專利名稱：：纖維素材料的處理和用于其中的酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及從纖維素材料生產(chǎn)糖水解物。更精確地說(shuō)，本發(fā)明涉及從木質(zhì)纖維素材料利用酶轉(zhuǎn)換生產(chǎn)可發(fā)酵糖?？砂l(fā)酵糖可用于例如生產(chǎn)生物乙醇或其它用途。本發(fā)明特別涉及以纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase)、內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanase)、P-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase)及任選的木聚糖酶(Xylanase)處理纖維素材料的方法，并涉及酶制劑及其用途。本發(fā)明進(jìn)一步涉及新穎的纖維素分解多肽、編碼該多肽的多核苷酸，并涉及包含該多核苷酸的載體及宿主細(xì)胞。本發(fā)明更進(jìn)一步涉及該多肽的用途以及制備該多肽的方法。
背景技術(shù)：
：糖水解物可用于微生物生產(chǎn)多種多樣的精細(xì)化學(xué)品或生物聚合物，諸如有機(jī)酸，例如乳酸，或乙醇或其它醇，例如正丁醇、1，3-丙二醇或聚羥基鏈垸酸酯(PHA)。糖水解物亦可作為其它例如用于富集、分離及純化高價(jià)值糖的非微生物方法或許多聚合方法的原料。糖水解物的主要用途之一是生產(chǎn)生物燃料。生物乙醇和/或其它化學(xué)品的生產(chǎn)可能發(fā)生于生物煉制的一體化工藝中(Wyman2001)。化石燃料的資源有限，及其所釋放的二氧化碳量增加并導(dǎo)致溫室現(xiàn)象，喚起了使用生物質(zhì)作為可再生和清潔的能源來(lái)源的需求。從纖維素材料生產(chǎn)生物燃料即乙醇是一種有前景替代技術(shù)。生物燃料是目前運(yùn)輸業(yè)的唯一選擇，其可以數(shù)量級(jí)減少二氧化碳的排放。乙醇可用于現(xiàn)行的交通工具及配送系統(tǒng)，因此毋須昂貴的基礎(chǔ)設(shè)施投資。源自木質(zhì)纖維素再生性原料的糖亦可用作各種各樣可取代油基化學(xué)品的化學(xué)產(chǎn)品的原料。植物中大部分碳水化合物是木質(zhì)纖維素的形式，木基本上由纖維素(cellulose)、半纖維素(hemicellulose)、果膠(pectin)及木質(zhì)素(lignin)組成。在木質(zhì)纖維素到乙醇的方法中，木質(zhì)纖維素材料首先經(jīng)化學(xué)或物理預(yù)處理，使纖維素成分更容易水解。接著纖維素部分被水解以得到可經(jīng)酵母菌發(fā)酵成為乙醇的糖。木質(zhì)素是得到的主要副產(chǎn)品，其可用作固體燃料。生物乙醇的生產(chǎn)成本高且其能量輸出低，是該方法更經(jīng)濟(jì)的研究仍在持續(xù)進(jìn)行中。酶法水解被認(rèn)為是將纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)換成可發(fā)酵糖的最有前景的技術(shù)。然而，酶法水解在工業(yè)規(guī)模中僅被有限地被利用，特別是當(dāng)利用高度木質(zhì)化的材料如木材或農(nóng)業(yè)廢棄物時(shí)，該項(xiàng)技術(shù)不令人滿意。酶法步驟的成本是該方法的主要經(jīng)濟(jì)因素的一。已經(jīng)作出許多努力以改善纖維素材料酶法水解的效率(Badger2002)。US2002/0192774A1描述用于轉(zhuǎn)換固體木質(zhì)纖維素生物質(zhì)成為可燃燒的燃料產(chǎn)物的連續(xù)方法。經(jīng)濕式氧化或汽爆的預(yù)處理后，該生物質(zhì)被部份分離成為纖維素、半纖維素及木質(zhì)素，然后利用一或多種碳水化合酶(EC3.2)進(jìn)行部份水解。Celluclast,NovoNordiskA/S公司的商品，含有纖維素酶及木聚糖酶活性，被提供作為范例。US2004/0005674A1描述可直接用于木質(zhì)纖維素底物上的新穎酶混合物，從而可以避免預(yù)處理過(guò)程中形成的毒性廢棄物并可以節(jié)省能源。該增效的酶混合物包含纖維素酶及輔助酶如纖維素酶、木聚糖酶、木質(zhì)素酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶或葡萄糖醛酸酶或其任何組合物?？紤]的纖維素酶包含內(nèi)切葡聚糖酶(EG)、/3-葡萄糖苷酶(BG)及纖維二糖水解酶(CBH)。該實(shí)施例說(shuō)明木霉木聚糖酶及纖維素酶制劑的混合物的用途。Kumbi等人(2005)研究了以新穎及商品化的真菌纖維素酶來(lái)酶法水解經(jīng)汽爆及乙醇有機(jī)溶劑預(yù)處理的花旗松。他們測(cè)試了兩種商品化的里氏木霉(Trichodermareesei)纖維素酶制劑及兩種由木霉屬(Trichodermasp.)及青霉屬(Penicilliumsp.)的突變菌株產(chǎn)生的新穎制劑。木霉屬制劑相較于其它制劑顯示顯著更好的表現(xiàn)。更好的表現(xiàn)至少有部分被認(rèn)為是由于顯著較高的P-葡萄糖苷酶活性所致，其減輕纖維二糖水解酶及內(nèi)切葡聚糖酶的產(chǎn)物抑制。US2004/0053373Al是關(guān)于一種將纖維素轉(zhuǎn)換成葡萄糖的方法，通過(guò)以包含纖維素酶及經(jīng)修飾的纖維二糖水解酶I(CBHI)的酶混合物處理經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素底物。該CBHI已通過(guò)滅活其纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)加以修飾。CBHI修飾的優(yōu)點(diǎn)為例如高底物濃度下較好的回收及較高的水解率。纖維素酶選自EG、CBH及BG。優(yōu)選CBHI得自木霉菌。US2005/0164355Al描述了在至少一種表面活性劑存在時(shí)，以一或多種纖維分解酶分解木質(zhì)纖維素材料的方法。其它的酶諸如半纖維素酶、酯酶、過(guò)氧化物酶、蛋白酶、漆酶(laccase)或其混合物亦可以使用。表面活性劑存在相較于表面活性劑不存在，可增加木質(zhì)纖維素材料的分解。纖維分解酶可以是任何參與木質(zhì)纖維素分解的酶，包括CBH、EG及BG。有大量文獻(xiàn)公開了各種纖維素酶及半纖維素酶。纖維二糖水解酶(CBHs)公開于例如WO03/000941,其涉及得自各種真菌的CBHI酶。未提供所述酶的生理特性，亦未提供其用途的任何實(shí)施例。Hong等人(2003b)表征了產(chǎn)生于酵母菌中的金黃色嗜熱子囊菌(Thermoascusaurantiacus)CBHI的特征。該酶的應(yīng)用未描述。Tuohy等人(2002)描述了得自埃莫森籃狀菌(Talaromycesemersonii)的3種形式的纖維二糖水解酶。Cel5家族的內(nèi)切葡聚糖酶(EGsfam5)被描述于例如WO03/062409，其涉及用于詞料應(yīng)用的包含至少2種熱穩(wěn)定性酶的組成物。Hong等人(2003a)描述于酵母菌中生產(chǎn)來(lái)自金黃色嗜熱子囊菌的熱穩(wěn)定性e-l，4-內(nèi)切葡聚糖酶。其應(yīng)用未解釋。WO01/70998涉及得自籃狀菌的e-葡聚糖酶。它們還描述了得自埃莫森籃狀菌的e-葡聚糖酶。討論了食物、飼料、飲料、釀造及清潔劑應(yīng)用。并未提及木質(zhì)纖維素水解。WO98/06858描述了得自黑曲霉菌(Aspergillusniger)的P-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶，且討論了該酶于飼料及食物上的應(yīng)用。1^097/13853描述了在cDNA文庫(kù)中篩檢編碼酶的DNA片段的方法。該cDNA文庫(kù)是酵母菌或真菌源的，優(yōu)選來(lái)自曲霉菌。該酶優(yōu)選為纖維素酶。VanPetegem等人(2002)描述了來(lái)自金黃色嗜熱子囊菌的Cel5家族內(nèi)切葡聚糖酶的三維結(jié)構(gòu)。Parry等人(2002)描述了來(lái)自金黃色嗜熱子囊菌的Cel5家族內(nèi)切葡聚糖酶的作用模式。Cel7家族的內(nèi)切葡聚糖酶(EGsfam7)被披露于例如US5,912,157，其關(guān)于毀絲霉屬(Mycdiophthora)內(nèi)切葡聚糖酶及其同源物及其于清潔劑、紡織及紙漿上的應(yīng)用。US6，071，735描述于堿性條件下展現(xiàn)高度內(nèi)切葡聚糖酶活性的纖維素酶。討論了作為清潔劑在紙漿和造紙及紡織應(yīng)用上的用途。未提及生物乙醇。US5，763，254公開了分解纖維素/半纖維素且于CBD中具有保守的氨基酸殘基的酶。Cd45家族的內(nèi)切葡聚糖酶(EGsfam45)被描述于例如US6，001,639，其涉及具有內(nèi)切葡聚糖酶活性且具有2個(gè)保守氨基酸序列的酶。一般性討論了在紡織、清潔劑及紙漿和造紙應(yīng)用上的用途，并提及木質(zhì)纖維素材料的處理，但未提供實(shí)施例。WO2004/053039涉及內(nèi)切葡聚糖酶的清潔劑應(yīng)用。US5，958，082公開了內(nèi)切葡聚糖酶、特別是得自太瑞斯梭孢殼霉(Thidaviaterrestris)者于紡織應(yīng)用上的用途。EP0495258涉及包含腐質(zhì)霉(Humicola)纖維素酶的清潔劑組合物。US5，948,672描述了包含內(nèi)切葡聚糖酶、特別是得自腐質(zhì)霉者的纖維素酶制劑及其于紡織及紙漿應(yīng)用上的用途。木質(zhì)纖維素水解未被提及。小量的0-葡萄糖苷酶(BG)通過(guò)水解由纖維二糖水解酶所產(chǎn)生的纖維二糖，增強(qiáng)了生物質(zhì)水解成葡萄糖。纖維二糖轉(zhuǎn)換成葡萄糖通常是主要的限速步驟。e-葡萄糖苷酶被公開于例如US2005/0214920，其涉及得自煙曲霉菌(Aspergillusfumigatus)的BG。該酶已于米曲霉菌(Aspergillusoryzae)及里氏木霉中生產(chǎn)。該酶于分解生物質(zhì)或清潔劑應(yīng)用上的用途被一般性討論，但未舉例說(shuō)明。WO02/095014描述了具有纖維二糖酶活性的米曲霉菌酶。從生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇的用途被一般性討論但未舉例說(shuō)明。WO2005/074656公開了源自例如金黃色嗜熱子囊菌；煙曲霉菌；太瑞斯梭孢殼霉及金黃色嗜熱子囊菌的具有增強(qiáng)纖維素分解活性的多肽。WO02/26979公開了植物物質(zhì)的酶法處理。US6，022,725描述了克隆及擴(kuò)增里氏木霉的P-葡萄糖苷酶基因，及US6，103,464描述用于編碼來(lái)自絲狀真菌的e-葡萄糖苷酶的DNA的檢測(cè)方法。未提供應(yīng)用實(shí)施例。木聚糖酶被描述于例如FR2786784，其有關(guān)可用于例如處理動(dòng)物詞料及面包制作的熱穩(wěn)定性木聚糖酶。該酶源自嗜熱性真菌，特別是嗜熱子囊菌屬。US6,197,564描述了具有木聚糖酶活性且得自棘孢曲霉菌(Aspergillusaculeatus)的酶。舉例說(shuō)明了該酶于烘培上的應(yīng)用。WO02/24926涉及籃狀菌木聚糖酶。提供了飼料及烘培的實(shí)施例。WO01/42433公開了用于食品及飼料應(yīng)用的來(lái)自埃莫森籃狀菌的熱穩(wěn)定性木聚糖酶。研究最透徹且應(yīng)用最廣泛的真菌來(lái)源的纖維素分解酶已經(jīng)源自里氏木霉(紅褐肉座菌(Hypocreajecorina)的無(wú)性型)。因此大多數(shù)商業(yè)化的真菌纖維素酶亦源自里氏木霉。然而，大部分來(lái)自較不知名真對(duì)于用于分解纖維素底物、特別是木質(zhì)纖維素底物的新方法，及增強(qiáng)分解效率的新穎酶及酶混合物，有持續(xù)的需求。還需要在高溫下工作的方法及酶，如此可使用高黏稠度的生物質(zhì)并導(dǎo)致高濃度的糖及乙醇。這種方法可能引起顯著節(jié)省能源及投資成本。高溫還可降低水解過(guò)程中污染的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明的目標(biāo)在于達(dá)到至少部分這些需求。發(fā)明簡(jiǎn)述目前意外發(fā)現(xiàn)纖維素分解酶，特別是得自金黃色嗜熱子囊菌、嗜熱枝頂孢菌(Acremoniumthermophilum)或嗜熱毛殼菌(Chaetomiumthermophilum)的纖維二糖水解酶，對(duì)于水解纖維素材料特別有用。除了纖維二糖水解酶之外，這些真菌還具有非常適合用于分解纖維素材料的內(nèi)切葡聚糖酶、e-葡萄糖苷酶及木聚糖酶。這些酶在寬溫度范圍內(nèi)呈現(xiàn)非常有效的動(dòng)力學(xué)，并且雖然它們?cè)诟邷叵掠懈叨然钚?，但在?biāo)準(zhǔn)水解溫度下亦非常有效。這使它們極度適合各種在常規(guī)溫度及升高的溫度下進(jìn)行的纖維素底物水解方法。本發(fā)明提供一種以纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶及e-葡萄糖苷酶處理纖維素材料的方法，其中所述纖維二糖水解酶包含與SEQIDNO:2、4、6或8、或與其酶活性片段具有至少80%同一性的氨基酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種酶制劑，其包含纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶及P-葡萄糖苷酶，其中所述纖維二糖水解酶包含與SEQIDNO:2、4、6或8、或與其酶活性片段具有至少80%同一性的氨基酸序列。還提供了所述酶制劑分解纖維素材料的用途，以及所述方法在從纖維素材料制備乙醇的過(guò)程中的用途。本發(fā)明還涉及一種多肽，其包含具有纖維素分解活性的片段且選自a)包含的氨基酸序列至少與SEQIDNO:4具有66%同一性、與SEQIDNO:6具有79%同一性、與SEQIDNO:12具有78%同一性、與SEQIDNO:14具有68%同一性、與SEQIDNO:16具有72%同一性、與SEQIDNO:20具有68%同一性、與SEQIDNO:22或24具有74%同一性或與SEQIDNO:26具有78%同一性的多肽；b)包含具有纖維素分解活性片段的a)的變異體；及c)具有纖維素分解活性的a)或b)的片段。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是一種選自下列的分離的多核苷酸a)SEQIDNO:3、5、11、13、15、19、21、23或25的核苷酸序列，或編碼權(quán)利要求35的多肽的序列；b)a)的互補(bǔ)鏈；c)包含至少20個(gè)核苷酸的a)或b)的片段；及d)由于基因密碼而與a)、b)或c)所定義的任一序列簡(jiǎn)并的序列。本發(fā)明還另外提供一種載體，其包含作為異源性序列的所述多核苷酸，以及一種包含所述載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還包括登錄號(hào)為DSM16728、DSM16729、DSM17324、DSM17323、DSM17729、DSM16726、DSM16725、DSM17325或DSM17667的大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株。本發(fā)明的其它目標(biāo)為包含至少一種新穎多肽的酶制劑，以及所述多肽或酶制劑于燃料、紡織、清潔劑、紙漿和造紙、食品、詞料或飲料工業(yè)上的用途。還提供了一種制備多肽的方法，該多肽包含具有纖維素分解活性的片段且選自a)包含的氨基酸序列至少與SEQIDNO:4具有66%同一性、與SEQIDNO:6具有79%同一性、與SEQIDNO:12具有78%同一性、與SEQIDNO:14具有68%同一性、與SEQIDNO:16具有72%同一性、與SEQIDNO:20具有68%同一性、與SEQIDNO:22或24具有74%同一性或與SEQIDNO:26具有78%同一性的多肽；b)包含具有纖維素分解活性片段的a)的變異體；及c)具有纖維素分解活性的a)或b)的片段，所述方法包括用編碼所述多肽的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并于能夠表達(dá)所述多肽的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，和任選回收并純化所產(chǎn)生的多肽。還進(jìn)一步提供一種以至少一種能夠產(chǎn)生上述多肽的微生物的耗盡培養(yǎng)基處理纖維素材料的方法，其中該方法包括令纖維素材料與耗盡培養(yǎng)基反應(yīng)以得到經(jīng)水解的纖維素材料。本發(fā)明的特定實(shí)施方案于從屬權(quán)利要求中提及。本發(fā)明的其它目標(biāo)、細(xì)節(jié)及優(yōu)點(diǎn)可自下列附圖、詳細(xì)說(shuō)明及實(shí)施例中變得明了。圖1.纖維素酶及P-葡萄糖苷酶活性于6種測(cè)試真菌菌株上清液中的溫度依賴性。給定溫度下分析中的孵育時(shí)間為60分鐘，分析pH値為5.0(MUL活性)或4.8(CMCase或BGU)。于60。C得到的活性被設(shè)定為100%的相對(duì)活性。A)金黃色嗜熱子囊菌ALK04239，B)金黃色嗜熱子囊菌ALK04242，C)嗜熱枝頂孢菌ALK04245，D)嗜熱籃狀菌(Talaromycesthermophilus)ALK04246，E)嗜熱毛殼菌ALK04261,F)嗜熱毛殼菌ALK04265。圖2.用于轉(zhuǎn)化里氏木霉原生質(zhì)體以產(chǎn)生重組真菌蛋白質(zhì)的表達(dá)盒的示意圖。該重組基因處于里氏木霉cbhl(Cel7A)啟動(dòng)子(cbhlprom)控制下且通過(guò)使用里氏木霉cbhl終止子(cbhlterm)來(lái)確保轉(zhuǎn)錄終止。包含amdS基因作為轉(zhuǎn)化標(biāo)記。圖3A).測(cè)定得自金黃色嗜熱子囊菌ALK04242、嗜熱毛殼菌ALK04265及嗜熱枝頂孢菌ALK04245的重組CBH/Cel7蛋白制劑在4-甲基傘形酮基-P-D-乳糖苷(MUL)上5(TC下10分鐘時(shí)的最適pH。結(jié)果以三次單獨(dú)測(cè)量的平均值(士標(biāo)準(zhǔn)差)表示。B)測(cè)量得自金黃色嗜熱子囊菌ALK04242、嗜熱毛殼菌ALK04265及嗜熱枝頂孢菌ALK04245的重組CBH/Cel7蛋白制劑在4-甲基傘形酮基-P-D-乳糖苷糖(MUL)上最佳pH下60分鐘時(shí)的熱穩(wěn)定性。結(jié)果以三次單獨(dú)測(cè)量的平均值(士標(biāo)準(zhǔn)差)表示。這二個(gè)反應(yīng)皆包含BSA(100微克/毫升)以作為穩(wěn)定劑。圖4.以純化的重組纖維二糖水解酶于45'C下水解結(jié)晶纖維素(Avicel)。底物濃度1%(重量/體積)，pH5.0，酶濃度1.4微摩爾。A)具有CBD的纖維二糖水解酶，B)沒(méi)有CBD的纖維二糖水解酶(核心)。圖5.以純化的重組纖維二糖水解酶于70。C下水解結(jié)晶纖維素(Avicel)。底物濃度1%(重量/體積)，pH5.0，酶濃度1.4微摩爾。A)包含CBD的纖維二糖水解酶，B)沒(méi)有CBD的纖維二糖水解酶(核心)。圖6A).在50'C下與CMC底物反應(yīng)IO分鐘，測(cè)定異源生產(chǎn)的枝頂孢菌EG—40/Cel45A、EG—40—like/Cel45B及嗜熱子囊菌EG—28/Cel5A活性的pH依賴性。B)分別于pH5.5、4.8及6.0處測(cè)量枝頂孢菌EG—40/Cel45A、EG—40—like/Cel45B及嗜熱子囊菌EG—28/Cel5A的最適溫度。除了EG—28/Cel5A為IO分鐘，該包含CMC作為底物的反應(yīng)進(jìn)行60分鐘。添加BSA(100微克/毫升)作為穩(wěn)定劑。圖7A).在50'C與4-硝基苯基-e-D-吡喃葡糖苷底物反應(yīng)10分鐘，測(cè)定異源生產(chǎn)的枝頂孢菌BG—101/Cel3A、毛殼菌BG_76/Cel3A及嗜熱子囊菌BG一81/Cel3A活性的pH依賴性。B)分別于pH4.5、5.5及4.5下測(cè)量枝頂孢菌eG—101/Cel3A、毛殼菌PG—76/Cel3A及嗜熱子囊菌eG—81/Cel3A的最適溫度。該包含4-硝基苯基-P-D-吡喃葡糖苷作為底物的反應(yīng)進(jìn)行達(dá)60分鐘，并添加BSA(100微克/毫升)作為穩(wěn)定劑。圖8A).與樺木木聚糖(birchxylan)底物5(TC反應(yīng)IO分鐘，測(cè)定異源生產(chǎn)的嗜熱子囊菌XYN—30/XynlOA木聚糖酶活性的pH依賴性。B)在pH5.3的60分鐘反應(yīng)中測(cè)量XYN—30/XynlOA的最適溫度，并添加BSA(100微克/毫升)作為穩(wěn)定劑。圖9.于55及60'C下以嗜熱性酶的混合物(混合物l)與里氏木霉酶水解經(jīng)清洗的汽爆的云杉纖維(10毫克/毫升)。酶劑量以FPU/克底物干物質(zhì)的劑量給予，F(xiàn)PU于5(TC、pH5下分析。于pH5下攪拌水解達(dá)72小時(shí)。結(jié)果以三次單獨(dú)測(cè)量的平均值(土標(biāo)準(zhǔn)差)表示。圖10.于45、55及57.5t:下以嗜熱性酶的混合物(混合物2)及里氏木霉酶水解經(jīng)汽爆的玉米桿(10毫克/毫升)。用于"混合物2"的酶劑量為5FPU/克的底物干物質(zhì)，及里氏木霉酶的酶劑量為5FPU/克Celluclast干物質(zhì)添加100nkat/克Novozym188干物質(zhì)(濾紙活性于50'C、pH5下測(cè)定)。于pH5下伴隨攪拌進(jìn)行水解達(dá)72小時(shí)。結(jié)果以三次單獨(dú)測(cè)量的平均值(士標(biāo)準(zhǔn)差)表示。該底物包含可溶性還原糖(約0.7毫克/毫升)。此背景糖含量從水解過(guò)程中形成的還原糖中減去。圖11.于45、55及60'C下以包含得自金黃色嗜熱子囊菌的新穎嗜熱性木聚糖酶的嗜熱性酶混合物(混合物3)及里氏木霉酶水解經(jīng)汽爆的玉米桿(10毫克/毫升)。"混合物3"的酶劑量為5FPU/克底物干物質(zhì)，里氏木霉酶的酶劑量為5FPU/克Celluclast干物質(zhì)添加100nkat/克Novozym188干物質(zhì)(濾紙活性于5(TC、pH5下測(cè)定)。于pH5下伴隨攪拌進(jìn)行水解達(dá)72小時(shí)。結(jié)果以三次單獨(dú)測(cè)量的平均值(±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。該底物包含可溶性還原糖(約0.7毫克/毫升)。此背景糖含量從水解期間所形成的還原糖中減去。圖12.于45、55及6(TC下以包含得自金黃色嗜熱子囊菌的新穎嗜熱性木聚糖酶XYN—30/XynlOA的嗜熱性酶混合物(混合物3)及里氏木霉酶水解經(jīng)汽爆的云杉纖維(10毫克/毫升)。"混合物3"的酶劑量為5FPU/克底物干物質(zhì)，里氏木霉酶的酶劑量為5FPU/克Celluclast干物質(zhì)添加100nkat/克Novozym188干物質(zhì)(濾紙活性于50°C、pH5下測(cè)定)。于pH5下伴隨攪拌進(jìn)行水解達(dá)72小時(shí)。結(jié)果以三次單獨(dú)測(cè)量的平均值(士標(biāo)準(zhǔn)差)表示。圖13.葡萄糖對(duì)于不同e-葡萄糖苷酶制劑活性的影響D使用對(duì)硝基苯基-P-D-吡喃葡糖苷為底物的標(biāo)準(zhǔn)分析于分析混合物中存在葡萄糖時(shí)進(jìn)行。該活性以沒(méi)有葡萄糖時(shí)所得到的活性的百分比表示。圖14.從50至7(TC的溫度下酶混合物的FPU活性，以標(biāo)準(zhǔn)條件下(50°C，l小時(shí))的活性的百分比表示。圖15.兩種不同里氏木霉菌株的相對(duì)纖維素酶活性，該菌株生長(zhǎng)于含未處理的Nutriose(NO)或經(jīng)BG—81/Cel3A預(yù)處理的Nutriose(NBG81)作為碳源的培養(yǎng)基中。本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明纖維素是高等植物的主要結(jié)構(gòu)成分。其提供植物細(xì)胞高抗張強(qiáng)度，幫助它們抵抗機(jī)械應(yīng)力及滲透壓。纖維素是一種e-l,4-葡聚糖，其由通過(guò)P-1，4-糖苷鍵連接的葡萄糖殘基直鏈組成。纖維二糖是纖維素最小的重復(fù)單位。在細(xì)胞壁中纖維素被堆疊成不同方向的板層，其包埋于半纖維素及木質(zhì)素的基質(zhì)中。半纖維素是碳水化合物聚合物的異質(zhì)性類型，其主要包含不同的葡聚糖、木聚糖及甘露聚糖。半纖維素由線性骨架組成，其中e-l,4-連接殘基被通常包含乙?；⑵咸烟侨┧峄?、阿拉伯糖基及半乳糖基的短側(cè)鏈取代。半纖維素可以化學(xué)方式與木質(zhì)素交聯(lián)。木質(zhì)素是各種取代的對(duì)羥苯基丙烷單位的復(fù)雜交聯(lián)聚合物，其提供細(xì)胞壁強(qiáng)度以承受機(jī)械應(yīng)力，同時(shí)可保護(hù)纖維素不受酶水解。木質(zhì)纖維素是纖維素和半纖維素與苯酚丙醇單位的聚合物和木質(zhì)素的組合物。其物理性質(zhì)堅(jiān)硬、密實(shí)且不易受影響，為生物圈中含量最豐富的生化材料。含木質(zhì)纖維素的材料的實(shí)例為硬木及軟木屑、木漿、鋸屑及林木業(yè)廢棄物；農(nóng)業(yè)生物質(zhì)如谷類未桿、甜菜渣、玉米桿及穗軸、甘蔗渣、莖、葉、皮、殼等；廢棄物品如都市固體廢棄物、報(bào)紙及辦公室廢紙、例如谷粒的研磨廢料；專用能源作物(例如柳木、楊木、柳枝稷(switchgmss)或草蘆等)。優(yōu)選實(shí)例為玉米桿、柳枝稷、谷類禾桿、甘蔗渣及木材衍生材料。本文所使用的"纖維素材料"涉及任何包含纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)纖維素以為重要成分的材料。"木質(zhì)纖維素材料"是指任何包含木質(zhì)纖維素的材料。這類材料是例如植物材料如包括軟木及硬木的木材、草本作物、農(nóng)業(yè)殘余物、紙漿及造紙殘余物、廢紙、食物及詞料業(yè)廢棄物等。紡織纖維諸如棉、源自棉、亞麻、大麻、黃麻的纖維及人造纖維素纖維如木代爾(modal)、黏膠(viscose)、天絲(lyocell)是纖維素材料的特定例子。纖維素材料在自然界中會(huì)被很多不同的生物體包括細(xì)菌及真菌分解。纖維素通常由不同纖維素酶相繼或同時(shí)作用分解。纖維素經(jīng)生物轉(zhuǎn)換成葡萄糖通常需要三種類型的水解酶(1)切斷內(nèi)部3-l,4-糖苷鍵的內(nèi)切葡聚糖酶；(2)從纖維素聚合物鏈末端切割雙糖纖維二糖的外切型纖維二糖水解酶；(3)水解纖維二糖及其它短纖維寡糖成為葡萄糖的e-葡萄糖苷酶。換句話說(shuō)，三種主要類型的纖維素酶為纖維二糖水解酶(CBH)、內(nèi)切葡聚糖酵(EG)及e-葡萄糖苷酶(BG)。包含底物的更復(fù)雜纖維素的分解需要廣泛的各種酶。舉例來(lái)說(shuō)，木質(zhì)纖維素是由半纖維素酶如木聚糖酶及甘露聚糖酶分解。半纖維素酶是一種水解半纖維素的酶。"纖維素分解酶"為具有"纖維素分解活性"的酶，這表示它們能夠?qū)⒗w維素底物或其衍生物水解成較小的糖。因此纖維素分解酶包括纖維素酶及半纖維素酶。本文所使用的纖維素酶包括纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶及P-葡萄糖苷酶。里氏木霉具有著名且有效的纖維素酶系統(tǒng)，其包含兩個(gè)CBH、兩個(gè)主要及一些次要的EG及BG。里氏木霉CBHI(Cel7A)自纖維素鏈的還原端切割糖，并具有C端纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)且可能構(gòu)成多達(dá)60%的總分泌蛋白質(zhì)。里氏木霉CBHII(Cel6A)自纖維素鏈的非還原端切割糖，并具有N端纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域且可能構(gòu)成多達(dá)20%的總分泌蛋白質(zhì)。內(nèi)切葡聚糖酶EGI(Cd7B)及EGV(Cel45A)于C端具有CBD，EGII(Cel5A)具有N端CBD而EGIII(Cell2A)根本沒(méi)有纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。CBHI、CBHII、EGI及EGII也稱為木霉菌的"主要纖維素酶"，共占總分泌蛋白質(zhì)的80至90%。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，一種酶可能對(duì)幾種底物有活性且酶活性可利用不同底物、方法及條件測(cè)定。鑒別不同的纖維素分解活性討論于例如vanTilbeurgh等人1988。除了表達(dá)纖維素分解活性的催化結(jié)構(gòu)域/核心之外，纖維素分解酶可能包含一或多種纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)，亦稱為碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域/組件(CBD/CBM)，其可位于催化結(jié)構(gòu)域的N或C端。CBD具有碳水化合物結(jié)合活性且介導(dǎo)纖維素酶與結(jié)晶纖維素結(jié)合，但是對(duì)該酶對(duì)于可溶性底物的纖維素酶水解活性的影響很少或沒(méi)有。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域通常通過(guò)柔性且高度糖基化的接頭區(qū)域連接。本文使用的"纖維二糖水解酶"或"CBH"是指自葡萄糖鏈末端切割纖維素且主要產(chǎn)生纖維二糖的酶。它們也稱為1,4-e-D-葡聚糖纖維二糖水解酶或纖維素-l，4-P-纖維二糖酶。它們從包含1,4-e-D-糖苷鍵的聚合物如纖維素的還原或非還原端水解該鍵，從而釋出纖維二糖。從里氏木霉已分離出兩種不同的CBH，CBHI和CBHII。它們具有由連接纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)的催化結(jié)構(gòu)域所組成的模塊結(jié)構(gòu)。自然界中亦有缺乏CBD的纖維二糖水解酶。"內(nèi)切葡聚糖酶"或"EG"是指切斷纖維素鏈內(nèi)部糖苷鍵的酶。它們被分類為EC3.2丄4。它們是1,4-P-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶且催化葡萄糖聚合物如纖維素及其衍生物中1,4-e-D-糖苷鍵的內(nèi)切水解。有些天然存在的內(nèi)切葡聚糖酶具有纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其它則沒(méi)有。有些內(nèi)切葡聚糖酶也具有木聚糖酶活性(Bailey等人，1993)。"e-葡萄糖苷酶"或"BG"或"PG"是指將小的可溶性寡糖包括纖維二糖分解成葡萄糖的酶。它們分類為EC3.2丄21。它們是e-D-葡糖苷葡萄糖水解酶，通常催化末端非還原的e-D-葡萄糖殘基的水解。這些酶識(shí)別葡萄糖的寡糖。典型的底物為纖維二糖及纖維三糖。纖維二糖為纖維二糖水解酶的抑制劑，因此分解纖維二糖對(duì)于克服纖維二糖水解酶的終產(chǎn)物抑制而言很重要。木聚糖酶是能識(shí)別及水解半纖維素的酶，它們包括外切水解及內(nèi)切水解的酶。它們通常具有將半纖維素分解成木糖的內(nèi)切-l,4-P-木聚糖酶(EC3.2丄8)或P-D-木糖苷酶(EC3.2丄37)活性。與本發(fā)明有關(guān)的"木聚糖酶"或"Xyn"特別是指分類為EC3.2丄8的、水解木質(zhì)纖維素基體或純化木聚糖的木糖聚合物的酶。除此之外，纖維素酶可根據(jù)它們的主要序列分類為各種糖基水解酶家族，由家族一些成員的三維結(jié)構(gòu)分析得到支持(Henrissat1991,Henrissat和Bairoch1993,1996)。某些糖基水解酶為多功能性酶，其包含屬于不同糖基水解酶家族的催化結(jié)構(gòu)域。家族3由e-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)組成，諸如本文所述的TaBG—81、AtBG—101及CtBG—76。家族5(過(guò)去稱為celA)主要由內(nèi)切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)組成，諸如本文所述的TaEG—28。家族7(過(guò)去稱為纖維素酶家族celC)包含內(nèi)切葡聚糖酶(EC3.2丄4)及纖維二糖水解酶(EC3.2丄91)，諸如本文所述的CtEG—54、TaCBH、AtCBH—A、AtCBH—C及CtCBH。家族10(過(guò)去稱為celF)主要由木聚糖酶(EC3.2.1.8)組成，諸如本文所述的TaXYN—30及AtXYN_60。家族45(過(guò)去稱為celK)包含內(nèi)切葡聚糖酶(EC3.2丄4)，諸如本文所述的AtEG—40及AtEG—40一like。用于水解纖維素材料的纖維素分解酶可得自金黃色嗜熱子囊菌、嗜熱枝頂孢菌或嗜熱毛殼菌。"可得自"是指它們可以從所述物種得到，但是不排除從其它來(lái)源得到的可能性。換句話說(shuō)，它們可能源自任何有機(jī)體，包括植物。優(yōu)選它們?cè)醋晕⑸锢缂?xì)菌或真菌。該細(xì)菌可能例如來(lái)自選自芽胞桿菌屬(Bacillus)、固氮螺菌屬(Azospirillum)及鏈霉菌屬(Streptomyces)的類屬。更優(yōu)選該酶源自真菌(包括絲狀真菌及酵母菌)，例如來(lái)自選自嗜熱子囊菌屬、枝頂孢菌屬、毛殼菌屬、無(wú)毛毛殼菌屬(Achaetomium)、梭孢殼菌屬(Thielavia)、曲霉菌屬、葡萄孢屬(Botrytis)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、金錢菌屬(Collybia)、層孔菌屬(Fomes)、鐮孢屬(FUSarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、肉座菌屬(Hypocrea)、香蔬屬(Lentinus)、馬蘭諾菌屬(Melanocarpus)、毀絲霉屬、麥瑞菌屬(Myriococcum)、脈孢菌屬(Neurospora)、青霉菌屬(Penicillium)、毛平革菌屬(Phanerochaete)、射脈菌屬(Phlebia)、側(cè)耳屬(PleurotUS)、柄孢殼屬(Podospora)、絲核菌屬(Rhizoctonia)、西塔利菌屬(Scytalidium)、密孔菌屬(PycnoporUS)、栓菌屬(Trametes)及木霉菌屬。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，酶可得自保藏為CBS116239的金黃色嗜熱子囊菌菌株ALK04242、目前被歸類為嗜熱枝頂孢菌的保藏為CBS116240的菌株ALK04245、或保藏為CBS730.95的嗜熱毛殼菌菌株ALK04265。該纖維二糖水解酶優(yōu)選包含與SEQIDNO:2、4、6或8或與其酶活性片段具有至少80%同一性的氨基酸序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>這些CBHs相較于里氏木霉CBH具有優(yōu)勢(shì)的纖維素抑制常數(shù)，且當(dāng)以不同纖維素底物測(cè)試時(shí)，它們顯示改善的水解結(jié)果。SEQIDNO:2及4不包含CBD。當(dāng)纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)與本身不具有CBD的CBH連接時(shí)，則可獲得特別加強(qiáng)的水解結(jié)果。該CBD可得自例如木霉菌屬或毛殼菌屬物種，且優(yōu)選通過(guò)接頭與CBH連接。所形成的包含通過(guò)接頭與CBD連接的CBH核心區(qū)的融合蛋白可能包含與SEQIDNO:28或30具有至少80%同一性的氨基酸序列。包含SEQIDNO:27或29序列的多核苷酸編碼該融合蛋白。內(nèi)切葡聚糖酶可能包含與SEQIDNO:10、12、14或16或其酶活性片段具有至少80%同一性的氨基酸序列。這些內(nèi)切葡聚糖酶具有良好的熱穩(wěn)定性。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>P-葡萄糖苷酶可能包含與SEQIDNO:22、24或26或其酶活性片段具有至少80%同一性的氨基酸序列。這些e-葡萄糖苷酶對(duì)于葡萄糖抑制具有良好抗性，這有利于避免纖維素材料的酶法水解期間的終產(chǎn)物抑制。該e-葡萄糖苷酶可能也被用于制備槐糖(sophorose)，一種用于里氏木霉培養(yǎng)中的纖維素酶誘導(dǎo)物。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>木聚糖酶可能包含與SEQIDNO:18或20或其酶活性片段具有至少80%同一性的氨基酸序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>術(shù)語(yǔ)"同一性"在此是指兩個(gè)氨基酸序列之間從由對(duì)應(yīng)基因所編碼第一個(gè)氨基酸至最后一個(gè)氨基酸互相比較的整體同一性。全長(zhǎng)序列的同一性是利用EMBOSS(歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件；Rice等人，2000)程序包3.0.0版中的尼德曼-王氏(Needleman-Wunsch)整體比對(duì)程序測(cè)量，參數(shù)如下EMBLOSUM62，間隔罰分10.0,延長(zhǎng)罰分0.5。該算法在尼德曼-王氏(1970)中描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解這樣的事實(shí)，利用尼德曼-王氏算法所得到的結(jié)果僅在比對(duì)序列的對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)域時(shí)才是可比較的。因此例如包含CBD或信號(hào)序列的纖維素酶序列與缺乏這些元件的序列相比較是做不到的的。根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式，使用與SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26或至少與其酶活性片段具有至少80、85、90、95或99%同一性的纖維素分解多肽。術(shù)語(yǔ)"酶活性片段"是指具有纖維素分解活性的定義序列的任何片段。換句話說(shuō)，酶活性片段可能是該定義序列的成熟蛋白質(zhì)部分或可能只是成熟蛋白質(zhì)部分的片段，條件是其仍具有纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶、e-葡萄糖苷酶或木聚糖酶活性。優(yōu)選纖維素分解酶是重組酶，其可以用一般的已知方式生產(chǎn)。分離包含該酶基因的多核苷酸片段，將該基因插入表達(dá)載體中的強(qiáng)啟動(dòng)子下，該載體被轉(zhuǎn)移至適當(dāng)宿主細(xì)胞內(nèi)，且令該宿主細(xì)胞于激發(fā)該酶產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)。不同宿主系統(tǒng)中利用重組技術(shù)生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法是該領(lǐng)域所熟知的(Sambrook等,1989;Coen,2001;Gellissen,2005)。優(yōu)選該酶被產(chǎn)生成為分泌至培養(yǎng)基的胞外酶，這樣可方便酶的回收及分離。生產(chǎn)宿主的耗盡培養(yǎng)基可以就這樣用，或可以自其中除去宿主細(xì)胞，和/或可以濃縮、過(guò)濾或分餾該耗盡培養(yǎng)基。其也可被干燥。本文中分離的多肽可以僅表示細(xì)胞及細(xì)胞碎片已被從包含該多肽的培養(yǎng)基中除去。該多肽的分離可方便地通過(guò)例如向耗盡培養(yǎng)基中添加陰離子和/或陽(yáng)離子聚合物以促進(jìn)細(xì)胞、細(xì)胞碎片及一些具有無(wú)用副作用的酶沉積。接著該培養(yǎng)基利用無(wú)機(jī)過(guò)濾劑及濾器過(guò)濾，以除去形成的沉淀物。之后濾液利用半透膜進(jìn)一步處理以去除過(guò)量的鹽、糖及代謝產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方案，異源性多核苷酸包含的基因類似于登錄號(hào)DSM16723、DSM16728、DSM16729、DSM16727、DSM17326、DSM17324、DSM17323、DSM17729、DSM16724、DSM16726、DSM16725、DSM17325或DSM17667的微生物所包含的基因。該生產(chǎn)宿主可以是任何能夠表達(dá)纖維素分解酶的有機(jī)體。優(yōu)選該宿主是微生物細(xì)胞，更優(yōu)選是真菌。最優(yōu)選該宿主是絲狀真菌。優(yōu)選該重組宿主被修飾以表達(dá)及分泌纖維素分解酶，作為其主要活性或主要活性之一。這可通過(guò)刪除主要的同源分泌基因例如木霉菌的四個(gè)主要纖維素酶和通過(guò)將異源性基因打靶到已經(jīng)修飾以確保高表達(dá)及生產(chǎn)濃度的基因座中達(dá)成。用于生產(chǎn)纖維素分解酶的優(yōu)選宿主特別是來(lái)自木霉菌屬或曲霉菌屬的菌株?？梢蕴砑用阜ㄓ行Я康母鶕?jù)本發(fā)明水解纖維素材料所需的酶，或同時(shí)，例如以酶混合物的形式，或相繼，或作為同步糖化及發(fā)酵(SSF)的一部分。任何包含與SEQIDNO:2、4、6或8或與其酶活性片段具有至少80%同一性的氨基酸序列的纖維二糖水解酶組合物可以與內(nèi)切葡聚糖酶及P-葡萄糖苷酶的任何組合物一起使用。如果該纖維素材料包含半纖維素，將額外使用半纖維素酶，優(yōu)選木聚糖酶以供分解。內(nèi)切葡聚糖酶、e-葡萄糖苷酶及木聚糖酶可能選自本文所描述者，但不限于此。它們也可以是例如商品化的酶制劑。除了纖維素酶及任選的半纖維素酶之外，還可以使用一或多種其它酶，例如蛋白酶、淀粉酶、漆酶、脂肪酶、果膠酶、酯酶和/或過(guò)氧化物酶。其它酶處理可以在纖維素酶處理之前、之中或之后進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)"酶制劑"表示包含至少一種所需酶的組合物。該制劑可包含至少為部分純化和分離形式的酶。其可以甚至基本上由所需的酶組成。或者該制劑可以為包含一或多種纖維素分解酶的耗盡培養(yǎng)基或?yàn)V液。除纖維素分解活性之外，該制劑可包含添加物，諸如媒介物、穩(wěn)定劑、緩沖劑、防腐劑、表面活性劑和/或培養(yǎng)基成分。優(yōu)選的添加劑為該些通常用于供特定應(yīng)用的酶制劑中者。該酶制劑可以是液體、粉末或顆粒的形式。該酶制劑優(yōu)選為耗盡培養(yǎng)基。"耗盡培養(yǎng)基"是指包含所產(chǎn)生的酶的宿主的培養(yǎng)基。優(yōu)選該宿主細(xì)胞于生產(chǎn)后與所述培養(yǎng)基分離。根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方案，酶制劑包含CBH、EG及BG的混合物，任選加上木聚糖酶和/或其它酶。CBH包含與SEQIDNO:2、4、6或8或與其酶活性片段具有至少80%同一性的氨基酸序列，且其可得自金黃色嗜熱子囊菌、嗜熱枝頂孢菌或嗜熱毛殼菌，然而EG、BG及木聚糖酶可能來(lái)自任何來(lái)源包括來(lái)自所述有機(jī)物?？赡艽嬖谟谥苿┑钠渌笧槔绲鞍酌?、淀粉酶、漆酶、脂肪酶、果膠酶、酯酶和/或過(guò)氧化物酶。不同的酶混合物及組合物可用來(lái)配合不同的處理?xiàng)l件。舉例來(lái)說(shuō)，如果分解過(guò)程是在高溫下進(jìn)行，則選擇熱穩(wěn)定性酶。家族7的CBH與家族45的內(nèi)切葡聚糖酶的組合物，任選與家族3的BG和/或家族10的木聚糖酶組合，于45'C及升高的溫度下均具有出色的水解性能。里氏木霉的纖維素分解酶于水解時(shí)常規(guī)用于約40至5(TC的溫度范圍內(nèi)，且于SSF時(shí)為30至40'C?？傻米越瘘S色嗜熱子囊菌、嗜熱枝頂孢菌或嗜熱毛殼菌的CBH、EG、BG及Xyn在這些溫度下也有效，但除此之外它們大部分在介于50至75°C、或甚至高達(dá)80和85°C的溫度下亦非常有效，諸如介于55至70。C，例如介于60至65"C。對(duì)于短暫孵育時(shí)間而言，酶混合物在甚至高達(dá)85X:仍有作用，至于完全水解通常使用較低溫度。以CBH、EG、BG及Xyn處理纖維素材料的方法特別適用于自木質(zhì)纖維素材料生產(chǎn)可發(fā)酵糖。該可發(fā)酵糖接著利用酵母菌發(fā)酵成為乙醇，并且作為燃料使用。它們亦可作為用于化工過(guò)程例如所謂生物煉制中生產(chǎn)各種化學(xué)物質(zhì)或結(jié)構(gòu)單元的中間物或原料。木質(zhì)纖維素材料在酶法水解之前可預(yù)處理以破壞纖維素底物的纖維結(jié)構(gòu)，并使纖維素成分更容易接觸纖維素分解酶。目前的預(yù)處理包括機(jī)械性、化學(xué)性或熱處理方法及其組合。該材料可以例如通過(guò)汽爆或酸水解預(yù)處理。很多新穎的纖維素分解多肽可見(jiàn)于金黃色嗜熱子囊菌、嗜熱枝頂孢菌及嗜熱毛殼菌。該新穎的多肽可包含具有纖維素分解活性且選自包含氨基酸序列的多肽的片段，所述氨基酸序列至少與SEQIDNO:4具有66%、優(yōu)選為70%或75%的同一性，與SEQIDNO:6具有79%同一性，與SEQIDNO:12具有78%同一性，與SEQIDNO:14具有68%、優(yōu)選為70%或75%同一性，與SEQIDNO:16具有72%、優(yōu)選為75%的同一性，與SEQIDNO:20具有68%、優(yōu)選為70%或75%同一性，與SEQIDNO:22或24具有74X同一性或與SEQIDNO:26具有78%同一性。該新穎多肽也可以使所述多肽的變異體。"變異體"可以是同菌株、種或?qū)僦刑烊话l(fā)生成為例如等位變異體的多肽，或可以通過(guò)突變產(chǎn)生。其可包含氨基酸取代、刪除或插入，但仍與上述定義的酶以基本上類似的方式發(fā)揮作用，也就是包含具有纖維素分解活性的片段。該纖維素分解多肽通常作為包含信號(hào)序列的不成熟多肽于細(xì)胞中產(chǎn)生，該信號(hào)序列于蛋白質(zhì)分泌過(guò)程中被切割。它們的N端和/或C端都可能于分泌時(shí)被進(jìn)一步處理以得到成熟、具有酶活性的蛋白質(zhì)。因此"包含具有纖維素分解活性的片段"的多肽是指該多肽可以是不成熟或成熟形式，優(yōu)選為成熟形式，也就是經(jīng)過(guò)處理。該新穎多肽可進(jìn)一步為上述"多肽或變異體的片段"。該片段可以是上述蛋白質(zhì)的成熟形式，或其可以只是該成熟蛋白質(zhì)的酶活性部分。根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方案，該多肽具有與SEQIDNO:4、6、12、14、16、20、22、24或26或與其纖維素分解活性片段具有至少80、85、90、95或99%同一性的氨基酸序列。其亦可以為變異體，或其具有纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶、木聚糖酶或e-葡萄糖苷酶活性的片段。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，該多肽基本由SEQIDNO:4、6、12、14、16、20、22、24或26序列的纖維素分解活性片段組成。該新穎的多核苷酸可以包含SEQIDNO:3、5、11、13、15、19、21、23或25的核苷酸序列或編碼上述新穎多肽的序列，包括其互補(bǔ)鏈。本文所使用的多核苷酸是指RNA及DNA，且其可以為單鏈或雙鏈。該多核苷酸也可以是包含至少20個(gè)核苷酸、例如至少25、30或40個(gè)核苷酸的所述多核苷酸的片段。根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方案，其長(zhǎng)度至少為100、200或300個(gè)核苷酸。另外該多核苷酸可以因基因密碼而與上述定義的任一序列簡(jiǎn)并。這表示不同的密碼子可以編碼相同的氨基酸。根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施例方案，多核苷酸"包含于"SEQIDNO:3、5、11、13、15、19、21、23或25中，這表示該序列具有上述序列的至少部分。根據(jù)本發(fā)明的另一種實(shí)施方案，該多核苷酸包含的基因類似于登錄號(hào)DSM16728、DSM16729、DSM17324、DSM17323、DSM17729、DSM16726、DSM16725、DSM17325或DSM17667的微生物所包含的基因。該新穎蛋白質(zhì)/多肽可以如上述制備。該新穎多核苷酸被插入載體中，其能夠表達(dá)由異源性序列編碼的多肽，且該載體可以被插入能夠表達(dá)所述多肽的宿主細(xì)胞中。該宿主細(xì)胞優(yōu)選為木霉菌屬或曲霉菌屬。編碼該新穎多肽的異源性基因被導(dǎo)入登錄號(hào)為DSM16728、DSM16729、DSM17324、DSM17323、DSM17729、DSM16726、DSM16725、DSM17325或DSM17667的大腸桿菌菌株中的質(zhì)粒上。該新穎的酶可以是酶制劑的成分。該酶制劑可以包含一或多種新穎的多肽，且其可以例如耗盡培養(yǎng)基、粉末、顆?；蛞后w的形式。根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方案，其包含纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶、P-葡萄糖苷酶及任選的木聚糖酶活性和/或其它酶活性。其可以進(jìn)一步包含任何常規(guī)添加劑。該新穎的酶可被用于任何與纖維素分解酶有關(guān)的工藝，諸如于燃料、紡織、清潔劑、紙漿和造紙、食品、詞料或飲料工業(yè)上，特別是用于水解纖維素材料以供生產(chǎn)包含乙醇的生物燃料。在紙漿和造紙工業(yè)上，它們可被用于修飾纖維素纖維例如處理牛皮紙漿、機(jī)械紙漿或回收紙。本發(fā)明由下列非限制性實(shí)施例說(shuō)明。然而應(yīng)了解的是，上述說(shuō)明及實(shí)施例中給出的實(shí)施方案僅供說(shuō)明之用，且在本發(fā)明的范圍內(nèi)各種改變及修飾皆是有可能的。實(shí)施例實(shí)施例1.篩選表達(dá)纖維素分解活性的菌株及其培養(yǎng)供純化測(cè)試約25個(gè)來(lái)自羅爾(RoalOy)菌種保藏中心的真菌菌株的纖維素分解活性包括e-葡萄糖苷酶。經(jīng)過(guò)初步篩選，選出6個(gè)菌株供進(jìn)一步試驗(yàn)。它們是金黃色嗜熱子囊菌ALK04239及ALK04242、嗜熱枝頂孢菌ALK04245、嗜熱籃狀菌ALK04246及嗜熱毛殼菌ALK04261及ALK04265。菌株ALK04239、ALK04242及ALK04246于搖瓶中以3XB培養(yǎng)基42t:培養(yǎng)7天，包含(克/升)SolkaFloc纖維素18、酒糟18、斯佩爾特燕麥木聚糖9、碳酸鈣2、豆粉4.5、(NH4)HP044.5、小麥麩皮3.0、磷酸二氫鉀1.5、水合硫酸鎂1.5、氯化鈉0.5、硝酸鉀0.9、刺槐豆膠9.0、微量元素溶液#10.5、微量元素溶液#20.5及Struktol(Stow，OH，USA)消泡劑0.5毫升；pH調(diào)至6.5。微量元素溶液弁l含(克/升)硫酸錳1.6、七水硫酸鋅3.45及六水氯化鈷2.0;微量元素溶液#2含(克/升)七水硫酸鐵5.0及兩滴濃硫酸。菌株ALK04261于搖瓶中以1XB培養(yǎng)基培養(yǎng)，其具有3XB培養(yǎng)基(上述)各成分的1/3，但碳酸鈣、氯化鈉及微量元素的濃度相同。該菌株于45'C下培養(yǎng)7天。菌株ALK04265于搖瓶中以下列培養(yǎng)基培養(yǎng)，克/升SolkaFloc纖維素40、Pharmamedia(TradersProtein，Memphis，TN，USA)10、玉米漿粉5、硫酸銨5及磷酸二氫鉀15;pH調(diào)至6.5。該菌株于45'C下培養(yǎng)7天。培養(yǎng)后的細(xì)胞及其它固體經(jīng)離心收集且回收上清液。為了搖瓶培養(yǎng)，分別添加蛋白酶抑制劑PMSF(苯甲基磺酰氟)及抑胃肽至1毫摩爾和10微克/毫升。若非立即使用，將該制劑分裝儲(chǔ)存于-2(TC下。為了評(píng)估該酶的熱活性，在作為穩(wěn)定劑的100微克牛血清白蛋白(BSA)/毫升存在下，于50°C、60°C、65°C、70。C及75。C下對(duì)該搖瓶培養(yǎng)的制備物進(jìn)行1小時(shí)的分析。初步分析于50'C及65'C下以兩種不同的pH值(4.8/5.0或6.0)進(jìn)行，以確認(rèn)哪一個(gè)pH更適合熱活性分析。所有搖瓶上清液進(jìn)行下列活性的分析類纖維二糖水解酶I活性("CBHI")及類內(nèi)切葡聚糖酶I活性("EGI"):這些在50毫摩爾的乙酸鈉緩沖液中測(cè)量，以0.5毫摩爾的MUL(4-甲基傘形酮基-i3-D-乳糖苷糖)作為底物。添加葡萄糖(IOO毫摩爾)以抑制任何干擾性P-葡萄糖苷酶活性。于370納米處測(cè)定釋出的4-甲基傘形酮基。通過(guò)測(cè)量纖維二糖(5毫摩爾)存在及不存在時(shí)的活性來(lái)區(qū)分"CBHI"及"EGI"活性。未被纖維二糖抑制的活性代表"EGI"活性，其余的MUL活性代表"CBHI"活性(vanTilbeurgh等，1988)。該分析于pH5.0或6.0進(jìn)行(見(jiàn)下述)。內(nèi)切葡聚糖酶(CMCase)活性基本上按照Bailey和Nevalainen1981;Haakana等2004所述，以2%(重量/體積)的羧甲基纖維素(CMC)作為底物于50毫摩爾檸檬酸鹽緩沖液中分析。還原糖以DNS試劑測(cè)定。分析于pH4.8或6.0進(jìn)行(見(jiàn)下述)。e-葡萄糖苷酶(BGU)活性如Bailey和Nevalainen1981所述，以4-硝基苯基-j8-D-吡喃葡糖苷(l毫摩爾)于50毫摩爾檸檬酸鹽緩沖液中分析。于400納米處測(cè)定釋出的4-硝苯苯酚。該分析于pH4.8或6.0進(jìn)行(見(jiàn)下述)。酶的相對(duì)活性如圖1所示。該相對(duì)活性的表示是以60'C的活性設(shè)定為100%(圖1)。所有菌株皆產(chǎn)生酶，所述酶于高溫下(65卩至75'C)具有高活性。在蛋白質(zhì)純化方面，ALK04242亦于2升生物反應(yīng)器中(BraunBiostat⑧B，Braun，Melsungen，德國(guó))生長(zhǎng)于下列培養(yǎng)基(克/升)中SolkaFloc纖維素40、豆粉IO、硝酸銨5、磷酸二氫鉀5、七水硫酸鎂0.5、二水氯化鈣0.05、微量元素溶液弁10.5、微量元素溶液#20.5。通氣量為lvvm，以Stmktol控制消泡，攪拌200至800rpm及溫度為47°C。運(yùn)行二個(gè)批次，一批的pH值為4.7士0.2(氨氣/硫酸)，另一批的初始pH為4.5。培養(yǎng)時(shí)間為7天。培養(yǎng)后的細(xì)胞及其它固體經(jīng)離心去除。菌株ALK04245于2升生物反應(yīng)器中(BraunBiostatB，Braun，Melsungen,德國(guó))生長(zhǎng)于下列培養(yǎng)基中，克/升SolkaFloc纖維素40、玉米漿粉15、酒糟5、斯佩爾特燕麥木聚糖3、刺槐豆膠3、硫酸銨5及磷酸二氫鉀5。pH的范圍為5.2土0.2(氨氣/硫酸)，通氣量lvvm，以300至600rpm攪拌，以Struktol控制消泡及溫度為42°C。培養(yǎng)時(shí)間為4天。培養(yǎng)后的細(xì)胞及其它固體經(jīng)離心去除。在酶純化方面，ALK04261于10升的生物反應(yīng)器中(BraunBiostatED，Braun,Melsungen,德國(guó))生長(zhǎng)于下列培養(yǎng)基中，克/升SolkaFloc纖維素30、酒糟10、斯佩爾特燕麥木聚糖5、碳酸鈣2、豆粉10、小麥麩皮3.0、硫酸銨5、磷酸二氫鉀5、七水硫酸鎂0.5、氯化鈉0.5、硝酸鉀0.3、微量元素溶液#10.5及微量元素溶液#20.5。pH值范圍為5.2±0.2(氨氣/硫酸)，通氣量lvvm，以200至600rpm攪拌，以Struktol控制消泡及溫度為42°C。培養(yǎng)時(shí)間為5天。第二批以類似條件生長(zhǎng)，除了SolkaFloc添加至40克/升及酒糟加至15克/升。上清液經(jīng)離心回收，且通過(guò)Seitz-K150及EK濾紙(PallSeitzSchenkFiltersystemsGmbH,BadKreuznach,德國(guó))過(guò)濾。之后上清液利用Pellicon微細(xì)超過(guò)濾系統(tǒng)(濾紙NMWL10kDa;Millipore，Billerica，MA，USA)濃縮約10倍。在酶純化方面，ALK04265亦于10升的生物反應(yīng)器中(BraunBiostatED，Braun,Melsungen，德國(guó))在與上述相同的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，除了磷酸二氫鉀添加至2.5克/升。pH值范圍為5.3±0.3(氨氣/磷酸)，通氣量0.6vvm，以500rpm攪拌，以Struktol控制消泡及溫度為43°C。培養(yǎng)時(shí)間為7天。上清液經(jīng)離心回收，且通過(guò)Seitz-K150及EK濾紙過(guò)濾(PallSeitzSchenkFiltersystemsGmbH，BadKreuznach，德國(guó))。之后上清液利用Pellicon微細(xì)超過(guò)濾系統(tǒng)(濾紙NMWL10kDa;Millipore，Billerica，MA，USA)濃縮約20倍。實(shí)施例2.純化及表征來(lái)自嗜熱枝頂孢菌ALK04245及嗜熱毛殼菌ALK04265的纖維二糖水解酶嗜熱枝頂孢菌ALK04245及嗜熱毛殼菌ALK04265按實(shí)施例1所述生長(zhǎng)。主要的纖維二糖水解酶利用對(duì)氨基芐基l-硫基-e-纖維二糖苷-基親和柱純化，按Tomme等.，1988所述制備。培養(yǎng)上清液先緩沖成50毫摩爾的乙酸鈉緩沖液pH5.0，含1毫摩爾s-葡萄糖酸內(nèi)酯及o.i摩爾葡萄糖以阻止e-葡萄糖苷酶存在時(shí)配體水解。纖維二糖水解酶以0.1摩爾乳糖洗脫，且最后利用AKTA系統(tǒng)AmershamPharmaciaBiotech)的Superdex200HR10/30柱(，以凝膠過(guò)濾色譜法純化。凝膠過(guò)濾法中所使用的緩沖液為50毫摩爾磷酸鈉pH7.0，其包含0.15摩爾氯化鈉。純化的纖維二糖水解酶以SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，且根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)(低分子量校正試劑盒，AmershamBiosciences)評(píng)估的兩個(gè)蛋白質(zhì)的分子量均被確定為約70kDa。純化的枝頂孢菌及毛殼菌纖維二糖水解酶遵照Henrissat等人的方案(1998)(Henrissat,1991;Henrissat和Bairoch,1993)，分別被命名為AtCel7A及CtCel7A。該制劑的比活度利用4-甲基傘形酮基-e-D-乳糖苷(MUL)、4-甲基傘形酮基-e-D-纖維二糖苷(MUG2)或4-甲基傘形酮基-P-D-纖維三糖苷(MUG3)作為底物(vanTilbeurgh等，1988)，于0.05摩爾檸檬酸鈉緩沖液pH5中于5(TC下10分鐘測(cè)定的。內(nèi)切葡聚糖酶及木聚糖酶活性利用羧甲基纖維素(CMC)及樺木葡糖醛酸木聚糖(Bailey等.，1992)作為底物，以標(biāo)準(zhǔn)程序(根據(jù)IUPAC，1987)測(cè)定。根據(jù)與1%底物及0.25微摩爾酶劑量于50"、pH5.0進(jìn)行24小時(shí)反應(yīng)所形成的還原糖，計(jì)算對(duì)Avicel的比活度。根據(jù)Lowry等，1951所述測(cè)量純化酶制劑的蛋白質(zhì)含量。為了表征水解的終產(chǎn)物，以高效液相色譜(Dionex)分析如上述于24小時(shí)水解試驗(yàn)中釋出的可溶性糖。里氏木霉經(jīng)純化的纖維二糖水解酶I(CBHI/Cel7A)被當(dāng)作參比。該純化的酶及里氏木霉CBHI/Cel7A的比活度列于表1。與里氏木霉CBHI/Cel7A比較，純化的AtCel7A及CtCel7A纖維二糖水解酶對(duì)于小的合成性底物具有較高的比活度。本文所公開的酶對(duì)Avicel明顯具有較高的比活度。純化的酶制劑對(duì)木聚糖及CMC的低活性可以是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)本身的性質(zhì)，或至少部分是因?yàn)闅堄嗟纳倭课廴拘悦浮Ｋ屑兓拿杆饫w維素的主要終產(chǎn)物為纖維二糖，其對(duì)纖維二糖水解酶是典型的。表1.純化的纖維二糖水解酶及里氏木霉的參比酶的比活度(nkat/毫克)(50。C，pH5.0，24小時(shí))<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>純化的纖維二糖水解酶的熱穩(wěn)定性于不同溫度下測(cè)定。該反應(yīng)利用4-甲基傘形酮基-P-D-乳糖苷糖作為底物，于0.1%BSA存在時(shí)于pH5.0下進(jìn)行60分鐘。嗜熱毛殼菌ALK04265CBH/Cel7A及嗜熱枝頂孢菌ALK04245CBH/Cel7A分別直到65'C及6(TC時(shí)穩(wěn)定。里氏木霉參比酶(CBHI/Cel7A)在到達(dá)55°C時(shí)維持100%活性。實(shí)施例3.純化和表征來(lái)自嗜熱枝頂孢菌ALK04245的內(nèi)切葡聚糖酶嗜熱枝頂孢菌ALK04245按實(shí)施例l所述生長(zhǎng)。培養(yǎng)上清液于70〔下孵育24小時(shí)，之后以超過(guò)濾濃縮。純內(nèi)切葡聚糖酶通過(guò)疏水交互作用及陽(yáng)離子交換色譜法然后以凝膠過(guò)濾連續(xù)純化得到。純化期間收集到的級(jí)分的內(nèi)切葡聚糖酶活性利用羧甲基纖維素(CMC)作為底物測(cè)定(IUPAC法1987)。利用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)BioRad分析試劑盒(Bio-RadLaboratories)測(cè)量蛋白質(zhì)含量。濃縮的培養(yǎng)上清液被施加于用含1摩爾硫酸銨的20毫摩爾磷酸鉀緩沖液pH6.0平衡的HiPrep16/10丁基FF疏水性相互作用柱。結(jié)合的蛋白質(zhì)以從上述緩沖液至5毫摩爾磷酸鉀pH6.0的線性梯度洗脫。收集級(jí)分并以上述方式測(cè)定內(nèi)切葡聚糖酶活性。內(nèi)切葡聚糖酶活性于120至15mS/cm的寬電導(dǎo)區(qū)域內(nèi)洗脫。組合的級(jí)分被施加于以8毫摩爾乙酸鈉pH4.5平衡的HiTrapSPXL陽(yáng)離子交換柱。結(jié)合的蛋白質(zhì)以平衡緩沖液中0至0.25摩爾氯化鈉的線性梯度洗脫。含有內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白質(zhì)在3至7mS/cm的電導(dǎo)區(qū)被洗脫。重復(fù)陽(yáng)離子交換色譜法且以冷凍干燥濃縮該蛋白質(zhì)洗脫物。溶解的樣品加樣到用含0.15摩爾氯化鈉的20毫摩爾磷酸鈉緩沖液pH7.0平衡的Superdex75HR10/30凝膠過(guò)濾管柱。主要的蛋白質(zhì)級(jí)分從滯留體積為13.3毫升的柱中被洗脫。通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳判斷該蛋白質(zhì)洗脫物為純的，且經(jīng)評(píng)估其分子量為40kDa。該名為AtEG—40的純化蛋白質(zhì)于5(TC下的比活度被測(cè)定為450nkat/mg(IUPAC法1987，使用CMC為底物)。純化的內(nèi)切葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性于不同溫度下測(cè)定。該反應(yīng)利用羧甲基纖維素作為底物，于O.l毫克/毫升BSA存在時(shí)于pH5.0下進(jìn)行60分鐘。嗜熱枝頂孢菌EG_40/Cel45A直到8CTC都穩(wěn)定。里氏木霉參比酶EGI(Cel7B)及EGII(Cel5A)分別于高達(dá)60。C及65。C時(shí)都維持100%活性。實(shí)施例4.純化來(lái)自嗜熱毛殼菌ALK04261的內(nèi)切葡聚糖酶嗜熱毛殼菌ALK04261按照實(shí)施例1所述生長(zhǎng)。純內(nèi)切葡聚糖酶通過(guò)用疏水交互作用及陽(yáng)離子交換色譜法繼以凝膠過(guò)濾連續(xù)純化得到。于純化期間收集的級(jí)分的內(nèi)切葡聚糖酶活性利用羧甲基纖維素(CMC)作為底物測(cè)定(IUPAC法1987)。培養(yǎng)上清液中添加硫酸銨以達(dá)到與含有1摩爾硫酸銨的20毫摩爾磷酸鉀pH6.0相同的電導(dǎo)性。該樣品被施加于用含1摩爾硫酸銨的20毫摩爾磷酸鉀pH6.0平衡的HiPrep16/10苯基FF疏水性柱。以20至0毫摩爾磷酸鉀pH6.0的線性梯度及之后以5毫摩爾磷酸鉀pH6.0和水進(jìn)行洗脫。結(jié)合的蛋白質(zhì)以0至6摩爾尿素的線性梯度洗脫。收集級(jí)分并以上述方式測(cè)定內(nèi)切葡聚糖酶活性。含內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白質(zhì)于尿素梯度剛開始時(shí)被洗脫。級(jí)分通過(guò)10DG柱(Bio-Rad)被合并、平衡成為16毫摩爾Tris-HClpH7.5(I=1.4mS/cm)，且施加于以20毫摩爾Tris-HClpH7.5平衡的HiTrapDEAEFF陰離子交換柱。結(jié)合的蛋白質(zhì)以平衡緩沖液中0至1摩爾氯化鈉的線性梯度洗脫。收集級(jí)分并如上述分析內(nèi)切葡聚糖酶活性。該蛋白質(zhì)于10至20mS/cm的范圍被洗脫。該樣品利用10DG柱(Bio-Rad)平衡至15毫摩爾乙酸鈉，且被施加到以20毫摩爾乙酸鈉pH4.5平衡的HiTrapSPXL陽(yáng)離子交換柱。蛋白質(zhì)以0至0.4摩爾乙酸鈉pH4.5的線性梯度洗脫。內(nèi)切葡聚糖酶活性在1至10mS/cm的范圍被洗脫。收集樣品經(jīng)冷凍千燥。該樣品被溶解于水中且施加到以含0.15摩爾氯化鈉的20毫摩爾磷酸鈉pH6.0平衡的Superdex75HR10/30凝膠過(guò)濾柱。收集級(jí)分且合并那些含有內(nèi)切葡聚糖酶活性的級(jí)分。以SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳判斷該蛋白質(zhì)洗脫物為純的，且根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)(預(yù)染色的SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)，BroadRange,Bio-Rad)評(píng)估其分子量為54kDa。該名為CtEG—54的純化蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)以PhastSystem(Pharmacia)測(cè)定約為5.5。實(shí)施例5.純化來(lái)自金黃色嗜熱子囊菌ALK04242的內(nèi)切葡聚糖酶金黃色嗜熱子囊菌ALK04242按照實(shí)施例1所述生長(zhǎng)。純內(nèi)切葡聚糖酶通過(guò)疏水相互作用及陰離子交換色譜法繼以凝膠過(guò)濾連續(xù)純化得到。于純化期間收集的級(jí)分的內(nèi)切葡聚糖酶活性利用羧甲基纖維素(CMC)作為底物確定(IUPAC法1987)。蛋白質(zhì)含量利用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)以BioRad分析試劑盒(Bio-RadLaboratories)測(cè)量。培養(yǎng)上清液被施加于以含有0.7摩爾硫酸銨的20毫摩爾磷酸鉀緩沖液pH6.0平衡的HiPrep16/10丁基疏水性相互作用柱。結(jié)合的蛋白質(zhì)以0.2摩爾硫酸銨(I=39mS/cm)洗脫。含有內(nèi)切葡聚糖酶活性的級(jí)分被組合并以超過(guò)濾濃縮。該樣品于10DG柱(Bio-Rad)中脫鹽并被施加于以15毫摩爾Tris-HCLpH7.0平衡的HiTrapDEAEFF陰離子交換柱。結(jié)合的蛋白質(zhì)于平衡緩沖液中以0至0.4摩爾氯化鈉的線性梯度洗脫。含有內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白質(zhì)在15至21mS/cm的電導(dǎo)區(qū)被洗脫。收集到的級(jí)分如上述合并及濃縮。樣品被施加于以含0.05摩爾氯化鈉的50毫摩爾乙酸鈉緩沖液pH5.0平衡的SephacrylS-100HR26/60凝膠過(guò)濾柱。從柱中洗脫含有內(nèi)切葡聚糖酶活性的蛋白質(zhì)級(jí)分，該柱具有對(duì)應(yīng)分子量16kDa的滯留體積。收集到的級(jí)分被合并、濃縮且重復(fù)凝膠過(guò)濾。以SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳判斷該蛋白質(zhì)洗脫物為純的，且評(píng)估其分子量為28kDa。該名為TaEG_28的純化蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在IEF凝膠(PhastSystem，Pha腦cia)中測(cè)定約為3.5。TaEG—28于5(TC下的比活度被測(cè)定為4290nkat/mg(IUPAC法1987，使用CMC為底物)。實(shí)施例6.純化和表征來(lái)自嗜熱枝頂孢菌ALK04245的e-葡萄糖苷酶嗜熱枝頂孢菌ALK04245按照實(shí)施例1所述生長(zhǎng)。純P-葡萄糖苷酶通過(guò)疏水相互作用及陰離子交換色譜法繼以凝膠過(guò)濾連續(xù)純化得到。純化期間收集到的級(jí)分的e-葡萄糖苷酶活性利用4-硝基苯基-P-D-吡喃葡糖苷作為底物測(cè)定(Bailey和Linko，1990)。蛋白質(zhì)含量利用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)BioRad分析試劑盒(Bio-RadLaboratories)湖!j量。該培養(yǎng)上清液被施加于以含l摩爾硫酸銨的20毫摩爾磷酸鉀緩沖液pH6.0平衡的HiPrep16/10苯基SepharoseFF疏水性相互作用柱。結(jié)合的蛋白質(zhì)于137至16mS/cm電導(dǎo)區(qū)中以從平衡緩沖液至5毫摩爾磷酸鉀的線性梯度洗脫。收集的級(jí)分被合并并經(jīng)超濾濃縮。該樣品于IODG柱(Bio-Rad)中脫鹽并被施加于以10毫摩爾磷酸鉀pH7.0平衡的HiTrapDEAEFF陰離子交換柱。結(jié)合的蛋白質(zhì)于1.5至12mS/cm電導(dǎo)區(qū)中以從平衡緩沖液至含0.25摩爾氯化鈉的相同緩沖液的線性梯度洗脫。如上述重復(fù)陰離子交換色譜，除了所使用的是4毫摩爾磷酸鉀緩沖液pH7.2。蛋白質(zhì)在6至9mS/cm的電導(dǎo)區(qū)被洗脫。含有P-葡萄糖苷酶活性的級(jí)分被收集、組合及濃縮。來(lái)自陰離子交換色譜的活性物質(zhì)被施加于以含0.15摩爾氯化鈉的20毫摩爾磷酸鈉pH6.5平衡的SephacrylS-300HR26/60柱。具有P-葡萄糖苷酶活性的蛋白質(zhì)以對(duì)應(yīng)分子量243kDa的滯留體積被洗脫。該蛋白質(zhì)以SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳判斷為純的，且其分子量被評(píng)估為101kDa。該名為AtPG—lOl的純化蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在IEF凝膠(PhastSystem，Pharmacia)中測(cè)定為5.6至4.9的范圍內(nèi)。AtgG—101于5(TC下的比活度被測(cè)定為1100nkat/mg(利用4-硝基苯基-P-D-吡喃葡糖苷作為底物，Bailey和Linko，1990)。純化的e-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性于不同溫度下測(cè)定。該反應(yīng)利用4-硝基苯基-e-D-吡喃葡糖苷作為底物，于0.1毫克/毫升BSA存在時(shí)在pH5.0下進(jìn)行60分鐘。嗜熱枝頂孢菌PG—101直到7(TC都是穩(wěn)定的。曲霉菌參比酶(Novozym188)于高達(dá)60'C時(shí)維持100%活性。實(shí)施例7.純化來(lái)自嗜熱毛殼菌ALK04261的P-葡萄糖苷酶嗜熱毛殼菌ALK04261按照實(shí)施例1所述生長(zhǎng)。純e-葡萄糖苷酶通過(guò)疏水相互作用、陰離子和陽(yáng)離子交換色譜法繼以凝膠過(guò)濾連續(xù)純化得到。于純化期間收集到的級(jí)分的P-葡萄糖苷酶活性利用4-硝基苯基-e-D-吡喃葡糖苷作為底物測(cè)定(Bailey和Linko,1990)。該培養(yǎng)上清液被施加于以含0.8摩爾硫酸銨的20毫摩爾磷酸鉀pH6.0平衡的HiPrep16/10苯基SepharoseFF疏水性相互作用柱。以從平衡緩沖液至3毫摩爾磷酸鉀pH6.0的線性梯度進(jìn)行洗脫，隨后以水及6摩爾尿素洗脫。具有e-葡萄糖苷酶活性的第一級(jí)分于80至30mS/cm電導(dǎo)區(qū)被洗脫。第二e-葡萄糖苷酶活性以6摩爾尿素洗脫。以尿素洗脫的活性級(jí)分在以IO毫摩爾Tris-HClpH7.0平衡的10DG柱(Bio-Rad)中被集合和脫鹽。經(jīng)脫鹽后，該樣品被施加于以15毫摩爾Tris-HClpH7.0平衡的HiTrapDEAEFF陰離子交換柱。蛋白質(zhì)不與柱結(jié)合而是于樣品裝填期間被洗脫。該通流級(jí)分在用7毫摩爾乙酸鈉pH4.5平衡的10DG柱(Bio-Rad)中脫鹽。來(lái)自陰離子交換色譜的樣品被施加于以10毫摩爾乙酸鈉PH4.5平衡的HiTrapSPFF陽(yáng)離子交換柱。結(jié)合的蛋白質(zhì)以10毫摩爾至400毫摩爾乙酸鈉pH4.5的線性梯度洗脫。收集在電導(dǎo)區(qū)6.5至12mS/cm中被洗脫的具有e-葡萄糖苷酶活性的級(jí)分，在以7毫摩爾乙酸鈉pH4.5平衡的10DG柱(Bio-Rad)中脫鹽并冷凍干燥。經(jīng)凍干的樣品稀釋到100微升水中并至于以含0.15摩爾氯化鈉的20毫摩爾磷酸鈉pH4.5平衡的Superdex75HF10/30凝膠過(guò)濾柱。P-葡萄糖苷酶活性于13.64毫升的滯留體積處被洗脫。收集到的級(jí)分被合并、冷凍干燥并溶解于水。以SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳判斷該蛋白質(zhì)為純的，且評(píng)估其分子量為76kDa。該蛋白質(zhì)被命名為CtPG一76。實(shí)施例8.純化和表征來(lái)自金黃色嗜熱子囊菌ALK04242的P-葡萄糖苷酶金黃色嗜熱子囊菌ALK04242按照實(shí)施例1所述生長(zhǎng)。純P-葡萄糖苷酶通過(guò)疏水相互作用、陰離子和陽(yáng)離子交換色譜法繼以凝膠過(guò)濾連續(xù)純化得到。于純化期間收集到的級(jí)分的e-葡萄糖苷酶活性利用4-硝基苯基-e-D-吡喃葡糖苷作為底物測(cè)定(Bailey和Linko,1990)。蛋白質(zhì)含量利用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)以BioRad分析試劑盒(Bio-RadLaboratories)領(lǐng)!l量。該培養(yǎng)上清液被施加于以含0.7摩爾硫酸銨的20毫摩爾磷酸鉀pH6.0平衡的HiPrep16/10苯基SepharoseFF疏水性相互作用柱。結(jié)合的蛋白質(zhì)以0.2摩爾硫酸銨至5毫摩爾磷酸鉀pH6.0的線性梯度洗脫。P-葡萄糖苷酶活性是于梯度期間電導(dǎo)區(qū)28.0至1.1mS/cm中洗脫的。級(jí)分合并并以超濾濃縮。該樣品于10DG柱(Bio-Rad)中脫鹽并施加于以20毫摩爾Tris-HClpH7.0平衡的HiTrapDEAEFF陰離子交換柱。該酶于平衡緩沖液中以0至0.2摩爾氯化鈉的線性梯度洗脫且以含0.4摩爾氯化鈉的20毫摩爾Tris-HCl延遲洗脫。在約10至30mS/cm電導(dǎo)區(qū)中洗脫的樣品以超濾濃縮并以IODG柱(Bio-Rad)脫鹽。該樣品被施加于以9毫摩爾乙酸鈉pH4.5平衡的HiTrapSPXL陽(yáng)離子交換柱。該酶以10至400毫摩爾乙酸鈉的線性梯度洗脫并利用400毫摩爾乙酸鈉pH4.5延遲洗脫。具有e-葡萄糖苷酶活性的蛋白質(zhì)在線性梯度期間于5.0至11.3mS/cm電導(dǎo)區(qū)中被廣泛洗脫。來(lái)自陽(yáng)離子交換色譜的活性物質(zhì)被施加于以含0.15摩爾氯化鈉的20毫摩爾磷酸鈉pH7.0平衡的S印hacrylS-300HR26/60柱。具有P-葡萄糖苷酶活性的蛋白質(zhì)以對(duì)應(yīng)分子量294kDa的滯留體積被洗脫。所收集的級(jí)分被合并、凍干并溶解于水。該蛋白質(zhì)通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析被判斷為純的，且其分子量被評(píng)估為81kDa，表示最可能的蛋白質(zhì)的單體形式。利用3至9等電點(diǎn)的凝膠進(jìn)行等電聚焦(IEF)。經(jīng)銀染色后，除了對(duì)應(yīng)等電點(diǎn)4.55的狹窄帶以外，等電點(diǎn)5.85以上的廣泛區(qū)域被染色。被命名為TaPG一81的純化蛋白質(zhì)于5(TC下的比活度利用4-硝基苯基-e-D-吡喃葡糖苷作為底物，經(jīng)測(cè)定為600nkat/mg(Bailey和Linko，1990)。純化的P-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性于不同溫度下測(cè)定。該反應(yīng)利用4-硝基苯基-e-D-吡喃葡糖苷作為底物，于0.1毫克/毫升BSA存在時(shí)在pH5.0下進(jìn)行60分鐘。金黃色嗜熱子囊菌0G—81直到75。C都穩(wěn)定。曲霉菌參比酶(Novozym188)于高達(dá)60'C時(shí)維持100%活性。實(shí)施例9.純化來(lái)自嗜熱枝頂孢菌ALK04245的木聚糖酶嗜熱枝頂孢菌ALK04245按照實(shí)施例1所述生長(zhǎng)。培養(yǎng)上清液于7(TC下孵育24小時(shí)，之后以超濾濃縮。純木聚糖酶通過(guò)疏水相互作用及陽(yáng)離子交換色譜法然后以凝膠過(guò)濾連續(xù)純化得到。木聚糖酶活性利用樺木木聚糖作為底物測(cè)定(IUPAC法1987)。利用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)以BioRad蛋白分析試劑盒(Bio-RadLaboratories)分析蛋白質(zhì)。濃縮的培養(yǎng)上清液被施加于以含1摩爾硫酸銨的20毫摩爾磷酸鉀緩沖液pH6.0平衡的HiPrep16/10丁基FF疏水性相互作用柱。結(jié)合的蛋白質(zhì)以從上述緩沖液至5毫摩爾磷酸鉀pH6.0的線性梯度洗脫。蛋白質(zhì)級(jí)分于120至15mS/cm的廣泛電導(dǎo)區(qū)域內(nèi)洗脫。來(lái)自疏水性相互作用柱的樣品被施加于以8毫摩爾乙酸鈉pH4.5平衡的HiTrapSPXL陽(yáng)離子交換柱。該蛋白質(zhì)不與該柱結(jié)合，而是于樣品裝填期間通流洗脫。此洗脫物經(jīng)超濾濃縮。如上述重復(fù)進(jìn)行疏水性色譜。收集未結(jié)合的蛋白質(zhì)并冷凍干燥。該溶解樣品被加樣到用含有0.15摩爾氯化鈉的20毫摩爾磷酸鈉緩沖液pH7.0平衡的Superdex75HR10/30凝膠過(guò)濾管。以11.2毫升滯留體積從柱中被洗脫的蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳判斷為純的。該純化蛋白質(zhì)的分子量根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)(預(yù)染色的SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)，BroadRange,Bio-Rad)評(píng)估為60kDa。該名為AtXYN—60的蛋白質(zhì)于5(TC下的比活度被測(cè)定為1800nkat/mg(IUPAC法1987，利用樺木木聚糖作為底物)。較之5(TC，相對(duì)活性于60t:增加約1.2倍及70。C下為1.65倍(IO分鐘，pH5.0)。對(duì)MUG2(4-甲基傘形酮基-P-D-纖維二糖苷)、MUL(4-甲基傘形酮基-e-D-乳糖苷)及MUG3(4-甲基傘形酮基-e-D-纖維三糖苷)的比活度分別為54、33及78nkat/mg(50°C,pH5.0，IO分鐘)。這與家族10木聚糖酶也顯示對(duì)芳基吡喃葡糖苷的活性的事實(shí)相一致(Biely等1997)。實(shí)施例10.純化來(lái)自金黃色嗜熱子囊菌ALK04242的木聚糖酶金黃色嗜熱子囊菌ALK04242按照實(shí)施例1所述生長(zhǎng)。純木聚糖酶通過(guò)疏水相互作用、陰離子及陽(yáng)離子交換色譜法然后以凝膠過(guò)濾連續(xù)純化得到。木聚糖酶活性利用樺木木聚糖作為底物測(cè)定(IUPAC法1987)。利用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)以BioRad蛋白分析試劑盒(Bio-RadLaboratories)分析蛋白質(zhì)。培養(yǎng)上清液被施加于以含0.7摩爾硫酸銨的20毫摩爾磷酸鉀緩沖液pH6.0平衡的HiPrep16/10苯基SepharoseFF疏水性相互作用柱。結(jié)合的蛋白質(zhì)以二步驟洗脫方案洗脫。先將鹽濃度降低至0.2摩爾硫酸銨，然后以含0.2摩爾硫酸銨的20毫摩爾磷酸鉀pH6.0至5毫摩爾磷酸鉀pH6.0的線性梯度進(jìn)行洗脫。該蛋白質(zhì)以0.2摩爾硫酸銨洗脫(I=39mS/cm)。該樣品于10DG柱(Bio-Rad)中脫鹽并被施加于以15毫摩爾Tris-HCLpH7.0平衡的HiTrapDEAEFF陰離子交換管柱。蛋白質(zhì)不與陰離子交換管柱結(jié)合而是通流洗脫。超濾濃縮期間，該樣品的電導(dǎo)率通過(guò)加水調(diào)至對(duì)應(yīng)20毫摩爾乙酸鈉pH4.5的電導(dǎo)性，且pH調(diào)至4.5。該樣品被施加于以20毫摩爾乙酸鈉pH4.5平衡的HiTrapSPXL陽(yáng)離子交換柱。結(jié)合的蛋白質(zhì)以該平衡緩沖液至含1摩爾氯化鈉的相同緩沖液的線性梯度洗脫。該酶于1至7mS/cm的電導(dǎo)區(qū)被洗脫。該樣品經(jīng)冷凍干燥且之后溶解于水。凍干樣品被溶解于水且施加于以含0.15摩爾氯化鈉的20毫摩爾磷酸鈉pH7.0平衡的Superdex75HR10/30凝膠過(guò)濾柱。該蛋白質(zhì)以對(duì)應(yīng)分子量26kDa的滯留體積自柱中被洗脫。該蛋白質(zhì)通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳判斷為純的。該純蛋白質(zhì)的分子量根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)(預(yù)染色的SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)，BroadRange,Bio-Rad)評(píng)估為30kDa。該名為TaXYN—30的純化蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)以PhastSystem(Pharmacia)測(cè)定為約6.8。TaXYN—30于50'C下的比活度被測(cè)定為4800nkat/mg(IUPAC法19S7，利用樺木木聚糖作為底物)。實(shí)施例11.內(nèi)氨基酸測(cè)序內(nèi)肽是利用Q-TOF1(Micromass)儀器，通過(guò)電噴霧離子化結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MS/MS)測(cè)序。蛋白質(zhì)首先被垸基化且經(jīng)消化成為胰蛋白肽。所產(chǎn)生的肽在施加于Q-T0F1儀器之前通過(guò)納米液相色譜技術(shù)(反相)脫鹽且部分分離。嗜熱毛殼菌與嗜熱枝頂孢菌纖維二糖水解酶的內(nèi)肽序列顯示于表2。毛殼菌CBH的肽于對(duì)應(yīng)的cbh基因被克隆后得到。從枝頂孢菌CBH測(cè)定的肽未被利用于克隆該對(duì)應(yīng)基因。表2.從嗜熱毛殼菌ALK04265CBH(1一C-4一C)及嗜熱枝頂孢菌ALK04245的CBH(1A-4—A)測(cè)定的內(nèi)肽序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>I/L-具有相同分子量且ESI-MS/MS分析不能區(qū)別的亮氨酸及異亮氨酸Q/K-谷氨酰胺及賴氨酸的分子量?jī)H差0.036Da且ESI-MS/MS分析不能區(qū)別嗜熱枝頂孢菌ALK04245、嗜熱毛殼菌ALK04261及金黃色嗜熱子囊菌ALK04242的純化內(nèi)切葡聚糖酶、P-葡萄糖苷酶及木聚糖酶的內(nèi)肽序列列于表3、表4及表5。表3.從嗜熱枝頂孢菌ALK04245EG—40、嗜熱毛殼菌ALK04261EG—54及金黃色嗜熱子囊菌ALK04242EG—28內(nèi)切葡聚糖酶所測(cè)定的內(nèi)肽序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>(aI/L-具有相同分子量且ESI-MS/MS分析不能區(qū)別的亮氨酸及異亮氨酸，Q/K^谷氨酰胺及賴氨酸的分子量?jī)H差0.036Da且ESI-MS/MS分析不能區(qū)別表4.從嗜熱枝頂孢菌ALK04245/3G_101、嗜熱毛殼菌ALK04261/3G一76及金黃色嗜熱子囊菌ALK042420G_81^-葡萄糖苷酶所測(cè)定的內(nèi)肽序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>(aI/L-具有相同分子量且ESI-MS/MS分析不能區(qū)別的亮氨酸及異亮氨酸表5.自嗜熱枝頂孢菌ALK04245XYN一60及金黃色嗜熱子囊菌ALK04242XYN—30木聚糖酶所測(cè)定的內(nèi)含肽序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>實(shí)施例12.構(gòu)建金黃色嗜熱子囊菌、嗜熱毛殼菌及嗜熱枝頂孢菌的基因組文庫(kù)嗜熱毛殼菌ALK04265及嗜熱枝頂孢菌ALK04245的基因組文庫(kù)是根據(jù)廠商說(shuō)明制成LambdaDASHII載體(Stratagene，USA)。根據(jù)Raeder和Broda(1985)的方法分離的染色體DNA經(jīng)Sau3A部分消化。該經(jīng)消化的DNA按大小分級(jí)且所選大小的片段(約5至23kb)被去磷酸化且與BamHI消化的人載體臂連接。該連接的混合物依制造商說(shuō)明(Stratagene,USA)使用GigapackIIIGold包裝提取物包裝。嗜熱毛殼菌及嗜熱枝頂孢菌基因組文庫(kù)的滴度分別為3.6X1()S及3.7X105pfu/ml，擴(kuò)增的文庫(kù)的滴度分別為6.5Xl(T及4.2X10Spfu/ml。根據(jù)廠商說(shuō)明，使用LambdaFIXII/XhoI部分補(bǔ)平載體試劑盒(Stratagene,USA)來(lái)構(gòu)建金黃色嗜熱子囊菌ALK04242及嗜熱毛殼菌ALK04261的基因組文庫(kù)。根據(jù)Raeder和Broda(1985)的方法分離的染色體DNA經(jīng)Sau3A部分消化。該經(jīng)消化的DNA按大小分級(jí)且該所選大小的片段(約6至23kb)被補(bǔ)平且與XhoI消化的XFIXII載體臂連接。該連接混合物依制造商說(shuō)明(Stratagene，USA)使用GigapackIII金包裝提取物包裝。金黃色嗜熱子囊菌ALK04242及嗜熱毛殼菌ALK04261基因組文庫(kù)的滴度分別為0.2X106及0.3X106pfu/ml，擴(kuò)增基因庫(kù)的滴度分別為1.8Xl()9及3.8X109pfu/ml。實(shí)施例13.從金黃色嗜熱子囊菌、嗜熱毛殼菌及嗜熱枝頂孢菌中克隆纖維二糖水解酶(cbh/ce17)基因利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行DNA(質(zhì)粒、DNA片段)的分離及酶處理、大腸桿菌轉(zhuǎn)化等。所使用的基本方法描述于標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)手冊(cè)，例如Sambrook等(1989)及Sambrook和RUSsell(2001)。用于篩選依實(shí)施例12所述構(gòu)建的基因組文庫(kù)的探針以PCR擴(kuò)增，該P(yáng)CR在反應(yīng)中使用金黃色嗜熱子囊菌ALK04242、嗜熱毛殼菌ALK04265及嗜熱枝頂孢菌ALK04245基因組DNA作為模板。根據(jù)發(fā)表的核苷酸序列(WO03/000941,Hong等，2003b)設(shè)計(jì)一些于PCR反應(yīng)中測(cè)試的引物。該P(yáng)CR反應(yīng)混合物包含50毫摩爾Tris-HClpH9.0、15毫摩爾硫酸銨、0.1%TritonX-IOO、1.5毫摩爾氯化鎂、0.2毫摩爾dNTPs、5微摩爾的各引物及1單位DynazymeEXTDNA聚合酶(Finnzymes，芬蘭)及約0.5至1微克的基因組DNA。PCR反應(yīng)的條件如下95'C初次變性5分鐘，后續(xù)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的95'C變性1分鐘、嗜熱子囊菌ALK04242及毛殼菌ALK04265模板于62'C(士8。C梯度)退火1分鐘或枝頂孢菌ALK04245模板于58'C(士6。C梯度)退火1分鐘、72'C延伸2分鐘及72'C最后延伸IO分鐘。預(yù)期大小(從發(fā)表的cbh序列計(jì)算)的DNA產(chǎn)物得自所有使用的基因組模板。預(yù)期大小的DNA片段自最特定的PCR反應(yīng)分離且將它們克隆到pCR⑧Blunt-TOPO⑧載體(Invitrogen,USA)。該插入片段通過(guò)測(cè)序及與經(jīng)數(shù)種限制酶消化的基因體DNA進(jìn)行Souther斑點(diǎn)雜交來(lái)表征。被選來(lái)用作篩選金黃色嗜熱子囊菌、嗜熱毛殼菌及嗜熱枝頂孢菌基因組文庫(kù)的探針的PCR片段示于表6。表6.用于PCR反應(yīng)的引物及被選擇用于從金黃色嗜熱子囊菌、嗜熱毛殼菌及嗜熱枝頂孢菌基因組文庫(kù)篩選cbh/cel7基因的探針。并顯示基因組模板DNA及包含該探針片端的質(zhì)粒名稱。<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>從所有這些探針推導(dǎo)出的氨基酸序列與糖基水解酶家族7(Henrissat，1991;Henrissat和Bairoch,1993)的一些發(fā)表的CBH序列具有同源性(NCBI，國(guó)家生物技術(shù)信息中心，BLAST程序，2.2.9版；Altschul等，19卯)。來(lái)自表6所列的質(zhì)粒的插入片段根據(jù)廠商說(shuō)明(Roche，德國(guó))以洋地黃毒甙標(biāo)記，且以標(biāo)記的探針片段篩選擴(kuò)增基因組文庫(kù)(2X105至3X10S噬斑)。濾紙的雜交溫度為68t:且該濾紙?jiān)谑覝叵掠?xSSC-0.1%SDS清洗2x5分鐘，之后于68。C下用0.1xSSC-0.1%SDS加上所使用的同源探針清洗2xl5分鐘。各次雜交中得到一些陽(yáng)性噬斑。在篩選枝頂孢菌ALK04245基因組文庫(kù)時(shí)，一些陽(yáng)性噬斑與所述探針強(qiáng)烈雜交，但除此之外，不少噬斑與探針的雜交較弱。這表示該基因組中可能存在其它纖維二糖水解酶基因，導(dǎo)致交叉反應(yīng)。4至5個(gè)強(qiáng)烈雜交的噬斑從嗜熱子囊菌ALK04242及毛殼菌ALK04265基因組文庫(kù)篩選中被純化。在嗜熱枝頂孢菌ALK04245的例子中，6個(gè)純化噬斑中有4個(gè)與使用的探針弱雜交。分離噬菌體DNA并以Souther斑點(diǎn)雜交表征。該選出的與探針雜交的限制片段被亞克隆到pBluescriptIIKS+載體且該克隆的相關(guān)區(qū)域被測(cè)序?？偣部寺×?個(gè)cbh/cd7基因；1個(gè)來(lái)自金黃色嗜熱子囊菌ALK04242，1個(gè)來(lái)自嗜熱毛殼菌ALK04265及2個(gè)來(lái)自嗜熱枝頂孢菌ALK04245(在早期工作中，這些編號(hào)為At—cbh_C及At—cbh_A，后來(lái)分別被命名為Atcel7A及Atcel7B)。表7歸納了有關(guān)用于篩選基因的探針、從中分離基因的噬菌體克隆、包含帶有啟動(dòng)子及終止子區(qū)域的全長(zhǎng)基因的選擇限制片段、質(zhì)粒名稱及帶有這些質(zhì)粒的大腸桿菌菌株的DSM保藏號(hào)的信息。表7.用于克隆cbh/cd7基因的探針、噬菌體克隆株及選擇的次克隆株、質(zhì)粒編號(hào)及對(duì)應(yīng)大腸桿菌菌株的儲(chǔ)存編號(hào)。<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>有關(guān)基因及推導(dǎo)蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO:l至8)的相關(guān)信息分別歸納于表8及9。從含Ctcd7A及Atcel7A基因的克隆的推導(dǎo)氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)了嗜熱毛殼菌ALK04265及嗜熱枝頂孢菌ALK04245的純化CBH蛋白質(zhì)的肽序列(表2)。因此，可以推斷編碼嗜熱毛殼菌及嗜熱枝頂孢菌的純化CBH/Cel7蛋白質(zhì)的基因被克隆。表8.從金黃色嗜熱子囊菌ALK04242、嗜熱毛殼菌ALK04265及嗜熱枝頂孢菌ALK04245分離的cbh/cel7基因的概要。<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>表9.從金黃色嗜熱子囊菌ALK04242、嗜熱毛殼菌ALK04265及嗜熱枝頂孢菌ALK04245的cbh/cel7基因序列所推導(dǎo)的氨基酸序列的概要。ss，信號(hào)序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>(a對(duì)信號(hào)序列的預(yù)測(cè)利用SignalPV3.0程序(Nielsen等,1997;Bendtsen等,2004)進(jìn)行；NN值利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)得到，HMM值利用隱馬爾可夫模型得到。(b纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)，指出了C端CBD區(qū)域的氨基酸(Ml(Met#l)包含在編號(hào)中)(c不包含預(yù)測(cè)的信號(hào)序列。該預(yù)測(cè)于ExPASy服務(wù)器利用ComputepI/MW工具進(jìn)行(Gasteiger等，2003)。(dN-X-S/T序列的數(shù)量。金黃色嗜熱子囊菌cel7A及嗜熱枝頂孢菌Cel7A的推導(dǎo)氨基酸序列(不含CBD的核心)彼此的同源性最高(以尼德曼-王氏整體比對(duì)，EMBOSS3.0.0Needle分析，MatrixEBLOSUM62,間隔罰分10.0及延長(zhǎng)罰分0.5;Needleman和Wunsch,1970)。此外，推導(dǎo)的嗜熱枝頂孢菌Cel7A與推導(dǎo)的嗜熱毛殼菌Cel7A具有較低的同一性。嗜熱枝頂孢菌Cel7B與本發(fā)明的CBH/Cel7序列最為不同。推導(dǎo)的毛殼菌Cel7A序列與WO03/000941中所述的嗜熱毛殼菌、嗜熱西塔利菌(Scytalidiumthermophilum)及澳洲梭孢殼霉(Thielaviaaustraliensis)CBHI的多肽具有最高同一性(以尼德曼-王氏整體比對(duì)，EMBOSSNeedle分析，見(jiàn)上述)。同樣的，推導(dǎo)的金黃色嗜熱子囊菌Cel7A序列與金黃色嗜熱子囊菌發(fā)表的CBHI具有高度同一性(WO03/000941,Hong等，2003B)。嗜熱枝頂孢菌Cel7B與先前發(fā)表的序列具有顯著較低的同一性，其與來(lái)自水稻(Oryzasativa)的CBHI多肽更密切相關(guān)。與推導(dǎo)的嗜熱枝頂孢菌Cd7A序列同源性最高的是黑耳(Exidiaglandulosa)及嗜熱枝頂孢菌CBHI多核苷酸(WO03/000941)。比對(duì)顯示，該克隆的金黃色嗜熱子囊菌ALK04242、嗜熱毛殼菌ALK04265及嗜熱枝頂孢菌ALK04245序列編碼與糖苷水解酶家族7的多肽具有高度同源性的CBH蛋白質(zhì)，因此這些序列被命名為Cel7A或Cel7B(Henrissat等1998)。表10顯示金黃色嗜熱子囊菌ALK04242、嗜熱毛殼菌ALK04265及嗜熱枝頂孢菌ALK04245梭孢殼霉的cbh/cel7基因的推導(dǎo)氨基酸序列的互相比較，及進(jìn)一步與數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的序列比較。表10.與金黃色嗜熱子囊菌ALK04242、嗜熱毛殼菌ALK04265及嗜熱枝頂孢菌ALK04245的cbh/cd7基因的推導(dǎo)氨基酸序列同源性最高的序列。比對(duì)利用尼德曼-王氏整體比對(duì)進(jìn)行(EMBLOSUM62，間隔罰分10.0，延長(zhǎng)罰分0.5)。*表示源自本工作所克隆的纖維二糖水解酶基因之一的氨基酸序列。"核心"表示無(wú)CBD的比對(duì)。<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>實(shí)施例14.于里氏木霉生產(chǎn)重組CBH/Cel7蛋白質(zhì)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒以生產(chǎn)來(lái)自金黃色嗜熱子囊菌(TaCel7A)、嗜熱毛殼菌(CtCel7A)及嗜熱枝頂孢菌(AtCel7A，AtCel7B;早期工作中這些蛋白質(zhì)的暫時(shí)編號(hào)分別為At—CBH_C及At_CBH—A)的重組CBH/Cd7蛋白。構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒列于表11。包括其本身信號(hào)序列的重組cbh/cel7基因通過(guò)PCR與里氏木霉cbhl(cel7A)啟動(dòng)子精確融合。如Paloheimo等(2003)所述，轉(zhuǎn)錄終止由里氏木霉cd7A終止子確保且利用構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)amdS標(biāo)記基因篩選轉(zhuǎn)化體。線性表達(dá)盒(圖2)于EcoRI消化后自載體骨架分離且被轉(zhuǎn)化到里氏木霉A96及A98原生質(zhì)中(二菌株都刪除了編碼4種主要的纖維素酶CBHI/Cel7A、CBHII/Cel6A、EGI/Cel7B及EGII/Cel5A的基因)。轉(zhuǎn)化按照Penttila等(1987)加上Karhunen等(1993)所述的修改進(jìn)行，以乙酰胺為唯一氮源篩選。轉(zhuǎn)化體于篩選盤上在它們?cè)赑D上形成孢子之前透過(guò)單一的分生孢子被純化。表ll.用于里氏木霉中生產(chǎn)金黃色嗜熱子囊菌ALK04242(TaCel7A)、嗜熱毛殼菌ALK04265(CtCel7A)及嗜熱枝頂孢菌ALK04245(AtCel7A，AtCel7B)的CBH/Cel7蛋白質(zhì)所構(gòu)建的表達(dá)盒。表達(dá)盒的整體結(jié)構(gòu)如圖2所示。該克隆的cbh/cel7基因與里氏木霉cbhl/cel7A啟動(dòng)子完全融合。<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>(a用于里氏木霉轉(zhuǎn)化的表達(dá)盒利用EcoRI消化從載體骨架中分離。(b從基因組cbhl/cel7A終止子區(qū)域在終止密碼子之后的核苷酸數(shù)量。括號(hào)中包括位于3'端用于剪切基因組基因片段的限制位點(diǎn)。轉(zhuǎn)化子的CBH/Cd7生產(chǎn)是從搖瓶培養(yǎng)(50毫升)的培養(yǎng)上清液分析。轉(zhuǎn)化體在以5%磷酸二氫鉀緩沖的復(fù)合乳糖基纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Joutsjoki等1993)中于28"C下生長(zhǎng)7天。纖維二糖水解酶活性根據(jù)vanTilbeurgh等(1988)利用4-甲基傘形酮基-P-D-乳糖苷(MUL)底物進(jìn)行分析。選擇轉(zhuǎn)化體的基因型是利用Souther斑點(diǎn)法確認(rèn)，其中包含一些基因組消化物且相應(yīng)的表達(dá)盒被用來(lái)作為探針。TaCd7A、CtCel7A、AtCel7A及AtCel7B蛋白質(zhì)的異源性表達(dá)以SDS-PAGE分析，之后以考馬斯染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)包含整合的表達(dá)盒的AtCd7B轉(zhuǎn)化體在SDS-PAGE中不能檢測(cè)到纖維二糖水解酶活性或異源性蛋白質(zhì)產(chǎn)生，這表示利用所述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)于木霉中所產(chǎn)生的AtCel7B在檢測(cè)水平以下。重組CBH/Cd7酶制劑以最適pH及熱穩(wěn)定性表征。得自金黃色嗜熱子囊菌、嗜熱毛殼菌及嗜熱枝頂孢菌的重組CBH/Cd7蛋白質(zhì)的最適pH是利用4-甲基傘形酮基-e-D-乳糖苷(MUL)作為底物于pH3.0至8.0的范圍內(nèi)在通用馬氏(Mcllvaine)緩沖液中測(cè)定(圖3A)。CtCd7A及AtCd7A酶的最適pH為5.5，這以上活性開始逐漸下降。重組粗TaCel7A的最適pH為5.0(圖3A)。重組Cel7酶的熱穩(wěn)定性通過(guò)測(cè)量MUL于通用馬氏緩沖液中最適pH下反應(yīng)1小時(shí)的活性來(lái)測(cè)定。如結(jié)果所示，TaCel7A及CtCel7A于70。C下保持60%以上的活性，然而AtCd7A于較高溫度下(^65'C)表現(xiàn)出明顯較不穩(wěn)定(圖3B)。選擇的CBH/Cd7轉(zhuǎn)化體在28'C培養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室生物反應(yīng)器中的上述培養(yǎng)基中達(dá)3至4天，pH控制于4.4士0.2(氨氣/磷酸)以獲得用于應(yīng)用測(cè)試的物質(zhì)。離心回收上清液并通過(guò)Seitz-K150和EK過(guò)濾器(Pa11SeitzSchenkFiltersystemsGmbH,BadKreuznach，德國(guó))過(guò)濾。實(shí)施例15.于里氏木霉生產(chǎn)重組金黃色嗜熱子囊菌Cd7A+CBD融合蛋白質(zhì)將金黃色嗜熱子囊菌Cel7A(AF478686，Hong等,2003b;SEQIDNO:1)與接頭及里氏木霉CBHI/Cel7A(AR088330，Srisodsuk等1993)的CBD(=TrCBD)融合，隨后按照2005年4月29日提交的FI20055205/US11/119526所述在里氏木霉中生產(chǎn)融合蛋白(SEQIDNO:28，對(duì)應(yīng)核酸SEQIDNO:27)。此外，金黃色嗜熱子囊菌Cel7A與接頭及嗜熱毛殼菌Cel7A的CBD(SEQIDNO:7)(CtCBD)融合。為此，以PCR利用下列引物合成接頭及嗜熱毛殼菌Cel7A的CBD的編碼序列5，-TTAAACATATGTTATCTACTCCAACATCAAGGTCGGACCCATCGGCTCGACCGTCCCTGGCCTTGAC-3，(正向序歹ij)及5'-TATATGCGGCCGCAAGCTTTACCATCAAGTTACTCCAGCAAATCAGGGAACTG-3，(反向序列)。PCR反應(yīng)混合物包含lxDyNAzymeEXT反應(yīng)緩沖液(Finnzymes,芬蘭)、15毫摩爾鎂離子、0.2毫摩爾dNTP、2微摩爾的各引物、0.6單位的DyNAzymeEXTDNA聚合酶(Finnzymes，芬蘭)及約75納克/30微升包》嗜熱毛殼菌全長(zhǎng)cel7A基因的模板DNA。PCR反應(yīng)條件如下98'C初始變性2分鐘，后續(xù)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的98'C30秒、68°C(土4t:梯度)退火30秒、72"C延伸30秒及72。C最后延伸10分鐘。PCR反應(yīng)中的特定DNA片段于64'C至68.5t:的退火溫度范圍內(nèi)得到。嗜熱毛殼菌的合成CBD片段被連接到金黃色嗜熱子囊菌Cd7A基因之后，在結(jié)構(gòu)域之間形成GPIGST的接合點(diǎn)。在質(zhì)粒中的PCR擴(kuò)增片段經(jīng)測(cè)序確認(rèn)(SEQIDNO:29)。構(gòu)建的融合Cel7A基因與里氏木霉cbhl(Cel7A)啟動(dòng)子完全融合。轉(zhuǎn)錄終止由里氏木霉Cel7A終止子保證且如Paloheimo等(2003)所述利用構(gòu)巢曲霉amdS標(biāo)記基因篩選轉(zhuǎn)化體。線性表達(dá)盒于Notl消化后自載體骨架分離且被轉(zhuǎn)化到里氏木霉A96原生質(zhì)體。轉(zhuǎn)化按照Penttila等(1987)所述加上如Karhunen等(1993)所述的修改進(jìn)行，以乙酰胺為唯一氮源篩選。轉(zhuǎn)化體于篩選盤上于PD上形成孢子之前通過(guò)單一分生孢子被純化。金黃色嗜熱子囊菌Cel7A+CBD(SEQIDNO:28及30)生產(chǎn)的轉(zhuǎn)化體由搖瓶培養(yǎng)(50毫升)的培養(yǎng)上清液分析。轉(zhuǎn)化體于以5%磷酸二氫鉀pH5.5緩沖的復(fù)合纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Joutsjoki等1993)中生長(zhǎng)7天。纖維二糖水解酶活性根據(jù)vanTilbeurgh等(1988)利用4-甲基傘形酮基-e-D-乳糖苷糖MUL)底物進(jìn)行分析。選擇轉(zhuǎn)化體的基因型利用Souther印跡法確認(rèn)，其中一些基因組消化物被包含且表達(dá)盒被用來(lái)作為探針。SDS-PAGE分析顯示重組金黃色嗜熱子囊菌Cd7A+080酶于里氏木霉中被生產(chǎn)成為穩(wěn)定的融合蛋白。生產(chǎn)TaCel7A+TrCBD融合蛋白(SEQIDNO:28)的選擇轉(zhuǎn)化體也在28'C培養(yǎng)于2升生物反應(yīng)器中的上述培養(yǎng)基中達(dá)3至4天，pH控制于4.4±0.2(氮?dú)?磷酸)以獲得用于應(yīng)用測(cè)試的物質(zhì)。離心回收上清液并通過(guò)Seitz-K150及EK過(guò)濾器(PallSeitzSchenkFiltersystemsGmbH,BadKreuznach,德國(guó))過(guò)濾。實(shí)施例16.比較純化的重組纖維二糖水解酶的米-曼氏常數(shù)(Micliaelis-Menten)及纖維二糖抑制常數(shù)測(cè)定于里氏木霉中異源性產(chǎn)生的纖維二糖水解酶(實(shí)施例14及15)的米-曼氏常數(shù)及纖維二糖抑制常數(shù)。該酶按照實(shí)施例2所述純化。純化酶的蛋白質(zhì)濃度通過(guò)它們?cè)?80mn波長(zhǎng)處的吸光度利用理論摩爾消光是數(shù)測(cè)量，該系數(shù)從氨基酸序列計(jì)算(Gill和vonHippe1，1989)。TrCBHI/Cel7A、TaCBH/Cel7A、AtCBH/Cel7A及CtCBH/Cel7A的動(dòng)力學(xué)常數(shù)(Km及kcat值)及纖維二糖抑制常數(shù)(Ki)利用CNPLac(2-氯-4-硝基苯基-e-D-乳糖苷)作為底物于室溫下(22'C)在50毫摩爾磷酸鈉緩沖液pH5.7中測(cè)量。為了測(cè)量抑制常數(shù)(Ki)，在5種抑制劑濃度范圍(0至100微摩爾或0至400微摩爾)(其與Ki值有關(guān)(brackettheKivalue))存在的情況下使用8種不同底物濃度(31至4000微摩爾)。所有試驗(yàn)均在微量滴定板上進(jìn)行且總反應(yīng)體積為200微升。初始速率在各種情況下利用Varioscan(Thermolabsystems)微量低定板讀取儀，通過(guò)在405nm的測(cè)量值，以連續(xù)監(jiān)測(cè)氯-硝苯苯酚鹽陰離子(CNP，2-氯-4-硝苯酚)的釋放測(cè)量。結(jié)果由CNP標(biāo)準(zhǔn)曲線(從0至IOO微摩爾)計(jì)算。所使用的酶濃度為TrCBHI/Ce7A2.46pM，TaCBH/Cel7A1.58piM，CtCBH/Cel7A0.79piM及AtCBH/Cel7A3pM。Km及kcat常數(shù)利用Origin程序，從米-曼氏方程式的擬合計(jì)算。使用林-柏氏(Lineweaver-Burk)作圖法、再作圖(LWB斜率對(duì)[Glc2;纖維二糖])及漢氏(Hanes)作圖法區(qū)別競(jìng)爭(zhēng)型及混合型抑制及確定抑制常數(shù)(Ki)。動(dòng)力學(xué)測(cè)量的結(jié)果顯示于表12及13?？梢?jiàn)，CtCBH/Cel7A明顯具有較高的對(duì)CNPLac的轉(zhuǎn)換數(shù)(kcat)，同時(shí)專一性常數(shù)(kcat/Km)相較于里氏木霉的CBHI/Cel7A為高。纖維二糖(Glc2)是所有測(cè)量的纖維素酶的競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑，且TrCBHI/Cel7A(用作對(duì)照)被纖維二糖抑制得最強(qiáng)(也就是Ki值最低)。AtCBH/Cel7A的抑制常數(shù)較TrCBHI/Cel7A高出7倍以上。這些結(jié)果表明，所有三種新穎的纖維二糖水解酶《能更好地作用于纖維二糖水解，因?yàn)槠淅w維二糖抑制作用較里氏木霉Cel7A纖維二糖水解酶I降低。表12.比較四種GH家族7纖維二糖水解酶的纖維二糖抑制常數(shù)，于22'C下在50毫摩爾磷酸鈉緩沖液pH5.7中測(cè)量CNPLac。<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>表13.比較嗜熱毛殼菌纖維二糖水解酶Cel7A與里氏木霉CBHI/Cel7A的米-曼氏動(dòng)力學(xué)常數(shù)，于22'C下在50毫摩爾磷酸鈉緩沖液pH5.7中測(cè)量CNPLac。_<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>實(shí)施例17.以重組纖維二糖水解酶水解結(jié)晶纖維素(Avicel)純化的重組纖維二糖水解酶CtCel7A、TaCel7A、TaCel7A+TrCBD、TaCel7A+CtCBD、AtCel7A以及CtCel7A的核心版(見(jiàn)下)于兩種溫度下，45及7(TC，以等摩爾量測(cè)試結(jié)晶纖維素水解；純化的里氏木霉TrCel7A及其核心版(見(jiàn)下)被用來(lái)比較。結(jié)晶纖維素(Ph101，Avicel;Fluka,Bucsh,瑞士)水解分析于1.5毫升試管規(guī)模50毫摩爾乙酸鈉pH5.0中進(jìn)行。Avicel及酶溶液(1.4微摩爾)于45。C或70。C下?lián)u晃，且該反應(yīng)混合物的最后體積為325微升。繼續(xù)水解直至24小時(shí)，于6個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)釆集樣品且加入含9體積94%乙醇及1體積1摩爾甘氨酸(pHll)的163微升停止試劑以停止反應(yīng)。該溶液通過(guò)MillexGV130.22微米過(guò)濾單位(Millipore，Billerica，MA,USA)過(guò)濾。在上清液中所形成的可溶性還原糖利用纖維二糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(50至1600微摩爾纖維二糖)，以對(duì)羥基苯甲酰肼(PA-HBAH)方法(Lever，1972)測(cè)定。將新鮮調(diào)配的0.1摩爾PAHBAH(Sigma-Aldrich，St丄ouis，MO，USA)的0.5摩爾氫氧化鈉(100微升)溶液加入到150微升的過(guò)濾樣品中并煮沸10分鐘，之后令該溶液于冰上冷卻。測(cè)量該樣品于405mn處的吸光度。天然形式的包含CBD的纖維二糖水解酶的核心版依下列方式獲得CtCel7A及TrCel7A暴露于蛋白水解消化以移除纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。木瓜蛋白酶(木瓜乳膠，14單位/毫克，Sigma)消化天然纖維二糖水解酶在反應(yīng)混合物中以37'C進(jìn)行24小時(shí)，該反應(yīng)混合物由10毫摩爾L-半胱胺酸及2毫摩爾EDTA于50毫摩爾乙酸鈉緩沖液(pH5.0)加上木瓜蛋白酶組成(測(cè)試二種木瓜蛋白酶濃度反應(yīng)混合物中Cel7A總量的1/5或1/10量的木瓜蛋白酶)。所形成的核心蛋白如上述以DEAESepharoseFF(Pharmacia,Uppsala，瑞士)陰離子交換管柱純化。產(chǎn)物以SDS-PAGE分析。于45及7(TC下的水解結(jié)果分別如圖4及5所示。該結(jié)果清楚地顯示，所有纖維二糖水解酶相較于現(xiàn)有技術(shù)的纖維二糖水解酶里氏木霉Cd7A在這兩種溫度下皆表現(xiàn)出更快更完全的水解。在7(TC下，來(lái)自金黃色嗜熱子囊菌ALK04242及嗜熱毛殼菌ALK04265的熱穩(wěn)定性纖維二糖水解酶較里氏木霉Cd7A出色，在嗜熱子囊菌Cd7A核心與里氏木霉Cel7A的CBD連接(TaCel7A+TrCBD)的情況下亦然。令人意外的是，本研究分離及克隆的纖維二糖水解酶在包含CBD時(shí)，其在相較于同樣酶濃度的現(xiàn)有技術(shù)的纖維二糖水解酶里氏木霉Cel7A(CBHI)時(shí)，于慣用的水解溫度45X:下，其結(jié)晶纖維素水解的速率及產(chǎn)物形成也同樣出色。這些結(jié)果亦與酶制劑(AtCel7A及CtCel7A)相同，該些酶制劑純化自原始宿主且測(cè)試Avicel水解(50°C，24小時(shí))(實(shí)施例2，表1)。實(shí)施例18.克隆嗜熱枝頂孢菌ALK04245、嗜熱毛殼菌ALK04261及金黃色嗜熱子囊菌ALK04242的內(nèi)切葡聚糖酶基因如實(shí)施例13所述使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)。枝頂孢菌、毛殼菌及嗜熱子囊菌基因組文庫(kù)的構(gòu)建已于實(shí)施例12中描述。源自純化的枝頂孢菌及毛殼菌內(nèi)切葡聚糖酶的肽分別與一些糖基水解酶家族45的內(nèi)切葡聚糖酶具有同源性，例如白馬蘭諾菌(Melanocarpusalbomyces)Cel45A內(nèi)切葡聚糖酶(AJ515703)及特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)內(nèi)切葡聚糖酶(A35275)。源自嗜熱子囊菌內(nèi)切葡聚糖酶的肽與發(fā)表的金黃色嗜熱子囊菌EG1內(nèi)切葡聚糖酶序列(AF487830)具有幾乎100%的同一性。為了擴(kuò)增用于篩選枝頂孢菌及毛殼菌基因組文庫(kù)的探針，根據(jù)肽序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。蛋白質(zhì)序列中肽的順序及引物的相應(yīng)有義或反義性質(zhì)從與已發(fā)表的同源性內(nèi)切葡聚糖酶的比較推導(dǎo)而來(lái)。引物序列及該對(duì)應(yīng)肽列于表14。由于嗜熱子囊菌肽與已發(fā)表的序列幾乎具有100%同一性，該內(nèi)切葡聚糖酶基因直接從該基因組DNA通過(guò)PCR擴(kuò)增。表14.被合成且用來(lái)作為PCR引物以擴(kuò)增用于從對(duì)應(yīng)的基因組文庫(kù)中篩選嗜熱枝頂孢菌cel45A(EG—40)及嗜熱毛殼菌cel7B(EG_54)基因的探針的寡核苷酸。<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>(a用于設(shè)計(jì)引物序列的肽的氨基酸(bN=A、C、G或T;R-A或G;Y=C或T(c不是源自純化的枝頂孢菌EG—40蛋白質(zhì)但源自與EG一40同源的白馬蘭諾菌Cel45A序列(AJ515703)的肽(d于寡核苷酸5'端加入HindlII限制位點(diǎn)(e于寡核苷酸5'端加入EcoRI限制位點(diǎn)禾U用基因組DNA為模板，以正向(TAYTGGGAYTGYTGYAARCC)及反向(RTTRTCNGCRTTYTGRAACCA)引物擴(kuò)增供篩選基因組文庫(kù)的嗜熱枝頂孢菌cel45A基因特異性探針。PCR反應(yīng)混合物包含50毫摩爾Tris-HClpH9.0、15毫摩爾硫酸銨、0.1%TritonX-IOO、1.5毫摩爾氯化鎂、0.1毫摩爾dNTP、0.5微摩爾的各引物、1單位DynazymeEXTDNA聚合酶(Finnzymes,芬蘭)及約0.5微克的枝頂孢菌基因組DNA。PCR反應(yīng)的條件如下95'C初次變性5分鐘，后續(xù)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的95'C變性1分鐘、50至6(TC退火1分鐘、72'C延伸2分鐘及72'C最后延伸IO分鐘。為了擴(kuò)增嗜熱毛殼菌cel7B基因(編碼CtEG—54)特異性探針，使用正向引物(GGAATTCGAYCARACNGARCARTA)及反向引物(GCAAGCTTCGRCARAARTCRTCRTT)。PCR反應(yīng)混合物包含10毫摩爾Tris-HClpH8.8、50毫摩爾氯化鉀、0.1%TritonX-lOO、1.5毫摩爾氯化鎂、0.2毫摩爾dNTP、250皮摩爾的各引物、2單位DynazymeIIDNA聚合酶(Fiimzymes，芬蘭)及約2微克的毛殼菌基因組DNA。PCR反應(yīng)的條件如上述，除了退火于45至5(TC進(jìn)行。自枝頂孢菌PCR反應(yīng)得到兩個(gè)PCR產(chǎn)物。從瓊脂糖凝膠分離約0.6及0.8kb大小的DNA片段且被克隆到pCR4-TOPOTA載體(Invitrogen，USA)，分別形成質(zhì)粒pALK1710及pALK1711。該DNA產(chǎn)物通過(guò)測(cè)序及與經(jīng)過(guò)數(shù)種限制酶消化的基因組枝頂孢菌DNA進(jìn)行Souther印跡雜交來(lái)表征。用兩個(gè)片段在嚴(yán)格清洗條件下得到的雜交牛莫式表明，從枝頂孢菌基因組文庫(kù)可篩選出兩個(gè)推導(dǎo)的內(nèi)切葡聚糖酶基因。這兩個(gè)PCR產(chǎn)物的推導(dǎo)氨基酸序列與糖基水解酶家族45的一些已發(fā)表的內(nèi)切葡聚糖酶序列具有同源性(BLAST程序，美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation);Altschul等，1990)。從毛殼菌PCR反應(yīng)得到一個(gè)預(yù)期大小(從同源的特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶序列A35275推算)的PCR產(chǎn)物。此約0.7kb的DNA片段被克隆導(dǎo)入pCR4-TOPOTA載體(Invitrogen，USA)以形成質(zhì)粒pALK2005并依上述方法分析。此PCR產(chǎn)物的推導(dǎo)的氨基酸序列與糖基水解酶家族7的一些已發(fā)表的纖維素酶序列具有同源性(NCBI，美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心，BLAST程序，2.2.9版；Altschul等，1990)。來(lái)自質(zhì)粒pALK1710、pALK1711及pALK2005的插入片段根據(jù)廠商說(shuō)明(Roche，德國(guó))以限制酶消化分離并以洋地黃毒甙標(biāo)記。來(lái)自擴(kuò)增的枝頂孢菌或毛殼菌基因組文庫(kù)的約1-2乂105個(gè)噬斑被篩選。雜交溫度為68t:且該濾紙?jiān)谑覝叵掠?xSSC-0.1%SDS清洗2x5分鐘，之后于68。C下以0.1xSSC-0.1%SDS清洗2x15分鐘。得到一些陽(yáng)性噬斑，其中每次篩選純化5至6個(gè)強(qiáng)雜交噬斑。噬菌體DNA通過(guò)Souther印跡雜交法分離和分析。與探針雜交的限制性片段被亞克隆導(dǎo)入pBluescriptIIKS+載體(Stratagene,USA)且相關(guān)部分被測(cè)序。在所有情況下，該亞克隆的噬菌體片段包含感興趣的全長(zhǎng)基因。表15概括了用于篩選內(nèi)切葡聚糖酶基因的探針、自其中分離基因的噬菌體克隆、包含帶有啟動(dòng)子及終止子區(qū)域的全長(zhǎng)基因的選擇限制性片段、包含亞克隆噬菌體片段的質(zhì)粒名稱及帶有這些質(zhì)粒的大腸桿菌菌株于DeutscheSammlimgvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH培養(yǎng)物保藏中心(DSM)的保藏號(hào)的信息。表15.用于克隆內(nèi)切葡聚糖酶基因的探針、噬菌體克隆株及選擇的亞克隆、質(zhì)粒名稱及大腸桿菌菌株的對(duì)應(yīng)保藏號(hào)。<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>金黃色嗜熱子囊菌cd5A基因(編碼EG—28)(SEQIDNO:9)通過(guò)PCR反應(yīng)直接從分離的基因組DNA擴(kuò)增。用于擴(kuò)增的正向C)及反向(AACTGAGGCATAGAAACTGACGTCATATT)引物根據(jù)已發(fā)表的金黃色嗜熱子囊菌egl基因(AF487830)設(shè)計(jì)。該P(yáng)CR反應(yīng)混合物包含lxPhusionHF緩沖液、0.3毫摩爾dNTP、0.5微摩爾的各引物、2單位PhusionTMDNA聚合酶(Finnzymes，芬蘭)及約0.25微克的嗜熱子囊菌基因組DNA。PCR反應(yīng)的條件如下95'C初次變性5分鐘，后續(xù)進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的95"C30秒，于57至67。C退火30秒，72'C延伸2.5分鐘及72'C最后延伸5分鐘。該包含精確基因(從啟動(dòng)至終止密碼子)的1.3kb擴(kuò)增產(chǎn)物被作為SacII-PstI片段克隆導(dǎo)入pBluescriptIIKS+載體。測(cè)序兩個(gè)獨(dú)立的克隆株且選擇一個(gè)克隆并命名為pALK1926。包含pALK1926的大腸桿菌菌株于DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH培養(yǎng)物保藏中心的保藏號(hào)為DSM17326。該基因及推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO:9至16)的相關(guān)信息分別歸納于表16及17。純化的枝頂孢菌EG—40(基因Atcel45A)、毛殼菌EG—54(基因Ctcel7B)及嗜熱子囊菌EG—28(基因Tacel5A)內(nèi)切葡聚糖酶的肽序列可見(jiàn)于克隆基因的對(duì)應(yīng)推導(dǎo)氨基酸序列，這表示適當(dāng)?shù)幕虮豢寺　１?6.從嗜熱枝頂孢菌、嗜熱毛殼菌及金黃色嗜熱子囊菌分離的內(nèi)切葡聚糖酶基因的概要。<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>(a包含終止密碼子(b不包含終止密碼子表17.嗜熱枝頂孢菌、嗜熱毛殼菌及金黃色嗜熱子囊菌的推導(dǎo)內(nèi)切葡聚糖酶序列的概要。ss，信號(hào)序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>(a信號(hào)序列的預(yù)測(cè)是利用SignalPV3.0程序進(jìn)行(Nielsen等，1997;Bendtsen等，2004);NN值利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)得到及HMM值利用隱馬爾可夫模型得到。(b蛋白質(zhì)中存在纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，指出C端CBD的氨基酸(根據(jù)全長(zhǎng)多肽編號(hào))。(c不包含預(yù)測(cè)的信號(hào)序列。該預(yù)測(cè)于ExPASy服務(wù)器利用ComputepI/MW工具進(jìn)行(Gasteiger等，2003)。(d利用NetNGlyc1.0程序預(yù)測(cè)推定的N糖基化位點(diǎn)N-X-S/T(Gupta等,2004)。(e依據(jù)Hong等，2003a。枝頂孢菌EG—40(AtCel45A)及EG_40_like(AtCel45B)、毛殼菌EG—54(CtCel7B)及嗜熱子囊菌EG—28(TaCel5A)內(nèi)切葡聚糖酶的推導(dǎo)蛋白質(zhì)序列與糖基水解酶家族45(枝頂孢菌)、家族7(毛殼菌)及家族5(嗜熱子囊菌)的纖維素酶享有同源性，從而確認(rèn)這些被分離的基因是這些基因家族的成員。與枝頂孢菌內(nèi)切葡聚糖酶EG_40/Cel45A及EG—40_like/Cel45B具有最近同源性的分別是太瑞斯梭孢殼霉(CQ827970，77.3%同一性)及嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathe畫phila)(AR094305,66.9%同一性)的內(nèi)切葡聚糖酶(表18)。兩個(gè)分離的枝頂孢菌家族45內(nèi)切葡聚糖酶互相僅具有53.7%的同一性。在這些酶中，只有EG—40/Cel45A包含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)。與毛殼菌EG—54/Cd7B內(nèi)切葡聚糖酶的預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)序列的最近同源性發(fā)現(xiàn)是白馬蘭諾菌Cel7A纖維素酶序列(AJ515704)。這二個(gè)蛋白質(zhì)序列之間的同一性為70.6%。分離的金黃色嗜熱子囊菌內(nèi)切葡聚糖酶的蛋白質(zhì)序列與已發(fā)表的金黃色嗜熱子囊菌EGI的序列(AF487830,表18)完全相同。其與埃莫森籃狀菌的e-葡聚糖酶序列(AX254752，71.1%同一性)有最近的同源性。表18.推導(dǎo)的嗜熱枝頂孢菌EG—40、EG—40—like/Cel45B、嗜熱毛殼菌EG—54/Cel7B及金黃色嗜熱子囊菌EG—28/Cel5A內(nèi)切葡聚糖酶與其同源性配對(duì)物的比較。該比對(duì)利用EMBOSS程序套件包的Needle程序進(jìn)行。*表示由本研究克隆的基因編碼的內(nèi)切葡聚糖酶。<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>實(shí)施例19.于里氏木霉中生產(chǎn)重組的內(nèi)切葡聚糖酶構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒以如實(shí)施例14所述生產(chǎn)重組枝頂孢菌EG—40/Cel45A、EG—40—like/Cel45B及嗜熱子囊菌EG—28/Cel5A蛋白質(zhì)。線性表達(dá)盒(表19)通過(guò)限制酶消化從載體骨架分離、轉(zhuǎn)化到里氏木霉A96中且依實(shí)施例14所述純化轉(zhuǎn)化體。表19.為了在里氏木霉中生產(chǎn)嗜熱枝頂孢菌EG_40/Cel45A、EG—40Jike/Cel45B及金黃色嗜熱子囊菌EG一28/Cel5A內(nèi)切葡聚糖酶構(gòu)建的表達(dá)盒。表達(dá)盒的示意性結(jié)構(gòu)在圖2中表述。<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>(a用于里氏木霉轉(zhuǎn)化的表達(dá)盒利用EcoRI或NotI消化從自載體骨架中分離。(b指示包含在表達(dá)盒中的克隆基因的終止密碼子后的核苷酸數(shù)量。括號(hào)中指示位于基因的3'區(qū)域用來(lái)構(gòu)建表達(dá)盒的限制性位點(diǎn)。轉(zhuǎn)化體的內(nèi)切葡聚糖酶生產(chǎn)是由搖瓶培養(yǎng)的培養(yǎng)上清液分析的(50毫升)。轉(zhuǎn)化體按照實(shí)施例14生長(zhǎng)，而重組蛋白質(zhì)的酶活性基本按照Bailey和Nevalainen1981;Haakana等2004所述，于50毫摩爾檸檬酸鹽緩沖液pH4.8中測(cè)量5(TC下培養(yǎng)上清液中還原糖自羧甲基纖維素(2%(重量/體積)CMC)的釋出。重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)還通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳從培養(yǎng)上清液檢測(cè)。枝頂孢菌EG_40特異性多克隆抗體于兔中生產(chǎn)(芬蘭赫爾辛基大學(xué)，UniversityofHelsinki)。EG_40的表達(dá)利用ProBlotWestern印跡AP系統(tǒng)(Promega)以抗EG—40抗體通過(guò)Western印跡法驗(yàn)證。選出的轉(zhuǎn)化體的基因型利用表達(dá)盒作為探針以Souther印跡法分析。異源性生產(chǎn)的內(nèi)切葡聚糖酶的最適pH利用羧甲基纖維素作為底物，于pH4.0至8.0的范圍內(nèi)在通用馬氏緩沖液中測(cè)定。如圖6A所示，枝頂孢菌EG—40/Cd45A蛋白質(zhì)的pH范圍最廣(4.5至6.0)，最適是于pH5.5。其它異源性生產(chǎn)的內(nèi)切葡聚糖酶的最適pH對(duì)于枝頂孢菌EG—40—like/Cel45B及嗜熱子囊菌EG—28/Cel5A分別為pH5.0至5.5及6.0。這些內(nèi)切葡聚糖酶酶活性的最適溫度如上述于50至85。C的溫度范圍內(nèi)測(cè)定。枝頂孢菌EG—40/Cel45A、EG—40—like/Cel45B及嗜熱子囊菌EG—28/Cel5A的酶最高活性作用溫度分別被測(cè)定為75°C、6(TC及75。C(圖6B)。選擇的轉(zhuǎn)化體如實(shí)施例U所述，于2升生物反應(yīng)器中培養(yǎng)4天(28°C，pH4.2)，以獲得用于應(yīng)用測(cè)試的物質(zhì)。實(shí)施例20.克隆嗜熱枝頂孢菌ALK04245、嗜熱毛殼菌ALK04261及金黃色嗜熱子囊菌ALK04242e-葡萄糖苷酶基因如實(shí)施例13所述使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)。枝頂孢菌、毛殼菌及嗜熱子囊菌基因組文庫(kù)的構(gòu)建已于實(shí)施例12中描述。源自純化的枝頂孢菌、毛殼菌及嗜熱子囊菌e-葡萄糖苷酶的肽分別與一些糖基水解酶家族3的P-葡萄糖苷酶具有同源性，例如纖維素分解枝頂孢菌(Acremoniumcellulolyticus)(BD168028)、綠木霉(Trichodermaviride)(AY368687)及埃莫森籃狀菌(AY072918)的e-葡萄糖苷酶。為了擴(kuò)增用于篩選枝頂孢菌、毛殼菌或嗜熱子囊菌基因組文庫(kù)的探針，根據(jù)肽序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。蛋白質(zhì)序列中肽的順序及引物的相應(yīng)有義或反義性質(zhì)是從與已發(fā)表的同源性e-葡萄糖苷酶的比較推導(dǎo)而來(lái)。引物序列及該對(duì)應(yīng)肽列于表20。表20.被合成且用作PCR引物以擴(kuò)增用于從對(duì)應(yīng)基因組文庫(kù)中篩選嗜熱枝頂孢菌cel3A(i8G_101)、嗜熱毛殼菌cel3A(j8G一76)及金黃色嗜熱子囊菌cel3A(/3G_81)基因的探針的寡核苷酸。_<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>(a用于設(shè)計(jì)引物序列的肽的氨基酸(b為了降低簡(jiǎn)并性，一些密碼子的選擇是根據(jù)真菌的偏好。N=A、C、G或T;R-A或G;S=C或G;Y=C或T(c不是源自純化的枝頂孢菌PG—101蛋白.質(zhì)但源自與0GJ01具有同源性的纖維素分解枝頂孢菌e-葡萄糖苷酶序列(BD168028)的肽利用枝頂孢菌、毛殼菌或嗜熱子囊菌基因組DNA為模板，以所列的引物組合(表20)擴(kuò)增供篩選構(gòu)建的基因組文庫(kù)的探針。PCR反應(yīng)混合物包含50毫摩爾Tris-HClpH9.0、15毫摩爾硫酸銨、0.1%TritonX-IOO、1.5毫摩爾氯化鎂、0.1至0.2毫摩爾dNTP、0.25微摩爾的各引物、1單位DynazymeEXTDNA聚合酶(Finnzymes，芬蘭)及約0.5微克的基因組DNA。PCR反應(yīng)條件如下95C初次變性5分鐘，接著30個(gè)循環(huán)的95°C1分鐘，于40°C(枝頂孢菌DNA為模板)、50°C(以毛殼菌DNA為模板)或63。C(以嗜熱子囊菌DNA為模板)退火1分鐘，72。C延伸2至3分鐘及72。C最后延伸5至10分鐘。自瓊脂糖凝膠分離預(yù)期大小的特定PCR產(chǎn)物(從同源性e-葡萄糖苷酶序列BD168028、AY072918及AY368687估計(jì))。約1.8kb(枝頂孢菌)、1.5kb(毛殼菌)及1.52kb(嗜熱子囊菌)的DNA片段被克隆導(dǎo)入pCR4-T0P0TA載體(Invitrogen，USA)，分別形成質(zhì)粒pALK1924、pALK1935及pALK1713。該DNA產(chǎn)物通過(guò)測(cè)序及與經(jīng)過(guò)數(shù)種限制酶消化的基因組DNA進(jìn)行Souther鄰跡雜交來(lái)表征。嚴(yán)格清洗條件下的雜交模式表明，自枝頂孢菌、毛殼菌及嗜熱子囊菌基因組文庫(kù)可分離出一個(gè)假定的e-葡萄糖苷酶基因。所有三個(gè)PCR產(chǎn)物的推導(dǎo)氨基酸序列與糖基水解酶家族3的一些已發(fā)表的e-葡萄糖苷酶序列具有同源性(BLAST程序，國(guó)家生物技術(shù)信息中心；Altschul等,1990)。來(lái)自質(zhì)粒pALK1713、pALK1924及pALK1935的插入片段根據(jù)廠商說(shuō)明(Roche，德國(guó))通過(guò)限制酶消化分離并以洋地黃毒甙標(biāo)記。約1-2乂105個(gè)來(lái)自擴(kuò)增的枝頂孢菌、毛殼菌或嗜熱子囊菌基因組文庫(kù)的噬斑如實(shí)施例18所述被篩選。得到一些陽(yáng)性噬斑，其中自每次篩選純化5至6個(gè)強(qiáng)雜交噬斑。噬菌體DNA通過(guò)Souther印跡雜交法分離和分析。與探針雜交的限制性片段被亞克隆導(dǎo)入pBluescriptIIKS+載體(Stratagene，USA)且相關(guān)部分被測(cè)序。在所有情況下，亞克隆的噬菌體片段包含感興趣的全長(zhǎng)基因。表21概括了用于篩選e-葡萄糖苷酶基因的探針、自其中分離基因的噬菌體克隆、包含帶有啟動(dòng)子及終止子區(qū)域的全長(zhǎng)基因的選擇的限制性片段、包含亞克隆噬菌體片段的質(zhì)粒名稱及帶有這些質(zhì)粒的大腸桿菌菌株于DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH培養(yǎng)物保藏中心(DSM)保藏號(hào)的信息。表21.用于克隆e-葡萄糖苷酶基因的探針、噬菌體克隆及選擇的亞克隆、質(zhì)粒名稱及大腸桿菌菌株的相應(yīng)保藏號(hào)。<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>(a包含終止密碼子(b不包含終止密碼子表23.嗜熱枝頂孢菌、嗜熱毛殼菌及金黃色嗜熱子囊菌的推導(dǎo)e-葡萄糖苷酶序列的概要。ss，信號(hào)序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>(a信號(hào)序列的預(yù)測(cè)利用SignalPV3.0程序進(jìn)行(Nielsen等，1997;Bendtsen等,2004);NN值利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)得到及HMM值利用隱馬爾可夫模型得到。(b蛋白質(zhì)中存在纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。(c不包含預(yù)測(cè)的信號(hào)序列。該預(yù)測(cè)于ExPASy服務(wù)器利用ComputepI/MW工具進(jìn)行(Gasteiger等，2003)。(d利用NetNGlyc1.0程序預(yù)測(cè)推定的N糖基化位點(diǎn)N-X-S/T(Gupta等，2004)。枝頂孢菌/3G_101/Cel3A、毛殼'菌)3G—76/Cel3A及嗜熱子囊菌/3G—81/Cel3A/3-葡萄糖苷酶的推導(dǎo)蛋白質(zhì)序列與糖基水解酶家族3的酶具有同源性，因此確認(rèn)這些被分離的基因?qū)儆诖嘶蚣易?。枝頂孢菌、毛殼菌及嗜熱子囊?-葡萄糖苷酶的最相近的對(duì)應(yīng)物分別為稻瘟菌(P-葡萄糖苷酶，AY849670)、粗糙脈孢菌(假設(shè)性，XM_324308)及埃莫森籃狀菌(e-葡萄糖苷酶，AY072918)中者(表24)。發(fā)現(xiàn)的最高序列同一性(73.2%)是嗜熱毛殼菌eG—76/Cel3A與粗糙脈孢菌的假設(shè)性蛋白質(zhì)，表示新穎的酶基因被克隆。表24.推導(dǎo)的嗜熱枝頂孢菌eG—101/Cel3A、嗜熱毛殼菌(8G一76/Cel3A及金黃色嗜熱子囊菌]8G_81/Cel3A的/3-葡萄糖苷酶與其同源性配對(duì)物的比較。該比對(duì)利用EMBOSS程序包的Needle程序進(jìn)行。*表示本研究克隆的基因所編碼的p-葡萄糖苷酶。<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>實(shí)施例21.在里氏木霉中生產(chǎn)重組的e-葡萄糖苷酶按照實(shí)施例14所述，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒以生產(chǎn)重組枝頂孢菌/3G—101/Cel3A、毛殼菌0G—76/Cel3A及嗜熱子囊菌/3G_81/CeI3A蛋白質(zhì)。線性表達(dá)盒(表25)通過(guò)限制酶消化從載體骨架分離、轉(zhuǎn)化導(dǎo)入里氏木霉A96或A33(這兩種菌株皆刪除了編碼4種主要纖維素酶CBHI/Cel7A、CBHII/Cel6A、EGI/Cel7B及EGII/Cel5A基因)且依實(shí)施例14所述純化轉(zhuǎn)化體。表25.用于在里氏木霉中生產(chǎn)嗜熱枝頂孢菌/3G一101/Cel3A、嗜熱毛殼菌/3G一76/Cel3A及金黃色嗜熱子囊菌81/Cel3A的P-葡萄糖苷酶所構(gòu)建的表達(dá)盒。表達(dá)盒的示意性結(jié)構(gòu)表述于圖2。<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>(a用于里氏木霉轉(zhuǎn)化的表達(dá)盒利用EcoRI或Notl消化從載體骨架中分離。(b顯示包含在表達(dá)盒中的克隆基因的終止密碼子后的核苷酸數(shù)量。括號(hào)中顯示位于基因的3'區(qū)域用來(lái)構(gòu)建表達(dá)盒的限制位點(diǎn)。轉(zhuǎn)化體的P葡聚糖酶生產(chǎn)是由搖瓶培養(yǎng)的培養(yǎng)上清液分析(50毫升)。轉(zhuǎn)化體如實(shí)施例14所述生長(zhǎng)，且重組蛋白質(zhì)的酶活性依Bailey和Nevalainen1981所述，利用4-硝基苯基-P-D-吡喃葡糖苷底物于培養(yǎng)上清液中測(cè)量。重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)還通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳從培養(yǎng)上清液分析。此外，嗜熱子囊菌PG一81的表達(dá)如實(shí)施例19所述用抗PG—81抗體經(jīng)Western印跡分析驗(yàn)證。選擇的轉(zhuǎn)化體的基因型利用表達(dá)盒作為探針以Souther印跡法分析。異源性生產(chǎn)的e-葡萄糖苷酶的最適pH利用4-硝基苯基-P-D-吡喃葡糖苷作為底物，于pH3.0至8.0的范圍內(nèi)于通用馬氏緩沖液中測(cè)定。枝頂孢菌PG一101、毛殼菌PG—76及嗜熱子囊菌eG一81的最適pH分別為pH4.5、5.5及4.5(圖7A)。這些P-葡萄糖苷酶的最適酶活性溫度如上述于50至85'C的溫度范圍內(nèi)測(cè)定。枝頂孢菌/3G一101/Cel3A、毛殼菌/3G—76/Cel3A及嗜熱子囊菌)8G一81/Cel3A的酶最高活性分別被測(cè)定為在70。C、65。C及75。C(圖7B)。選擇的轉(zhuǎn)化體如實(shí)施例14所述，于2升生物反應(yīng)器中培養(yǎng)4天(28°C，pH4.2)，以獲得用于應(yīng)用測(cè)試的物質(zhì)。實(shí)施例22.克隆嗜熱枝頂孢菌ALK04245及金黃色嗜熱子囊菌ALK04242的木聚糖酶基因如實(shí)施例13所述使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)。枝頂孢菌基因組文庫(kù)的構(gòu)建巳于實(shí)施例12中描述。源自純化的枝頂孢菌木聚糖酶的肽與糖基水解酶家族10的木聚糖酶具有同源性，例如灰腐質(zhì)霉XYNI(AB001030)。源自嗜熱子囊菌木聚糖酶的所有肽與已發(fā)表的金黃色嗜熱子囊菌XYNA序列(AJ132635)完全一致，因此證實(shí)該純化的蛋白質(zhì)是相同的酶。因此嗜熱子囊菌木聚糖酶基因通過(guò)PCR從基因組DNA擴(kuò)增。為了擴(kuò)增用于從基因組文庫(kù)中篩選枝頂孢菌木聚糖酶基因的探針，根據(jù)肽序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物(實(shí)施例11，表5)。蛋白質(zhì)序列中肽的順序及引物的相應(yīng)有義或義性質(zhì)是從與同源性特異腐質(zhì)霉XYNI序列(AB001030)的比較中推導(dǎo)而來(lái)。有義引物序列(GAYGGYGAYGCSACYTAYATG)是根據(jù)肽3(氨基酸2至8),而反義引物(YTTYTGRTCRTAYTCSAGRTTRTA)是根據(jù)肽1(氨基酸4至11)。預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物(自同源性特異腐質(zhì)霉XYNI序列AB001030估算)自反應(yīng)中得到。該約0.7kb大小的DNA片段被克隆導(dǎo)入pCR4-T0P0TA載體(Invitrogen，USA)，得到質(zhì)粒pALK1714，且通過(guò)測(cè)序表征。該P(yáng)CR產(chǎn)物的推導(dǎo)氨基酸序列與糖基水解酶家族10的一些已發(fā)表的木聚糖酶序列具有同源性(BLAST程序，國(guó)家生物技術(shù)信息中心；Altschul等，1990)。來(lái)自質(zhì)粒pALK1714的插入片段根據(jù)廠商說(shuō)明(Roche,德國(guó))，通過(guò)限制性酶消化而分離并以洋地黃毒甙標(biāo)記。約l-2Xl()S個(gè)來(lái)自擴(kuò)增的枝頂孢菌基因組文庫(kù)的噬斑如實(shí)施例18所述被篩選。得到一些陽(yáng)性噬斑，其中有5個(gè)強(qiáng)烈雜交噬斑被純化。噬菌體DNA通過(guò)Souther印跡雜交法被分離并分析。與探針雜交的0.3kbXbal限制性片段被亞克隆導(dǎo)入pBluescriptIIKS+載體(Stratagene，USA)，形成質(zhì)粒pALK1725。pALK1725的相關(guān)部分被測(cè)序并發(fā)現(xiàn)其包含全長(zhǎng)嗜熱枝頂孢菌xynlOA基因(SEQIDNO:19)。包含pALK1725的大腸桿菌菌株在DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH培養(yǎng)物保藏中心的保藏號(hào)為DSM16726。金黃色嗜熱子囊菌xynlOA基因(SEQIDNO:17)利用PCR反應(yīng)直接自分離的基因組DNA擴(kuò)增。用于擴(kuò)增該基因的正向是根據(jù)發(fā)表的金黃色嗜熱子囊菌xynA基因(AJ132635)設(shè)計(jì)。PCR反應(yīng)混合物包含50毫摩爾Tris-HClpH9.0、15毫摩爾硫酸銨、0.1%TritonX-lOO、1.5毫摩爾氯化鎂、0.3毫摩爾dNTP、1微摩爾各引物、1單位DynazymeEXTDNA聚合酶(Finnzymes，芬蘭)及約0.5微克的嗜熱子囊菌基因組DNA。PCR反應(yīng)的條件如下95'C初次變性5分鐘，接著30個(gè)循環(huán)的95°C1分鐘，于60至66匸退火1分鐘，72。C延伸3分鐘及72'C最后延伸10分鐘。該包含準(zhǔn)確基因(從啟動(dòng)至終止密碼子)的1.9kb擴(kuò)增產(chǎn)物被作為SacII-BamHI片段克隆導(dǎo)入pBluescriptIIKS+載體。三個(gè)獨(dú)立克隆被測(cè)序且選擇一個(gè)克隆被并命名為pALK1715。包含pALK1715的大腸桿菌菌株于DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH培養(yǎng)物保藏中心的保藏號(hào)為DSM16724。該基因及推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO:17至20)的相關(guān)信息分別歸納于表26及27。純化的枝頂孢菌XYN—60及嗜熱子囊菌XYN一30蛋白質(zhì)的肽序列可見(jiàn)于該克隆基因(分別為AtxynlOA及TaxynlOA)的相應(yīng)推導(dǎo)氨基酸序列，證明適當(dāng)?shù)幕虮豢寺　１?6.從嗜熱枝'頇孢菌及金黃色嗜熱子囊菌分離的木聚糖酶基因的概要。木聚糖酶基含內(nèi)含編碼區(qū)域內(nèi)含子內(nèi)含子長(zhǎng)度SEQID因子的長(zhǎng)(bpf數(shù)量(bp)NO:度(bp產(chǎn)AtxynlOA147112482135,8519TaxynlOA1.9139871073,74,68,103,69,65,93,66,100，21217(a包含終止密碼子(b不包含終止密碼子表27.嗜熱枝頂孢菌及金黃色嗜熱子囊菌的推導(dǎo)木聚糖酶序列的概要。ss，信號(hào)序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>(a信號(hào)序列的預(yù)測(cè)利用SignalPV3.0程序進(jìn)行(Nielsen等,1997;Bendtsen等，2004);NN值利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)得到及HMM值利用隱馬爾可夫模型得到。(b存在碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域CBD，顯示C端CBD的氨基酸(根據(jù)全長(zhǎng)多肽編號(hào))。(c不包含預(yù)測(cè)的信號(hào)序列。該預(yù)測(cè)于ExPASy服務(wù)器利用ComputepI/MW工具進(jìn)行(Gasteiger等,2003)。(d利用NetNGlyc1.0程序預(yù)測(cè)假定的N糖基化位點(diǎn)N-X-S/T(Gupta等，2004)。(e根據(jù)LoLeggio等，1999枝頂孢菌及嗜熱子囊菌木聚糖酶的推導(dǎo)蛋白質(zhì)序列與糖基水解酶家族10的一些酶H有同源性，鑒別相應(yīng)的基因是家族10木聚糖酶的成員。發(fā)現(xiàn)的枝頂孢菌XYN—60/XynlOA最相近的對(duì)應(yīng)物是灰腐質(zhì)霉XYLI(AB001030)，其顯示與XYN—60具有67.1%同一性(表28)。該分離的金黃色嗜熱子囊菌XYN—30/XynlOA木聚糖酶的預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)序列與發(fā)表的金黃色嗜熱子囊菌XYNA(P23360，表28)的序列完全相同。最相近的同源性在黑曲霉菌的木聚糖酶序列中發(fā)現(xiàn)(A62445，69.7%同一性)。表28.推導(dǎo)的嗜熱枝頂孢菌XYN_60/XynlOA及金黃色嗜熱子囊菌XYN一30/XynlOA木聚糖酶與其同源性配對(duì)物的比較。該比對(duì)利用EMBOSS程序包的Needle算法進(jìn)行。*表示本研究克隆的基因所編碼的木聚糖酶。有機(jī)體、酶及登錄號(hào)同一性(％)*金黃色嗜熱子囊菌XYN—30100.0金黃色嗜熱子囊菌XynA，P23360100.0金黃色嗜熱子囊菌XynA,AF12752999.4黑.曲霉菌木聚糖酶，A6244569.7棘孢曲霉菌木聚糖酶，AR13784469.9土曲霉菌(Aspergillusterreus)家族10xyn，DQ08743665.0醬油曲霉菌(Aspergillussojae)，XynXIAB04041463.8產(chǎn)黃青霉菌(Penicilliumchrysogenum)木聚糖酶AY58358562.5*嗜熱枝頂孢菌XYN—60跳0灰腐質(zhì)霉XYLI，AB00103067.1稻瘟病菌70-15，假設(shè)性XM—36494763.8棘孢曲霉菌木聚糖酶，AR14983953.7埃莫森籃狀菌木聚糖酶，AX40383151.8玉蜀黍赤霉(Gibberellazeae)木聚糖酶，AY57596251.4稻瘟病菌XYL5,AY14434848.5埃莫森籃狀菌，AX17228746.9實(shí)施例23.在里氏木霉中生產(chǎn)重組木聚糖酶按照實(shí)施例14所述，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒以生產(chǎn)重組枝頂孢菌XYN—60/XynlOA及嗜熱子囊菌XYN—30/XynlOA蛋白質(zhì)。線性表達(dá)盒(表29)通過(guò)限制酶消化從載體骨架分離、轉(zhuǎn)化導(dǎo)入里氏木霉A96，且依實(shí)施例14所述純化轉(zhuǎn)化體。表29.為了在里氏木霉中生產(chǎn)嗜熱枝頂孢菌XYN—60/XynlOA及金黃色嗜熱子囊菌XYN—30/XynlOA木聚糖酶所構(gòu)建的表達(dá)盒。表達(dá)盒的示意性結(jié)構(gòu)示于圖2。<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>(a用于里氏木霉轉(zhuǎn)化的表達(dá)盒通過(guò)EcoRI消化從載體骨架中分離。(b顯示包含在表達(dá)盒中的克隆基因的終止密碼子后的核苷酸數(shù)量。括號(hào)中顯示位于基因的3'區(qū)域用來(lái)構(gòu)建表達(dá)盒的限制位點(diǎn)。轉(zhuǎn)化體的木聚糖酶生產(chǎn)從搖瓶培養(yǎng)的培養(yǎng)上清液分析(50毫升)。轉(zhuǎn)化體按照實(shí)施例14生長(zhǎng)，且重組蛋白質(zhì)的酶活性依Bailey和Poutanen1989所述，于50毫摩爾檸檬酸鹽緩沖液pH5.3中測(cè)量50°C下培養(yǎng)上清液中還原糖自樺木木聚糖(1%重量/體積)的釋出。重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)還通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳從培養(yǎng)上清液中分析。此外，這兩種木聚糖酶的表達(dá)如實(shí)施例19所述以抗XYN—30或抗XYN一60抗體通過(guò)Western印跡法確認(rèn)。選擇轉(zhuǎn)化體的基因型是利用表達(dá)盒作為探針以Souther印跡法分析。嗜熱子囊菌XYN_30/XynlOA于里氏木霉中生產(chǎn)，且該異源性生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的最適pH利用樺木木聚糖作為底物，于pH3.0至8.0的范圍內(nèi)在通用馬氏緩沖液中測(cè)定(圖8A)。最適pH值測(cè)定為pH4.5。XYN—30酶活性的最適溫度經(jīng)測(cè)定為75°C(圖8B)。選擇的轉(zhuǎn)化體如實(shí)施例14所述，于2升生物反應(yīng)器中培養(yǎng)4天(28°C，pH4.2)，以獲得用于應(yīng)用測(cè)試的物質(zhì)。實(shí)施例24.重組纖維二糖水解酶在水解中的性能純化的重組纖維二糖水解酶的性能在水解研究中以純化的里氏木霉酶評(píng)估。水解用純化酶的受控混合物作用于數(shù)種經(jīng)預(yù)處理的底物進(jìn)行。依實(shí)施例14及15所述，獲得包含不同的克隆CBH/Cel7酶的里氏木霉培養(yǎng)過(guò)濾物，且利用實(shí)施例2所述的親和色譜法純化CBH酶。此外，純里氏木霉纖維素酶(依Suurnakki等，2000所述純化)被用于酶混合物中。試驗(yàn)中所使用的纖維二糖水解酶為金黃色嗜熱子囊菌ALK04242CBH(TaCel7A)金黃色嗜熱子囊菌ALK04242CBH(TaCel7A)，帶有基因連接的里氏木霉CBD(TaCel7A+TrCBD)金黃色嗜熱子囊菌ALK04242CBH(TaCel7A)，帶有基因連接的嗜熱毛殼菌CBD(TaCel7A+CtCBD)嗜熱'枝頂孢菌ALK04245CBH(AtCel7A)嗜熱毛殼菌ALK04265CBH(CtCel7A)各種待測(cè)試的CBH/Cd7(劑量14.5毫克/克底物干物質(zhì))與里氏木霉的EGII/Cel5A(3.6毫克/克)或與包含里氏木霉EGI/Cel7B(1.8毫克/克)、EGII/Cel5A(1.8毫克/克)、木聚糖酶pl9(Tenkanen等1992)(5000nkat/克)及乙酰木聚糖酯酶(acetylxylanesterase)(AXE)(Sundberg和Poutanen，1991)(250nkat/克)的混合物一起使用。所有混合物均額外添加來(lái)自商業(yè)酶制劑Novozym188的/3-葡萄糖苷酶(176nkat/克干重)。包含酶混合物及懸浮于0.05摩爾乙酸鈉的10毫克(干物質(zhì))/毫升底物的三份重復(fù)試管于45'C下以磁攪拌混合孵育48小時(shí)。還制備含滅活的酶及相應(yīng)底物的參比樣品。水解產(chǎn)物的釋出用葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)以DNS法測(cè)定還原糖(表3Q)。下列底物于試驗(yàn)中使用結(jié)晶纖維素(Avicel)經(jīng)清洗蒸氣預(yù)處理的云杉纖維(以3%重量/重量二氧化硫浸滲20分鐘，之后于215'C下以蒸氣預(yù)處理5分鐘)，干物質(zhì)25.9%(SPRUCE)。經(jīng)清洗的濕氧化玉米桿纖維(WOCS)經(jīng)清洗蒸氣預(yù)處理的柳木纖維(于210'C下預(yù)處理14分鐘)，干物質(zhì)23.0%(WILLOW)。表30.用CBH酶水解產(chǎn)物(45°C，pH5.0)。48小時(shí)水解后的反應(yīng)產(chǎn)物為還原糖(毫克/毫升)，測(cè)量葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)?？s寫CBH=纖維二糖水解酶；EGI二里氏木霉的內(nèi)切葡聚糖酶I(Cel7B);EGII=里氏木霉的內(nèi)切葡聚糖酶II(Cel5A);bG^-葡萄糖苷酶(來(lái)自Novozym188);XYI^里氏木霉的木聚糖酶p19(XYNII)，AXE-里氏木霉的乙酰木聚糖酯酶；nd二未進(jìn)行。<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>在表30中，不同的纖維二糖水解酶根據(jù)相同的蛋白質(zhì)水解劑量加以比較。結(jié)果顯示在纖維素底物(Avicd及云杉纖維)上，具有基因連接的CBD的金黃色嗜熱子囊菌的Cel7A比里氏木霉CBHI/Cel7A顯示出明顯較高的水解作用。沒(méi)有CBD，則的金黃色嗜熱子囊菌Cel7A對(duì)這些底物的效率較低。嗜熱枝頂孢菌及嗜熱毛殼菌纖維二糖水解酶對(duì)一些底物的性能也比里氏木霉CBHI/Cel7A好；特別是，嗜熱毛殼菌對(duì)純纖維素(Avicel)表現(xiàn)出高效率。當(dāng)?shù)孜锇@著量的半纖維素(柳木及玉米桿)時(shí)，CBHI/Cd7A酶明顯同時(shí)需要額外的半纖維素酶及內(nèi)切葡聚糖酶才能有效作用。若額外的半纖維素酶不存在時(shí)，具有基因連接的CBD的金黃色嗜熱子囊菌Cd7A再次呈現(xiàn)明顯的最高的水解活性。若加上最重要的半纖維素分解酶(木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶及EGI)，具有基因連接的CBD的金黃色嗜熱子囊菌的Cel7A同樣呈現(xiàn)最高效率。嗜熱枝頂孢菌Cd7A較里氏木霉酶更有效且嗜熱毛殼菌Cel7A產(chǎn)生的水解產(chǎn)物與里氏木霉CBHI/Cel7A的水平相同。里氏木霉的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域看來(lái)比嗜熱毛殼苗的CBD在金黃色嗜熱子囊菌Cel7A的水解性能效率略好，即使該差異相當(dāng)小?？梢宰龀鼋Y(jié)論，當(dāng)木霉菌酶混合物中CBHI/Cel7A被本發(fā)明所生產(chǎn)的纖維二糖水解酶取代時(shí)，就具有基因連接的CBD的金黃色嗜熱子囊菌Cel7A而言，其以本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所判斷的水解活性被明顯改善，就嗜熱枝頂孢菌Cd7A及嗜熱毛殼菌Cd7A而言亦得到改善。同時(shí)考慮到本發(fā)明所生產(chǎn)的纖維二糖水解酶較好的溫度穩(wěn)定性，結(jié)果顯示在45'C以上的溫度下使用本發(fā)明生產(chǎn)的纖維二糖水解酶可明顯改善纖維素酶的酶混合物的性能。實(shí)施例25.重組內(nèi)切葡聚糖酶于水解中的性能在與純化CBH/Cel7及CBH/Cel6酶混合的水解試驗(yàn)中，比較包含內(nèi)切葡聚糖酶的制劑對(duì)數(shù)種經(jīng)預(yù)處理底物的作用。依實(shí)施例19所述獲得包含不同的克隆內(nèi)切葡聚糖酶酶的里氏木霉培養(yǎng)過(guò)濾物。利用熱處理(6(TC，2小時(shí)，pH5)自混合物中去除不耐熱蛋白質(zhì)以富集該酶，上清液被使用于水解試驗(yàn)。此外，純里氏木霉纖維素酶(依Suurnakki等，2000所述純化)被用于酶混合物中。試驗(yàn)中所使用的內(nèi)切葡聚糖酶為嗜熱枝頂孢菌ALK04245內(nèi)切葡聚糖酶AtEG—40/Cel45A(ALK04245EG_40)嗜熱枝頂孢菌ALK04245內(nèi)切葡聚糖酶AtEG—40一like/Cel45B(ALK04245EG一40Jike)金黃色嗜熱子囊菌ALK04242內(nèi)切葡聚糖酶TaEG—28/Cel5A(ALK04242EG—28)下列底物于試驗(yàn)中使用經(jīng)清洗蒸氣預(yù)處理的云杉纖維(以3%二氧化硫浸滲20分鐘，之后于215。C下以蒸氣預(yù)處理5分鐘)，干物質(zhì)25.9%(SPRUCE)。汽爆的玉米桿纖維(于21(TC下以蒸氣預(yù)處理5分鐘)，干物質(zhì)化0%(SECS)待研究的內(nèi)切葡聚糖酶(劑量840nkat/克干物質(zhì)，根據(jù)IUPAC，1987的內(nèi)切葡聚糖酶對(duì)HEC的活性)與里氏木霉的纖維二糖水解酶(CBHI/Cel7A，8.1毫克/克干物質(zhì)及CBHII/Cel6A，2.0毫克/克干物質(zhì))或與具有基因連接的里氏木霉CBD的金黃色嗜熱子囊菌Cel7A(10.1毫克/克千物質(zhì))一起使用。里氏木霉的純化(Suuraakki等，2000)EGI(Cel7B)及EGII(Cd5A)亦被包含于試驗(yàn)中以供比較。所有混合物均額外添加來(lái)自Novozym188的P-葡萄糖苷酶(為了使P-葡萄糖苷酶總劑量達(dá)560nkat/克干重，使用相對(duì)高劑量以補(bǔ)償不同EG制劑背景活性的差異)。三份重復(fù)試管于45X:下混合孵育達(dá)48小時(shí)，并準(zhǔn)備含不活化的酶及相應(yīng)底物的參比樣品。水解產(chǎn)物的釋出采用以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)的DNS法測(cè)定還原糖(表31)。表31.不同內(nèi)切葡聚糖酶制劑與里氏木霉的纖維二糖水解酶或與包含里氏木霉CBD的金黃色嗜熱子囊菌Cel7A—起使用時(shí)的水解產(chǎn)物。于48小時(shí)水解(45°C,pH5.0)后的反應(yīng)產(chǎn)物為還原糖(毫克/毫升)，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量?？s寫CBHI二里氏木霉的纖維二糖水解酶I(Cel7A);CBHII二里氏木霉的纖維二糖水解酶II(Cel6A);EGI二里氏木霉的內(nèi)切葡聚糖酶I(Cel7B);EGII二里氏木霉的內(nèi)切葡聚糖酶II(Cel5A);bG二e-葡萄糖苷酶(來(lái)自Novozym188);nd=未進(jìn)行。<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>在表31中，不同的內(nèi)切葡聚糖酶根據(jù)相同的水解活性劑量加以比較。這有利于試驗(yàn)中所使用的對(duì)底物(羥乙基纖維素)特異活性較低的酶，且低估對(duì)羥乙基纖維素具有高特異活性酶的效率。在任何情況下，結(jié)果顯示嗜熱枝頂孢菌內(nèi)切葡聚糖酶在與混合物中使用的這兩種纖維二糖水解酶一起作用時(shí)具有非常好的水解表現(xiàn)。嗜熱枝頂孢菌內(nèi)切葡聚糖酶的表現(xiàn)與里氏木霉EGI/Cel7B類似，其對(duì)于含半纖維素的玉米桿底物是非常有效的酶，因?yàn)樗膹?qiáng)烈木聚糖酶副活性。金黃色嗜熱子囊菌內(nèi)切葡聚糖酶Cel5A(ALK04242EG_28)比里氏木霉酶顯示較低的水解活性?？梢宰龀鲆韵陆Y(jié)論，來(lái)自嗜熱枝頂孢菌的內(nèi)切葡聚糖酶與相應(yīng)的木霉菌酶比較時(shí)，在此實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所評(píng)判的水解作用上，表現(xiàn)出相當(dāng)或提高的效率。同時(shí)考慮到本發(fā)明所描述的內(nèi)切葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性，結(jié)果顯示在高于45"C的溫度下使用本發(fā)明所述的內(nèi)切葡聚糖酶可改善纖維素酶混合物的性能。實(shí)施例26.于高溫下水解經(jīng)蒸氣預(yù)處理的云杉令干物質(zhì)為25.9%的經(jīng)清洗的汽爆云杉纖維(以3%重量/重量二氧化硫浸滲20分鐘，之后于215"C下以蒸氣預(yù)處理5分鐘)以10毫克/毫升的稠度懸浮于5毫升的0.05摩爾乙酸鈉緩沖液中。此底物利用不同的酶混合物于試管中在調(diào)節(jié)到不同溫度的水浴中磁性攪拌水解達(dá)72小時(shí)。于各采樣點(diǎn)，取出水解中的三份重復(fù)試管，煮沸10分鐘以終止酶水解，將其離心，分析上清液中水解的反應(yīng)產(chǎn)物。僅包含底物的空白(僅加入緩沖液代替酶)亦以相應(yīng)條件孵育。利用下列成分制備嗜熱性纖維素酶的混合物嗜熱性CBH/Cel7制劑，其包含具有基因的里氏木霉CBHI/Cel7A的CBD的金黃色嗜熱子囊菌ALK04242Cel7A。該蛋白質(zhì)制劑以實(shí)施例15所述生產(chǎn)并根據(jù)實(shí)施例2純化，形成純化的TaCd7A+TrCBD制劑，其蛋白質(zhì)含量為5.6毫克/毫升。嗜熱性內(nèi)切葡聚糖酶制劑，其包含嗜熱枝頂孢菌ALK04245內(nèi)切葡聚糖酶AtEG_40/Cel45A。該蛋白質(zhì)如實(shí)施例19所述于里氏木霉中生產(chǎn)。為了富集該嗜熱性成分，該耗盡培養(yǎng)基經(jīng)熱處理(60'C下2小時(shí))。所得到的制劑包含4.9毫克/毫升的蛋白質(zhì)及422nkat/毫升的內(nèi)切葡聚糖酶活性(根據(jù)IUPAC，1987)。依實(shí)施例21所述制備嗜熱性e-葡萄糖苷酶制劑，其包含金黃色嗜熱子囊菌ALK04242P-葡萄糖苷酶TaPG_81/Cel3A。為了富集該嗜熱性成分，發(fā)酵液經(jīng)熱處理(65'C下2小時(shí))。所得到的制劑包含4.3毫克/毫升蛋白質(zhì)及6270nkat/毫升的|3-葡萄糖苷酶活性(根據(jù)Bailey和Linko，1990)。這些酶制劑組合如下(每10毫升混合物)CBH/Cel7制劑4.51毫升，內(nèi)切葡聚糖酶制劑5.19毫升及3-葡萄糖苷酶制劑0.29毫升。此混合物被用作嗜熱性酶的"混合物l"。為了比較及參比，構(gòu)建商用里氏木霉酶的現(xiàn)有技術(shù)混合物，組合下列成分(每10毫升)8.05毫升Celluclast1，5LFG(來(lái)自NovozymesA/S)及1.95毫升Novozym188(來(lái)自NovozymesA/S)。此被稱為"里氏木霉酶"。酶基于混合物的FPU活性定劑量，"混合物1"每1克干物質(zhì)云杉底物使用5.5FPU的劑量，及"里氏木霉酶"每1克干物質(zhì)云杉底物使用5.8FPU。于水解后24、48及72小時(shí)收集樣品并如上所述處理。利用以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)的還原糖分析(Berafeld，1955)定量水解產(chǎn)物。水解產(chǎn)物的量于圖9以還原糖表示。結(jié)果清楚地顯示本發(fā)明所述的酶相較于現(xiàn)有技術(shù)的里氏木霉酶于55及6(TC下對(duì)云杉底物有更好的性能。根據(jù)HPLC分析，自底物的最高糖收率為每10毫克干云杉底物5.67毫克。由于酶劑量相對(duì)較低，最終糖收率明顯較低。對(duì)熱穩(wěn)定性酶而言，在55r及6(TC下基于還原糖分析的糖收率理論值分別為66%及57%。對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的里氏木霉酶而言，在55r及6(TC下分別只有31X及11°%。實(shí)施例27.于高溫下水解經(jīng)蒸氣預(yù)處理的玉米桿令干物質(zhì)為45.3%的汽爆玉米桿纖維(于195t:下處理5分鐘)以10毫克/毫升的稠度懸浮于5毫升的0.05摩爾乙酸鈉緩沖液中。其處理及測(cè)量按實(shí)施例26所述進(jìn)行。利用下列成分構(gòu)建本發(fā)明所述的嗜熱性纖維素酶的混合物嗜熱性CBH制劑，其包含具有基因連接的里氏木霉CBHI/Cel7A的CBD的金黃色嗜熱子囊菌ALK04242Cel7A(TaCel7A+TrCBD，實(shí)施例15)。該制劑的蛋白質(zhì)含量為31毫克/毫升。包含嗜熱枝頂孢菌ALK04245內(nèi)切葡聚糖酶AtEG—40/Cel45A的嗜熱性內(nèi)切葡聚糖酶制劑如實(shí)施例19所述獲得。該濃縮的酶制劑包含2057nkat/毫升的內(nèi)切葡聚糖酶活性(根據(jù)IUPAC，1987)。依實(shí)施例21所述得到包含金黃色嗜熱子囊菌ALK04242{3-葡萄糖苷酶Ta81/Cel3A的嗜熱性e-葡萄糖苷酶制劑，其含有11500nkat/毫升的f3-葡萄糖苷酶活性(根據(jù)Bailey和Linko，1990)。嗜熱性木聚糖酶產(chǎn)物，其包含源自彎曲野野村菌(Nonomuraeaflexuosa)DSM43186的AM24木聚糖酶。該產(chǎn)物利用如WO2005/100557所述的已經(jīng)以表達(dá)盒PALK1502轉(zhuǎn)化的重組里氏木霉菌株制備。該固體產(chǎn)物溶解于水以形成10%溶液并得到具有208000nkat/毫升木聚糖酶活性的酶制劑(依Bailey等，1992分析)。這些酶制劑式組合如下(每10毫升混合物)CBH/Cel7制劑7.79毫升，內(nèi)切葡聚糖酶制劑0.96毫升，P-葡萄糖苷酶制劑1.14毫升及木聚糖酶制劑0.31毫升。此混合物被當(dāng)作嗜熱性酶的"混合物2"使用。為了比較及參比，組合(每10毫升)8.05毫升Celluclast1，5LFG(來(lái)自NovozymesA/S)及1.95毫升Novozym188(來(lái)自NovozymesA/S)，構(gòu)建商用里氏木霉酶的現(xiàn)有技術(shù)混合物。此被稱為"里氏木霉酶"。于水解后24、48及72小時(shí)收集樣品并按上述處理。利用以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)的還原糖分析(Bernfeld,1955)，定量水解產(chǎn)物。將含酶樣品的結(jié)果減去底物空白的結(jié)果，以還原糖表示的水解產(chǎn)物濃度如圖10所示。結(jié)果清楚地顯示本發(fā)明所述的酶相較于現(xiàn)有技術(shù)的木霉酶有更好的性能。在45'C下，嗜熱性酶的混合物相較于里氏木霉酶顯示更有效率的水解水解更快，同時(shí)得到更高的糖收率。根據(jù)HPLC分析，自底物的最高糖收率(包括使用的未清洗底物中的游離可溶性糖)為每10毫克干底物5.73毫克。因此，混合物2酶的水解在48小時(shí)內(nèi)幾乎完成。在55'C及57.5'C下，本發(fā)明所述的嗜熱性酶相較于現(xiàn)有技術(shù)木霉酶亦顯示明顯更好的性能。實(shí)施例28.于高溫下利用熱穩(wěn)定性木聚糖酶混合物水解經(jīng)預(yù)處理的玉米桿重復(fù)實(shí)施例27所述的程序，除了木聚糖酶產(chǎn)物XT02026A3被包含了在里氏木霉中生產(chǎn)的金黃色嗜熱子囊菌ALK04242木聚糖酶TaXYN—30/XynlOA的嗜熱性木聚糖酶制劑取代。如實(shí)施例23所述生產(chǎn)的發(fā)酵液含有132000nkat/毫升的木聚糖酶活性(依Bailey等,1992分析)。這些酶制劑組合如下(每10毫升混合物)CBH/Cel7制齊U7.64毫升、內(nèi)切葡聚糖酶制劑0.96毫升、e-葡萄糖苷酶制劑1.15毫升及木聚糖酶制劑0.25毫升。此混合物被當(dāng)作嗜熱性酶的"混合物3"使用。為了比較及參比，組合(每10毫升)8.05毫升的Celluclast1，5LFG(來(lái)自NovozymesA/S)及1.95毫升的Novozym188(來(lái)自NovozymesA/S)，構(gòu)建商用里氏木霉酶的現(xiàn)有技術(shù)混合物。此被稱為"里氏木霉酶"。于水解后24、48及72小時(shí)收集樣品并按上述處理。利用使用葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)的還原糖分析(Bernfeld，1955)定量水解產(chǎn)物。將含酶樣品的結(jié)果減去底物空白的結(jié)果，以還原糖表示的水解產(chǎn)物濃度如圖11所示。結(jié)果清楚地顯示本發(fā)明所述的酶混合物相較于現(xiàn)有技術(shù)的木霉酶的性能更好。在45'C下，嗜熱性酶的混合物相較于里氏木霉酶顯示更有效率的水解。在55'C及60"C下，本發(fā)明所述的嗜熱性酶相較于現(xiàn)有技術(shù)的木霉酶清楚地顯示更好的水解性能。新的酶混合物于6(TC的性能與現(xiàn)有技術(shù)酶于45'C的性能處于相同的水平。實(shí)施例29.于高溫下利用熱穩(wěn)定性木聚糖酶混合物水解經(jīng)預(yù)處理的云杉重復(fù)實(shí)施例28所述的程序，以清洗過(guò)的汽爆云杉纖維(以3%重量/重量二氧化硫浸滲20分鐘，之后于215"C下以蒸氣預(yù)處理5分鐘，干物質(zhì)為25.9%)為底物，水解溫度為45、55及6(TC。于水解后24、48及72小時(shí)收集樣品并按上述處理。利用使用葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)的還原糖分析(Bemfeld,1955)定量水解產(chǎn)物。將含酶樣品的結(jié)果減去底物空白的結(jié)果，以還原糖表示的水解產(chǎn)物濃度如圖12所示。結(jié)果清楚地顯示本發(fā)明所述的酶混合物相較于現(xiàn)有技術(shù)的木霉酶在所有的研究溫度下都具有更好的性能。在45'C下，嗜熱性酶的混合物相較于里氏木霉酶顯示更有效率的水解，這明顯是因?yàn)樵陂L(zhǎng)期水解時(shí)具有更好的穩(wěn)定性。本發(fā)明所述的酶混合物在55'C的效率仍與45'C處于相同水平，然而現(xiàn)有技術(shù)的混合物在此溫度下對(duì)底物效率差。本發(fā)明所述的嗜熱性酶于6(TC下呈現(xiàn)降低的水解作用，然而與現(xiàn)有技術(shù)的酶于45'C的性能幾乎在相同水平上。實(shí)施例30.評(píng)價(jià)來(lái)自嗜熱枝頂孢菌ALK04245、嗜熱毛殼菌ALK04261及金黃色嗜熱子囊菌ALK04242的P-葡萄糖苷酶的葡萄糖抑制由嗜熱枝頂孢菌ALK04245、嗜熱毛殼菌ALK04261及金黃色嗜熱子囊菌ALK04242菌株所生產(chǎn)的培養(yǎng)過(guò)濾液如實(shí)施例1中所述。這些制劑的i8-葡萄糖苷酶活性(依Bailey和Linko，1990測(cè)量)分別為21.4nkat/毫升、5.6nkat/毫升及18.6nkat/毫升。為了比較，本試驗(yàn)亦包含商業(yè)酶Celluclast1，5L(j3-葡萄糖苷酶534nkat/毫升)及Novozym188(/3-葡萄糖苷酶5840nkat/毫升)。為了評(píng)估不同的P-葡萄糖苷酶對(duì)葡萄糖抑制的敏感性，在不同濃度的葡萄糖存在下進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)活性分析程序。e-葡萄糖苷酶活性分析的底物(對(duì)硝基苯基-e-D-吡喃葡糖苷)溶液中添加葡萄糖，令分析混合物中的葡萄糖濃度調(diào)整為0至0.5摩爾的值。除此葡萄糖添加之外，該分析使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行(Bailey和Linko,1990)。不同葡萄糖濃度存在時(shí)的活性以不含葡萄糖的活性的百分比表示于圖13。結(jié)果顯示來(lái)自嗜熱毛殼菌及金黃色嗜熱子囊菌的P-葡萄糖苷酶受到葡萄糖抑制的影響小于商用酶中存在的e-葡萄糖苷酶Novozym188中的曲霉菌源/3-葡萄糖苷酶或Celluclast1,5L中的木霉源j8-葡萄糖苷酶。嗜熱枝頂孢菌酶顯示與Celluclast的里氏木霉酶相當(dāng)?shù)谋憩F(xiàn)。尤其是嗜熱毛殼菌酶明顯較不受高葡萄糖濃度的影響。因此這些結(jié)果顯示考慮到葡萄糖的抑制，在高葡萄糖濃度的工業(yè)條件下，使用新P-葡萄糖苷酶，特別是來(lái)自嗜熱枝頂孢菌ALK04242及嗜熱毛殼菌ALK04261菌株，在水解中具有明顯的優(yōu)勢(shì)。實(shí)施例31.酶混合物于高溫下的濾紙活性酶制劑的濾紙活性是根據(jù)IUPAC(1987)方法測(cè)定，除了酶反應(yīng)于50至7(TC的溫度下進(jìn)行之外，按照程序進(jìn)行。計(jì)算的FPU活性單位是根據(jù)試驗(yàn)條件下于1小時(shí)內(nèi)水解4X濾紙底物所需的酶量。FPU活性被視為代表酶制劑的總纖維素酶活性。酶混合物為依實(shí)施例27所述制備的混合物2、依實(shí)施例28所述制備的混合物3、及混合物4?；旌衔?的制備是組合實(shí)施例27所述的酶制劑(每10毫升混合物)如下CBH/Cel7制劑7.84毫升，內(nèi)切葡聚糖酶制劑0.99毫升及P-葡萄糖苷酶制劑1.17毫升。作為參比用的酶混合物，代表現(xiàn)有技術(shù)混合物，為依實(shí)施例26所述的"里氏木霉酶"制劑制備的"里氏木霉酶A"。"里氏木霉酶B"的構(gòu)建是組合(每10毫升)8.05毫升EconaseCE(ABEnzymesOY,Rajamaki,芬蘭的商用里氏木霉纖維素酶制劑)及1.95毫升Novozym188(來(lái)自NovozymesA/S)。酶制劑于不同溫度下測(cè)定的FPU活性以標(biāo)準(zhǔn)(IUPAC，1987)條件(50'C)的百分比表示于圖14。結(jié)果清楚顯示本發(fā)明的混合物較之基于來(lái)自木霉及曲霉酶的現(xiàn)有技術(shù)混合物在高溫下(60至7(TC)具有較高的整體纖維素酶活性。實(shí)施例32.利用新穎的e-葡萄糖苷酶制備槐糖高濃度的淀粉水解物混合物(Nutriose74/968,Roquette)經(jīng)依實(shí)施例21所述生產(chǎn)的富含金黃色嗜熱子囊菌0G一81/Cel3A的酶制劑處理，以產(chǎn)生包含顯著量的纖維素酶誘導(dǎo)物(槐糖)的糖混合物以克服葡萄糖阻遏。富含TaPG—81/Cel3A的酶制劑被加入70%(重量/重量)Nutriose溶液中，使最終濃度為1克總蛋白/升。該混合物的容器在65'C水浴中恒速攪拌下孵育3天，并用來(lái)作為兩種不同木霉菌株(A47及Rut-C30)的搖瓶培養(yǎng)基的碳源。酶處理的作用是以7天搖瓶培養(yǎng)期間所形成的內(nèi)切葡聚糖酶活性測(cè)量。而參比培養(yǎng)于相同條件下以未經(jīng)處理的Nutriose為碳源進(jìn)行。用測(cè)試菌株在經(jīng)Ta0G一81/Cel3A預(yù)處理的Nutriose培養(yǎng)基上進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)中，得到增加超過(guò)兩倍的活性。結(jié)果顯示于圖15。保藏的有機(jī)體列表<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>("theCentralbureauVoorSchimmelculturesatUppsalalaan8，3584CT，Utrecht,theNether-lands(2)theCentralbureauVoorSchimmelculturesatOosterstraat1,3742SKBAARN,TheNether-lands("DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSMZ)，MascheroderWeglb，D-38124Braunschweig,Germany(4)[在目前儲(chǔ)存期結(jié)束后，樣品將按照關(guān)于使菌株于本專利可行使時(shí)間過(guò)后可取得的協(xié)議而儲(chǔ)藏。]參考文獻(xiàn)AltschulS.，GishW.,MillerW.,MyersE.W.andLipmanD.J.(1990)Basiclocalalignmentsearchtool(基本局部比對(duì)搜索工具).J.Mol.Biol.215:403-410.Badger,P.C.(2002)Ethanolfromcellulose:ageneralreview.InTrendsinnewcropsandnewuses(來(lái)自纖維素的乙醇一般性綜述--在新作物和新用途中的趨勢(shì)).J.JanickandA.Whipkey(eds.).ASHSPress,Alexandria,VA，USA，pp.17-21.BaileyM.丄andK.M.H.NevalainenC!981)Induction,isolationandtestingofstableTrichodermareeseimutantswithimprovedproductionofsolu-bilizingcellulase(改進(jìn)生產(chǎn)溶解性纖維素酶的穩(wěn)定的里氏木霉突變株的誘導(dǎo)，分離和測(cè)試).EnzMicrobiolTechnol.3:153-157.Bailey,MJ.，Biely,P.andPoutanen，K.(1992)lnterlaboratorytestingforassayofxylanaseactivity(木聚糖酶活性分析的實(shí)驗(yàn)室間測(cè)i式).JBiotechnol.23:257-270.Bailey,M.J.andLinko,M.(1990)ProductionofjS-galactosidasebyAspergillusoryzaeinsubmergedbioreactorcultivation(通過(guò)米曲霉的液面下生物反應(yīng)器培養(yǎng)生產(chǎn)/5-半乳糖苷酶).J.Biotechnol.〗6:57-66.BaileyM.J.andPoutanenK.(1989)ProductionofxylanasesbystrainsofAspergillus(通過(guò)曲霉菌株生產(chǎn)木聚糖酶).Appl.Microbiol.Biotechnol.30:5-10.BaileyM.，Siika-ahoM.，ValkeajarviA.andPenttilaM.(1993)HydrolyticpropertiesoftwocellulasesofTrichodermareeseiexpressedinyeast(在酵母菌中表達(dá)的里氏木霉的兩種纖維素酶的水解性質(zhì)).Biotehnol.Appl.Biochem17:65-76,BendtsenJ.D.,NielsenH.，vonHeijneG.andBmnakS.(2004)Improvedpredictionofsignalpeptides:SignalP3.0(改進(jìn)的信號(hào)肽預(yù)測(cè)SignalP3.0).J.Mol.Biol.340:783-795.Bemfeld,B.(1955)Amylases,aand/3.In:MethodsinEnzymology，vol.1(酶學(xué)方法，第一巻，淀粉酶a和/),Eds.Colowick,S.P.andKaplan,N.0.AcademicPress,NewYork,pp.149-158.BielyP.，VrsanskaM.，TenkanenM.,KluepfelD,(1997)Endo-beta-1,4-xylanasefamilies:differencesincatalyticproperties(/3-1,4-內(nèi)切木聚糖酶家族催化性質(zhì)不同).JournalofBiotechnology57:151-166.Coen,D.M.(2001)Thepolymerasechainreaction(聚合酶鏈反應(yīng)).In:Ausubel,F.M.,Brent,R.,Kingston,R.E.,More,D.D.,Seidman,J.G.，Smith,K.andStruhl,K.(eds.)Currentprotocolsinmolecularbiology(分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法匯編).JohnWiley&Sons.Inc.,Hoboken,USA.Gasteiger,E.,GattikerA.，Hoogland，C,IvanyiI.,AppelR.D.andBairochA.(2003)ExPASy:theproteiomicsserverforin-depthproteinknowledgeandanalysis(ExPASy:深入的蛋白質(zhì)知識(shí)和分析的蛋白組學(xué)服務(wù)).NucleicAcidsRes.31:3784-3788.Gellissen,G.(ed.)(2005)Productionofrecombinantproteins.Novelmicrobialandeukaryoticexpressionsystems.(生產(chǎn)重組蛋白--親斤型微生物和真核表達(dá)系統(tǒng))Wiley-VCHVerlagGmbh&Co.Weinheim,Germany.Gill,S.C，and糧Hippel，P.H.(1989)Calcdationofproteinextinctioncoefficientsfromaminoacidsequencedata(從氣基酸序歹l(數(shù)據(jù)計(jì)算蛋白質(zhì)消光系數(shù)).Anal.Biochem.182:319-326.Gupta，R.,E.JungandS.B畫ak.(2004)PredictionofN-glycosylationsitesinhumanproteins,Inpreparation.(予頁(yè)測(cè)人類蛋白中的N-糖基化位點(diǎn)，準(zhǔn)備中)www.cbs.dtu.dk/services/NetNGIyc/HaakanaH.,Miettinen-OinonenA.，JoutsjokiV.，MantylaA.,SuominenP，andVehmaanperaJ.(2004)CloningofcellulasegenesfromMelanocarpusalbomycesandtheirefficientexpressioninTrichodermareesei.(從白馬蘭諾菌中克隆纖維素酶基因及其在里氏木霉中的有效表達(dá))Enz.Microbiol.Technol.34:159-167.HenrissatB.(1991)Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonaminoacidsequencesimilarities.Biochem.(根據(jù)氨基酸序列類似性對(duì)糖基水解,進(jìn)行分類)J.280:309-316.HenrissatB.andBairochA.(1993)Newfamiliesintheclassificationofglycosylhydrolasesbasedonaminoacidsequencesimilarities(在根據(jù)氨基酸序列類似性對(duì)糖基水解酶進(jìn)行分類中的新家族).Biochem.J.293:781-788.HenrissatB.andBairochA.(1996).Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases.(糖基水解,基干序列的分類的更新)Biochem.J.316:695-696HenrissatB.，TceriT.T.andWarrenR.A.J.(1998)Aschemefordesignatingenzymesthathydrolysethepolysaccharidesinthecellwallofplants.(水解植物細(xì)胞壁中的多糖的酶的命名方案)FEBSLetters425:352-354.HongJ.，H.Tamaki,K.Yamamoto,andKumagaiH.(2003a)Cloningofageneencodingathermo-stabileendo-/5-l,4-glucanasefromThermoascusaurantiacusanditsexpressioninyeast.(編碼金黃色嗜熱子囊菌的耐熱/3-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶的基因的克隆及其在酵母菌中的表達(dá))Biotech.Letters25:657-661.HongJ.，TamakiH.，YamamotoK.andKumagaiH.(2003b)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searchprogressinbioethanoltechnology.(生物乙醇技術(shù)的二十年試驗(yàn)，考驗(yàn)禾卩探索進(jìn)程)AppliedBiochemistryandBiotech-nology91-93:5-21.權(quán)利要求1.一種以纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶處理纖維素材料的方法，其中所述纖維二糖水解酶包含與SEQIDNO2、4、6或8或與其酶活性片段具有至少80％同一性的氨基酸序列。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述纖維二糖水解酶可得自金黃色嗜熱子囊菌(Thermoascusaurantiacus)、嗜熱枝頂孢菌(Acremoniumthermophilum)或嗜熱毛殼菌(Chaetomiumthermophilum)。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述纖維二糖水解酶可得自金黃色嗜熱子囊菌(Thermoascusaurantiacus)CBS116239、嗜熱枝頂孢菌(Acremoniumthermophilum)CBS116240或嗜熱毛殼菌(Chaetomiumthermophilum)CBS730.95。4.權(quán)利要求1的方法，其中使用重組酶，優(yōu)選在木霉菌(Trichoderma)或曲霉菌(Aspergillus)屬的菌株中產(chǎn)生。5.權(quán)利要求4的方法，包括使用可得自金黃色嗜熱子囊菌或嗜熱枝頂孢菌的纖維二糖水解酶，所述水解酶通過(guò)遺傳學(xué)方法連接了纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述連接的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域源自里氏木霉(Trichodermareesei)或嗜熱毛殼菌，且優(yōu)選所形成的融合蛋白包含與SEQIDNO:28或30具有至少80%同一性的氨基酸序列。7.權(quán)利要求1的方法，其中所述內(nèi)切葡聚糖酶包含與SEQIDNO:10、12、14或16或與其酶活性片段具有至少80%同一性的氨基酸序列。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述內(nèi)切葡聚糖酶可得自金黃色嗜熱子囊菌、嗜熱枝頂孢菌或嗜熱毛殼菌。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述內(nèi)切葡聚糖酶可得自金黃色嗜熱子囊菌CBS116239、嗜熱枝頂孢菌CBS116240或嗜熱毛殼菌CBS730.95。10.權(quán)利要求1的方法，其中所述e-葡萄糖苷酶包含與SEQIDNO:22、24或26或與其酶活性片段具有至少80%同一性的氨基酸序列。11.權(quán)利要求io的方法，其中所述e-葡萄糖苷酶可得自金黃色嗜熱子囊菌、嗜熱枝頂孢菌或嗜熱毛殼菌，優(yōu)選得自金黃色嗜熱子囊菌CBS116239、嗜熱枝頂孢菌CBS116240或嗜熱毛殼菌CBS730.95。12.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述纖維素材料是木質(zhì)纖維素材料。13.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，包括以至少一種其他酶，優(yōu)選木聚糖酶，處理木質(zhì)纖維素，所述木聚糖酶優(yōu)選包含與SEQIDNO:18或20或與其酶活性片段具有至少80%同一性的氨基酸序列。14.權(quán)利要求13的方法，其中所述木聚糖酶可得自金黃色嗜熱子囊菌或嗜熱枝頂孢菌，優(yōu)選得自金黃色嗜熱子囊菌CBS116239或嗜熱枝頂孢菌CBS116240。15.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述酶同時(shí)或相繼加入至纖維素材料。16.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中至少一種酶由類似于登錄號(hào)DSM16723、DSM16728、DSM16729、DSM16727、DSM17326、DSM17324、DSM17323、DSM17729、DSM16724、DSM16726、DSM16725、DSM17325或DSM17667的微生物中包含的基因的基因所編碼。17.權(quán)利要求1的方法，其中所述纖維素材料選自玉米桿、柳枝稷、谷類禾桿、甘蔗渣或木材衍生材料。18.—種酶制劑，包含纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶及e-葡萄糖苷酶，其中所述纖維二糖水解酶包含與SEQIDNO:2、4、6或8或與其酶活性片段具有至少80%同一性的氨基酸序列。19.權(quán)利要求18的酶制劑，其中所述纖維二糖水解酶可得自金黃色嗜熱子囊菌、嗜熱枝頂孢菌或嗜熱毛殼菌。20.權(quán)利要求19的酶制劑，其中所述纖維二糖水解酶可得自金黃色嗜熱子囊菌CBS116239、嗜熱枝頂孢菌CBS116240或嗜熱毛殼菌CBS730.95。21.權(quán)利要求18的酶制劑，其中所述酶是重組酶，優(yōu)選在木霉菌或曲霉菌屬的菌株中產(chǎn)生。22.權(quán)利要求21的酶制劑，其包含可得自金黃色嗜熱子囊菌的纖維二糖水解酶，所述水解酶通過(guò)遺傳學(xué)方法連接了纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。23.權(quán)利要求22的酶制劑，其中所述連接的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域源自里氏木霉或嗜熱毛殼菌，優(yōu)選所形成的融合蛋白包含與SEQIDNO:28或30具有至少80%同一性的氨基酸序列。24.權(quán)利要求18的酶制劑，其中所述內(nèi)切葡聚糖酶包含與SEQIDNO:10、12、14或16或與其酶活性片段具有至少80%同一性的氨基酸序列。25.權(quán)利要求24的酶制劑，其中所述內(nèi)切葡聚糖酶可得自金黃色嗜熱子囊菌、嗜熱枝頂孢菌或嗜熱毛殼菌，優(yōu)選得自金黃色嗜熱子囊菌CBS116239、嗜熱枝頂孢菌CBS116240或嗜熱毛殼菌CBS730.95。26.權(quán)利要求18的酶制劑，其中所述e-葡萄糖苷酶包含與SEQIDNO:22、24或26或與其酶活性片段具有至少80%同一性的氨基酸序列。27.權(quán)利要求26的酶制劑，其中所述e-葡萄糖苷酶可得自金黃色嗜熱子囊菌、嗜熱枝頂孢菌或嗜熱毛殼菌，優(yōu)選得自金黃色嗜熱子囊菌CBS116239、嗜熱枝頂孢菌CBS116240或嗜熱毛殼菌CBS730.95。28.如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的酶制劑，包含至少一種其他酶，優(yōu)選為木聚糖酶，所述木聚糖酶優(yōu)選包含與SEQIDNO:18或20或與其酶活性片段具有至少80%同一性的氨基酸序列。29.權(quán)利要求28的酶制劑，其中所述木聚糖酶可得自金黃色嗜熱子囊菌或嗜熱枝頂孢菌，優(yōu)選得自金黃色嗜熱子囊菌CBS116239或嗜熱枝頂孢菌CBS116240。30.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的酶制劑，其中至少一種酶是由類似于登錄號(hào)DSM16723、DSM16728、DSM16729、DSM16727、DSM17326、DSM17324、DSM17323、DSM17729、DSM16723、DSM16726、DSM16725、DSM17325或DSM17667的微生物中包含的基因的基因所編碼。31.如權(quán)利要求18的酶制劑，其是耗盡培養(yǎng)基、粉末、顆?；蛞后w的形式。32.根據(jù)權(quán)利要求18至31中任一項(xiàng)的酶制劑在分解纖維素材料中的用途。33.權(quán)利要求32的用途，其中所述纖維素材料選自玉米桿、柳枝稷、谷類禾桿、甘蔗渣或木材衍生材料。34.根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的方法在從纖維素材料制備乙醇的方法中的用途。35.—種多肽，其包含具有纖維素分解活性的片段，且選自a)包含至少與SEQIDNO:4具有66%同一性、與SEQIDNO:6具有79%同一性、與SEQIDNO:12具有78X同一性、與SEQIDNO:14具有68%同一性、與SEQIDNO:16具有72%同一性、與SEQIDNO:20具有68%同一性、與SEQIDNO:22或24具有74%同一性或與SEQIDNO:26具有78%同一性的氨基酸序列的多肽；b)包含具有纖維素分解活性片段的a)的變異體；及c)具有纖維素分解活性的a)或b)的片段。36.權(quán)利要求35的多肽，其包含a)與SEQIDNO:4、6、12、14、16、20、22、24或26具有至少80%同一性的氨基酸序列；b)包含具有纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶、木聚糖酶或e-葡萄糖苷酶活性的片段的a)的變異體；或c)具有纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶、木聚糖酶或e-葡萄糖苷酶活性的a)或b)的片段。37.—種分離的多核苷酸，選自a)SEQIDNO:3、5、11、13、15、19、21、23或25的核苷酸序列，或編碼權(quán)利要求35的多肽的序列；b)a)的互補(bǔ)鏈；c)包含至少20個(gè)核苷酸的a)或b)的片段；及d)由于基因密碼而與a)、b)或c)所定義的任一序列簡(jiǎn)并的序列。38.權(quán)利要求37的多核苷酸，其具有SEQIDNO:3、5、11、13、15、19、21、23或25所包含的序列。39.權(quán)利要求37的多核苷酸，其包含類似于選自登錄號(hào)DSM16728、DSM16729、DSM17324、DSM17323、DSM17729、DSM16726、DSM16725、DSM17325及DSM17667的微生物所包含的基因的基因。40.—種載體，其包含作為異源性序列的權(quán)利要求37至39中任一項(xiàng)的多核苷酸。41.權(quán)利要求40的載體，其能夠表達(dá)權(quán)利要求35的多肽。42.—種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求40的載體。43.權(quán)利要求42的宿主細(xì)胞，其能夠表達(dá)由異源性多核苷酸序列所編碼的多肽。44.權(quán)利要求43的宿主細(xì)胞，其是木霉菌或曲霉菌屬的菌株。45.—種大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株，其具有登錄號(hào)DSM16728、DSM16729、DSM17324、DSM17323、DSM17729、DSM16726、DSM16725、DSM17325或DSM17667。46.—種酶制劑，其包含權(quán)利要求35的多肽。47.權(quán)利要求46的酶制劑，其是耗盡培養(yǎng)基、粉末、顆?；蛞后w的形式。48.權(quán)利要求46或47的酶制劑，其包含纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶、P-葡萄糖苷酶及任選的木聚糖酶活性和/或其它酶活性。49.權(quán)利要求46至48中任一項(xiàng)的酶制劑，其進(jìn)一步包含傳統(tǒng)添加劑。50.根據(jù)權(quán)利要求35的多肽或根據(jù)權(quán)利要求46的酶制劑在燃料、紡織、清潔劑、紙漿和造紙、食品、飼料或飲料工業(yè)中的用途。51.根據(jù)權(quán)利要求50的用途，其中所述酶用于處理牛皮紙槳、機(jī)械紙漿或回收紙。52.權(quán)利要求50的用途，其中所述酶制劑是耗盡培養(yǎng)基。53.—種制備多肽的方法，所述多肽包含具有纖維素分解活性的片段且選自a)包含至少與SEQIDNO:4具有66%同一性、與SEQIDNO:6具有79%同一性、與SEQIDNO:12具有78%同一性、與SEQIDNO:14具有68%同一性、與SEQIDNO:16具有72%同一性、與SEQIDNO:20具有68%同一性、與SEQIDNO:22或24具有74%同一性或與SEQIDNO:26具有78%同一性的氨基酸序列的多肽；b)包含具有纖維素分解活性片段的a)的變異體；及c)具有纖維素分解活性的a)或b)的片段，所述方法包含用編碼所述多肽的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并于能夠表達(dá)所述多肽的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，及任選回收并純化所生產(chǎn)的多肽。54.—種以至少一種能夠產(chǎn)生多肽的微生物的耗盡培養(yǎng)基處理纖維素材料的方法，所述多肽包含具有纖維素分解活性的片段且選自a)包含至少與SEQIDNO:4具有66%同一性、與SEQIDNO:6具有79%同一性、與SEQIDNO:12具有78X同一性、與SEQIDNO:14具有68%同一性、與SEQIDNO:16具有72%同一性、與SEQIDNO:20具有68%同一性、與SEQIDNO:22或24具有74%同一性或與SEQIDNO:26具有78%同一性的氨基酸序列的多肽；b)包含具有纖維素分解活性片段的a)的變異體；及c)具有纖維素分解活性的a)或b)的片段，所述方法包含令纖維素材料與耗盡培養(yǎng)基反應(yīng)以得到水解的纖維素材全文摘要本發(fā)明涉及從纖維素材料中生產(chǎn)糖水解物。該方法可用于例如生產(chǎn)可發(fā)酵糖用于從木質(zhì)纖維素材料中生產(chǎn)生物乙醇。本發(fā)明描述了纖維素水解酶及其通過(guò)重組技術(shù)的生產(chǎn)，以及所述酶及酶制劑的用途。文檔編號(hào)C12P19/02GK101384713SQ200680052864公開日2009年3月11日申請(qǐng)日期2006年12月15日優(yōu)先權(quán)日2005年12月22日發(fā)明者亞爾諾·卡利奧,亞里·韋赫曼佩雷,利薩·維卡里,啼姆·哈羅內(nèi),桑尼·沃蒂萊內(nèi),泰爾?！て绽瓕?瑪麗卡·阿拉普拉內(nèi)恩,薩圖·胡曼,馬蒂·西伊卡-阿霍申請(qǐng)人:羅爾公司