類產(chǎn)堿假單胞菌株及其在制備西他列汀中間體中的應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種類產(chǎn)堿假單胞菌株及其在制備西他 列汀中間體中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 磷酸西他列汀（sitagliptinphosphate)是默沙東公司第一個研制的用于治療2 型糖尿病的二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制劑，該藥能有效地針對2型糖尿病中的胰島素抵抗 和胰島α、β細胞的功能障礙，通過抑制DPP-4減緩腸促胰島素GLP-1的降解，從而發(fā)揮降 糖作用。與易導致低血糖、體重增加和引起惡心嘔吐等副作用的傳統(tǒng)口服降糖藥物相比，該 抑制劑具有明顯的優(yōu)勢和良好的市場前景。磷酸西他列汀關(guān)鍵的手性中間體主要有兩個， 一個是手性β-氨基酸，一個是其相應的手性醇中間體，目前關(guān)于西他列汀的合成工作重 點主要圍繞這兩個手性中間體展開。
[0003]目前文獻報道此手性β-氨基酸的合成方法主要有以下幾種：
[0004] ( -）采用手性源誘導出手性的α-氨基酸，而后經(jīng)重氮化反應產(chǎn)生β-氨基酸， 從而構(gòu)建手性中心，該路線所用原料較為昂貴，反應條件相當苛刻，如需要_78°C及-30Γ 等低溫條件，且有些反應所需時間較長且操作較為繁瑣，中間產(chǎn)物的精制需要經(jīng)過柱層析 分離；
[0005] (二）采用手性磷釕催化劑對酮酯進行不對稱催化氫化，構(gòu)建手性二級醇，然后將 手性二級醇手性反轉(zhuǎn)為二級胺，該路線中手性催化劑價格昂貴，放大效應明顯；
[0006] (三）β-烯氨基酸中間體的不對稱氫化，不對稱氫化反應在昂貴的金屬催化劑如 與手性膦/二膦配體相組合的銠的存在下進行或是使用昂貴的釕金屬催化劑；
[0007] (四）以異丙胺為氨供體，以西他列汀前體酮為氨受體，利用轉(zhuǎn)氨酶生物催化制備 西他列汀，該方法具有環(huán)境友好，反應條件溫和等優(yōu)勢，但特殊酶的不易獲得和價格的高昂 特性（分離方案等）不可忽視；
[0008] (五）以三氟苯甲醛和Ν-乙酰甘氨酸經(jīng)縮合、還原、生物酶拆分、水解、保護氨基、 重氮化、Arndt-Fistert重排反應、水解得R-β-氨基丁酸，但是所述合成路線過長，手性拆 分獲得手性氨基酸的收率不超過50%，另外一半對映異構(gòu)體的循環(huán)利用是一大難題，且反 應過程用到重氮甲烷，重氮甲烷室溫下是不穩(wěn)定的有毒氣體，具有爆炸性，操作危險。
[0009] 而目前文獻報道相應的手性醇中間體的合成方法主要如下：
[0010] (一）W0 09/045507利用適當?shù)聂驶€原酶對β-羰基部分進行不對稱還原得到 β-羥基中間體，再與氮雜環(huán)丁酮中間體反應得到西他列汀，該方法的缺點在于：在高壓下 反應、使用非常昂貴的金屬手性催化劑（Rh或Ru)、低立體選擇性和銠污染產(chǎn)物以及由此引 起的最終化合物很難純化；
[0011] (二）W012/046254公開制備通過酶促轉(zhuǎn)化制備西他列汀的中間體的方法，提供了 兩種生物催化合成手性醇中間體的方法，分別為利用工程菌全細胞和工程菌所產(chǎn)的羰基還 原酶的粗提物作為生物催化劑，將西他列汀前體酮還原為相應的（S)構(gòu)型的醇；其方法具 有環(huán)境友好，反應條件溫和，ee值高等優(yōu)勢，但在另一方面，工程菌的構(gòu)建有很大的難度而 且花費昂貴，使用粗提酶作為生物催化劑存在的問題是游離的粗酶在反應液中不穩(wěn)定，酶 的催化能力較低，酶容易失活，不易實現(xiàn)酶的循環(huán)使用，且后期的分離操作復雜；而使用整 細胞作為催化劑，將底物溶于甲苯中進行兩相催化反應所存在的問題是，底物在甲苯中溶 解度小，反應所轉(zhuǎn)化的底物濃度較低，不適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
[0012] 現(xiàn)有的化學法和生物催化法合成西他列汀以及中間體的方法都存在其不足之處， 因此，開發(fā)更清潔的環(huán)境友好的制備西他列汀的中間體的方法是非常有意義的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種類產(chǎn)堿假單胞菌株，并提供了該菌株的用 途，通過該菌株菌體的生物催化能夠更經(jīng)濟地獲得西他列汀中間體。
[0014] 本發(fā)明以4-氧-4-[3-(三氟甲基）-5,6-二氫[1，2,4]三唑并[4,3-a]_吡 嗪-7(8!1)-基]-1-(2,4,5)-三氟苯基）丁-2-酮（11)為原料，利用微生物中的羰基還 原酶，區(qū)域選擇性和對映選擇性催化還原為（S)-3-羥基-1-[3-(三氟甲基）-5, 6-二氫 [1，2, 4]三唑并[4, 3-a]吡嗪-7 (8H)-基]-1-(2, 4, 5-三氟苯基）丁-1-酮（I)。
[0015] 本發(fā)明技術(shù)路線如下：
[0016]
[0017] 本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：
[0018] 1、類產(chǎn)喊假單胞菌（Pseudomonaspseudoalcaligenes)XW_40,由中國典型培養(yǎng)物 保藏中心保藏，保藏號為CCTCCNO:M2015521。
[0019] 2、上述類產(chǎn)堿假單胞菌XW-40在制備西他列汀中間體中的應用。
[0020] 優(yōu)選的，以類產(chǎn)堿假單胞菌XW-40菌體作為催化劑，將原料4-氧-4-[3-(三氟 甲基）-5,6_ 二氫[1，2,4]三唑并[4,3-&]-吡嗪-7(8!1)-基]-1-(2,4,5)-三氟苯基） 丁-2-酮催化還原為（S)-3-羥基-1-[3-(三氟甲基）-5,6-二氫[1，2,4]三唑并[4,3-a] 吡嗪-7 (8H)-基]-1- (2, 4, 5-三氟苯基）丁 -1-酮。
[0021] 優(yōu)選的，所述反應體系中還包括輔酶再生底物和有機助溶劑。
[0022] 優(yōu)選的，所述催化劑類產(chǎn)堿假單胞菌XW-40菌體經(jīng)過重新收集，洗滌后用于下一 批次西他列汀中間體的制備。
[0023] 優(yōu)選的，所述類產(chǎn)堿假單胞菌XW-40菌體濃度為90g(干重）/L，原料濃度為10g/ L，輔酶再生底物為質(zhì)量分數(shù)5 %的葡萄糖，有機助溶劑為體積分數(shù)10 %的二甲基亞砜，反 應時間為28小時。
[0024] 本發(fā)明的有益效果在于：（1)篩選的產(chǎn)羰基還原酶菌株P(guān)seudomonas pseudoalcaligenesXW-40具有高度的區(qū)域選擇性和對映選擇性，能夠有 效催化4-氧-4-[3-(三氟甲基）-5,6-二氫[1，2,4]三唑并[4,3-a]_吡 嗪-7 (8H)-基]-1-(2, 4, 5)-三氟苯基）丁 -2-酮（II)還原為西他列汀手性 中間體（S)-3-羥基-1-[3-(三氟甲基）-5, 6-二氫[1，2, 4]三唑并[4, 3-a]吡 嗪-7 (8H)-基]-1- (2, 4, 5-三氟苯基）丁 -1-酮（I)，無副產(chǎn)物產(chǎn)生，簡化了分離過程；（2) 對于土壤中菌株的篩選，選擇與底物（II)結(jié)構(gòu)相似的苯乙酮為唯一的碳源進行菌株的篩 選，可以快速地從眾多種土壤中快速的篩選出合適的疑似初篩菌株，再將其用于（II)的還 原，快速的選擇出最佳的菌株；（3)所篩選的菌株P(guān)seudomonaspseudoalcaligenesXW-40 在最適的反應條件下能耐受l〇g/L的高底物濃度，并且仍保持高選擇性，底物抑制作用較 弱，從而可實現(xiàn)高底物濃度的生物催化，這一點對于目前所報道的利用野生細菌進行生物 還原來說相對少見；（4)PseudomonaspseudoalcaligenesXW-40菌體能夠循環(huán)使用，待一 批反應結(jié)束后將菌體離心，可重新投入下一批次的催化反應中，與分批補料相比，同時去除 了底物與產(chǎn)物對細胞的抑制作用，使菌體的催化活性達到最大限度的利用，同一批菌體可 循環(huán)使用5次，收率和光學純度高，過程綠色，成本低廉。
[0025] 菌種保藏
[0026] 本發(fā)明中類產(chǎn)喊假單胞菌（Pseudomonaspseudoalcaligenes)XW-40是從土壤中 分離獲得，送中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)保藏，保藏編號為CCTCCN0:M2015521，地 址位于湖北省武漢市武漢大學，保藏日期為2015年9月10日，分類命名為類產(chǎn)堿假單胞菌 Pseudomonaspseudoalcaligenes。菌落在固體培養(yǎng)基的形態(tài)為表面形態(tài)扁平，圓形，邊緣 部分光滑整齊，整個菌落呈潮濕狀，顏色呈乳白色，不透明，菌落直徑約為1. 9mm，生理學性 質(zhì)見表2。經(jīng)16SrDNA分子生物學鑒定為類產(chǎn)堿假單胞菌，同源性達100%。
【具體實施方式】
[0027] 下面對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方 法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0028] 實施例1土壤菌株的初篩
[0029] 稱取約lg土壤樣品于10ml無菌水中，振蕩混勾后離心，吸取上清液1ml加入到 100ml以苯乙酮為唯一碳源的最小鹽培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)5-7天。然后將培養(yǎng)的菌懸液涂布 至以苯乙酮為唯一碳源的最小鹽瓊脂培養(yǎng)基中，將平板上長出來的菌落分離純化接種于瓊 脂斜面上（培養(yǎng)基組成：蛋白胨5g/L，酵母膏1. 5g/L，葡萄糖10g/L，牛肉膏1. 5g/L，NaCl 5g/L，pH7. 0)，30°C培養(yǎng)48h，作為進一步篩選的疑似菌株，編號保存。
[0030] 實施例2產(chǎn)羰基還原酶菌株的篩選
[0031] 將實施例1分離純化得到的菌種接種于組成為蛋白胨5g/L，酵母膏1. 5g/L、葡萄 糖 10g/L，牛肉膏L5g/L，NaCl5g/L，pH7. 0 的培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng) 48h，4°C下 7000rpm/min 離心10min，收集菌體，用冷生理鹽水洗滌兩次，得細胞濕菌體。
[0032] 采用如下菌株篩選體系進行篩選：lg/L底物（II)，質(zhì)量分數(shù)5%的葡萄糖，10% (v/v)無水乙醇，80g/L菌體（干重），0· 1M的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液，ρΗ7· 0, 30°C 下攪拌反應12h，離心，上清液用乙酸乙酯萃取3次，有機層合并，無水硫酸鎂干燥過夜，反 相C1S液相色譜以及手性液相色譜測定轉(zhuǎn)化率和對映體過量（ee)。
[0033] 液相色譜條件為：檢測轉(zhuǎn)化率時色譜柱C1S(250X4. 6mmX5μm，Agilent America)，流動相：水 / 乙腈（v/v) = 70/30，流速lml/min，檢測波長：268nm， 溫度：25°C;4_ 氧-4-[3-(三氟甲基）-5, 6-二氫[1，2, 4]三唑并[4, 3-a]_ 吡 嗪-7 (8H)-基]-1- (2, 4, 5)-三氟苯基）丁 -2-酮及3-羥基-1- [3-(三氟甲基）-5, 6-二氫 [1，2, 4]三唑并[4, 3-a]吡嗪-7 (8H)-基]-1-(2, 4, 5-三氟苯基）丁 -1-酮的保留時間分 別為19. 7和26. 8min;檢測ee時色譜柱ChiracelAY-H(5X250mm)，流動相：正己烷/無水 乙醇（v/v) = 85 :15,流速：1.Oml/min，檢測波長：268nm，溫度：25°C;在化學合成外消旋醇 3-羥基-1-[3-(三氟甲基）-5,6_二氫[1，2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)_基]-1-(2,4， 5_三氟苯基）丁-1-酮的分析中，S和R異構(gòu)體的保留時間分別為11.3min以及17. 8min。 采用相同方法確定制備醇產(chǎn)物的手性構(gòu)型，將轉(zhuǎn)化率大于5%的菌株的結(jié)果表述于表1中，
[0034] 表1產(chǎn)羰基還原酶菌株的篩選
[0035]
[0036] 由表1可知，對映體過量（ee)最高以及轉(zhuǎn)化率最好的為編號40-1的菌株，觀察了 40-1號菌落在固體培養(yǎng)基的形態(tài)為表面形態(tài)扁平，圓形，邊緣部分光滑整齊，整個菌落呈潮 濕狀，顏色呈乳白色，不透明，菌落直徑約為1.9mm，生理學性質(zhì)見表2。經(jīng)16SrDNA分子 生物學鑒定為類產(chǎn)堿假單胞菌，同源性達100%，命名為Pseudomonaspseudoalcaligenes XW-40,其DNA序列見SEQIDNo. 1。
[0037]表140-1菌株生理生化性質(zhì)
[0040]實施例3產(chǎn)物⑴制備
[0041]利用PseudomonaspseudoalcaligenesXW-40 細菌制備（S)_3_ 羥基-1-[3_(三 氟甲基）-5,6_二氫[1，2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)_基]-l-(2,4,5-三氟苯基） 丁 -1-酮（I)。取5ml種子液轉(zhuǎn)接至100ml新鮮的培養(yǎng)基中（250ml容量的搖瓶）（培養(yǎng)基 組分以及培養(yǎng)條件見實施例2)，在30°C下，190轉(zhuǎn)/分鐘震蕩培養(yǎng)48小時，4°C下，7000轉(zhuǎn) /分鐘條件下離心10分鐘，