(xì)胞例如成肌細(xì)胞以及分化的肌細(xì)胞例如終末分化的肌管。"肌細(xì)胞"也涵蓋了不同組織學(xué)類型的肌細(xì)胞，包括但非限于橫紋肌細(xì)胞(例如骨骼肌細(xì)胞)、平滑肌細(xì)胞(例如腸肌細(xì)胞)和心肌細(xì)胞。另夕卜，本文所用術(shù)語(yǔ)"肌細(xì)胞"不是物種特異性的。術(shù)語(yǔ)"天然發(fā)生的"當(dāng)用于描述一個(gè)對(duì)象時(shí)，是指該對(duì)象可以在自然界發(fā)現(xiàn)。例如，存在于可以從自然來(lái)源中分離的生物體(包括細(xì)菌)中且未經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室中人工有意修飾的多肽或多核苷酸序列是天然發(fā)生的。然而，必須意識(shí)到人工進(jìn)行任何處理均可使得"天然發(fā)生的"對(duì)象成為本文所用術(shù)語(yǔ)"分離的"對(duì)象。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"核酸"、"多核苷酸"及"核酸分子"是指任何脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生的片段，及通過(guò)任何連接、切斷、內(nèi)切核酸酶作用及外切核酸酶作用產(chǎn)生的片段。核酸可以包含天然發(fā)生的核苷酸(如脫氧核糖核苷酸和核糖核酸)或者天然發(fā)生的核苷酸的類似物(例如天然發(fā)生的核苷酸的a-對(duì)映異構(gòu)體形式)，或者這二者組合的單體。修飾的核苷酸在糖成分和/或嘧啶或嘌呤堿基成分中具有修飾。糖成分的修飾包括例如一或多個(gè)羥基基團(tuán)由鹵素、烷基、胺和疊氮基置換，或者糖可以官能化為醚或酯。另外，全部的糖成分均可以用空間和電子相似的結(jié)構(gòu)如疊氮糖和碳環(huán)形糖類似物置換。堿基成分中修飾的例子包括烷化的嘌呤和嘧啶，?；泥堰屎袜奏?，或者其它熟知的雜環(huán)取代基。核酸單體可以通過(guò)磷酸二酯鍵或者這種鍵的類似物連接。磷酸二酯鍵的類似物包括硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)、硒代磷酸酉旨(phosphoroselenoate)、二硒j戈磷酸酯(phosphorodiselenoate)、硫f^磷酰苯月安(phosphoroanilothioate)、苯月安磷酰酉旨(phosphoranilidate)、氨基磷酸酉旨(phosphoroamidate)等。術(shù)i吾"核酸"還包括所謂的"肽核酸"，其包含與聚酰胺主鏈附著的天然發(fā)生的或者修飾的核酸堿基。核酸可以是單鏈或雙鏈的。術(shù)語(yǔ)"可操縱地連接"當(dāng)用于描述兩個(gè)核酸區(qū)域之間的關(guān)系時(shí)，是指所述區(qū)域是以使它們以指定方式發(fā)揮功能的位置關(guān)系并列。例如，控制序列與編碼序列的"可操縱地連接"可以是這種方式的連接，其中編碼序列的表達(dá)在與控制序列相容的條件下實(shí)現(xiàn)，例如當(dāng)合適的分子(例如誘導(dǎo)子和聚合酶)與控制或調(diào)節(jié)序列結(jié)合時(shí)。因此，在一些實(shí)施方案中，短語(yǔ)"可操縱地連接"是指啟動(dòng)子與編碼序列的連接，由此所述編碼序列的轉(zhuǎn)錄由所述啟動(dòng)子控制和調(diào)節(jié)?？刹倏v地連接啟動(dòng)子與編碼序列的技術(shù)為本領(lǐng)域所已知，關(guān)于感興趣的編碼序列的精確定向和定位依賴于所述啟動(dòng)子的特殊性質(zhì)。因此，術(shù)語(yǔ)"可操縱地連接"可以描述與核苷酸序列連接的啟動(dòng)子區(qū)域，由此所述核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄由所述啟動(dòng)子區(qū)域控制和調(diào)節(jié)。相似地，稱核苷酸序列在與其可操縱地連接的啟動(dòng)子的"轉(zhuǎn)錄控制下"?？刹倏v地連接啟動(dòng)子區(qū)域與核苷酸序列的技術(shù)為本領(lǐng)域所已知。術(shù)語(yǔ)"可操縱地連接"也是指轉(zhuǎn)錄終止序列與核苷酸序列的連接，由此所述核苷酸序列的的轉(zhuǎn)錄終止由所述轉(zhuǎn)錄終止序列控制。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄終止序列包含通過(guò)RNA聚合酶III導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄在終止子序列TTTTTTT的第三個(gè)或者第四個(gè)T終止的序列。因此，初始的小轉(zhuǎn)錄物典型在3'末端具有3或4個(gè)U。描述兩個(gè)核酸或蛋白質(zhì)序列的短語(yǔ)"相同性百分比"和"相同百分比"是指在一些實(shí)施方案中當(dāng)排列對(duì)比最大對(duì)應(yīng)的兩或多個(gè)序列或亞序列時(shí)，其具有至少60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%核苷酸或氨基酸殘基相同性，通過(guò)使用如下序列對(duì)比算法或通過(guò)目測(cè)進(jìn)行測(cè)量。一些實(shí)施方案中的相同性百分比存在于長(zhǎng)度為至少大約10個(gè)、20個(gè)、50個(gè)、100個(gè)及150個(gè)殘基的序列區(qū)域中。在一些實(shí)施方案中，相同性百分比存在于全長(zhǎng)的指定區(qū)域中，如編碼區(qū)或者完整的miRNA。為了進(jìn)行序列對(duì)比，典型將一個(gè)序列作為參考序列以與檢測(cè)序列進(jìn)行對(duì)比。當(dāng)使用序列對(duì)比算法時(shí)，將檢測(cè)序列和參考序列輸入計(jì)算機(jī)中，如果需要?jiǎng)t指定亞序列對(duì)應(yīng)物，并指定序列對(duì)比算法參數(shù)。然后所述序列對(duì)比算法基于指定的程序參數(shù)計(jì)算檢測(cè)序列與參考序列的序列相同性百分比?？梢赃M(jìn)行最佳的序列對(duì)比方法，例如Smith&Waterman,198133描述的局部同源算法，Needleman&Wunsch,197034描述的同源序列排列對(duì)比算法，Pearson&Lipman，198835所述的搜索相似性方法，這些算法的計(jì)算機(jī)執(zhí)行程序(GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTAintheGCGWISCONSINPACKAGE,得自Accelrys，Inc.,SanDiego,California,UnitedStatesofAmerica),或者通過(guò)目領(lǐng)!]。見(jiàn)Ausubel&a/.，198936所述。適于確定序列相同性百分比和序列相似性的算法的一個(gè)例子是Altschul"a/.,199037所述BLAST算法。進(jìn)行BLAST分析的軟件可通過(guò)全球信息網(wǎng)公開(kāi)得自國(guó)家生物技術(shù)信息中心。這個(gè)算法包括首先通過(guò)鑒別查詢序列中長(zhǎng)度W的短字而鑒別高得分的序列對(duì)(HSP)，當(dāng)與數(shù)據(jù)庫(kù)序列中相同長(zhǎng)度的字排列對(duì)比時(shí)其匹配或滿足一些正值的閾值得分T。T是指鄰域字得分閾值37。這些初始的擊中作為種子開(kāi)始搜索以發(fā)現(xiàn)含有其的較長(zhǎng)HSP。然后將所述字擊中沿著每個(gè)序列的兩個(gè)方向擴(kuò)展，直至可以增加序列排列對(duì)比的累積得分。對(duì)于核苷酸序列，累積得分使用參數(shù)M(—對(duì)匹配殘基的獎(jiǎng)分；總是>O)和N(錯(cuò)配殘基的罰分；總是<0)計(jì)算。對(duì)于氨基酸序列，使用得分矩陣計(jì)算累積得分。當(dāng)累積序列排列對(duì)比得分從其達(dá)到的最大值減少數(shù)量X時(shí)，字hits在每個(gè)方向的延伸停止，累積得分趨于為O或低于O，由于一或多個(gè)負(fù)分值的殘基對(duì)比的累積或者每個(gè)序列達(dá)到終點(diǎn)所致。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定了序列排列對(duì)比的靈敏性和速度。BLASTN程序(對(duì)于核苷酸序列)使用默認(rèn)值，字長(zhǎng)度(W"ll，期望值(E)=10，cutoffHOO,M=5，N=-4，兩個(gè)鏈均進(jìn)行對(duì)比。對(duì)于氨基酸序列，BLASTP程序使用默認(rèn)值，字長(zhǎng)度(W)-3，期望值(E"IO，及BLOSUM62得分矩陣38。除了計(jì)算序列相同性百分比之外，BLAST算法對(duì)于兩個(gè)序列之間的相似性也進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。見(jiàn)例如Karlin&Altschul199339所述。由BLAST算法提供的一種相似性測(cè)量是最小和概率(P(N))，其提供了兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間的匹配將隨機(jī)發(fā)生的概率。例如，如果檢測(cè)核酸序列與參考核酸序列對(duì)比的最小和概率在一些實(shí)施方案中低于大約0.1、0.01及0.001，則認(rèn)為所述檢測(cè)核酸序列與參考序列相似。描述兩個(gè)核苷酸序列的術(shù)語(yǔ)"基本相同"是指兩或多個(gè)序列或亞序列當(dāng)最大相應(yīng)性對(duì)比和排列時(shí)，使用如下序列對(duì)比算法之一或者通過(guò)目測(cè)進(jìn)行測(cè)量，在一些實(shí)施方案中具有至少大約70%核苷酸相同性，在一些實(shí)施方案中具有至少大約75%核苷酸相同性，在一些實(shí)施方案中具有至少大約80%核苷酸相同性，在一些實(shí)施方案中具有至少大約85%核苷酸相同性，在一些實(shí)施方案中具有至少大約90°/。核苷酸相同性，在一些實(shí)施方案中具有至少大約95%核苷酸相同性，在一些實(shí)施方案中具有至少大約97%核苷酸相同性及在一些實(shí)施方案中具有至少大約99%核苷酸相同性。在一個(gè)實(shí)施例中，所述基本相同性存在于至少17個(gè)殘基的序列中，在一些實(shí)施方案中存在于至少大約18個(gè)殘基的序列中，在一些實(shí)施方案中存在于至少大約19個(gè)殘基的序列中，在一些實(shí)施方案中存在于至少大約20個(gè)殘基的序列中，在一些實(shí)施方案中存在于至少大約21個(gè)殘基的序列中，在一些實(shí)施方案中存在于至少大約22個(gè)殘基的序列中，在一些實(shí)施方案中存在于至少大約23個(gè)殘基的序列中，在一些實(shí)施方案中存在于至少大約24個(gè)殘基的序列中，在一些實(shí)施方案中存在于至少大約25個(gè)殘基的序列中，在一些實(shí)施方案中存在于至少大約26個(gè)殘基的序列中，在一些實(shí)施方案中存在于至少大約27個(gè)殘基的序列中，在一些實(shí)施方案中存在于至少大約30個(gè)殘基的序列中，在一些實(shí)施方案中存在于至少大約50個(gè)殘基的序列中，在一些實(shí)施方案中存在于至少大約75個(gè)殘基的序列中，在一些實(shí)施方案中存在于至少大約100個(gè)殘基的序列中，在一些實(shí)施方案中存在于至少大約150個(gè)殘基的序列中，在另一個(gè)實(shí)施例中存在于包含完整編碼序列的核苷酸序列中。在一些實(shí)施方案中，多態(tài)性序列可以是基本相同的序列。術(shù)語(yǔ)"多態(tài)性"是指群體中兩或多個(gè)遺傳確定的備選序列或等位基因的存在。等位基因差異可以僅是一個(gè)堿基對(duì)。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員意識(shí)到所述多態(tài)性序列相應(yīng)于相同基因。兩個(gè)核苷酸序列是基本相同的另一指征是這兩個(gè)分子在嚴(yán)格條件下彼此特異性或者充分雜交。在核酸雜交的情況中，對(duì)比的兩個(gè)核酸序列可以稱作"探針序列"和"檢測(cè)序列"。"探針序列"是參考核酸分子，"檢測(cè)序列"是檢測(cè)核酸分子，通常在核酸分子的異質(zhì)群體中發(fā)現(xiàn)。用于雜交研究或測(cè)定的核苷酸序列的一個(gè)例子包括探針序列，其在一些實(shí)施方案中互補(bǔ)于或模擬本發(fā)明的核酸分子的至少大約14_40個(gè)核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施例中，探針包含14-20個(gè)核苷酸，或者當(dāng)需要時(shí)會(huì)更長(zhǎng)，例如30、40、50、60、100、200、300或500個(gè)核37苷酸或者直至給定基因的全長(zhǎng)。這種片段可易于通過(guò)例如化學(xué)合成直接合成、通過(guò)應(yīng)用核酸擴(kuò)增技術(shù)、或者通過(guò)將選擇的序列導(dǎo)入重組載體中以重組產(chǎn)生而制備。短語(yǔ)"耙向"包括"特異性雜交"，是指一種分子僅與特定的核苷酸序列在嚴(yán)格條件下結(jié)合、形成雙鏈體或雜交，所述序列存在于復(fù)合的核酸混合物中(例如總細(xì)胞DNA或RNA)。非限制性例如，雜交可以在5xSSC、4xSSC、3xSSC、2xSSC,、lxSSC或者0,2xSSC中進(jìn)行至少大約1小時(shí)、2小時(shí)、5小時(shí)、12小時(shí)或者24小時(shí)(見(jiàn)Sambrook&Russell，2001關(guān)于SSC緩沖液及其它雜交條件的描述)?？梢蕴岣唠s交溫度以調(diào)節(jié)反應(yīng)的嚴(yán)格性，例如從大約25。C(室溫)提高至大約45。C、50°C、55°C、60。C或65。C。雜交反應(yīng)也可以包括影響嚴(yán)格性的另一種物質(zhì)，例如在存在50%甲酰胺的條件下進(jìn)行雜交增加在指定溫度下雜交的嚴(yán)格性。雜交反應(yīng)之后可以跟隨一個(gè)洗滌步驟，或者兩或多個(gè)洗滌步驟，所述洗滌可以是相同或不同的鹽度和溫度。例如，洗滌溫度可以從大約25。C(室溫)提高至大約45。C、50°C、55°C、60°C、65。C或更高以調(diào)節(jié)嚴(yán)格性。洗滌步驟可以在存在洗滌劑例如SDS的條件下進(jìn)行。例如，雜交之后可跟隨兩個(gè)洗滌步驟，每一次洗滌均在65。C在2xSSC、0.1%SDS中洗滌大約20分鐘，及任選兩個(gè)額外洗滌步驟，每次洗滌均在65。C在0.2xSSC、0.P/。SDS中洗滌大約20分鐘。如下是可用于克隆與本發(fā)明的參考核苷酸序列基本相同的同源核苷酸序列的雜交和洗滌的實(shí)施例在一個(gè)實(shí)施例中探針核苷酸序列與靶核苷酸序列在7。/。十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaPO4、1mm乙二胺四乙酸(EDTA)中在50。C雜交，隨后在2XSSC、0.1%SDS中在5(TC洗漆；在一些實(shí)施方案中，探針與檢測(cè)序列在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaPO4、1mmEDTA中在5(TC雜交，隨后在IXSSC、0.1%SDS中在5(TC洗滌；在一些實(shí)施方案中，探針與檢測(cè)序列在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaPO4、1mmEDTA中在5(TC雜交，隨后在0.5XSSC、0.1%SDS中在50。C洗滌；在一些實(shí)施方案中，探針與檢測(cè)序列在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaP04、1mmEDTA中在50°C雜交，隨后在0.1XSSC、0.1%SDS中在50°C洗滌；在另一個(gè)實(shí)施例中，探針與檢測(cè)序列在7M十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaP04、1mmEDTA中在50°C雜交，隨后在0.1XSSC、0.1%SDS中在65。C洗滌。.嚴(yán)格雜交條件的其它例子包括在42°。在包含或者由50%甲酰胺、10xDenhardt，s(0.2%Ficoll、0.2%聚乙烯吡咯烷酮、0.2%牛血清白蛋白)和200mg/ml變性載體DNA例如剪切的鮭精DNA組成的溶液中過(guò)夜雜交，隨后進(jìn)行兩次洗滌，每次洗滌均在65。C在2xSSC、0.1%SDS中洗滌大約20分鐘，及另外兩次洗滌，每次洗滌均在65'C在0.2xSSC、0.le/。SDS中洗滌大約20分鐘。雜交可包括兩個(gè)核酸于溶液中雜交，或者于溶液中的一個(gè)核酸與附著于固體支持物例如濾膜上的一個(gè)核酸雜交。當(dāng)一個(gè)核酸位于固體支持物上時(shí)，在雜交之前可以進(jìn)行預(yù)雜交步驟。預(yù)雜交可以是在與雜交相同溶液、相同溫度下(但是無(wú)互補(bǔ)多核苷酸鏈)進(jìn)行至少大約l小時(shí)、3小時(shí)或者10小時(shí)。因此，在回顧現(xiàn)有揭示內(nèi)容的基礎(chǔ)上，嚴(yán)格條件為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知，或者可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員不用進(jìn)行過(guò)多實(shí)驗(yàn)而確定36，40-44短語(yǔ)"充分雜交"是指探針核酸分子與靶核酸分子之間的互補(bǔ)雜交，且包含最小的錯(cuò)配，可以通過(guò)降低雜交的嚴(yán)格性調(diào)節(jié)以實(shí)現(xiàn)希望的雜交。術(shù)語(yǔ)"表型"是指例如具有任一種性狀或任意性狀的細(xì)胞或生物體的全部物理、生物化學(xué)和生理學(xué)組成。由此，表型得自細(xì)胞或生物體內(nèi)基因的表達(dá)，并與潛在可觀測(cè)或可測(cè)定的性狀相關(guān)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"多肽"、"蛋白質(zhì)"和"肽"在本文可互換使用，是指20個(gè)的氨基酸或氨基酸類似物的聚合物，無(wú)論其大小和功能如何。盡管"蛋白質(zhì)"通常用于描述相對(duì)較大的多肽，而"肽"通常用于描述小的多肽，但是這些術(shù)語(yǔ)在本領(lǐng)域的應(yīng)用是重疊和變化的。除非特別指出，則術(shù)語(yǔ)"多肽"在本文用于描述肽、多肽和蛋白質(zhì)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)"、"多肽"和"肽"當(dāng)在本文描述基因產(chǎn)物時(shí)可互換應(yīng)用。術(shù)語(yǔ)"多肽"涵蓋了所有功能的蛋白質(zhì)，包括酶。因此，多肽例如包括基因產(chǎn)物、天然發(fā)生的蛋白質(zhì)、其同系物、直向同源物、共生同源物、片段、及其它等價(jià)物、變體和類似物。術(shù)語(yǔ)"多肽片段"或"片段"當(dāng)用于描述參考多肽時(shí)，是指與所述參考多肽自身相比缺失了氨基酸殘基的多肽，但是剩余的氨基酸序列與所述參考多肽中的相應(yīng)位置通常相同。這種缺失可以發(fā)生在參考多肽的氨基末端或者羧基末端或者這兩端。片段長(zhǎng)度典型為至少5、6、8或者10個(gè)氨基酸，至少14個(gè)氨基酸，至少20、30、40或50個(gè)氨基酸，至少75個(gè)氨基酸，或者至少IOO、150、200、300、500或更多個(gè)氨基酸。片段可以保留所述參考多肽的一或多種生物學(xué)活性。另外，片段可包括特定區(qū)域的亞片段，這種亞片段保留其從中產(chǎn)生的區(qū)域的功能。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"引物"是指在一些實(shí)施方案中包含外顯子或內(nèi)含子區(qū)域的兩或多個(gè)脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的序列，在一些實(shí)施方案中包含3個(gè)以上、8個(gè)以上及在一些實(shí)施方案中包含至少大約20個(gè)核苷酸。這種寡核苷酸在一些實(shí)施方案中長(zhǎng)度為10-30個(gè)堿基。術(shù)語(yǔ)"純化的"是指所述對(duì)象以優(yōu)勢(shì)存在(即在摩爾基礎(chǔ)上其較組合物中任何其它各個(gè)物質(zhì)更豐富)。"純化部分"是指一種組合物，其中所述對(duì)象包含至少大約50%(在摩爾基礎(chǔ)上)的所有存在的物質(zhì)。在確定溶液或分散液中物質(zhì)的純度中，其中所述物質(zhì)溶解或分散于其中的溶劑或基質(zhì)通常不包括在這種確定中；相反，僅考慮溶解或分散40的物質(zhì)(包括感興趣的物質(zhì)之一)。通常地，純化的組合物具有一種物質(zhì)，其包含所述組合物中存在的大約80%、85%、卯％、95%、99%以上或更多的所有物質(zhì)。所述物質(zhì)可以純化為基本同質(zhì)的(通過(guò)常規(guī)檢測(cè)方法在所述組合物中不能檢測(cè)到污染物)，其中所述組合物基本上由一種物質(zhì)組成。多肽的純度可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方法確定，包括例如氨基末端氨基酸序列分析、凝膠電泳和質(zhì)譜分析。"參考序列"是指用作序列對(duì)比基礎(chǔ)的指定序列。參考序列可以是較大序列的亞類，例如全長(zhǎng)核苷酸或者氨基酸序列的一個(gè)節(jié)段，或者可以包含完整的序列。由于兩個(gè)蛋白質(zhì)均以是(1)包含與所述兩個(gè)蛋白質(zhì)相似的一個(gè)序列(即完整的蛋白質(zhì)序列的一部分)，及(2)可進(jìn)一步包含與所述兩個(gè)蛋白質(zhì)不同的一個(gè)序列，因此兩個(gè)(或多個(gè))蛋白質(zhì)之間的序列對(duì)比典型通過(guò)"對(duì)比窗"對(duì)比這兩個(gè)蛋白質(zhì)的序列(見(jiàn)上述)，以鑒別和對(duì)比呈現(xiàn)序列相似性的局部區(qū)域。術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)序列"在本說(shuō)明書中是一個(gè)專業(yè)術(shù)語(yǔ)，是指為影響編碼序列和非編碼序列的表達(dá)所必需或希望的多核苷酸序列，如起始信號(hào)、增強(qiáng)子、調(diào)節(jié)子、啟動(dòng)子和終止序列，所述調(diào)節(jié)序列與所述編碼序列和非編碼序列可操縱地連接。調(diào)節(jié)序列的例子在Goeddel，199045中描述，包括例如猿病毒4040(SV40)的早期和晚期啟動(dòng)子、腺病毒或巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子、CMV最小啟動(dòng)子、lac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、TAC或TRC系統(tǒng)、T7啟動(dòng)子(其表達(dá)由T7RNA聚合酶指導(dǎo))、噬菌體入的主要操縱子和啟動(dòng)子、fd外殼蛋白的控制區(qū)、3-磷酸甘油酸激酶或者其它糖解酶的啟動(dòng)子、酸性磷酸酶的啟動(dòng)子例如Pho5、酵母a-交配因子的啟動(dòng)子、桿狀病毒系統(tǒng)的多角體蛋白啟動(dòng)子，及已知控制原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或其病毒的基因表達(dá)的其它序列，以及這些序列的各種組合。這種控制序列的性質(zhì)和應(yīng)用根據(jù)宿主生物體而可以不同。在原核生物中，這種調(diào)節(jié)序列通常包括啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄終止序列。術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)序列"最小限度包括其存在可以影響表達(dá)的成分，且也可以包括其存在是有利的其它成分，例如前導(dǎo)序列和融合配體序列。在某些實(shí)施方案中，多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄在啟動(dòng)子序列(或者其它調(diào)節(jié)序列)的控制下，所述啟動(dòng)子序列控制所述多核苷酸在指定類型細(xì)胞中的表達(dá)。也應(yīng)理解所述多核苷酸可以在調(diào)節(jié)序列的控制下，所述調(diào)節(jié)序列與控制天然發(fā)生形式的多核苷酸的表達(dá)的那些序列相同或不同。在一些實(shí)施方案中，啟動(dòng)子序列選自CMV最小啟動(dòng)子、肌酸激酶(MCK)、及a-肌球蛋白重鏈(MHC)啟動(dòng)子。例如，肌酸激酶(MCK)啟動(dòng)子指導(dǎo)骨骼肌中基因表達(dá)，可以用于在組織包括骨骼肌組織中表達(dá)miRNA，例如miR-l、miR-133或miR-206，使用目前可以利用的轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行。應(yīng)理解不需要應(yīng)用針對(duì)任何啟動(dòng)子鑒別的全部啟動(dòng)子(例如本文列出的啟動(dòng)子)，可以使用其功能衍生物。如本文所用，短語(yǔ)"功能衍生物"是指一種核酸序列，其包含足以指導(dǎo)另一個(gè)可操縱地連接的核酸分子轉(zhuǎn)錄的序列。正是如此，"功能衍生物"可以作為最小啟動(dòng)子而起作用。多核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的終止典型由可操縱地連接的轉(zhuǎn)錄終止序列(例如RNA聚合酶m終止序列)調(diào)節(jié)。在某些情況中，轉(zhuǎn)錄終止子對(duì)于校正mRNSA聚腺苷酸化也起作用。所述3'非轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)DNA序列在一些實(shí)施方案中包括大約50-1,000、100-1,000個(gè)核苷酸堿基對(duì)，且含有轉(zhuǎn)錄和翻譯終止序列。在一些實(shí)施方案中，RNA聚合酶m終止序列包含核苷酸序列TTTTTTT。術(shù)語(yǔ)"報(bào)道基因"是指一種核酸，其包含編碼可易于檢測(cè)其存在或活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列，包括但非限于螢光素酶、熒光蛋白(例如綠色熒光蛋白)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、p-半乳糖苷酶、分泌的胎盤堿性磷酸酶、(3-內(nèi)酰胺酶、人生長(zhǎng)激素，及其它分泌的酶報(bào)道基因。通常地，報(bào)道基因編碼不是由宿主細(xì)胞產(chǎn)生的一種多肽，其通過(guò)細(xì)胞分析可以檢測(cè)到，例如通過(guò)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行直接熒光分析、放射性同位素分析或者分光光度分析，及典型不需要?dú)⑺兰?xì)胞進(jìn)行的信號(hào)分析。在某些情況中，報(bào)道基因編碼一種酶，其導(dǎo)致宿主細(xì)胞的熒光性質(zhì)發(fā)生改變，這可通過(guò)定性、定量或者半定量功能或者轉(zhuǎn)錄激活而檢測(cè)。所述酶的例子包括酯酶、P-內(nèi)酰胺酶、磷酸酶、過(guò)氧化物酶、蛋白酶(組織纖溶酶原激活物或尿激酶)，及可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或者未來(lái)將揭示的合適的生色或熒光底物檢測(cè)其功能的其它酶。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"測(cè)序"是指使用常規(guī)的人工或自動(dòng)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)確定DNA、RNA或者蛋白質(zhì)耙樣本的核酸或氨基酸的有序線性序列。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"基本純的"是指所述多核苷酸或多肽基本上沒(méi)有與其在天然狀態(tài)下關(guān)聯(lián)的序列和分子及分離步驟中使用的那些分子。術(shù)語(yǔ)"基本行沒(méi)有"是指在一些實(shí)施方案中所述樣本中至少50%、70%、80%和90%沒(méi)有與其自然狀態(tài)下關(guān)聯(lián)的材料和化合物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"靶細(xì)胞"是指其中希望插入核酸序列或多肽或者另外在已知未修飾的細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行修飾的細(xì)胞。導(dǎo)入耙細(xì)胞中的核酸序列可以是可變長(zhǎng)度。另外，核酸序列可以作為質(zhì)?；蚱渌d體的一種成分或者作為裸序列進(jìn)入靶細(xì)胞中。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"靶基因'是指一種基因，使用本發(fā)明的方法和組合物靶向于其加以調(diào)節(jié)。因此，靶基因包含一個(gè)核酸序列，所述核酸序列的表達(dá)水平(在mRNA或者多肽水平)由miRNA負(fù)調(diào)節(jié)。相似地，術(shù)語(yǔ)"靶RNA"或者"靶mRNA"是指耙基因的轉(zhuǎn)錄物，miRNA與其結(jié)合，導(dǎo)致調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。所述耙基因可以是衍生自細(xì)胞的基因、內(nèi)源基因、轉(zhuǎn)基因、外源基因如病原體基因，例如在感染后存在于細(xì)胞中的病毒。含有靶基因的細(xì)胞可以衍生自或者包含在任何生物體中，例如植物、動(dòng)物、原生動(dòng)物、病毒、細(xì)菌或者真菌中。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)錄"是指一個(gè)細(xì)胞過(guò)程，包括RNA聚合酶與基因的相互作用，指導(dǎo)所述基因的編碼序列中存在的結(jié)構(gòu)信息的RNA表達(dá)。所述過(guò)程包括但非限于如下步驟(a)轉(zhuǎn)錄開(kāi)始；(b)轉(zhuǎn)錄物延長(zhǎng)；(C)轉(zhuǎn)錄物剪接；(d)轉(zhuǎn)錄物加帽；(e)轉(zhuǎn)錄終止；(f)轉(zhuǎn)錄物聚腺苷酸化；(g)轉(zhuǎn)錄物的核輸出；(h)轉(zhuǎn)錄物編輯；及(i)穩(wěn)定所述轉(zhuǎn)錄物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)錄因子"是指胞質(zhì)或核蛋白，其結(jié)合基因，或者結(jié)合基因的RNA轉(zhuǎn)錄物，或者結(jié)合另一種蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)結(jié)合一個(gè)基因或RNA轉(zhuǎn)錄物或者反過(guò)來(lái)結(jié)合基因或RNA轉(zhuǎn)錄物的另一種蛋白質(zhì)結(jié)合，從而調(diào)節(jié)所述基因的表達(dá)。這種調(diào)節(jié)可另外通過(guò)其它機(jī)制實(shí)現(xiàn)；"基因的轉(zhuǎn)錄因子"的含義是指以一些方式改變所述基因的轉(zhuǎn)錄水平的因子。術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)染"是指在受體細(xì)胞中導(dǎo)入核酸，例如表達(dá)載體，在某些情況中包括核酸介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)化"是指其中細(xì)胞基因型由于細(xì)胞吸收外源核酸的結(jié)果而改變的過(guò)程。例如，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可表達(dá)本發(fā)明的miRNA。如本文所用，概率的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中"顯著性"或者"顯著的"是描述兩或多個(gè)實(shí)體之間存在非隨機(jī)的關(guān)聯(lián)性。為了確定一種關(guān)系是否是"顯著性"或者具有"顯著性"，可以對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以計(jì)算概率，以p值表示。這些p值低于自定義的截?cái)帱c(diǎn)則認(rèn)為是顯著的。在一個(gè)實(shí)施例中，認(rèn)為p值低于或等于0.05具有顯著性，在一些實(shí)施方案中，認(rèn)為p值低于0.01具有顯著性，在一些實(shí)施方案中，認(rèn)為p值低于0.005具有顯著性，在一些實(shí)施方案中，認(rèn)為p值低于0.001具有顯著性。如本文所用，短語(yǔ)"靶RNA"是指作為調(diào)節(jié)耙位的一種RNA分子(例如編碼基因產(chǎn)物的mRNA分子)。在一些實(shí)施方案中，所述耙RNA由靶基因編碼。相似地，短語(yǔ)"靶位點(diǎn)"是指耙RNA內(nèi)的序列，其被"靶向"由miRNA構(gòu)建體介導(dǎo)裂解，所述miRNA構(gòu)建體在其反義鏈中含有與靶位點(diǎn)互補(bǔ)的序列。也相似地，短語(yǔ)"耙細(xì)胞"是指表達(dá)耙RNA且其中導(dǎo)入指定miRNA的細(xì)胞。靶細(xì)胞在一些實(shí)施方案中是肌細(xì)胞。如果一種miRNA與一種RNA分子具有足夠的核苷酸相似性，則所述miRNA"耙向"所述RNA分子，預(yù)期其在足以使得所述miRNA與所述RNA分子相互作用的條件下調(diào)節(jié)所述RNA的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，所述相互作用發(fā)生在肌細(xì)胞中。在一些實(shí)施方案中，所述相互作用在生理學(xué)條件下發(fā)生。如本文所用，短語(yǔ)"生理學(xué)條件"是指在體內(nèi)肌細(xì)胞內(nèi)條件，無(wú)論該肌細(xì)胞是對(duì)象的一部分還是對(duì)象的組織，或者該肌細(xì)胞正在體外生長(zhǎng)。因此，如本文所用，短語(yǔ)"生理學(xué)條件"是指作為對(duì)象的一部分或者當(dāng)在體外生長(zhǎng)時(shí)的肌細(xì)胞內(nèi)的所述肌細(xì)胞可以暴露于其下的任何條件。如本文所用，短語(yǔ)"可檢測(cè)水平的裂解"是指耙RNA的裂解程度(及裂解產(chǎn)物RNA的形成)，其足以使得可以在耙RNA的隨機(jī)降解產(chǎn)生的RNA背景之上檢測(cè)到裂解產(chǎn)物。miRNA-介導(dǎo)的裂解產(chǎn)物從至少l-5c/。的靶RNA中的產(chǎn)生足以使得可以在大多數(shù)檢測(cè)方法的背景之上進(jìn)行檢測(cè)。術(shù)語(yǔ)"microRNA"和"miRNA"可互換應(yīng)用，是指大約17-24個(gè)核苷酸的核酸分子，其從pri-miRNA、pre-miRNA或者其功能等價(jià)物中產(chǎn)生。miRNA與小干擾RNA(siRNAs)相反，盡管在外源供應(yīng)miRNA和siRNA的情況中這種差別也許是人為的。所述差別是miRNA是核酸酶活性對(duì)于如本文已經(jīng)描述的發(fā)夾分子的產(chǎn)物，siRNA可以從完全雙鏈的RNA分子或者發(fā)夾分子中產(chǎn)生。關(guān)于miRNA的進(jìn)一步的信息以及已知的公開(kāi)的miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)和該數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索工具可見(jiàn)于并入本文作參考的WellcomeTrustSangerInstitutemiRBase::Sequenceswebsite所述。也見(jiàn)于并入本文作參考的ThemicroRNARegistry,Griffiths-JonesS.，NAR,2004，32,DatabaseIssue,D109-D111所述。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"RNA"是指包含至少一個(gè)核糖核苷酸殘基的分子。"核糖核苷酸"是指在P-D-呋喃核糖成分的2'位置具有羥基基團(tuán)的核苷酸。該術(shù)語(yǔ)涵蓋了雙鏈RNA、單鏈RNA、具有雙鏈區(qū)和單鏈區(qū)的RNA、分離的RNA如部分純化的RNA、基本純的RNA、合成的RNA及重組產(chǎn)生的RNA。因此，RNA包括但非限于mRNA轉(zhuǎn)錄物、miRNA和miRNA前體，及siRNAs。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"RNA"也涵蓋了改變的RNA或者RNA類似物，這是通過(guò)添加、缺失、取代和/或改變一或多個(gè)核苷酸而與天然發(fā)生的RNA而有所不同的RNA。這種改變可以包括在如RNA的末端或內(nèi)部例如RNA的一或多個(gè)核苷酸處添加非核苷酸材料。本發(fā)明的RNA分子中的核苷酸也可以包含不標(biāo)準(zhǔn)的核苷酸，如非天然發(fā)生的核苷酸或者化學(xué)合成的核苷酸或者脫氧核苷酸。這些改變的RNA可以稱作類似物或者天然發(fā)生的RNA的類似物。如本文所用，短語(yǔ)"雙鏈RNA"是指一種RNA分子，其至少一部分是形成雙鏈體的Watson-Crick堿基對(duì)。由此，該術(shù)語(yǔ)涵蓋了完全或者僅部分雙鏈的RNA分子。雙鏈RNA的例子包括但非限于包含至少兩個(gè)獨(dú)特RNA鏈的分子，其通過(guò)分子間雜交而部分或全部形成雙鏈。另外，該術(shù)語(yǔ)還包括通過(guò)分子內(nèi)雜交可以形成雙鏈區(qū)(例如發(fā)夾)的一個(gè)RNA分子。因此，如本文所用，短語(yǔ)"分子間雜交"和"分子內(nèi)雜交"是指雙鏈分子，其中參與雙鏈體形成的核苷酸分別存在于不同分子或相同分子上。如本文所用，短語(yǔ)"雙鏈區(qū)"是指通過(guò)核苷酸之間的氫鍵形成的雙鏈構(gòu)象的核酸分子的任何區(qū)域及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它核酸雙鏈體，所述核苷酸之間的氫鍵包括但非限于胞嘧啶與鳥(niǎo)苷、腺苷與胸苷、腺苷與尿嘧啶之間的氫鍵。雙鏈區(qū)的長(zhǎng)度可以是大約15個(gè)連續(xù)堿基對(duì)至幾千個(gè)堿基對(duì)。在一些實(shí)施方案中，所述雙鏈區(qū)為至少15個(gè)堿基對(duì)，在一些實(shí)施方案中是15至300個(gè)、15至大約60個(gè)46堿基對(duì)。如上文所述，雙鏈區(qū)的形成得自互補(bǔ)RNA鏈的雜交(例如有義鏈與反義鏈的雜交)，通過(guò)分子間雜交(即包含2或多個(gè)獨(dú)特的RNA分子)或者通過(guò)分子內(nèi)雜交形成，當(dāng)一個(gè)RNA分子含有能在同一RNA分子上彼此雜交的自身互補(bǔ)區(qū)時(shí)可發(fā)生后者的雜交。這些自身互補(bǔ)區(qū)典型由一段短核苷酸序列(例如大約5-10個(gè)核苷酸)分隔，由此形成本領(lǐng)域稱作"發(fā)夾"或"莖一環(huán)結(jié)構(gòu)的"分子內(nèi)雜交。IIL核酸本發(fā)明中應(yīng)用的核酸分子包括編碼肌細(xì)胞基因產(chǎn)物的核酸分子，以及本發(fā)明中用于調(diào)節(jié)肌細(xì)胞基因表達(dá)的核酸分子(例如miRNA核酸分子)。因此，本發(fā)明中應(yīng)用的核酸分子包括但非限于本文描述的核酸分子。例如，本發(fā)明中應(yīng)用的核酸分子包括但非限于miR-l(UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUA，SEQIDNO:l)，miR-133(UUGGUCCCCUUCAACCAGCUGU，SEQIDNO:2)，miR-206(UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG，SEQIDNO:3)，miR-208(AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU，SEQIDNO:4)，miR-22(AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU，SEQIDNO:5)，miR畫26(UUCAAGUAAUyCAGGAUAGGy(U)，SEQIDNO:6)，miR-29(UAGCACCAUyUGAAAUCrGU(kUU),SEQIDNO:7)，miR-30(ykUwmAswysshhswyUvnvv(bC)，SEQIDNO:8)，miR-128(UCACAGUGAACCGGUCUCUUUy，SEQIDNO:9)，miR-143(UGAGAUGAAGCACUGUAGCUCA，SEQIDNO:10)和miR-145(GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUU，SEQIDNO:11);及與這些序列基本相同的序列(例如在一些實(shí)施方案中，與SEQIDNO:1-11任一序列至少70%、80%、85%、90%、91°/。、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的序列)；及這些序列的亞序列和延長(zhǎng)的序列。本發(fā)明還涵蓋了包含所述核酸序列的基因、cDNA、錢和基因和載體。上文及本文別處應(yīng)用的單字母表示的核苷酸代碼根據(jù)并入本文作參考的WIPOStandardST.25(1998),Appendix2,Tablel,(M.P.E.P.2422,Tablel)而定。特別地，如下表l示出了單字母代碼表示的相關(guān)核苷酸。括號(hào)中的核苷酸(例如(n》是指可以存在或不存在的核苷酸。另外，圖21列出了基于SEQIDNO:5-ll核苷酸排列的SEQIDNO:5-ll的各個(gè)可能序列。表l:單字母代碼的核苷酸縮寫<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>本發(fā)明方法中應(yīng)用的核苷酸序列的一個(gè)例子包含彼此互補(bǔ)的序列，所述互補(bǔ)區(qū)在一些實(shí)施方案中能形成至少大約15-300、至少大約15-24個(gè)堿基對(duì)的雙鏈體。所述雙鏈體的一個(gè)鏈包含本發(fā)明的核酸分子的核酸序列的至少15個(gè)連續(xù)堿基的核酸序列。在一個(gè)實(shí)施例中，所述雙鏈體的一個(gè)鏈包含具有15、16、17或者18個(gè)核苷酸、或者更長(zhǎng)如19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)核苷酸、或者直至本文所述任何核酸序列全長(zhǎng)的核酸序列。這種片段可易于通過(guò)例如化學(xué)合成方法直接合成所述片段、通過(guò)應(yīng)用核酸擴(kuò)增技術(shù)、或者通過(guò)在重組載體中導(dǎo)入選擇的序列進(jìn)行重組產(chǎn)生而制備。短語(yǔ)"特異性雜交"是指一種分子僅與特定的核苷酸序列(當(dāng)該序列存在于復(fù)合的核酸混合物中例如總DNA或RNA中時(shí))在嚴(yán)格條件下結(jié)合、形成雙鏈體或者雜交。術(shù)語(yǔ)"亞序列"是指包含較長(zhǎng)的核酸或氨基酸序列的一部分的核酸分子或氨基酸分子的序列。亞序列的一個(gè)例子是包含pri-miRNA或pre-miRNA(miRNA前體)的雙鏈體區(qū)的一部分的一個(gè)序列，包括但非限于在核酸酶作用后成為成熟miRNA的核苷酸或者miNRA前體中的單鏈區(qū)。術(shù)語(yǔ)"延長(zhǎng)的序列"是指在所述核酸中摻入額外的核苷酸(或者其它類似分子)。例如，聚合酶(例如DNA聚合酶)可以在所述核酸分子的3，末端添加序列。另外，所述核苷酸序列可以與其它DNA序列組合，如啟動(dòng)子、啟動(dòng)子區(qū)、增強(qiáng)子、聚腺苷酸化信號(hào)、內(nèi)含子序列、額外的限制酶位點(diǎn)及其它編碼節(jié)段。本發(fā)明的核酸可以被克隆、合成、重組改變、誘變或者對(duì)其組合進(jìn)行這些技術(shù)。用于分離核酸的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)為本領(lǐng)域所已知。例如，非限制性的方法是由Silhavy198446、AusubelWa/"198936、Glover&Hames,199547及Sambrook&Russell,200140所述方法。產(chǎn)生堿基對(duì)改變、缺失或小的插入的位點(diǎn)特異性誘變方法也為本領(lǐng)域所已知，由出版物例證(見(jiàn)例如Adelmanaa/.，198348、Sambrook&Russell,200140)。IV:miRNA-表達(dá)載體在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，miRNA分子或者miRNA前體分子是從插入核酸載體中的轉(zhuǎn)錄單位表達(dá)的(所述載體或者通常稱作"重組載體"或者"表達(dá)載體")。載體可用于將編碼miRNA的核酸分子輸送至肌細(xì)胞中以靶向特定基因。所述重組載體可以是例如DNA質(zhì)?；虿《据d體。本領(lǐng)域已知多種表達(dá)載體。適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體的選擇可以基于一些因素包括但非限于表達(dá)所希望的細(xì)胞類型而決定。術(shù)語(yǔ)"載體"是指能轉(zhuǎn)運(yùn)與其連接的另一種核酸的核酸。載體包括能自主復(fù)制和表達(dá)其連接的核酸的那些載體。能指導(dǎo)與其可操縱地連接的基因表達(dá)的載體在本文稱作"表達(dá)載體"。通常地，用于重組技術(shù)中的表達(dá)載體通常是質(zhì)粒形式。然而，本發(fā)明包括其它形式的表達(dá)載體，其發(fā)揮相同功能并隨后將為本領(lǐng)域所了解。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"表達(dá)載體"是指能指導(dǎo)特定核苷酸序列在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)的核苷酸序列，其包含與轉(zhuǎn)錄終止序列可操縱地連接的感興趣的核苷酸序列可操縱地連接的啟動(dòng)子。其還典型包含所述核苷酸序列正確翻譯所需的序列。包含感興趣的核苷酸序列的構(gòu)建體可以是嵌合的。所述構(gòu)建體也可以是天然發(fā)生的，但是已經(jīng)以重組方式獲得以用于異源表達(dá)的構(gòu)建體。感興趣的核苷酸序列，包括設(shè)計(jì)為正確表達(dá)所述核苷酸序列的任何額外序列，也可以稱作"表達(dá)盒"。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"異源基因"、"異源DNA序列"、"異源核苷酸序列"、"外源核酸分子"或者"外源DNA節(jié)段"均是指源自與指定宿主細(xì)胞無(wú)關(guān)的來(lái)源，或者如果源自相同來(lái)源，則是其原始形式的修飾形式。因此，宿主細(xì)胞中的異源基因包括與特定宿主細(xì)胞是內(nèi)源的、但是已經(jīng)例如通過(guò)誘變或者通過(guò)分離自天然轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列而修飾的基因。該術(shù)語(yǔ)還包括天然發(fā)生的核苷酸序列的非天然發(fā)生的多個(gè)拷貝。因此，該術(shù)語(yǔ)是指與所述細(xì)胞不相關(guān)或異源的DNA節(jié)段，或者與所述細(xì)胞同源、但是在宿主細(xì)胞中的不是最初發(fā)現(xiàn)其的位置。術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子"或者"啟動(dòng)子區(qū)"均是指基因內(nèi)位于5'至編碼序列并發(fā)揮指導(dǎo)編碼序列轉(zhuǎn)錄功能的核苷酸序列。啟動(dòng)子區(qū)包含一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，且可以另外包含一或多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法應(yīng)用RNA聚合酶III啟動(dòng)子。"最小啟動(dòng)子"是具有為發(fā)生基本水平的轉(zhuǎn)錄所需的最小元件的核苷酸序列。如此，最小啟動(dòng)子不是完整的啟動(dòng)子，而是在實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中能指導(dǎo)報(bào)道構(gòu)建體基本水平轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的亞序列。最小啟動(dòng)子包括但非限于巨細(xì)胞病毒(CMV)最小啟動(dòng)子、單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)最小啟動(dòng)子、猿病毒40(SV40)最小啟動(dòng)子、人P-肌動(dòng)蛋白最小啟動(dòng)子、人EF2最小啟動(dòng)子、腺病毒E1B最小啟動(dòng)子，及熱激蛋白(hsp)70最小啟動(dòng)子。最小啟動(dòng)子通常增加一或多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件以影響可操縱地連接的基因的轉(zhuǎn)錄。例如，細(xì)胞類型特異性或者組織特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件可以加入最小啟動(dòng)子中，以產(chǎn)生指導(dǎo)可操縱地連接的核苷酸序列以細(xì)胞類型特異性或者組織特異性方式轉(zhuǎn)錄的重組啟動(dòng)子。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"最小啟動(dòng)子"也涵蓋了本文揭示的啟動(dòng)子的功能衍生物，包括但非限于RNA聚合酶m啟動(dòng)子(例如H1、7SL、5S或者U6啟動(dòng)子)、腺病毒VA1啟動(dòng)子、Vault啟動(dòng)子、端粒末端轉(zhuǎn)移酶RNA啟動(dòng)子和tRNA基因啟動(dòng)子。不同的啟動(dòng)子具有不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件組合?；蚴欠裨诩?xì)胞中表達(dá)依賴于組成基因的啟動(dòng)子的特定轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的組合及所述細(xì)胞核中存在的不同轉(zhuǎn)錄因子。如此，根據(jù)其在體內(nèi)或者在體外的功能活性，啟動(dòng)子通常被分為"組成型啟動(dòng)子"、"組織特異性啟動(dòng)子"、"細(xì)胞特異性啟動(dòng)子"或者"可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子"。例如，組成型啟動(dòng)子是能指導(dǎo)基因在生物體的多種類型細(xì)胞(在一些實(shí)施方案中是在所有類型細(xì)胞)中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子的例子包括編碼某些組成型或者"管家"功能的如下基因的啟動(dòng)子次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HPRT)、二氫葉酸還原酶(DHFR，(Scharfmann1991)、.腺苷脫氨酶、磷酸甘油酸激酶(PGK)、丙酮酸激酶、磷酸甘油酸變位酶、(3-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(見(jiàn)例如Williamsea/.，1993)，及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它組成型啟動(dòng)子。另一方面，"組織特異性"或者"細(xì)胞類型特異性"啟動(dòng)子指導(dǎo)在生物體的一些組織或細(xì)胞類型中轉(zhuǎn)錄，但是在一些或所有其它組織或者細(xì)胞類型中是失活的。組織特異性啟動(dòng)子的例子包括在下文詳細(xì)描述的那些啟動(dòng)子，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它組織特異性和細(xì)胞類型特異性啟動(dòng)子。當(dāng)用于描述啟動(dòng)子時(shí)，如本文所用，術(shù)語(yǔ)"連接"是指啟動(dòng)子元件的物理性接近，由此其一起發(fā)揮指導(dǎo)可操縱地連接的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的功能。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列"或者"轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件"均是指啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)能應(yīng)答調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的一個(gè)核苷酸序列。應(yīng)答可以包含轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量的增加或減少，由轉(zhuǎn)錄因子與包含所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的核苷酸序列的結(jié)合而介導(dǎo)。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列是轉(zhuǎn)錄終止序列，或者在本文稱作轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)錄因子"通常是指通過(guò)與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件及進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞成分相互作用而調(diào)節(jié)基因表達(dá)的蛋白質(zhì)，包括RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子(TAFs)、染色質(zhì)重塑蛋白及影響基因轉(zhuǎn)錄的任何其它相關(guān)蛋白。V:調(diào)節(jié)肌細(xì)胞中基因表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)肌細(xì)胞中基因特異性表達(dá)的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括將肌細(xì)胞與耙向所述肌細(xì)胞中基因的miRNA或者編碼所述miRNA的載體接觸。靶向肌細(xì)胞中一或多個(gè)特定基因可以高水平特異性操縱肌細(xì)胞功能或發(fā)育(例如分化)。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了調(diào)節(jié)肌細(xì)胞功能或發(fā)育的方法，通過(guò)將肌細(xì)胞與靶向肌細(xì)胞中可調(diào)節(jié)肌細(xì)胞功能或發(fā)育的基因的miRNA接觸。在一些實(shí)施方案中，靶向于特定基因的miRNA選自miR-l、miR-133、miR-206、miR隱208、miR隱22、miR-26、miR-29、miR-30、miR-128、miR-143和miR-145(分別為SEQIDNO:1-11),包括具有與SEQIDNO:1-11任一序列至少70%、80%、85%、卯％、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的序列的miRNA。如果一種miRNA與一種RNA分子具有足夠的核苷酸相似性，期望在足以使得所述miRNA與所述RNA分子相互作用的條件下調(diào)節(jié)所述RNA分子表達(dá)，則所述miRNA"靶向于"所述RNA分子。在一些實(shí)施方案中，所述相互作用發(fā)生在肌細(xì)胞中。在一些實(shí)施方案中，所述相互作用在生理學(xué)條件下發(fā)生。如本文所用，短語(yǔ)"生理學(xué)條件"是指在體內(nèi)肌細(xì)胞內(nèi)的條件，無(wú)論所述肌細(xì)胞是對(duì)象或?qū)ο蠼M織的一部分，還是在體外生長(zhǎng)的肌細(xì)胞。因此，如本文所用，短語(yǔ)"生理學(xué)條件"是指作為生物體的一部分或是在體外生長(zhǎng)的肌細(xì)胞可以暴露于其的任何條件。在一些實(shí)施方案中，靶基因是肌細(xì)胞分化基因或者肌細(xì)胞組織基因，且當(dāng)其表達(dá)時(shí)可以分別調(diào)節(jié)肌細(xì)胞的分化和/或增殖。在一些實(shí)施方案中，靶基因可以表達(dá)抑制肌細(xì)胞分化和/或增殖的基因。因此，所述miRNA對(duì)一或多個(gè)這些分化和/或增殖靶基因表達(dá)的靶向抑制可以導(dǎo)致所處理的肌細(xì)胞的分化和/或增殖增加。在本發(fā)明的非限制性實(shí)施方案中，所述肌細(xì)胞分化基因可以編碼組蛋白脫乙酰酶4(HDAC4)多肽或者甲狀腺激素受體蛋白240(TRAP240)，所述肌細(xì)胞增殖基因可編碼血清應(yīng)答因子(SRF)多肽。利用本發(fā)明揭示的miRNA之一可以靶向抑制一或多種肌細(xì)胞分化或增殖基因的表達(dá)。例如，miRNAmiR-l和miRNA-133分別特異性靶向HDAC4和SRF的3'非翻譯區(qū)，并抑制由這些基因編碼的基因產(chǎn)物的表達(dá)。因此，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，肌細(xì)胞的分化可以通過(guò)將其與miR-l接觸而增加，所述miR-l靶向編碼HDAC4的基因，從而充分阻止HDAC4的表達(dá)并增加肌細(xì)胞分化。同樣，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，肌細(xì)胞的增殖可以通過(guò)將其與接觸而增加，所述miR-133靶向編碼SRF的基因，從而充分阻止SRF的表達(dá)并增加肌細(xì)胞增殖。VL治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明在一些實(shí)施方案中提供了治療對(duì)象肌損傷的治療方法。如本發(fā)明所揭示，miRNA可以靶向基因以調(diào)節(jié)所述基因的表達(dá)。特別地，miRNA可以靶向發(fā)揮抑制肌細(xì)胞分化和/或增殖功能的基因表達(dá)產(chǎn)物，以抑制這些基因的表達(dá)，使得肌細(xì)胞分化和/或增殖增加。另外，內(nèi)源miRNA可以靶向miRNA抑制劑，以有益于治療肌損傷的方式促進(jìn)特定基因產(chǎn)物的表達(dá)。另外，miRNA和/或miRNA抑制劑的組合物可以共同給予肌損傷對(duì)象，優(yōu)化損傷的康復(fù)。肌細(xì)胞分化和/或增殖的增加可以有益于損傷的肌組織康復(fù)或者刺激所示損失的肌組織再生。因此，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，治療肌損傷的方法包括給予對(duì)象肌損傷部位有效量的miRNA、編碼所述miRNA的載體、miRNA的抑制劑，或者組合給予這些物質(zhì)，其中所述miRNA靶向于所述肌損傷部位肌細(xì)胞中的基因。肌組織的發(fā)育及可比的肌組織生長(zhǎng)和/或康復(fù)如損傷后的康復(fù)可以同階段發(fā)生。代表性的階段包括未分化的肌細(xì)胞增殖，隨后所述肌細(xì)胞分化為肌組織的成熟細(xì)胞。因此，促進(jìn)肌損傷部位肌組織的修復(fù)可以通過(guò)同等給予所述損傷部位增強(qiáng)未分化的肌細(xì)胞增殖的miRNA禾口/或miRNA抑制劑，給予損傷部位miRNA和/或miRNA抑制劑增強(qiáng)增殖的肌細(xì)胞分化為成熟的功能性肌組織。例如，如本發(fā)明所揭示，已經(jīng)確定miR-l和miR-133在調(diào)節(jié)骨骼肌增殖和分化中發(fā)揮獨(dú)特作用。miR-133通過(guò)抑制SRF而增強(qiáng)肌細(xì)胞增殖。相反，miR-l通過(guò)靶向HDAC4(—種肌細(xì)胞基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄抑制劑)而促進(jìn)肌細(xì)胞分化。因此，在本發(fā)明的一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，首次將miR-133和miR-l抑制劑(例如2'-0-甲基-miR-l)在第一時(shí)間點(diǎn)共同給予肌損傷部位，以增加損傷部位的肌細(xì)胞增殖。然后，在第二時(shí)間點(diǎn)共同給予miR-l禾口miR-133抑制劑(例如2，-0-甲基-1^仗-133)，增加增殖的肌細(xì)胞的分化。暫時(shí)同等共同給予多種1^1^八和/或miRNA抑制劑可進(jìn)一步改善肌損傷的康復(fù)。在一些實(shí)施方案中，肌損傷得自機(jī)械性肌創(chuàng)傷、肌組織退行性疾病、心肌損傷或者這些損傷的組合。機(jī)械性肌創(chuàng)傷可以是例如鈍傷如在車禍或者穿刺傷的結(jié)果，其中所述肌組織被切開(kāi)或撕開(kāi)。非限制性的肌組織退行性疾病的例子包括肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(例如Duchenne肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(DMD))、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病(例如肌萎縮性(脊髓)側(cè)索硬化(ALS))、炎癥性肌病(例如皮肌炎(DM))、神經(jīng)肌肉接頭病變(例如重癥肌無(wú)力(MG))、內(nèi)分泌性肌病(例如甲亢肌病(HYPTM))，及代謝性肌病(例如磷酸化酶缺陷(MPD))。非限制性的心肌損傷的例子包括心肌梗塞和心肌再灌注損傷。在一些實(shí)施方案中，靶向特定基因的miRNA選自miR-l、miR-133、miR-206、miR-208、miR-22、miR-26、miR-29、miR-30、miR-128、miR-143和miR-145(分別為SEQIDNO:1-11)，包括具有與SEQIDNO:l-ll任一序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93°/。、94°/。、95%、96°/。、97%、98%或者99%相同的序列的miRNA。在一些實(shí)施方案中，所述基因是肌細(xì)胞分化基因(例如編碼HDAC4或者TRAP240)或者肌細(xì)胞增殖基因(例如編碼SRF)。關(guān)于本發(fā)明的治療方法，優(yōu)選的對(duì)象是脊椎動(dòng)物對(duì)象。優(yōu)選的脊椎動(dòng)物是溫血?jiǎng)游?；?yōu)選的溫血脊椎動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物最優(yōu)選是人。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"對(duì)象"包括人和動(dòng)物對(duì)象。因此，本發(fā)明還提供了獸用治療用途。如此，本發(fā)明提供了對(duì)哺乳動(dòng)物的治療，所述哺乳動(dòng)物如人以及那些由于瀕臨滅絕而重要的哺乳動(dòng)物，如西伯利亞虎；以及具有經(jīng)濟(jì)學(xué)重要性的哺乳動(dòng)物如供人類消費(fèi)的在農(nóng)場(chǎng)飼養(yǎng)的動(dòng)物；和/或?qū)τ谌祟惥哂猩鐣?huì)重要性的動(dòng)物，如寵物或動(dòng)物園內(nèi)動(dòng)物。這種動(dòng)物的例子包括但非限于食肉動(dòng)物如貓和狗；豬，包括豬(pig)、豬(hog)及野豬；反芻動(dòng)物和/或有蹄動(dòng)物如牛(cattle)、牛(oxen)、綿羊、長(zhǎng)頸鹿、梅花鹿、山羊、野牛和駱駝；及馬。本發(fā)明還提供了對(duì)鳥(niǎo)類的治療，包括治療瀕臨滅絕的和/或動(dòng)物園中的那些鳥(niǎo)類，以及家禽、特別是馴養(yǎng)的家禽即家禽(poultiy)，如火雞、雞、鴨、鵝、珍珠雞等，其對(duì)人類也具有經(jīng)濟(jì)學(xué)重要性。因此，本發(fā)明還提供了對(duì)家畜的治療，包括但非限于馴養(yǎng)的豬、反芻動(dòng)物、有蹄動(dòng)物、馬(包括賽馬)、家禽等。給予對(duì)象miRNA或者編碼所述miRNA的載體的適當(dāng)方法包括但非限于全身性給予、腸道外給予(包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)給予)、口服、含服、皮下給予、吸入、氣管內(nèi)裝置、手術(shù)植入、經(jīng)皮給予、局部注射和超高速注射/轟擊。在適當(dāng)情況下，持續(xù)注入可增強(qiáng)藥物集中于靶位點(diǎn)。本發(fā)明的方法中使用的特定給予模式依賴于多種因素，包括但非限于應(yīng)用的miRNA和/或載體，所治療的疾病的嚴(yán)重性及活性化合物在給予之后的代謝或清除機(jī)制。本文所用術(shù)語(yǔ)"有效量"是指所述治療組合物(例如包含miRNA或者編碼所述miRNA的載體的組合物)足以產(chǎn)生可測(cè)生物學(xué)應(yīng)答(例如肌細(xì)胞分化和/或增殖增加)的量。本發(fā)明治療組合物中活性化合物的實(shí)際劑量水平可以變化，以便給予所述活性化合物的量有效達(dá)到針對(duì)特定對(duì)象和/或應(yīng)用的希望的治療應(yīng)答。選擇的劑量水平依賴于多種因素，包括治療組合物的活性、配方、給予途徑、與其它藥物或治療方法的組合、治療疾病的嚴(yán)重性，及治療對(duì)象的一般狀況和病史。優(yōu)選地，給予最小劑量，在不存在劑量限制毒性的條件下逐步增加劑量，達(dá)到最低限度的有效量。有效劑量的確定和調(diào)整以及何時(shí)及怎樣進(jìn)行如此調(diào)整的評(píng)估為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。實(shí)施例如下實(shí)施例例證了本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明的揭示及本領(lǐng)域技術(shù)人員的通識(shí)，技術(shù)人員意識(shí)到如下實(shí)施例僅是例證了本發(fā)明，在不偏離本發(fā)明范圍的前提下可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改變、修改和變化。實(shí)施例1為了理解microRNAs(miRNA)在骨骼肌增殖和分化中的參與作用，我們使用確立的微陣列分析方法分析了miRNA在骨骼肌分化期間的表達(dá)9。我們選擇使用C2C12成肌細(xì)胞，因?yàn)檫@種細(xì)胞系精確地在體外模擬骨骼肌分化，當(dāng)從培養(yǎng)基中去除血清時(shí)，成肌細(xì)胞被誘導(dǎo)成為終末分化的肌管1(M2。我們發(fā)現(xiàn)檢測(cè)的miRNA成分的表達(dá)在分化的C2C12成肌細(xì)胞/肌管中被上調(diào)(圖la和圖6)。通過(guò)Northern印跡分析證實(shí)miR-l和miR-133在分化的成肌細(xì)胞中表達(dá)增加(圖lb和圖7)。實(shí)施例2miR-l和miR-133在成體心肌和骨骼肌組織中特異性表達(dá)，但是在測(cè)試的其它組織中不是這樣(圖lc,圖8)。然而，關(guān)于哺乳動(dòng)物發(fā)育期間特異性miRNA的時(shí)間和空間分布的了解還很少。我們因此檢測(cè)了miR-l禾BmiR-133在小鼠胚胎和新生小鼠中的表達(dá)。miR-l和miR-133在E13.5和E16.5胚胎發(fā)育中的心臟和骨骼肌中極低水平表達(dá)(圖ld和圖8)。發(fā)現(xiàn)在新生小鼠的心臟和骨骼肌中miR-l和miR-133表達(dá)水平增加，但是其仍顯著低于在成體中的表達(dá)水平(圖le和圖8)。這些數(shù)據(jù)與在斑馬中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致，在斑馬中大多數(shù)miRNA在胚胎發(fā)生期間相對(duì)較晚期表達(dá)16。實(shí)施例3miR-l和miR-133聚集在小鼠染色體2(間隔9.3kb)和18(間隔2.5kb)上(圖9和參考文獻(xiàn)14)。我們使用包括miR-l或miR-133序列的300bp基因組探針進(jìn)行Northern印跡分析(圖9a-9e)。來(lái)自染色體18的miR-l和miR-133探針從分離自心臟和骨骼肌的總RNA中檢測(cè)到一個(gè)~6kb初級(jí)轉(zhuǎn)錄物(圖9b和9c)，表明miR-l和miR-133確實(shí)一起轉(zhuǎn)錄。同時(shí)來(lái)自染色體2的miR-l和miR-133探針從心臟和骨骼肌中檢測(cè)到一個(gè)-10kb轉(zhuǎn)錄物，miR-133探針也與4.5kb和2.2kb的兩個(gè)額外的轉(zhuǎn)錄物雜交，同時(shí)miR-l探針也檢測(cè)到一個(gè)6kb主要轉(zhuǎn)錄物(圖9d和9e)，提示轉(zhuǎn)錄后加工的潛在參與作用。總之，我們的數(shù)據(jù)表明miR-l和miR-133的心肌和骨骼肌特異性表達(dá)在初始的轉(zhuǎn)錄步驟進(jìn)行。實(shí)施例4我們推論控制染色體2和18的miR-l和miR-133簇的轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)元件很可能是保守的。因此，我們進(jìn)行了序列分析并鑒別了高度保守的區(qū)域(2kb)，其位于染色體2和18上的miR-1/133簇上游大約50kb處(圖10)。當(dāng)來(lái)自染色體2的這種基因組片段用于驅(qū)動(dòng)dsRed報(bào)道基因在轉(zhuǎn)基因Xem^i/s中的表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)所述轉(zhuǎn)基因的心肌和骨骼肌特異性表達(dá)(圖10)。實(shí)施例5為了評(píng)定miR-l和miR-133在骨骼肌中的功能，我們首先嘗試在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-l和miR-133。我們使用印跡分析以及miR-l和miR-133"感應(yīng)器"17檢測(cè)并確認(rèn)了這兩個(gè)miRNA的表達(dá)和活性，所述感應(yīng)器中miR-l或miR-133的互補(bǔ)序列克隆在dsRed編碼序列的下游(圖11，數(shù)據(jù)未示出)。使用miR-l或miR-133轉(zhuǎn)染C2C12成肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞維持在生長(zhǎng)培養(yǎng)基(GM)中，或者將其移至分化培養(yǎng)基(DM)中。miR-l顯著增強(qiáng)肌生成，這通過(guò)分別為早期和晚期肌原性標(biāo)記的肌形成蛋白和肌球蛋白重鏈(MHC)、以及其它肌原性標(biāo)記包括MyoD、Mef2和骨骼肌oc-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)均增加而表明(圖2a-2e、2i、2j和表2)。miR-l誘導(dǎo)肌原性標(biāo)記基因在維持在對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)條件(圖2c)和分化條件(圖2、2d、2e)下的細(xì)胞中表達(dá)。由miR-l誘導(dǎo)的肌原性分化加速也伴隨著細(xì)胞增殖降低，其通過(guò)磷酸-組蛋白H3的表達(dá)顯著降低而表明(圖2、2c、2e和表2)。特別需要注意的是，miR-l誘導(dǎo)的肌生成是特異性的，因?yàn)樵诠趋兰〖?xì)胞中不內(nèi)源表達(dá)的GFP對(duì)照物或miR-208的過(guò)表達(dá)示出無(wú)作用(圖2a-2e)。另外，在miR-l"種子"序列中導(dǎo)入突變消除了其激活肌原性基因表達(dá)的能力(圖2d-2e)。相反，miR-133的過(guò)表達(dá)抑制肌形成蛋白和MHC的表達(dá)(圖2，a-e和表2)并促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖(圖2c-2e和表2)。同樣，miR-133對(duì)成肌細(xì)胞增殖的作用是特異性的，因?yàn)閷?duì)照組示出無(wú)作用且導(dǎo)入的突變消除miR-133的功斷圖2a-2e，2j)。表2:miR-l和miR-133過(guò)表達(dá)和敲除對(duì)于肌原性增殖和分化的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>我們進(jìn)行了交互實(shí)驗(yàn)，其中用miR-l或miR-1332'-0-甲基反義抑制性寡聚物(或者對(duì)照GFP和miR-208)轉(zhuǎn)染C2C12成肌細(xì)胞，已經(jīng)示出抑制miRNA的功能"，w。用miR-l抑制劑轉(zhuǎn)染的細(xì)胞示出肌生成抑制及成肌細(xì)胞增殖得以促進(jìn)，這通過(guò)肌原性標(biāo)記減少及磷酸-組蛋白H3增加而表明(圖2f-2i和表2)。與miR-133促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖并抑制分化的作用一致，miR-133的抑制導(dǎo)致相反作用，其中肌生成增強(qiáng)而細(xì)胞增殖被抑制(圖2f-2j和表2)。相反，對(duì)照的2，-0-甲基抑制劑示出無(wú)作用(圖2f-2j)。我們推斷miR-l和miR-133在骨骼肌增殖和分化中具有不同作用miR-l促進(jìn)成肌細(xì)胞分化，而miR-133剌激成肌細(xì)胞增殖。實(shí)施例6在從果蠅到人的大多數(shù)動(dòng)物物種中均已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了miR-l和miR-133，提示其是進(jìn)化保守的。為了檢測(cè)miR-l和miR-133對(duì)骨骼肌和心臟發(fā)育的作用，我們鑒別了miR-1和miR-133在Xem戸s中的拷貝，并測(cè)試其錯(cuò)表達(dá)(mis-expression)的功能。在單細(xì)胞階段導(dǎo)入miR-1導(dǎo)致軸(axis)顯著縮短，伴隨著與未注射的或者注射miGFP的對(duì)照組(n〉45，兩個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn))相比，前結(jié)構(gòu)(anteriorstructures)的減少及沿著背-腹軸的身體大小的增加(圖3)。盡管在注射miR-1的胚胎中形成體節(jié)(圖3)，但是全標(biāo)本包埋抗體染色和系列切片表明所述組織是高度無(wú)組織構(gòu)造的，且不能發(fā)育成分節(jié)段的結(jié)構(gòu)(圖3e，3f，3j)。通過(guò)組織學(xué)、原肌球蛋白染色(圖3f，3j)及心肌肌動(dòng)蛋白染色判斷心肌組織完全不存在。除了這些缺陷之外，磷酸-組蛋白H3染色顯著降低(圖3i-3k)，與miR-l在調(diào)節(jié)肌細(xì)胞增殖和分化中的基本作用一致。盡管miR-133的錯(cuò)表達(dá)也導(dǎo)致前結(jié)構(gòu)減少及體節(jié)發(fā)育缺陷，但是與miR-1相反，前-后的長(zhǎng)度僅略為減少，且體節(jié)缺陷在不能形成體節(jié)的胚胎的更前部或后部最嚴(yán)重(圖3g，3h)。另外，心肌組織經(jīng)常在miR-133胚胎中形成，但是其是高度無(wú)組織構(gòu)造的且不能經(jīng)歷心臟回路或心室形成(圖3g，3h，3k)?？傊?，這些數(shù)據(jù)提示miR-l和miR-133的準(zhǔn)確時(shí)程和水平對(duì)于正確的骨骼肌和心臟發(fā)育是必需的。實(shí)施例7HDAC4在其3'UTR含有兩個(gè)天然發(fā)生的推定的miR-l位點(diǎn)，其在脊椎動(dòng)物物種中是進(jìn)化保守的(圖12)。相似地，在哺乳動(dòng)物SRF基因的3，UTR中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)保守的miR-133結(jié)合位點(diǎn)(圖12)，示出在體外和體內(nèi)肌組織增殖和分化中起重要作用11，24，25。我們將小鼠SRF和HDAC4的3'UTR與螢光素酶報(bào)道基因融合，并將這些構(gòu)建體連同轉(zhuǎn)染對(duì)照物一起轉(zhuǎn)染進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。miR-l的異位過(guò)表達(dá)顯著抑制HDAC43'UTR螢光素酶報(bào)道基因，而miR-133抑制SRF3，UTR螢光素酶報(bào)道基因的表達(dá)(圖4a)。相反，在miR-l或miR-133"種子"序列中導(dǎo)入突變則消除這種抑制，表示這種作用的特異性(圖4a)。當(dāng)上述報(bào)道基因轉(zhuǎn)染進(jìn)C2C12成肌細(xì)胞中且在誘導(dǎo)細(xì)胞分化之前和之后測(cè)量螢光素酶活性時(shí)，發(fā)現(xiàn)所述報(bào)道基因活性在分化的細(xì)胞中顯著抑制(圖4b)，表示內(nèi)源miR-l和miR-133水平增加抑制所述報(bào)道基因。通過(guò)miRNA"感應(yīng)器"監(jiān)測(cè)內(nèi)源miR-l和miR-133的作用和特異性(圖11)。相反，MCK-luc報(bào)道基因(一種肌細(xì)胞分化的指示劑)的螢光素酶活性在分化的肌細(xì)胞中增加(圖4b)。另外，miR-l的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致在生長(zhǎng)條件(圖4c)和分化條件(圖4e)下C2C12細(xì)胞中內(nèi)源HDAC4蛋白被負(fù)調(diào)節(jié)，而miR-133抑制內(nèi)源SRF蛋白的表達(dá)(圖4c，4e)。相反，這些miRNA不改變SRF和HDAC4的mRNA水平(圖4d)，支持了miRNA主要通過(guò)抑制翻譯而抑制其靶基因功能的觀點(diǎn)。當(dāng)應(yīng)用miR-l或miR-133的2'-0-甲基翻譯寡聚物時(shí)，其分別減輕對(duì)蛋白質(zhì)水平的HDAC4或SRF的抑制作用(圖4g)，而對(duì)其mRNA水平則無(wú)作用(圖4f)。為了進(jìn)一步證實(shí)HDAC4和SRF在調(diào)節(jié)骨骼肌基因表達(dá)中是miR-l或miR-133的關(guān)聯(lián)靶，我們測(cè)試了共轉(zhuǎn)染SRF或HDAC4的表達(dá)質(zhì)粒是否能"抑制"miRNA介導(dǎo)的肌生成。確實(shí)，如圖4h所示，SRF的過(guò)表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)了由miR-133誘導(dǎo)的肌原性基因阻抑。相反，HDAC4抵消了miR-l對(duì)骨骼肌基因表達(dá)的作用(圖4h)。與HDAC4和SRF潛在參與miR-l和miR-133依賴性骨骼肌增殖和分化一致，內(nèi)源性HDAC4和SRF蛋白水平在分化的C2C12細(xì)胞中被下調(diào)，伴隨肌原性分化標(biāo)記表達(dá)的增加和有絲分裂指數(shù)標(biāo)記磷酸組蛋白H3表達(dá)的降低(圖4i和圖7d)。SRF和HDAC4蛋白降低的表達(dá)伴隨著miR-l和miR-133表達(dá)的增加(對(duì)比圖4i和圖lb)。這些數(shù)據(jù)加在一起證實(shí)miR-l和miR-133分別特異性阻抑HDAC4和SRF蛋白水平，這(至少部分)導(dǎo)致這些miRNA對(duì)成肌細(xì)胞增殖和分化的調(diào)節(jié)作用。我們鑒定了心臟和骨骼肌特異性miR-l和miR-133并且表明了它們?cè)诳刂乒趋兰≡鲋澈头只械墓δ?。令人注目地，我們發(fā)現(xiàn)miR-l和miR-133在相同的染色體基因座中簇集并且一起為一個(gè)單個(gè)轉(zhuǎn)錄物，變成兩個(gè)獨(dú)立的成熟miRNA，它們具有不同的生物學(xué)功能，抑制不同的靶基因。這暗示miRNA參與復(fù)雜的分子機(jī)制。令人感興趣地，盡管miR-l和miR-133的組織特異性表達(dá)由myoD禾卩SRFS控制，但是SRF表達(dá)由miR-133阻抑。因此，這些發(fā)現(xiàn)揭示了一負(fù)調(diào)節(jié)環(huán)，其中miRNA參與調(diào)節(jié)途徑，從而控制細(xì)胞增殖和分化(圖5)。實(shí)施例l一7的材料和方法經(jīng)微陣列進(jìn)行的MicroRNA表達(dá)分析在不同時(shí)間點(diǎn)(第0、1、3和5天，轉(zhuǎn)移到DM中第一天計(jì)為第0天)從在生長(zhǎng)培養(yǎng)基(GM)或分化培養(yǎng)基(DM)中培養(yǎng)的C2C12細(xì)胞中分離總RNA，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基由含有10%胎牛血清(FBS)(Sigma)和1X青霉素/鏈霉素(Invitrogen,Carlsbad,California,U.S.A.)的Dulbecco，sModifiedEagleMedium(DMEM)(SigmaChemicalCo.，StLouis,Missouri,U.S.A.)組成，所述分化培養(yǎng)基由含有2%馬血清(Sigma)的DMEM(Sigma)組成。如所述9進(jìn)行微陣列雜交和數(shù)據(jù)分析。簡(jiǎn)而言之，在一次性反應(yīng)室(MJResearch,Reno,Nevada,U.S.A.;partnumberSLF-0601)中，將2.5ug分離的RNA使用RNA連接酶用5'-磷酸-胞苷酰-尿苷酰-Cy3-3'(Dharmacon，Inc.,Lafayette,Colorado,U.S.A.)標(biāo)記，并與0.5mM用ALEXA647(Cy5)(MolecularProbes,Eugene,Oregon,U.S.A.)標(biāo)記的針對(duì)124個(gè)microRNA的寡核苷酸探針混合物雜交。歸一化的log(以2為底)數(shù)據(jù)由基因群集并繪制為熱圖。信號(hào)范圍從一4倍到+4倍。黃色代表相對(duì)于中值的高表達(dá)，藍(lán)色代表相對(duì)于中值的低表達(dá)。Northern印跡分析用TRIZOL試劑(Invitrogen)從C2C12細(xì)胞、小鼠胚胎或成年組織中提取總RNA。為進(jìn)行miRNA的Northern印跡分析，施加PEG以除去大的RNA。簡(jiǎn)而言之，將30嗎每種總RNA樣品與5XPEG溶液1:1混合并置于冰上10分鐘。在4°C以最大速度離心10分鐘后，將上清轉(zhuǎn)移到新鮮試管中。然后加入2.5體積的100X乙醇沉淀RNA并以最大速度離心30分鐘。如所述13進(jìn)行miRNA的Northern印跡分析。用作探針的miR-1和miR-133寡核苷酸序列見(jiàn)表3所列。Northern印跡分析被用于檢測(cè)miRNA的一級(jí)轉(zhuǎn)錄物，如所述26，使用來(lái)自每一樣品的20fig總RNA進(jìn)行所述分析。miR-1和miR-133的基因組片段經(jīng)PCR克隆并用作探針。表3本文描述的寡核苷酸的序列名稱序列miR-l探針TACATACTTCTTTACATTCCAmiR-133探針ACAGCTGGTTGMGGGGACCAAmiR-133a-l-上CATGTGACCCCTCACACACAmiR-133a-l-下ACAAGGGGAGCCTGGATCCCmiR-133a-2-上GGACATATGCCTAAACACGTGAniiR-133a-2-下GAAACATCTTTATCCAGTTTmiR-l-2-上AGACTGAGACACAGGCGACACCmiR-1-2-下TGCCGGTCCATCGGTCCATTGCmiR-l國(guó)l-上CACTGGATCCATTACTCTTCmiR誦l-l-下TTGGAATGGGGCTGTTAGTAmiR-lmut-上TGAACATTCAGTGCTAT織GMGTATGTAI11IGGGTAGGTAmiR-lrauN下TACCTACCCAAMTACATACTTCTTTATAGCACTGMTGTTCAmiR-133mut陽(yáng)上MTCGCCTaTCAATGGATTTGTCAACCAGCTGTAGCTATGCATrGATmiR-133mut-下ATCAATGCATAGCTACAGCTGGTTGACAAATCCATTGMGAGGCGATTmiR-1雙鏈體UGG媚GUAAAGAAGUAUGUACAUACUUCUUUACAUUCCAUAmiR-l-mut雙鏈體■ACCAUAAAGAAGUAUGUACAUACUUO)UUAUGGUUMUAmiR-133雙鏈體UUGGUCCCCUUCAACCAGCUGUAGCUGGUUGAAGGGGACCAAAUmiR-133-mm雙鏈體UCAAG眼CUUCMCCAGOJGUAGCUGGUUGAAG醒CUUGAAUmiR-208雙鏈體AUAAGACGAGC織AAGCUUGUAAGCUUUUUGCUCGUCUUAUACGFP雙鏈體MCUUCAGGGUCAGCUUGCOJUGGCAAGCUGACCCUGAAGUUGG2'-0-甲基-miR-1MAUACAUACUUCUUUACAUUCCAUAGC2'力-甲基-miR-133AGCUACAGCUGGUUGAAGGGGACCAAAUCCA甲基-miR-208GACCMCAAGCUUUUUGCUCGUCUUAUACGUG甲基-GFPMGGCAAGCUGACCCUGAAGUUHDAC4-UTR國(guó)上CAGCACTGGTGATAGACTTGGHDAC4-UTR-下CTTMGAATAAGTTCAATAAGACSRF-tJTR-上AGATATGGGGGCTTGTGCCCSRF-l汀R-下CTGGGAGAAAGGGGGTAGAC肌形成蛋白FTGGAGCTGTATGAGACATCCC肌形成蛋白R(shí)TGGACAATGCTCAGGGGTCCCMyoDFGCAGGCTCTGCTGCGCGACCMyoDRTGCAGTCGATCTCTCMAGCACC骨骼a-肌動(dòng)蛋白FCAGAGCMGCGAGGWCC骨骼a-肌動(dòng)蛋白R(shí)GTCCCCAGAATCCAACACGMEF2DFCAAGCTGTTCCAGTATGCCAGMEF2DRMGGGATGATGTCACCAGGGHDAC4FGAGAGMTTCTGCTAGCAATGAGCTCCCMmiR-l和miR-133的克隆和表達(dá)用小鼠基因組DNA作為模板(PCR引物見(jiàn)上表3)從小鼠染色體2和18(ch2和chl8)經(jīng)PCR擴(kuò)增miR-l和miR-133前體的基因組片段。將PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)pcDNATM(+)3.1載體(Invitrogen)并通過(guò)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞(COS7，10T1/2或C2C12)中而確定miRNA的表達(dá)并用Northern印跡分析檢測(cè)。細(xì)胞培養(yǎng)、體外肌生成分化和螢光素酶報(bào)道基因測(cè)定如所述12培養(yǎng)C2C12成肌細(xì)胞并誘導(dǎo)肌生成。如所述12，26進(jìn)行瞬時(shí)螢光素酶報(bào)道基因測(cè)定。miRNA雙螺旋和針對(duì)miR-l，miR-133，miR-208和GFP的2'-0-甲基反義寡核苷酸購(gòu)自(序列見(jiàn)表3)。用LIPOFECTAMINETM(Invitrogen)轉(zhuǎn)染(200nM)或使用AmaxaBiosystems(Gaithersburg，Maryland,U.S.A.)NUCLEOFECTOR系統(tǒng)(5ng)的電穿孔而將它們導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。為構(gòu)建3'UTR-螢光素酶報(bào)道基因，切下pGL3-Contro1載體(Promega,Madison,Wisconsin,U.S.A.)的多克隆位點(diǎn)并置于螢光素酶基因的下游。小鼠/fZX4C4和5TF的3'UTR經(jīng)PCR擴(kuò)增并克隆進(jìn)修飾的pGL3-對(duì)照載體以產(chǎn)生構(gòu)建體SRF-3，UTR禾nHDAC4-3，UTR(PCR引物序列見(jiàn)表3)。如所述26進(jìn)行螢光素酶報(bào)道基因測(cè)定。Western印跡和免疫染色Western印跡根據(jù)先前所述27進(jìn)行。使用下述抗體抗肌漿蛋白；SRF;MEF2;HDAC4;和p-微管蛋白(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,California,U.S.A.);和磷酸組蛋白H3(UpstateBiotechnology,LakePlacid,NewYork,U.S.A.)。識(shí)別橫紋肌特異性MHC的MF20抗體得自DSHB(UniversityofIowa,IowaCity,Iowa,U.S.A,)。為進(jìn)行免疫染色，12孔板中的處理的C2C12細(xì)胞用4X甲醛在37。C固定5分鐘并更換到0.1。/。NP40/PBS溶液中，置于室溫15分鐘。第一抗體在下述濃度下在含有3XBSA的0.1%NP40-PBS中保溫2小時(shí)抗肌漿蛋白(1:20稀釋)，抗磷酸組蛋白H3(1:100稀釋),MF20(1:10稀釋)。加入在含有35^BSA的0.P/。NP40-PBS中的第二抗體熒光素抗小鼠/兔(1:100稀釋；VectorLaboratories,Burlingame,California,U.S.A.)，置于37。Cl小時(shí)。加入DAPI，在室溫保持5分鐘。用PBS洗若干次后，將細(xì)胞進(jìn)行熒光顯微鏡觀察。挑取覆蓋完整孔的10個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)每孔的綠色熒光陽(yáng)性細(xì)胞和用DAPI染色的總細(xì)胞。RT-PCR分析基本上如所述27進(jìn)行RT-PCR。用.TotalRNAwereextractedfromC2C12cellsusingTRIZOL試齊U(Invitrogen)從C2C12細(xì)胞提取總RNA，并用隨機(jī)六聚體和MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)將2.0等份逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。對(duì)于每種情況，使用2.5%cDNA庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增并且PCR進(jìn)行24—28個(gè)循環(huán)。PCR引物的序列可以見(jiàn)表3。胚胎注射和轉(zhuǎn)基因使用標(biāo)準(zhǔn)方法獲得和培養(yǎng)Ze"o;w/"ei^胚胎。DNA構(gòu)建體用Kpnl線性化并Kroll&Amaya28描述的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎。在LeicaMZFLIII顯微鏡下分析轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。制備和用miRNA注射Xe"o/7^基本上如先前所述"進(jìn)行。然而，RNA在注射前未被加帽。如所述3()進(jìn)行whole-mount免疫組織學(xué)分析。實(shí)施例8miR-208是心臟特異性miRNA，其在人類、小鼠和大鼠之間是保守的(圖14)。Northern印跡分析揭示miR-208表達(dá)是發(fā)育調(diào)節(jié)的(圖15)。Northern印跡從分階段的小鼠組織中制備并用與miR-208互補(bǔ)的放射標(biāo)記的探針探査。相對(duì)于E13.5,E16.5和新生兒時(shí)期的心臟，miR-208水平在成年小鼠心臟中顯著更高。m/i-20S由心肌a-巡^^歪A置鏈(a-M//(^基因的內(nèi)含子容納(圖14)。兩種心臟肌球蛋白重鏈異構(gòu)體之一a-A/7/C在小鼠發(fā)育過(guò)程中弱表達(dá)，但是后來(lái)變成成年小鼠心臟中的主要異構(gòu)體。miR-208和a-MHC均是心臟特異性的并且從相反鏈轉(zhuǎn)錄，這提示miR-208是由a-A/i/C內(nèi)含子加工而來(lái)并且與a-Mi/C轉(zhuǎn)錄平行表達(dá)。實(shí)施例9為了研究miR-208在心肌細(xì)胞中的體外功能，我們選擇使用新生大鼠心肌細(xì)胞因?yàn)槠涫怯糜谘芯啃呐K細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和電生理學(xué)特征的公認(rèn)的體外模型。新生心肌細(xì)胞不會(huì)喪失其在出生后的復(fù)制能力；大部分經(jīng)歷有絲分裂并在體外和體內(nèi)增殖，其中心臟基因表達(dá)也被激活。很可能miR-208促進(jìn)心肌細(xì)胞分化，因?yàn)橄鄬?duì)于早期發(fā)育其在成年心臟中高表達(dá)。為了確定心臟中miR-208功能，這一模型系統(tǒng)被用于研究miR-208表達(dá)和抑制對(duì)心臟生成程序的作用。體外模型系統(tǒng)培養(yǎng)的心肌細(xì)胞是心臟研究中最廣泛使用的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭弧男〉牟溉閯?dòng)物制備心肌細(xì)胞相對(duì)于完整動(dòng)物研究是經(jīng)濟(jì)的、可靠的并且能進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)。由于經(jīng)濟(jì)和技術(shù)原因，心肌細(xì)胞最通常從新生大鼠中分離。我們經(jīng)小的改動(dòng)而基本上如先前所述86分離了大鼠心肌細(xì)胞。功能性成熟miRNA可以使用RNAPolII啟動(dòng)子序列介導(dǎo)miRNA前體序列加上150個(gè)側(cè)翼核苷酸的轉(zhuǎn)錄而異位表達(dá)。所產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄物由miRNA加工機(jī)制識(shí)別并變成能介導(dǎo)翻譯阻抑的完全功能的miRNA。我們經(jīng)PCR從小鼠基因組DNA擴(kuò)增了miR-208前體序列和側(cè)翼區(qū)并將這一片段插入到腺病毒載體中產(chǎn)生表達(dá)miR-208的重組腺病毒(Ad-208)。Northern印跡分析表明在用增加濃度的Ad-208感染的分離的心肌細(xì)胞中w/r-2朋表達(dá)劑量依賴性增加(圖16)。這一工具可以被用于研究miR-208過(guò)表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞表型的體外作用。異位miR-208表達(dá)的分析使用細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定來(lái)確定miR-208表達(dá)的改變是否影響增殖。以低密度鋪板心肌細(xì)胞并用Ad-208感染。盡管腺病毒已成功地廣泛用于心肌細(xì)胞研究中，但是具有Ad-GFP的細(xì)胞也可以以與Ad-208相同的感染復(fù)數(shù)(MOI)被感染以控制由腺病毒感染導(dǎo)致的間接作用。因?yàn)閮煞N病毒均表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)，因此感染效率也通過(guò)外熒光顯微鏡術(shù)(epifluorescencemicroscopy)而控制。在感染之前和在感染后24、48、72和96小時(shí)在亮視野照明下計(jì)數(shù)細(xì)胞。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩種條件下的10個(gè)視野的細(xì)胞被計(jì)數(shù)。對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。可以使用不成對(duì)Studentt檢驗(yàn)確定每個(gè)特定時(shí)間點(diǎn)每個(gè)視野的所計(jì)數(shù)的平均細(xì)胞數(shù)在Ad-208和Ad-GFP感染之間顯著不同的概率，而成對(duì)StudenU檢驗(yàn)可以確定每種感染所計(jì)數(shù)的平均細(xì)胞數(shù)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間顯著不同的概率。如果任意兩個(gè)平均數(shù)顯著不同的概率大于和等于95%，則那些不同被認(rèn)為是顯著的。細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定由使用磷酸組蛋白H3抗體而確定有絲分裂指數(shù)和經(jīng)BrdU摻入確定經(jīng)歷DNA合成的細(xì)胞百分比的研究而補(bǔ)充。固定的細(xì)胞被TUNEL染色以排除miR-208過(guò)表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞死亡的可能性。Ad-208感染對(duì)心肌細(xì)胞增殖的潛在結(jié)果是細(xì)胞數(shù)降低、增加或無(wú)變化。不希望受理論限制，很可能miR-208表達(dá)相對(duì)于對(duì)照減慢了心肌細(xì)胞增殖，因?yàn)閙iR-208在分化的成年心肌細(xì)胞中高表達(dá)。已經(jīng)表明一系列心臟轉(zhuǎn)錄因子，包括Nkx2.5，MEF2C,GATA4,myocardin和TBX5在早期分化中的心肌細(xì)胞中表達(dá)，使得它們成為心臟分化的早期遺傳標(biāo)記。心肌特異性收縮蛋白如a-MHC，P-MHC，a-CA,和MLV2V是心肌細(xì)胞的終末分化標(biāo)記。這些心臟基因中的一些在發(fā)育過(guò)程中被差異調(diào)節(jié)。例如，卩-^ff/C在胚胎心臟中高表達(dá)，但是在新生后變得下調(diào)，而a-7kff/C具有相反的表達(dá)模式。為了確定miR-208是否具有調(diào)節(jié)心臟基因表達(dá)的作用，檢査了異位miR-208表達(dá)對(duì)新生大鼠心肌細(xì)胞中的心臟標(biāo)記基因表達(dá)的作用。不希望受理論限制，預(yù)期miR-208表達(dá)會(huì)降低胎兒基因表達(dá)和/或促進(jìn)成年心臟基因的表達(dá)。使用半定量逆轉(zhuǎn)錄酶-PCR(RT-PCR)方法，分析了各種心臟標(biāo)記基因在Ad-208vs.Ad-GFP感染的新生大鼠心肌細(xì)胞中的相對(duì)mRNA轉(zhuǎn)錄物水平。從分離自感染的心肌細(xì)胞的RNA經(jīng)常規(guī)技術(shù)制備cDNA文庫(kù)。在幾乎所有組織中高表達(dá)的GAPDH被擴(kuò)增并被用于歸一化cDNA水平。所有PCR引物系列設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增跨越一或多個(gè)內(nèi)含子的產(chǎn)物，如果存在DNA污染其會(huì)產(chǎn)生更大的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。另夕卜，使用市售抗體經(jīng)Western印跡分析檢查各種心臟標(biāo)記的蛋白質(zhì)表達(dá)水平以確定蛋白質(zhì)表達(dá)中檢測(cè)到的任何變化是否與mRNA轉(zhuǎn)錄物水平中的變化一致。除了研究miR-208對(duì)心臟基因表達(dá)的作用之外，還確定了對(duì)各種心臟蛋白質(zhì)(包括轉(zhuǎn)錄因子和結(jié)構(gòu)成分)的定位的任何作用。對(duì)Ad-208感染的心肌細(xì)胞的觀察提示這些細(xì)胞顯示與Ad-GFP感染的心肌細(xì)胞不同的形態(tài)學(xué)(圖16b)。Ad-208感染的心肌細(xì)胞相對(duì)于其Ad-GFP感染的對(duì)應(yīng)物似乎更"圓(rounded)"。將Ad-208和Ad-GFP感染的心肌細(xì)胞固定在蓋玻片上，用核實(shí)的第一抗體和第二抗體探查，進(jìn)行核染色，并通過(guò)顯微鏡分析所述玻片。失活miR-208與miR-208過(guò)表達(dá)研究并行，使用與miR-208反義的2，-0-甲基寡核苷酸研究了miR-208抑制的作用。2，-0-甲基寡核苷酸是序列特異性的且是以化學(xué)計(jì)量方式不可逆的miRNA功能抑制劑。這個(gè)miRNA抑制系統(tǒng)適合心肌細(xì)胞。將反義miR-2082'-0-甲基寡核苷酸或者作為對(duì)照的隨機(jī)2'-0-甲基寡核苷酸通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)試劑或者通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)染進(jìn)心肌細(xì)胞中。具有直接附著于螢光素酶基因3'末端的反義miR-208序列的報(bào)道基因構(gòu)建體(luc-miR-208-感應(yīng)器)用作對(duì)照，并檢測(cè)所述系統(tǒng)阻斷miR-208功能的效力。如miR-208過(guò)表達(dá)研究所述，對(duì)mRNA和蛋白質(zhì)水平以及蛋白質(zhì)定位進(jìn)行研究。實(shí)施例10miR-208在胚胎心臟中微弱表達(dá)，且其表達(dá)在成體心臟中顯著增加。這個(gè)實(shí)施例分析了miR-208在發(fā)育中的心臟中還是在成體心臟中的基因調(diào)節(jié)功能更重要。在發(fā)育期間，有人主張miR-208可能不重要，因?yàn)槠湓谂咛ブ形⑷醣磉_(dá)。與該主張相反，適量的miR-208對(duì)于調(diào)節(jié)發(fā)育期間的某些遺傳途徑是關(guān)鍵的。另外，在發(fā)育期間比在成體階段微弱表達(dá)的宿主基因a-ikff/C敲除的小鼠，遭受胚胎致死性，但是還未知miR-208的表達(dá)在這些動(dòng)物中是否受影響87。在成體心臟中檢測(cè)到的miR-208高水平表達(dá)可表示其在晚期發(fā)育中的最重要功能。為了對(duì)這些觀點(diǎn)加以分類，開(kāi)發(fā)了兩個(gè)小鼠模型以研究miR-208功能mz7-20S敲除小鼠和條件化過(guò)表達(dá)miR-208的轉(zhuǎn)基因小鼠。miR-208敲除小鼠設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)并產(chǎn)生對(duì)于miR-208無(wú)功能的小鼠，不影響其宿主基因pi-Mi/C的表達(dá)。產(chǎn)生胚胎干細(xì)胞衍生的mW-20S敲除小鼠是一種三階段方法產(chǎn)生靶載體；通過(guò)同源重組向胚胎干細(xì)胞中導(dǎo)入DNA序列；產(chǎn)生遺傳修飾的衍生自胚胎干細(xì)胞的小鼠?；谄浞N子區(qū)內(nèi)的序列同源性，將相關(guān)miRNA分屬不同家族。這些家族也許過(guò)剩地調(diào)節(jié)相同基因的表達(dá)，潛在地使得對(duì)其在體內(nèi)的功能進(jìn)行的遺傳分析復(fù)雜化。miR-208的種子區(qū)在系統(tǒng)樹(shù)中與其它已知的miRNA不聚類，使得miR-208是一種合適的miRNA敲除候選物。使用稱作重組工程(recombineering)策略構(gòu)建miR-208耙向構(gòu)建體，這種策略利用線性DNA片段和環(huán)狀質(zhì)粒之間的同源重組88，89。所述環(huán)狀質(zhì)?？珊衜iR-208位于其中的gi-MHC基因的6-7kb片段。所述線性DNA片段含有兩個(gè)同源臂，用來(lái)用floxed選擇盒置換22ntmiR-208序列。將用所述環(huán)狀質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌用所述線性DNA片段電穿孔，隨后由所述線性片段編碼的抗性選擇重組集落。所得構(gòu)建體用于通過(guò)同源重組耙向ES細(xì)胞。一旦使用基于PCR的篩選或者Southern印跡鑒別了雜合ES細(xì)胞，通過(guò)胚泡注射將其用于產(chǎn)生嵌合體。目前揭示的敲除設(shè)計(jì)僅留下pi-MHC的內(nèi)含子內(nèi)的外源DNA的很少的足跡，并幫助確保g-M7/C轉(zhuǎn)錄或者p-MHCmRNA剪接模式保持不受影響。傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因小鼠設(shè)計(jì)傳統(tǒng)的基因策略如圖17所示。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因方法是由兩個(gè)轉(zhuǎn)基因組成的二元系統(tǒng)。一個(gè)轉(zhuǎn)基因編碼miR-208(/e^朋)，另一個(gè)轉(zhuǎn)基因編碼反式激活物(^i)，其通過(guò)結(jié)合其啟動(dòng)子內(nèi)的調(diào)節(jié)序列而激活miR-208轉(zhuǎn)基因。當(dāng)存在強(qiáng)力霉素(DOX)時(shí)，ZZ4結(jié)合被抑制(即tet-off)，因此可以通過(guò)DOX處理調(diào)節(jié)miR-208轉(zhuǎn)基因。確立miR-208轉(zhuǎn)基因純合的小鼠群落。將小鼠與具有fZ4轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠交配，產(chǎn)生雙重轉(zhuǎn)基因小鼠以進(jìn)行研究。采用Mendelian遺傳學(xué)，4個(gè)后代中有1個(gè)是雙重轉(zhuǎn)基因的，且表達(dá)miR-208，在此被表達(dá)。利用g-M/ZC啟動(dòng)子指導(dǎo)fM表達(dá)。g-M/7C啟動(dòng)子已經(jīng)充分鑒定，足以在早期發(fā)育中正確指導(dǎo)組織特異性表達(dá)9°。使用啟動(dòng)子在雙重轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中表達(dá)^4將增加與內(nèi)源miR-208相同組織中的miR-208劑量，因?yàn)閮?nèi)源miR-208通常源自g-Mi/C基因內(nèi)的內(nèi)含子。使用小鼠g-M/fC啟動(dòng)子指導(dǎo)fL4表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠品系巳經(jīng)存在并成功應(yīng)用91，92。&^^轉(zhuǎn)基因小鼠品系使得我們可以研究miR-208表達(dá)在發(fā)育的胚胎或成體小鼠心臟中的獨(dú)立劑量作用。典型地，常規(guī)的轉(zhuǎn)基因建立者中的早期胚胎致死性會(huì)嚴(yán)重限制可用于研究的發(fā)育阻抑胚胎數(shù)并阻礙表型分析。使用傳統(tǒng)的策略，我們能延緩雙重轉(zhuǎn)基因小鼠中的miR-208轉(zhuǎn)基因表達(dá)，如果早期miR-208過(guò)表達(dá)證實(shí)是致死性的。分析根據(jù)表現(xiàn)出的表型進(jìn)行特異性分析。通常地，可以使用組織學(xué)和生物化學(xué)方法鑒定發(fā)育中的胚胎和/或成體中潛在的表型。檢査心臟的總異常性并制成切片進(jìn)行組織學(xué)分析，以鑒別潛在的更微細(xì)的發(fā)育缺陷。缺陷的可能性是無(wú)數(shù)的，且可以包括從缺陷的膈形成直至增厚的心房的任何事件。同樣可能的是表型可以是收縮性缺陷，可以通過(guò)電生理學(xué)研究鑒定。實(shí)施例11對(duì)miR-208的直接分子靶的鑒別促進(jìn)了對(duì)于其生物學(xué)功能的了解。靶預(yù)測(cè)用于補(bǔ)充在體外和體內(nèi)小鼠模型進(jìn)行的miR-208的功能研究的觀測(cè)結(jié)果。不希望受到理論的限制，推測(cè)Thrapl表達(dá)由miR-208調(diào)節(jié)。Thrapl的3，UTR含有兩個(gè)預(yù)測(cè)的miR-208結(jié)合位點(diǎn)(圖18)。這兩個(gè)靶位位于Thrapl終止密碼子下游80bp，并且彼此間隔僅50bp。這兩個(gè)靶均與miR-208的種子區(qū)完全互補(bǔ)。772m;^基因編碼遍在表達(dá)的TRAP(甲狀腺激素受體蛋白)復(fù)合物的一個(gè)240kd亞基93。TRAP是一種多亞基蛋白質(zhì)復(fù)合物，是核受體的共激活物。TRAP最初被鑒定為甲狀腺激素核受體94。Thmpl未被鑒定，但是在其它TRAP亞基中的缺陷已經(jīng)示出影響核受體信號(hào)化。小鼠中TRAP220基因的消除使得心臟和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育受損，而TRAP230和TRAP240的果蠅(DrawpMfl)同系物是正確的目艮-觸角盤(eye-antennaldisc)發(fā)育所必需95'96。與Thmpl高度相似的基因(稱作Thrap2)中的突變，在先天性心臟缺陷-大動(dòng)脈換位(TranspositionoftheGreatArteries)患者中發(fā)現(xiàn)97。因此，TRAP家族成員對(duì)于正確發(fā)育是重要的。特別感興趣的是Thrapl是miR-208的靶位，因?yàn)橐阎谞钕偌に貙?duì)于心肌收縮性發(fā)揮重要作用。甲狀腺激素與心肌肌球蛋白異構(gòu)體變換相關(guān)聯(lián)。在心肌細(xì)胞中，甲狀腺激素導(dǎo)致pt-MHCmRNA快速累積，同時(shí)抑制P-MHC表達(dá)98，99。一些正向作用甲狀腺應(yīng)答因子(TRE)位于g-M/fC啟動(dòng)子內(nèi)，已經(jīng)鑒別了卩-MHC啟動(dòng)子內(nèi)的負(fù)向作用half-TRE1GQ'1Q1。a-MFC和卩-7l^/C基因串聯(lián)排列在染色體14上，其編碼兩種心肌肌球蛋白重鏈異構(gòu)體，以不同速度將ATP轉(zhuǎn)變?yōu)闄C(jī)械功，且其蛋白質(zhì)表達(dá)比率影響心肌肌節(jié)的收縮性；gi-MHC是"快速的"，而P-MHC是"慢速的"。其表達(dá)受發(fā)育調(diào)節(jié)。在小鼠和大鼠中，(3-MHC在后期胎兒生命中占優(yōu)勢(shì)，但是在出生后不久gt-MHC成為主要的成體心肌異構(gòu)體。這種轉(zhuǎn)變很可能由出生后不久發(fā)生的循環(huán)中的甲狀腺激素高漲導(dǎo)致98。在較大的哺乳動(dòng)物如兔和人中，(3-MHC是主要的成體心肌異構(gòu)體。然而，g-il///C和卩-iV/7/C基因的啟動(dòng)子在小鼠與人之間是高度保守的，提示它們被相似調(diào)節(jié)。鑒于miR-208源自a-ikff/C內(nèi)含子，不受理論的限制，很可能miR-208作為負(fù)反饋回路中甲狀腺激素信號(hào)化的組織特異性抑制劑，通過(guò)靶向TRAP復(fù)合物的一種成分而調(diào)節(jié)心肌肌球蛋白重鏈異構(gòu)體的比率(圖19)。最初的篩選策略是查詢miR-208的過(guò)表達(dá)是否負(fù)調(diào)節(jié)在3'UTR中具有推定靶位點(diǎn)的報(bào)道基因的表達(dá)。我們將Thmpl3'UTR直接插入到組成型表達(dá)的螢光素酶報(bào)道基因的編碼序列后面。結(jié)果提示miR-208靶向ThmplUTR(圖18)。為了證實(shí)這種觀測(cè)結(jié)果，我們單獨(dú)及組合突變了ThmplUTR內(nèi)的兩個(gè)推定靶位點(diǎn)的種子區(qū)?？梢詫?duì)突變的多核苷酸進(jìn)行檢測(cè)，以確定其是否可以減輕miR-208介導(dǎo)的抑制。先前的研究已經(jīng)證實(shí)甲狀腺激素經(jīng)轉(zhuǎn)錄激活心肌細(xì)胞中9t-7V///C鏈的表達(dá)并抑制表達(dá)98'99，1Q2。用Ad-208感染心肌細(xì)胞，通過(guò)監(jiān)測(cè)？t-MHC和p-MHC的轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)水平以確定miR-208表達(dá)是否抑制甲狀腺激素信號(hào)化。miR-208對(duì)于pt-M/fC表達(dá)的抑制間接支持了我們的假說(shuō)，即miR-208靶向甲狀腺激素信號(hào)化途徑的一種成分。為了進(jìn)一步證實(shí)預(yù)測(cè)的靶位，可以確定miR-208表達(dá)是否降低w/i-2M敲除小鼠和wzT-20S轉(zhuǎn)基因小鼠模型心臟中mRNA或蛋白質(zhì)水平。應(yīng)用靶向蛋白質(zhì)的特異性抗體。人Thmpl可商購(gòu)。如果在小鼠研究中無(wú)效，則開(kāi)發(fā)小鼠Thmpl-特異性抗體。miR-208的其它候選靶位除了Thrapl之外，我們將四個(gè)其它感興趣的miR-208推定靶的3'UTR直接克隆螢光素酶基因，以進(jìn)行報(bào)道基因研究。所述3'UTR來(lái)自5P3(5^5反式/^^存,厲f3)、五Z44(眼缺失同系物(eywa&e"f/zowofogJ*4)、GS7Vi:242(酪蛋白激酶么a/p/7apo/y/ep^fe)和SP3蛋白質(zhì)的表達(dá)模式與miR-208表達(dá)模式相反；SP3是與含有GC盒的多種啟動(dòng)子相互作用的轉(zhuǎn)錄因子1Q3，1Q4，1Q5。SP3蛋白質(zhì)易于在小鼠胚胎心臟中檢測(cè)到，但是在成年小鼠心臟中幾乎不能檢測(cè)到。SP3與miR-208的相反表達(dá)模式證實(shí)miR-208調(diào)節(jié)SP3翻譯。EYA4是miR-208的一種感興趣的潛在靶，確定其與人體心臟病理學(xué)相關(guān)聯(lián)。已經(jīng)鑒別了人EYA4中導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病及相關(guān)的心功能衰竭的突變1()6'1()7。EYA4是一種轉(zhuǎn)錄共激活物，其與^^-oc"fc家族成員(5^7-&:^)和Dm/z轉(zhuǎn)錄因子相互作用，導(dǎo)致基因激活1()8，1()9。人EYA4中突變的鑒定通過(guò)在斑馬中進(jìn)行的研究得到支持，弱化的EYA4水平產(chǎn)生心功能衰竭的形態(tài)學(xué)和血液動(dòng)力學(xué)特征106。目前，未鑒別出EYA4潛在的下游心肌細(xì)胞基因。CSNK2A2是一種廣泛表達(dá)的蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與DNA復(fù)制、調(diào)節(jié)基礎(chǔ)的和可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄、翻譯及控制代謝110，111。我們對(duì)于CSKN2A2在調(diào)節(jié)多種遺傳途徑中的潛力感興趣。與EYA4相似，根據(jù)確定的與心血管功能和病理學(xué)的相關(guān)性，TTN也是令人感興趣的miR-208候選耙。TTN是一種在心肌和骨骼肌組織中均表達(dá)的大肌節(jié)蛋白質(zhì)，且對(duì)于肌節(jié)裝配和力傳遞(forcetransmission)很重要112。TTN中的突變與肥厚型和擴(kuò)張型心肌病相關(guān)聯(lián)。推測(cè)TTN為心肌和骨骼肌功能所必需，我們懷疑miR-208強(qiáng)調(diào)節(jié)TTN表達(dá)，但是可能的是一種肌節(jié)基因(即g-MHC)，可以調(diào)整另一基因(即TTN)的表達(dá)，以調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的收縮性質(zhì)。通過(guò)報(bào)道基因測(cè)定檢測(cè)預(yù)測(cè)的靶基因的3'UTR，以確定其是否授予miR-208-介導(dǎo)的抑制。候選基因通過(guò)突變預(yù)測(cè)的靶位點(diǎn)并檢測(cè)miR-208抑制是否被消除而進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。在對(duì)候選耙位點(diǎn)進(jìn)行初始的報(bào)道基因篩選之后，使用心肌細(xì)胞基于在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平候選基因表達(dá)分析miR-208過(guò)表達(dá)在體外作用。在體內(nèi)使用我們的mW-2M敲除及可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型在體內(nèi)研究核實(shí)的靶的生物學(xué)相關(guān)性。潛在的miR-208靶在體外和體內(nèi)的分析可以證實(shí)靶預(yù)測(cè)并證實(shí)其生物學(xué)相關(guān)性，以了解miR-208在心臟中的調(diào)節(jié)的遺傳途徑。實(shí)施例12骨骼肌在一生中反復(fù)損傷和修復(fù)。肌組織的再生維持老化期間的運(yùn)動(dòng)功能并延緩神經(jīng)肌肉疾病如迪謝內(nèi)(Duchenne)肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的臨床癥狀的出現(xiàn)。這種組織修復(fù)能力是由位于成熟肌纖維的基底層與肌膜之間的稱作衛(wèi)星細(xì)胞的干細(xì)胞樣細(xì)胞的亞類賦予的。在損傷時(shí)，衛(wèi)星細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期、增殖，然后退出細(xì)胞周期以更新靜態(tài)衛(wèi)星細(xì)胞或者分化為成熟肌纖維。細(xì)胞增殖和分化程序均是所必需的。本發(fā)明提供了證實(shí)miRNA應(yīng)答肌細(xì)胞增殖和分化的數(shù)據(jù)。方法:根據(jù)Yanetal卩"所述，將心臟毒素注射進(jìn)6周齡的雄性C57BL/6小鼠脛骨前肌(TA)中。在注射3天后收獲所述肌組織。未注射的TA肌組織用作對(duì)照。從TA肌組織中提取總RNA，并將其5pg用于進(jìn)行microRNA微陣列分析。結(jié)果圖20A和20B示出來(lái)自注射(損傷組)或未注射(對(duì)照組)心臟毒素的脛骨前肌(TA)的miRNA陣列表達(dá)數(shù)據(jù)。歸一化log(以2為底)數(shù)據(jù)根據(jù)基因而分級(jí)聚類，并繪制為熱圖。信號(hào)范圍是"4倍至+4倍。淡陰影表示相對(duì)于中值的高水平表達(dá)，濃陰影表示相對(duì)于中值的低水平表達(dá)。圖20A示出在損傷的肌組織中負(fù)調(diào)節(jié)的miRNA，圖20B示出在損傷的肌組織中上調(diào)的miRNA。實(shí)施例13骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞是位于成熟的多核肌纖維的質(zhì)膜與周圍的基底層之間的一組小單核細(xì)胞。長(zhǎng)期以來(lái)認(rèn)為衛(wèi)星細(xì)胞是成熟骨骼肌的前體細(xì)胞。最近的研究支持了這樣的觀點(diǎn)，即衛(wèi)星細(xì)胞是異源的且具有干細(xì)胞樣潛力。將這些細(xì)胞維持在靜態(tài)，但是一旦激活，其將大量增殖形成成肌細(xì)胞群，進(jìn)行分化和再生或修復(fù)肌組織。目前正在開(kāi)始揭示在正常條件下將衛(wèi)星細(xì)胞維持在其失活靜態(tài)以及其如何應(yīng)答肌損傷而變成活性狀態(tài)以促進(jìn)肌細(xì)胞再生的遺傳途徑和分子機(jī)制。Pax3和Pax7是成對(duì)的盒(box)/同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族成員，已經(jīng)表明它們?cè)诮閷?dǎo)衛(wèi)星細(xì)胞相關(guān)的骨骼肌再生過(guò)程中起重要且不同的作用。然而，還不太清楚在衛(wèi)星細(xì)胞維持和激活期間怎樣調(diào)節(jié)Pax蛋白的表達(dá)。令人感興趣地，Pax3和Pax7的表達(dá)在分化中的成肌細(xì)胞中被負(fù)調(diào)節(jié)。更重要地，Pax3或Pax7在C2C12成肌細(xì)胞中的異位過(guò)表達(dá)阻斷其分化。這些觀測(cè)結(jié)果提示衛(wèi)星細(xì)胞的靜止和自我更新?tīng)顟B(tài)以及成肌細(xì)胞增殖和分化是在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的嚴(yán)密控制下。另外，腦衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)在骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中表達(dá)，并抑制肌原性分化。先前發(fā)現(xiàn)且現(xiàn)在在本發(fā)明中揭示了Pax7和BDNF均是推定的miR-1/206調(diào)節(jié)性靶，提示miR-1/206在骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞調(diào)節(jié)中起重要作用。在衛(wèi)星細(xì)胞中建立miRNA過(guò)表達(dá)和檢測(cè)系統(tǒng)為了在衛(wèi)星細(xì)胞中異位有效過(guò)表達(dá)miRNA，調(diào)試一種基于逆轉(zhuǎn)錄病毒的過(guò)表達(dá)系統(tǒng)。miR-l和miR-206的側(cè)翼基因組序列(大約300-400bp)兩側(cè)具有鼠千細(xì)胞病毒(MSCV)-衍生的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體內(nèi)剪接供體(SD)和剪接受體(SA)，其中綠色熒光蛋白(GFP)編碼序列位于miRNA-SDSA序列的下游。以這種方式，miR-1/206禾BGFP將同時(shí)表達(dá)，且GFP的表達(dá)作為miR-1/206表達(dá)的極佳指征(圖23)。為了監(jiān)測(cè)miRNA在衛(wèi)星細(xì)胞中的表達(dá)和抑制作用，我們制成了"miRNA感應(yīng)器"，其中dsRed基因的表達(dá)在組成型活性CMV啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下。將miR-1/206的互補(bǔ)序列與dsRed報(bào)道基因的3，末端連接并插入MSCV-衍生的逆轉(zhuǎn)錄載體中，由此功能性miRNA將抑制dsRed蛋白的翻譯(圖22)。使用這個(gè)系統(tǒng)，我們可以精確地檢測(cè)miRNA在衛(wèi)星細(xì)胞中的表達(dá)和抑制作用，這樣為我們提供了進(jìn)一步研究miRNA在骨骼肌中的功能的有力工具。Pax7和BDNF是衛(wèi)星細(xì)胞中miR-1/206的調(diào)節(jié)耙我們發(fā)現(xiàn)Pax7和BDNF基因在其3，UTR中含有高度保守的miR-1/206耙位點(diǎn)(圖24、25、26)。我們將這些3，UTR序列克隆進(jìn)螢光素酶報(bào)道基因中，并檢測(cè)其是否被miRNA抑制。如圖24所示，miR-l和miR-206均強(qiáng)力抑制這些報(bào)道基因。當(dāng)保守的miRNA結(jié)合序列被突變時(shí)，miRNA介導(dǎo)的抑制被消除，表示所述抑制的特異性。這些資料提示miR-1/206通過(guò)抑制重要的靶基因而可以控制肌細(xì)胞和/或其前體細(xì)胞的增殖和分化。從單個(gè)骨骼肌肌纖維中分離衛(wèi)星細(xì)胞衛(wèi)星細(xì)胞是應(yīng)答出生后生長(zhǎng)和再生的成熟骨骼肌祖細(xì)胞。不希望受理論的限制，我們推測(cè)miRNA也是衛(wèi)星細(xì)胞的調(diào)節(jié)物。為了檢測(cè)這個(gè)假說(shuō)，我們開(kāi)始從新生的或成年小鼠的后足或膈的骨骼肌中分離衛(wèi)星細(xì)胞。我們能從單肌纖維中分離衛(wèi)星細(xì)胞，產(chǎn)生純的衛(wèi)星細(xì)胞群并提供重復(fù)的結(jié)果。當(dāng)培養(yǎng)基中包含bFGF時(shí)，這些衛(wèi)星細(xì)胞可以維持在未分化狀態(tài)，可以檢測(cè)Pax7及其它衛(wèi)星細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)。然而，當(dāng)除去生長(zhǎng)因子bFGF時(shí)，它們可被誘導(dǎo)分化為成肌細(xì)胞和肌管，在體外精確地模擬骨骼肌分化過(guò)程(圖28)。miR-1/206抑制衛(wèi)星細(xì)胞的增殖為了解釋miR-1/206在骨骼肌袓細(xì)胞中的功能，將分離自成年小鼠的單肌纖維的衛(wèi)星細(xì)胞鋪板于24孔組織培養(yǎng)板上，使用基于SDSA載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒將miR-1/206導(dǎo)入所述細(xì)胞中。以如下幾種方式監(jiān)測(cè)異位表達(dá)的miRNA的表達(dá)和活性應(yīng)用Northern印跡分析檢測(cè)和定量測(cè)量miR-1的表達(dá)。也使用其中的互補(bǔ)序列在dsRed報(bào)道基因的3'末端被克隆的"感應(yīng)器"報(bào)道基因監(jiān)測(cè)miR-1/206的活性。為了進(jìn)行增殖測(cè)定，將衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)物在收獲之前1小時(shí)用BrdU標(biāo)記。然后將細(xì)胞固定并通過(guò)計(jì)數(shù)BrdU陽(yáng)性染色的細(xì)胞測(cè)量增殖的細(xì)胞。如圖27所示，衛(wèi)星細(xì)胞中miR-1/206的過(guò)表達(dá)抑制其增殖。miR-1/206增強(qiáng)衛(wèi)星細(xì)胞的分化為了進(jìn)行分化動(dòng)力學(xué)分析，將單肌纖維的衛(wèi)星細(xì)胞鋪板于膠原包被的24孔平板中的DMEM加上20%FBS和10ng/ml的bFGF中。細(xì)胞鋪板密度為大約5X103細(xì)胞/cm2，并用miR-1/206逆轉(zhuǎn)錄病毒或?qū)φ盏哪孓D(zhuǎn)錄病毒感染。一旦從培養(yǎng)基中除去bFGF，則衛(wèi)星細(xì)胞自發(fā)退出細(xì)胞周期并分化。如圖28和29所示，miR-1/206的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)衛(wèi)星細(xì)胞的分化并促進(jìn)其分化動(dòng)力學(xué)?？傊景l(fā)明實(shí)施例中闡述的資料表明miR-1和miR-206在控制骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中起重要作用。本發(fā)明提供了衛(wèi)星細(xì)胞在骨骼肌再生和修復(fù)過(guò)程中的關(guān)鍵作用，不希望受理論的限制，這提示miR-1、miR-206和miR-133對(duì)于骨骼肌再生是重要的(圖30)。參考文獻(xiàn)下文列出的以及本說(shuō)明書中引用的所有參考文獻(xiàn)均以其全部?jī)?nèi)容并入本文作參考，提供了本發(fā)明應(yīng)用的技術(shù)和/或組合物的背景或教導(dǎo)方法學(xué)。1.Bartel，D.P,MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,andfunction,Ce〃116，281-97(2004).2.Ambros，V.ThefunctionsofanimalmicroRNAs.Atow431，350-5(2004).3.Lee，R.C.,Feinbaum,R丄.&Ambros，V.TheC.elegansheterochronicgenelin-4encodessmallRNAswithantisensecomplementaritytolin-14.CW/75，843-54(1993).4.Wightman，B.，Ha，I.&Ruvkun,G.Posttranscriptionalregulationoftheheterochronicgenelin-14bylin-4mediatestemporalpatternformationinC.elegans.CW/75，855-62(1993》5.Chen,C.Z.,Li，L.，Lodish，H.F.&Bartel，D.P.MicroRNAsmodulatehematopoieticlineagedifferentiation.303，83-6(2004).6.He，L.etal.AmicroRNApolycistronasapotentialhumanoncogene.Atowre435,828-33(2005).7.Giraldez，A丄etal.MicroRNAsregulatebrainmorphogenesisinzebrafish.5b/ewce308,833-8(2005).8.Zhao,Y,，Samal,E.&Srivastava，D.Serumresponsefactorregulatesamuscle-specificmicroRNAthattargetsHand2duringcardiogenesis.7VaZw436，214-20(2005》9.Thomson,J.M.，Parker,J.，Perou，C.M.&Hammond,S.M.AcustommicroarrayplatformforanalysisofmicroRNAgeneexpression.AtoM"to(is1,47-53(2004).10.Blau,H.M.etal.Plasticityofthedifferentiatedstate.Sdewce230，758-66(1985).11.Soulez，M.etal.GrowthanddifferentiationofC2myogeniccellsaredependentonserumresponsefactor.M/CW/16,6065-74(1996).12.Lu，J.，McKinsey,T,A.，Zhang，C丄.&Olson,E,N.RegulationofskeletalmyogenesisbyassociationoftheMEF2transcriptionfactorwithclassIIhistonedeacetylases.她/Ce//6，233-44(2000).13.Lee，R.C.&Ambros，V.AnextensiveclassofsmallRNAsinCaenorhabditiselegans.腸職294，862-4(2001).14.Lagos-Quintana，M.etal.Identificationoftissue-specificmicroRNAsfrommouse.Cwr編12，735-9(2002).15.Sempere，L.F.etal.ExpressionprofilingofmammalianmicroRNAsuncoversasubsetofbrain-expressedmicroRNAswithpossiblerolesinmurineandhumanneuronaldifferentiation.G師附e5,R13(2004).16.Wienholds，E.etal,MicroRNAexpressioninzebrafishembryonicdevelopmentSc^wce309，310-1(2005).17.Mansfield,J.H.etal.MicroRNA-responsive'sensor，transgenesuncoverHox-likeandotherdevelopmentallyregulatedpatternsofvertebratemicroRNAexpression.iVafGewe/36,1079-83(2004).18.Hutvagner,G"Simard，M丄，Mello，C.C.&Zamore，P.D.Sequence-specificinhibitionofsmallRNAfunction.尸ZoS2，E98(2004).19.Meister，G.，Landthaler,M.,Dorsett，Y.&Tuschl，T.Sequence-specificinhibitionofmicroRNA-andsiRNA-inducedRNAsilencing,10，544-50(2004).20.Lewis,B.P"Shih，I.H.，Jones-Rhoades,M.W.，Battel,D.P.&Burge,C.B.Predictionofma纖alia認(rèn)icroRNAtargets.Ce//115，787-98(2003).21.Kiriakidou,M.etal.Acombinedcomputational-experimentalapproachpredictshumanmicroRNAtargets.Dev18，1165-78(2004).22.Krek，A.etal.CombinatorialmicroRNAtargetpredictions.7Va/1Gewe/37，495-500(2005).23.McKinsey,T.A.，Zhang,C.L,,Lu，J.&Olson，E,N.Signal-dependentnuclearexportofahistonedeacetylaseregulatesmuscledifferentiation.TVaft/w408，106-11(2000).24.Wang，D.etal.RegulationofcardiacgrowthanddevelopmentbySRFanditscofactors.CoW，/wg//"A—;g畫Z編67，97-105(2002).25.Li，S.etal.Requirementforserumresponsefactorforskeletalmusclegrowthandmaturationrevealedbytissue-specificgenedeletioninmice.iVoc7Va//爿cadt/S^102,1082-7(2005).26.Wang，D.etal.Activationofcardiacgeneexpressionbymyocardin，atranscriptionalcofactorforserumresponsefactor.Ce//105，851-62(2001).27.Cao,D.etal.Modulationofsmoothmusclegeneexpressionbyassociationofhistoneacetyltransferasesanddeacetylaseswithmyocardin.Afo/Ce//5/o/25，364-76(2005).28.Kroll，K丄.&Amaya，E.TransgenicXenopusembryosfromspermnucleartransplantationsrevealFGFsignalingrequirementsduringgastrulation.Devefo戸M122,3173-83(1996).29.Conlon，F(xiàn)丄"Sedgwick，S.G"Weston，K.M.&Smith,J.C.InhibitionofXbratranscriptionactivationcausesdefectsinmesodermalpatterningandrevealsautoregulationofXbraindorsalmesoderm.Z)eve/o戸ew/122，2427-35(1996).30.Brown，D.D,etal.Tbx5andTbx20actsynergisticallytocontrolvertebrateheartmorphogenesis.Z)eve/o戶ew/132，553-63(2005》31.Freiere/d(1986)尸racAto"c^Sc/83:9373-9377.32.Turner^a/.(1987)CoW5^/"g/^frZ)^附p2waw/所o/LII:123-133.33.Smith&Waterman(1981)A/vJ;^/A/aA2:482-489.34.Needleman&Wunsch(1970)/M/編48:443-453.35.Pearson&Lipman(1988)尸racAto"carf&/85:2444-2448.36.Ausubela/.,eds(1989)CurrentProtocolsinMolecularBiology."Wiley,NewYork,NewYork,UnitedStatesofAmerica.37.Altschulw"/.(1990)/Afo/^o/215:403-410.38.Henikoff&Henikoff(1992)尸rocAtoMa^&!'C/S^89:10915-10919.39.Karlin&Altschul(1993)Ato"cac/&/C/S爿90:5873-5877.40.Sambrook&Russell(2001)MolecularCloning:ALaboratoryManual.3rded.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.41.AgrawalS(ed.)MethodsinMolecularBiology,volume20，HumanaPress,Totowa，NewJersey,UnitedStatesofAmerica.42.Tijssen(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology一HybridizationwithNucleicAcidProbes,Elsevier，NewYork,UnitedStatesofAmerica.43.Tibanyenda(1984)^^J5/oc/^w139:19-27.44.Ebel""/,(1992)31:12083-12086.45.Goeddel(1990)GeneExpressionTechnology.MethodsinEnzvmologv,Volume185，AcademicPress,SanDiego，California,UnitedStatesofAmerica.46.Silhavy(1984)ExperimentswithGeneFusions.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,UnitedStatesofAmerica.47.Glover&Hames(1995)DNACloning:APracticalApproach,2nded.IRLPressatOxfordUniversityPress,Oxford;NewYork.48.Adelmane/a/.(1983)2:183-193.49.Lee，R.C.，F(xiàn)einbaum,R.L.，andAmbros，V.(1993》TheC.elegansheterochronicgenelin畫4encodessmallRNAswithantisensecomplementaritytolin-14.Cell75，843-854.50.Wightman，B,,Ha，I.，andRuvkun，G.(1993).Posttranscriptionalregulationoftheheterochronicgenelin-14bylin-4mediatestemporalpatternformationinC.elegans.Cell75，855-862.51.Lee，Y"Kim，M"Han,J"Y醒，K.H.,Lee，S"Baek，S.H.，andKim，V.N.(2004).MicroRNAgenesaretranscribedbyRNApolymeraseII.EmboJZ,4051-4060.52.Bracht，J.，Hunter,S.,Eachus，R.，Weeks,P"andPasquinelli，A.E.(2004).Trans-splicingandpolyadenylationoflet-7microRNAprimarytranscripts.Rna70,1586-1594.53.Rodriguez,A,,Griffiths-Jones,S.，Ashurst,J.L.，andBradley,A.(2004).IdentificationofmammalianmicroRNAhostgenesandtranscriptionunits.GenomeRes"，1902-1910.54.Lee，Y,,Ahn，C.,Han，J.，Choi，H.,Kim，J"Yim,J,，Lee，J,，Provost,P.，Radmark,O.，Kim，S.,andKim,V.N.(2003).ThenuclearRNaseIIIDroshainitiatesmicroRNAprocessing.Nature415-419.55.Basyuk,E,,Suavet,F"Doglio,A.，Bordonne，R.,andBertrand，E.(2003).Humanlet-7stem-loopprecursorsharborfeaturesofRNaseIIIcleavageproducts.NucleicAcidsRes3/，6593-6597.56.Lund，E"Guttinger，S"Calado,A"Dahlberg,J.E"andKutay，U.(2004).NuclearexportofmicroRNAprecursors.Science3ft，95-98.57.Yi,R.，Qin,Y"Macara，I.G"andCullen,B.R-(2003).Exportin-5mediatesthenuclearexportofpre陽(yáng)microRNAsandshorthairpinRNAs,GenesDev77,3011-3016.58.Yi,R,,Doehle,B.P.，Qin，Y.，Macara,I.G,andCullen，B.R.(2005).Overexpressionofexportin5enhancesRNAinterferencemediatedbyshorthairpinRNAsandmicroRNAs.Rna//，220-226.59.Bohnsack，M.T.，Czaplinski，K.，andGorlich，D.(2004).Exportin5isaRanGTP-dependentdsRNA-bindingproteinthatmediatesnuclearexportofpre-miRNAs.Rna70，185-191.60.Gwizdek，C.，Ossareh-Nazari，B.，Brownawell，A.M.，Evers,S,，Macara，I.G"andDargemont,C.(2004).Minihelix-containingRNAsmediateexportin-5-dependentnuclearexportofthedouble-strandedRNA-bindingproteinILF3.JBiolChem279,884-891.61.Grishok，A.，Pasquinelli,A.E.,Conte，D.,Li，N.，Parrish，S,Ha，I.，Baillie，D.L.，F(xiàn)ire，A.，Ruvkun，G"andMello，C.C.(2001).GenesandmechanismsrelatedtoRNAinterferenceregulateexpressionofthesmalltemporalRNAsthatcontrolC.degansdevelopmentaltiming-Cell23-34.62.Hutvagner,G"McLachlan，J.，Pasquinelli，A.E.，Balint，E.,Tuschl,T.,andZamore，P.D.(2001).AcellularfunctionfortheRNA-interferenceenzymeDicerinthematurationofthelet-7smalltemporalRNA.Science293，834-838.63.Ketting,R.F.，F(xiàn)ischer,S.E.，Bernstein,E.,Sijen，T"Hannon，G,J.，andPlasterk,R.H.(2001).DicerfunctionsinRNAinterferenceandinsynthesisofsmallRNAinvolvedindevelopmentaltiminginC.elegans.GenesDev75，2654-2659.64.Schwarz,D.S.,Hutvagner,G，Du,T.，Xu,Z.，Aronin,N.,andZamore,P,D.(2003).AsymmetryintheassemblyoftheRNAienzymecomplex.Cell199-208.65.Khvorova,A.，Reynolds,A，，andJayasena，S.D,(2003).FunctionalsiRNAsandmiRNAsexhibitstrandbias.Cell7"，209-216.66.Pillai，R.S.,Artus，C.G，andFilipowicz,W,(2004).TetheringofhumangoproteinstomRNAmimicsthemiRNA-mediatedrepressionofproteinsynthesis.Rna70，1518-1525.67.Doench，丄G.，andSharp,RA.(2004).SpecificityofmicroRNAtargetselectionintranslationalrepression.GenesDev7S，504-511.68.Bartel，D.R(2004).MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,andfunction.Cell風(fēng)281-297.69.Bernstein,E.,Kim,S.Y.，Carmell,M.A.，Murchison,E.P,,Alcorn，H,，Li,M.Z.，Mills,A.A.,Elledge，S.J.，Anderson,K.V"andHarmon,G.J.(2003).Dicerisessentialformousedevelopment,NatGenet35，215-217.70.Harfe，B.D.,McManus，M.T"Mansfield,J.H.,Hornstein，E.，andTabin,C.J.(2005).TheRNaselllenzymeDicerisrequiredformorphogenesisbutnotpatterningofthevertebratelimb.ProcNatlAcadSciUSA.71.Giraldez，A.丄，Cinalli，R.M，Glasner，M,E.，Enright,A.J.，Thomson,J.M.，Baskerville，S,，Hammond,S.M.,Bartel，D.P"andSchier,A.F.(2005).MicroRNAsregulatebrahimorphogenesisinzebrafish.Science30S，833-838.72.Poy，M.N,Eliasson,L.,Krutzfeldt，J.，Kuwajima，S,，Ma,X.，Macdonald，P.E.，Pfeffer，S.，Tuschl，T,,Rajewsky,N.，Rorsman，P"andStoffel,M.(2004).Apancreaticislet-specificmicroRNAregulatesinsulinsecretion.Nature412，226-230.73.Esau，C.，Kang,X.，Peralta,E.，Hanson,E.，Marcusson，E.G，Ravichandran，L.V"Sun，Y.，Koo，S.,Perera，R.J.,Jain,R.，&a/.(2004).MicroRNA-143regulatesadipocytedifferentiation.JBiolChem279,52361-52365.74.He,L.，Thomson,J.M.,Hemann，M.T"Hernando-Monge，E.，Mu,D.，Goodson，S.，Powers,S.，Cordon-Cardo,C.,Lowe,S.W"Hannon,G.J.,andHammond,S.M.(2005).AmicroRNApolycistronasapotentialhumanoncogene.Nature435，828-833.75.Chen,C.Z.，Li，L.，Lodish，H.F,，andBartel,D.R(2004).MicroRNAsmodulatehematopoieticlineagedifferentiation.Science303，83-86.76.Johnston,R.J.，andHobert，O.(2003).AmicroRNAcontrollingleft/rightneuronalasymmetryinCaenorhabditiselegans.Nature426，845-849.77.Chang,S.，Johnston,R.J.，Jr,，F(xiàn)rokjaer-Jensen，C.，Lockery，S.，andHobert，O.(2004).MicroRNAsactsequentiallyandasymmetricallytocontrolchemosensorylateralityinthenematode.Nature柳，785-789.78.Yekta，S.，Shih,I.H.，andBarteL，D.P.(2004).MicroRNA-directedcleavageofHOXB8niRNA.Science鄧《594-596.79.Mansfield,J.H.，Harfe，B.D.，Nissen,R.，Obenauer，J.,Srineel，J.，Chaudhuri，A.，F(xiàn)arzan-Kashani,R"Zuker，M.，Pasquinelli，A.E"Ruvkun，G"Wa/.(2004).MicroRNA-responsive'sensor'transgenesuncoverHox-likeandotherdevelopmentallyregulatedpatternsofvertebratemicroRNAexpression.NatGenet_3<5，1079-1083.80.Zhao,Y.,Samal,E.，andSrivastava，D.(2005).Serumresponsefactorregulatesamuscle-specificmicroRNAthattargetsHand2duringcardiogenesis.NatureW<5，214-220.81.Lewis,B.P.,Shih，I.H.，Jones-Rhoades，M.W"Bartel,D.P"andBurge,C.B.(2003).PredictionofmammalianmicroRNAtargets.CellJ",787-798.82.John,B.,Enright,A.J.，Aravin,A.，Tuschl,T"Sander,C.，andMarks,D.S.(2004).HumanMicroRNAtargets.PLoSBiol2，e363.83.Kiriakidou,M.，Nelson,P.T"Kouranov，A.,Fitziev,P"Bouyioukos,C.，Mourelatos，Z.,andHatzigeorgiou,A.(2004).Acombinedcomputational-experimentalapproachpredictshumanmicroRNAtargets.GenesDev1165-1178.84.Krek,A"Grun，D.，Poy，M.N"Wolf,R.，Rosenberg,L.,Epstein,E.J"MacMenamin,P"daPiedade,I.，Gunsalus,K.C.,Stoffel，M,,andRajewsky,N.(2005).CombinatorialmicroRNAtargetpredictions.NatGenet37，495-500.85.Rajewsky,N.,andSocci,N.D.(2004).ComputationalidentificationofmicroRNAtargets.DevBiol267，529-535.86.Nicol，R.L.,Frey,N,,Pearson,G"Cobb，M.,Richardson,J.,andOlson,E.N.(2001).ActivatedMEK5inducesserialassemblyofsarcomeresandeccentriccardiachypertrophy.EmboJ20,2757-2767.87.Jones,W.K.，Grupp,I.L.，Doetschman，T.，Grupp,G，Osinska，H.，Hewett，T.E.,Boivin,G.，Gulick,J.,Ng,W.A.，andRobbins,J.(1996).Ablationofthemurinealphamyosinheavychaingeneleadstodosageeffectsandfunctionaldeficitsintheheart.JClinInvest站，1麵-1917.88.Liu,P.,Jenkins,N.A.,andCopeland,N.G.(2003).Ahighlyefficientrecombineering-basedmethodforgeneratingconditionalknockoutmutations.GenomeRes",476-484.89.Cotta-de-Almeida，V.，Schonhoff，S.，Shibata，T,,Leiter,A.，andSnapper,S.B.(2003).Anewmethodforrapidlygeneratinggene-targetingvectorsbyengineeringBACsthroughhomologousrecombinationinbacteria.GenomeRes/3，2190-2194.90.Subramaniam，A"Jones,W.K.，Gulick,J.，Wert，S.，Neumann,J.，andRobbins，J.(1991).Tissue-specificregulationofthealpha畫myosinheavychaingenepromoterintransgenicmice.JBiolChem266,24613-24620.91.Sanbe，A.，Gulick，J.，Hanks，M.C.,Liang，Osinska,H.，andRobbins，J.(2003).Reengineeringinduciblecardiac-specifictransgenesiswithanattenuatedmyosinheavychainpromoter.CircRes92，609-616.92.Czubryt，M.P.,McAnally，J.，F(xiàn)ishman,G.I.,andOlson,E.N.(2003).Regulationofperoxisomeproliferator-activatedreceptorgammacoactivator1alpha(PGC-1alpha)andmitochondrialfunctionbyMEF2andHDAC5.ProcNatlAcadSciUSA/W，1711-1716.93.Ito，M.，Yuan,C.X.，Malik，S.，Gu，W"Fondell，J.D.,Yamamura，S.，F(xiàn)u，Z,Y.，Zhang，X.，Qin，J.，andRoeder,R.G.(1999).IdentitybetweenTRAPandSMCCcomplexesindicatesnovelpathwaysforthefunctionofnuclearreceptorsanddiversemammalianactivators.MolCell3，361-370.94.Fondell,J.D.,Ge，H.，andRoeder，R.G.(1996).Ligandinductionofatranscriptionallyactivethyroidhormonereceptorcoactivatorcomplex.ProcNatlAcadSciUSA93，8329-8333.95.Treisman，J.(2001).DrosophilahomologuesofthetranscriptionalcoactivationcomplexsubunitsTRAP240andTRAP230arerequiredforidenticalprocessesineye-antennaldiscdevelopment.Development603-615.96.Ito，M.，Yuan,C.X,,Okano，H.J.，Darnell,R.B,，andRoeder,R.G.(2000).InvolvementoftheTRAP220componentoftheTRAP/SMCCcoactivatorcomplexinembryonicdevelopmentandthyroidhormoneaction.MolCell5，683-693.97.Muncke,N"Jung，C.，Rudiger，H.，Ulmer，H"Roeth，R"Hubert,A"Goldmuntz，E,，Driscoll,D.,Goodship，J.，Schon,K.，andRappold，G(2003).MissensemutationsandgeneinterruptioninPROSIT240,anovelTRAP240-likegene,inpatientswithcongenitalheartdefect(transpositionofthegreatarteries).Circulation/ftS,2843-2850.98.Lompre,A.M.，Nadal-Ginard，B.，andMahdavi，V.(1984).Expressionofthecardiacventricularalpha-andbeta-myosinheavychaingenesisdevelopmentallyandhormonallyregulated.JBiolChemZ59，6437-6446.99.Everett,A.W.，Sinha，A.M.，Umeda，P.K.,Jakovcic，S.，Rabinowitz,M.,andZak，R.(1984》Regulationofmyosinsynthesisbythyroidhormone:relativechangeinthealpha-andbeta-myosinheavychainmRNAlevelsinrabbitheart.Biochemistry"，1596-1599.100.Darling,D.S.，Carter,R,L.，Yen，P.M.，Welborn，J.M.，Chin，W,W.，andUmeda，P.K.(1993).Differentdimerizationactivitiesofalphaandbetathyroidhormonereceptorisoforms.JBiolChem10221-10227.101.Subramaniam，A.,Gulick，J.，Neumann,J.，Knotts,S.，andRobbins,J.(1993).Transgenicanalysisofthethyroid-responsiveelementsinthealpha-cardiacmyosinheavychaingenepromoter.JBiolChem，，4331-4336.102.Gustafson，T.A.，Markham，B.E.，Bahl，J.J.，andMorkin，E,(1987).Thyroidhormoneregulatesexpressionofatransfectedalpha-myosinheavy-chainfusiongeneinfetalheartcells.ProcNatlAcadSciUSAS《3122-3126.103.Santalucia，T"Boheler,K.R.，Brand，N.J.,Sahye，U.，F(xiàn)andos,C.，Vinals,F,，F(xiàn)erre，J"Testar，X.，Palacin，M.，andZorzano，A.(1999).FactorsinvolvedinGLUT-1glucosetransportergenetranscriptionincardiacmuscle,JBiolChem27《17626-17634.104.Hagen，G,，Muller,S.，Beato，M,,andSuske，G.(1994).Spl-mediatedtranscriptionalactivationisrepressedbySp3.EmboJ",3843-3851.105.Hagen，G"Muller,S.，Beato,M.，andSuske，G(1992).CloningbyrecognitionsitescreeningoftwonovelGTboxbindingproteins:afamilyofSplrelatedgenes.NucleicAcidsRes20,5519-5525.106.Schonberger,J.,Wang,L.，Shin,J.T"Kim，S.D.，Depreux，F(xiàn),F,，Zhu，H.，Zon，L.，Pizard，A.，Kim，J.B.，Macrae,C.A.，a/.(2005).MutationinthetranscriptionalcoactivatorEYA4causesdilatedcardiomyopathyandsensorineuralhearingloss.NatGenet37,418-422.<formula>formulaseeoriginaldocumentpage90</formula>權(quán)利要求1.一種治療對(duì)象中肌損傷的方法，所述方法包括給予對(duì)象中的肌損傷部位有效量的microRNA(miRNA)、編碼所述miRNA的載體、miRNA的抑制劑、或者其組合，其中所述miRNA靶向于肌損傷部位肌細(xì)胞中的基因。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述肌損傷得自機(jī)械性肌創(chuàng)傷、肌組織退行性疾病、心肌損傷或者其組合。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述對(duì)象是哺乳動(dòng)物。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述miRNA包含選自由SEQIDNO:1-11中任一序列及與SEQIDNO:1-11中任一序列至少70%相同的序列組成的組的核苷酸序列。5.權(quán)利要求1的方法，其中所述miRNA選自由miR-l、miR-133、miR-206、miR-208、miR畫22、miR-26、miR-29、miR畫30、miR-128、miR-143和miR-145組成的組。6.權(quán)利要求1的方法，其中所述miRNA靶向于所述基因的3，非翻譯區(qū)。7.權(quán)利要求1的方法，其中編碼所述miRNA的載體包含(a)與編碼所述miRNA分子的核酸分子可操縱地連接的啟動(dòng)子；及(b)轉(zhuǎn)錄終止序列。8.權(quán)利要求1的方法，其中miRNA的抑制劑能與耙miRNA雜交。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述靶miRNA選自由miR-1、miR-133、miR畫206、miR-208、miR-22、miR-26、miR陽(yáng)29、miR-30、miR-128、miR-143和miR-145組成的組。10.權(quán)利要求1的方法，其中所述基因選自肌細(xì)胞分化基因和肌細(xì)胞增殖基因。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述肌細(xì)胞分化基因編碼組蛋白脫乙酰酶4(HDAC4)多肽或者甲狀腺激素受體蛋白240(TRAP240)多肽。12.權(quán)利要求10的方法，其中所述肌細(xì)胞增殖基因編碼血清應(yīng)答因子(SRF)多肽。13.權(quán)利要求5的方法，其中在第一時(shí)間點(diǎn)將miR-133與miR-l抑制劑組合給予所述肌損傷部位，并在第二時(shí)間點(diǎn)將miR-l與miR-133抑制劑組合給予所述肌損傷部位。14.一種調(diào)節(jié)肌細(xì)胞分化、增殖或者這二者的方法，所述方法包括將肌細(xì)胞與靶向肌細(xì)胞中可調(diào)節(jié)肌細(xì)胞分化、增殖或者這二者的基因的microRNA(miRNA)或者編碼所述miRNA的載體接觸。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述調(diào)節(jié)是抑制。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述miRNA抑制所述基因的翻譯。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述miRNA靶向于所述基因的3'非翻譯區(qū)。18.權(quán)利要求14的方法，所述miRNA包含選自由SEQIDNO:1-11中任一序列及與SEQIDNO:1-11中任一序列至少70%相同的序列組成的組的核苷酸序列。19.權(quán)利要求14的方法，其中所述miRNA選自miR-l、miR-133、miR-206、miR-208、miR隱22、miR-26、miR-29、miR-30、miR-128、miR-143和miR-145組成的組。20.權(quán)利要求14的方法，其中編碼所述miRNA的載體包含(a)與編碼所述miRNA分子的核酸分子可操縱地連接的啟動(dòng)子；及(b)轉(zhuǎn)錄終止序列。21.權(quán)利要求14的方法，其中所述肌細(xì)胞分化基因編碼組蛋白脫乙酰酶4(HDAC4)多肽或者甲狀腺激素受體蛋白240(TRAP240)多肽。22.權(quán)利要求14的方法，其中所述肌細(xì)胞增殖基因編碼血清應(yīng)答因子(SRF)多肽。23.—種調(diào)節(jié)肌細(xì)胞中基因表達(dá)的方法，所述方法包括將肌細(xì)胞與耙向于所述肌細(xì)胞中基因的microRNA(miRNA)或者編碼該miRNA的載體接觸。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述調(diào)節(jié)是抑制。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述miRNA抑制所述基因的翻譯。26.權(quán)利要求25的方法，其中所述miRNA靶向于所述基因的3'非翻譯區(qū)。27.權(quán)利要求23的方法，其中所述miRNA包含選自由SEQIDNO:1-11中任一序列及與SEQIDNO:1-11中任一序列至少70%相同的序列組成的組的核苷酸序列。28.權(quán)利要求23的方法，其中所述miRNA選自由miR-1、miR-133、miR曙206、miR-208、miR-22、miR-26、miR-29、miR-30、miR-128、miR-143和miR-145組成的組。29.權(quán)利要求23的方法，其中編碼所述miRNA的載體包含(a)與編碼所述miRNA分子的核酸分子可操縱地連接的啟動(dòng)子；及(b)轉(zhuǎn)錄終止序列。30.權(quán)利要求23的方法，其中所述基因選自肌細(xì)胞分化基因和肌細(xì)胞增殖基因組成的組。31.權(quán)利要求30的方法，其中所述肌細(xì)胞分化基因編碼組蛋白脫乙酰酶4(HDAC4)多肽。32.權(quán)利要求30的方法，其中所述肌細(xì)胞增殖基因編碼血清應(yīng)答因子(SRF)多肽。33.—種抑制肌細(xì)胞中基因表達(dá)的方法，所述方法包括用編碼microRNA(miRNA)分子的載體轉(zhuǎn)化所述肌細(xì)胞，其中所述miRNA分子包含與所述基因的17個(gè)-24個(gè)連續(xù)核苷酸的亞序列至少70%相同的核苷酸序列。34.權(quán)利要求33的方法，其中所述miRNA抑制所述基因的翻譯。35.權(quán)利要求33的方法，其中所述亞序列位于所述基因的3'非翻譯區(qū)內(nèi)。36.權(quán)利要求33的方法，其中所述miRNA包含選自由SEQIDNO:1-11中任一序列及與SEQIDNO:1-11中任一序列至少70%相同的序列組成的組的核苷酸序列。37.權(quán)利要求33的方法，其中所述miRNA選自由miR-l、miR-133、miR-206、miR-208、miR-22、miR-26、miR-29、miR-30、miR-128、miR-143和miR-145組成的組。38.權(quán)利要求33的方法，其中編碼所述miRNA的載體包含(a)與編碼所述miRNA分子的核酸分子可操縱地連接的啟動(dòng)子；及(b)轉(zhuǎn)錄終止序列。39.權(quán)利要求33的方法，其中所述基因選自肌細(xì)胞分化基因和肌細(xì)胞增殖基因組成的組。40.權(quán)利要求39的方法，其中所述肌細(xì)胞分化基因編碼組蛋白脫乙酰酶4(HDAC4)多肽或者甲狀腺激素受體蛋白240(TRAP240)多肽。41.權(quán)利要求39的方法，其中所述肌細(xì)胞增殖基因編碼血清應(yīng)答因子CSRF:i多肽。42.—種在肌細(xì)胞中表達(dá)microRNA(miRNA)分子的載體，所述載體包含(a)與編碼所述miRNA分子的核酸分子可操縱地連接的啟動(dòng)子；及(b)轉(zhuǎn)錄終止序列。43.權(quán)利要求42的載體，其中所述表達(dá)的miRNA抑制所述肌細(xì)胞中基因的翻譯。44.權(quán)利要求43的載體，其中所述miRNA靶向于所述基因的3'非翻譯區(qū)。45.權(quán)利要求42的載體，所述所述miRNA包含選自由SEQIDNO:1-11中任一序列及與SEQIDNO:1-11中任一序列至少70%相同的序列組成的組的核苷酸序列。46.權(quán)利要求42的載體，其中所述miRNA選自miR-l、miR-133、miR-206、miR-208、miR-22、miR-26、miR-29、miR-30、miR-l28、miR-143和miR-145組成的組。47.權(quán)利要求43的載體，其中所述基因選自肌細(xì)胞分化基因和肌細(xì)胞增殖基因。48.權(quán)利要求47的載體，其中所述肌細(xì)胞分化基因編碼組蛋白脫乙酰酶4(HDAC4)多肽或者甲狀腺激素受體蛋白240(TRAP240)多肽。49.權(quán)利要求47的載體，其中所述肌細(xì)胞增殖基因編碼血清應(yīng)答因子(SRF)多肽。50.—種試劑盒，其包含權(quán)利要求39的載體及將所述載體導(dǎo)入肌細(xì)胞中的至少一種試劑。51.權(quán)利要求50的試劑盒，其進(jìn)一步包含將所述載體導(dǎo)入肌細(xì)胞中的說(shuō)明。52.包含權(quán)利要求42的載體的肌細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)肌細(xì)胞中基因表達(dá)的方法和組合物。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明組合物的細(xì)胞。文檔編號(hào)C12N15/113GK101448942SQ200680052681公開(kāi)日2009年6月3日申請(qǐng)日期2006年12月12日優(yōu)先權(quán)日2005年12月12日發(fā)明者王大之,陳健夫申請(qǐng)人:北卡羅來(lái)納大學(xué)查珀?duì)栂柗中?