一種飼用緩釋固定化纖維素酶的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種飼用緩釋固定化纖維素酶的制備方法，屬于纖維素酶制備領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]纖維素酶(β -1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶)是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，它不是單體酶，而是起協(xié)同作用的多組分酶系，是一種復(fù)合酶，主要由外切β -葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶等組成，還有很高活力的木聚糖酶，作用于纖維素以及從纖維素衍生出來的產(chǎn)物。微生物纖維素酶在轉(zhuǎn)化不溶性纖維素成葡萄糖以及在果蔬汁中破壞細(xì)胞壁從而提高果汁得率等方面具有非常重要的意義，纖維素酶廣泛存在于自然界的生物體中。細(xì)菌、真菌、動物體內(nèi)等都能產(chǎn)生纖維素酶。細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶的產(chǎn)量較少，主要是葡聚糖內(nèi)切酶，大多數(shù)對結(jié)晶纖維素?zé)o降解活性，且所產(chǎn)生的酶多是胞內(nèi)酶或吸附在細(xì)胞壁上，不分泌到培養(yǎng)液中，增加了提取純化的難度，因此對細(xì)菌的研究較少。但由細(xì)菌所產(chǎn)生的纖維素酶一般最適PH為中性至偏堿性。近20年來，隨著中性纖維素酶和堿性纖維素酶在棉織品水洗整理工藝及洗滌劑工業(yè)中的成功應(yīng)用，細(xì)菌纖維素酶制劑已顯示出良好的應(yīng)用前景。當(dāng)前阻礙人類廣泛高效利用纖維素酶的瓶頸，一是缺少纖維素酶高產(chǎn)菌，二是發(fā)酵產(chǎn)酶工藝仍待進(jìn)一步優(yōu)化。目前用于生產(chǎn)纖維素酶的微生物菌種較多的是絲狀真菌，其中，酶活力較強(qiáng)的菌種為木霉屬等，此外，反芻動物依靠瘤胃微生物可消化纖維素，但產(chǎn)量和活性較低。國內(nèi)外纖維素酶的制備方法是固體發(fā)酵法，固體發(fā)酵法雖然設(shè)備投資少，但占地面積大、易染雜菌、生產(chǎn)穩(wěn)定性較差，而且技術(shù)不易掌握，難以進(jìn)行擴(kuò)大化生產(chǎn)，制約了纖維素酶生產(chǎn)技術(shù)的推廣和應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題:針對固體發(fā)酵法生產(chǎn)纖維素酶，占地面積大、易染雜菌、生產(chǎn)穩(wěn)定性較差，且技術(shù)不易掌握，導(dǎo)致酶活性低、產(chǎn)量低、成本高，可控性差的弊端，提供了一種飼用緩釋固定化纖維素酶的制備方法，本發(fā)明是取明膠與去離子水、葡萄糖水溶液和聚乙二醇水溶液混合，再與甘油、冰醋酸溶液、交聯(lián)劑混合成緩釋包膜材料備用；再取甘露醇、胰蛋白胨、酵母和瓊脂混合，調(diào)節(jié)PH值，制得產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)基，接種產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)，將產(chǎn)氣莢膜梭菌接種在菜麩餅制得的菜麩餅葡萄糖溶液中，密封培養(yǎng)后，打開通入空氣，蒸發(fā)至干，與備用的緩釋包膜材料混合于模具中壓制，干燥制得。本發(fā)明制備方法簡單，所得產(chǎn)品活性高。
[0004]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下所述的技術(shù)方案是:
(1)按質(zhì)量比1:30，將明膠加入去離子水中進(jìn)行溶解，對其升溫至50?60°C后，在1200?1500r/min下，攪拌形成明膠溶液，隨后按重量份數(shù)計(jì)，分別選取上述30?40份明膠溶液，10?30份0.6mol/L的葡萄糖水溶液和30?60份0.9mol/L的聚乙二醇水溶液進(jìn)行混合，對其升溫至50?60°C，保溫?cái)嚢??lOmin，制備得明膠混合液；
(2)待攪拌完成后，按重量份數(shù)計(jì)，選取30?65份明膠混合液20?30份甘油和15?40份冰醋酸溶液，緩慢攪拌混合，混合速度為300?500r/min，待上述溶液混合完成后，按質(zhì)量比1:25，將交聯(lián)劑添加至上述混合溶液中，使其交聯(lián)形成緩釋包膜材料，備用，所述的交聯(lián)劑為過氧化二異丙苯和2，5- 二甲基-2，5 二叔丁基過氧化己烷，按質(zhì)量比1:1配比混合而成；
(3)按重量份數(shù)計(jì)，選取20?65份的甘露醇、5?15份的胰蛋白胨、15?20份的酵母和20?45份的瓊脂，攪拌混合形成培養(yǎng)基，加入去離子水調(diào)節(jié)pH為5.0?5.5，待調(diào)節(jié)完P(guān)H后，對其升溫至120°C，使其滅菌10?20min制得產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)基，隨后按接種比10%，將產(chǎn)氣莢膜梭菌接種至產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)基中，在36.5?37.5°C下靜置培養(yǎng)12?16h，備用；
(4)選取新鮮菜麩餅，將其置于80?90°C烘箱中干燥10?12h，隨后將其取出進(jìn)行碾磨并過篩，制備得80?100目大小的菜麩餅顆粒，隨后按質(zhì)量比1:5，將菜麩餅顆粒分散于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的葡萄糖溶液中，對其攪拌分散均勻后，將上述培養(yǎng)的產(chǎn)氣莢膜梭菌按接種比10%，接種至菜麩餅葡萄糖溶液中，使其密封培養(yǎng)3?5天；
(5 )待產(chǎn)氣莢膜梭菌開始分解菜麩餅顆粒后，將其打開通入空氣，待產(chǎn)氣莢膜梭菌死亡后，對其旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，收集含產(chǎn)氣莢膜梭菌的菜麩餅顆粒，按質(zhì)量比1: 1，將收集的菜麩餅顆粒與步驟(2)制備的緩釋包膜材料攪拌混合并置于模具中進(jìn)行壓制，隨后將其置于30?40°C下干燥成膜，即可制備得一種飼用緩釋固定化纖維素酶。
[0005]本發(fā)明的應(yīng)用方法:將制得的飼用緩釋固定化纖維素酶添加到雞飼料中，添加量為4?6g/kg，每日早晚各添加一次，其蛋產(chǎn)率提高了 2.9?3.1%，破蛋率降低了 16.2?16.5%。該纖維素酶使用效果好，酶活性高。
[0006]本發(fā)明與其他方法相比，有益技術(shù)效果是:
(1)本發(fā)明制備成本比傳統(tǒng)方法降低了18%，纖維素酶酶活力提高了 42%，酶活性大于9250IU/g ；
(2)該方法生產(chǎn)效率高，適合大規(guī)模生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0007]首先按質(zhì)量比1:30，將明膠加入去離子水中進(jìn)行溶解，對其升溫至50?60°C后，在1200?1500r/min下，攪拌形成明膠溶液，隨后按重量份數(shù)計(jì)，分別選取上述30?40份明膠溶液，10?30份0.6mol/L的葡萄糖水溶液和30?60份0.9mol/L的聚乙二醇水溶液進(jìn)行混合，對其升溫至50?60°C，保溫?cái)嚢??lOmin，制備得明膠混合液；然后待攪拌完成后，按重量份數(shù)計(jì)，選取30?65份明膠混合液20?30份甘油和15?40份冰醋酸溶液，緩慢攪拌混合，混合速度為300?500r/min，待上述溶液混合完成后，按質(zhì)量比1:25，將交聯(lián)劑添加至上述混合溶液中，使其交聯(lián)形成緩釋包膜材料，備用，所述的交聯(lián)劑為過氧化二異丙苯和2，5- 二甲基-2，5 二叔丁基過氧化己烷，按質(zhì)量比1:1配比混合而成；再按重量份數(shù)計(jì)，選取20?65份的甘露醇、5?15份的胰蛋白胨、15?20份的酵母和20?45份的瓊脂，攪拌混合形成培養(yǎng)基，加入去離子水調(diào)節(jié)pH為5.0?5.5，待調(diào)節(jié)完pH后，對其升溫至120°C，使其滅菌10?20min制得產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)基，隨后按接種比10%，將產(chǎn)氣莢膜梭菌接種至產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)基中，在36.5?37.5°C下靜置培養(yǎng)12?16h，備用；再選取新鮮菜麩餅，將其置于80?90°C烘箱中干燥10?12h，隨后將其取出進(jìn)行碾磨并過篩，制備得80?100目大小的菜麩餅顆粒，隨后按質(zhì)量比1: 5，將菜麩餅顆粒分散于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的葡萄糖溶液中，對其攪拌分散均勻后，將上述培養(yǎng)的產(chǎn)氣莢膜梭菌按接種比10%，接種至菜麩餅葡萄糖溶液中，使其密封培養(yǎng)3?5天；最后待產(chǎn)氣莢膜梭菌開始分解菜麩餅顆粒后，將其打開通入空氣，待產(chǎn)氣莢膜梭菌死亡后，對其旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，收集含產(chǎn)氣莢膜梭菌的菜麩餅顆粒，按質(zhì)量比1:1，將收集的菜麩餅顆粒與備用的緩釋包膜材料攪拌混合并置于模具中進(jìn)行壓制，隨后將其置于30?40°C下干燥成膜，即可制備得一種飼用緩釋固定化纖維素酶。
[0008]實(shí)例I
首先按質(zhì)量比1:30，將明膠加入去離子水中進(jìn)行溶解，對其升溫至50°C后，在1200r/min下，攪拌形成明膠溶液，隨后按重量份數(shù)計(jì)，分別選取上述30份明膠溶液，30份0.6mol/L的葡萄糖水溶液和40份0.9mol/L的聚乙二醇水溶液進(jìn)行混合，對其升溫至50°C，保溫?cái)嚢?min，制備得明膠混合液；然后待攪拌完成后，按重量份數(shù)計(jì)，選取30份明膠混合液30份甘油和40份冰醋酸溶液，緩慢攪拌混合，混合速度為300r/min，待上述溶液混合完成后，按質(zhì)量比1:25，將交聯(lián)劑添加至上述混合溶液中，使其交聯(lián)形成緩釋包膜材料，備用，所述的交聯(lián)劑為過氧化二異丙苯和2，5- 二甲基-2，5 二叔丁基過氧化己烷，按質(zhì)量比1:1配比混合而成；再按重量份數(shù)計(jì)，選取20份的甘露醇、15份的胰蛋白胨、20份的酵母和45份的瓊脂，攪拌混合形成培養(yǎng)基，加入去離子水調(diào)節(jié)pH為5.0，待調(diào)節(jié)完pH后，對其升溫至120°C，使其滅菌1min制得產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)基，隨后按接種比10%，將產(chǎn)氣莢膜梭菌接種至產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)基中，在3