專利名稱：處理生物樣品和/或化學(xué)樣品的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于處理流體滴中的生物樣品和/或化學(xué)樣品
的方法。
背景技術(shù)：
化學(xué)、制藥學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域中的設(shè)備小型化導(dǎo)致了微流體 設(shè)備的發(fā)展，所述微流體設(shè)備控制液體流動并使許多化學(xué)反應(yīng)和生物反 應(yīng)得以進行。然而，因為缺乏適合的微組件，例如微型分離器或微濾器， 所述設(shè)備不允許將常規(guī)的、多功能的化學(xué)實驗室縮微到單微芯片上。此 外，所述設(shè)備確實還常常不能滿足綜合的需求。因此，開孔設(shè)計(通常 是多孔板)常常與自動混合及清洗設(shè)備組合使用。然而，所述開孔設(shè)計 對進一步小型化提出越來越多的挑戰(zhàn)，其主要問題之一是蒸發(fā)問題。近來，因為有可能將分離和處理體積調(diào)低至皮升/飛升范圍， 流體滴的操控處理受到很大關(guān)注(例如參照國際專利申請WO 2004/030820)。已經(jīng)研發(fā)了幾種芯片實驗室(LOC)、微全分析系統(tǒng)(pTAS) 和生物微機電系統(tǒng)(BioMEMS)用于液滴在表面上的移動、合并/混合、 分裂和加熱，例如介質(zhì)上電潤濕(EWOD) [Pollack, M.G.等，Appl. Phys. Lett. (2000)， 77， 1725 1726]、聲表面波(SAW) [Wixforth， A.等，mstnews (2002)， 5， 42 43]、雙向電泳[Cascoyne， P.R,C.等，Lab-on曙a-Chip(2004)， 4, 299 309]及局部不對稱環(huán)境[Daniel， S.等，Langmuir (2005)， 21， 4240~4228]。然而，這些方法缺少進行連續(xù)生物處理的最重要操作將 原料和/或反應(yīng)產(chǎn)物從粗的混合物或復(fù)雜的混合物中分開/純化/分離的能 力。為了進行所述分離，需要引入固相作為基于液滴的體系的一部分。因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種用于處理化學(xué)樣品和/或 生物樣品的方法，所述方法避免了上述這些缺點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個方面是提供一種處理生物樣品和/或化學(xué)樣品的 方法。所述方法包括提供流體滴。所述流體滴包括內(nèi)相和外相。所述外
相與內(nèi)相不混溶。所述外相包圍所述內(nèi)相。所述內(nèi)相包含生物樣品和/或 化學(xué)樣品。所述內(nèi)相通過所述外相與環(huán)境隔離。所述流體滴還包含磁吸 性物質(zhì)。所述方法還包括提供至少一個表面。所述表面對于所述流體滴 內(nèi)相的流體具有使流體滴在與其接觸時仍保持完整的質(zhì)地和浸潤性。所 述方法還包括將流體滴放置到所述至少一個表面上。所述方法還包括對 所述流體滴中的生物樣品和/或化學(xué)樣品進行處理。在有些實施方式中， 所述方法還包括通過使磁場或電磁場作用于所述流體滴來控制該流體滴 相對于所述至少一個表面的位置。另一方面，本發(fā)明提供流體滴。所述流體滴包括內(nèi)相和外相， 以及至少一個磁吸性粒子。所述流體滴的外相與所述流體滴的內(nèi)相不混 溶。所述流體滴的外相包圍所述內(nèi)相。所述流體滴的內(nèi)相通過所述外相 與環(huán)境隔離。所述的至少一個磁吸性粒子包括能結(jié)合生物樣品和/或化學(xué) 樣品的配體。又一方面，本發(fā)明提供一種形成流體滴的方法。所述流體滴 包括內(nèi)相、外相以及至少一個磁吸性粒子。所述方法包括提供第一流體 及提供與所述第一流體不混溶的第二流體。所述方法還包括使所述第一
流體與所述第二流體接觸，由此形成包括內(nèi)相和外相的流體滴。所述第 一流體形成所述內(nèi)相，被形成所述外相的第二流體包圍。所述方法還包 括提供至少一個磁吸性粒子。所述磁吸性粒子包括能結(jié)合生物樣品和/或 化學(xué)樣品的配體。所述方法還包括將所述至少一個磁吸性粒子放置到所 述流體滴內(nèi)。


結(jié)合考慮非限制性的實施例及附圖，并參照詳細的描述，可
以更好地理解本發(fā)明，其中圖1是液滴與表面(5)的不同接觸角e的示意圖，所述表面 為平的(A、 B、 C)、凸的(D)和凹的(E)。所述液滴包括內(nèi)相(2) 和外相(3)。圖2顯示處于表面(5)上的具有較大接觸角e的液滴的側(cè)視 圖(A)和俯視圖(B)。所述液滴包括內(nèi)相(2)和外相(3)。所述液滴 還包括磁吸性粒子(1)。圖3A表示包含功能化磁吸性粒子(8)的、具有內(nèi)相(2)和 外相(3)的液滴的側(cè)視圖。用永磁體(20)將表面(5)下面的液滴控 制在相對于表面(5)的一個位置。圖3B顯示位于表面(5)上的、具有內(nèi)相(2)、外相(3)和 磁吸性粒子(8)的液滴(6)。圖3C顯示位于電磁體(7)上的圖3A或3B所示的液滴(6)， 所述電磁體是分別由上面或下面看到的電磁體陣列中的一個。圖4顯示通過第二流體滴(16)對流體滴(6)中的樣品進行 清洗的過程的俯視圖(A)(還可參照圖18)，以及側(cè)視圖(B)，顯示表 面(5)下面的磁體(20)。參與清洗過程的第二流體滴可位于不同于表 面(5)的表面，包括磁吸性粒子(1)、內(nèi)相(2)和外相(3)的流體滴 位于所述表面(C)。圖5是從樣品中分離目標物的示意圖。攜帶表面抗原(11)的 白細胞(10)與偶聯(lián)到磁吸性粒子(1)上的抗體(9)結(jié)合。圖6顯示使用本發(fā)明的方法進行的血液滴樣品的遺傳分析。 白細胞結(jié)合到液滴中的功能化的磁吸性粒子(1)上，分離、清洗、使用 薄膜傳感器(15)控制的薄膜加熱器(14)進行細胞熱裂解，并進行反 轉(zhuǎn)錄(RT)處理，然后進行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和焦磷酸測序(PSQ)。 箭頭示出了樣品移動的方向。圖7顯示了白血細胞(WBC)的分離，由與抗CD15和CD45 功能化的超順磁粒子(21)漿體混合的0.1pl新鮮的人毛細管全血開始， 在室溫下培養(yǎng)10分鐘。用PBS/1%BSA清洗兩次后，準備好WBC進行 下游處理。圖8顯示清洗后，將DAPI染色的白血細胞(22)固定化到 Dynabeads CD15禾口 CD45上。圖9顯示從-一滴人血(■)和100 nl ( )血液分離出來的白細 胞的絕對數(shù)目(左縱軸)和相對收率(右縱軸)、對于100 nl血液，10 分鐘后所分離出來的白細胞的相對收率是85%。圖10顯示通過實時檢測液滴中進行的RT-PCR的擴增分析。圖11顯示所得到的PCR產(chǎn)物的熔解曲線分析。 一個峰 (TM=87.6°C，使用購自MJ Research的Opticon 2熱循環(huán)儀測得的數(shù)值 TM=84.6°C)表示單一的PCR產(chǎn)物、幾乎沒有副產(chǎn)物。圖12顯示使用毛細管電泳對擴增的cDNA片段(圖10)同一 性的確認。使用具有約1400個白血細胞(■)的100 nl CD45/15或陰性 (沒有模板)對照(NTC. ，灰色)、1 plPCR混合物和5 nl礦物油，由 樣品得到具有208 bp的PCR產(chǎn)物(收率20.5 ng/W)。 1: 15 bp的標記物， 2:引物二聚體，3: 600 bp的標記物。圖13顯示通過所述PCR產(chǎn)物(cdsDNA=20.5ng/pl)液相焦磷酸 測序得到的熱解譜圖分析。圖14顯示使用本發(fā)明的方法，進行基于液滴的焦磷酸測序得 到的前三個堿基位置的熱解譜圖分析。圖15顯示共價偶聯(lián)到micromer⑧-M超順磁粒子(micromod) 上的、表面結(jié)合熒光素(FITC)標記的羊抗小鼠IgG (全分子)。圖16顯示與涂敷GtxMs IgG FITC/RbtxGt IgG Fc HRP的超順 磁粒子反應(yīng)后，含有底物溶液A (3,3'，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB))和B
(過氧化氫)的液滴(23)的無色溶液顏色變深(帶有藍色/帶有綠色， 24)。為了終止反應(yīng)，從反應(yīng)混合物中除去超順磁粒子(25)。圖17顯示使用本發(fā)明的方法，PCR過程中的溫度/時間的輪廓 線。因為芯片熱質(zhì)(thermal mass)較低(約0.5g)，可以實現(xiàn)快的加熱 速率和快的冷卻速率(士20 50Ks'1)。圖18進一步顯示對流體滴中的生物樣品和/或化學(xué)樣品進行 處理的例子，所述處理包括移動流體滴、將該流體滴與另一流體滴合并、
使流體滴的內(nèi)部混合、使用又一流體滴清洗該流體滴以及將該流體滴分 裂成子流體滴(參照實施例以了解細節(jié))。圖19顯示使用x平臺、y平臺操控本發(fā)明方法中流體滴的示 例性儀器。將使用膠帶固定的、涂敷特氟龍AF (無定形含氟聚合物)的 載玻片相對于固定的永磁體移動(A)，所述永磁體位于x、 y、 z平臺上 (詳見B)。圖20顯示通過初始清洗(A)結(jié)合超順磁粒子的白細胞獲得 的清洗液的內(nèi)容物，以及通過隨后的進一步清洗(B)結(jié)合超順磁粒子的 白細胞而獲得的另一清洗液的內(nèi)容物。所述另一清洗液幾乎不含任何紅 血球。這顯示了用單一液滴清洗除去紅血球的效率，所述效率大小約為5 個數(shù)量級。圖21示出焦磷酸測序的機理。
具體實施例方式本發(fā)明提供一種處理生物樣品和/或化學(xué)樣品的方法。所述方 法適于任何處理，尤其是可以在流體中以小型化規(guī)模實施的方法(參照 下文)。樣品可以是任何來源。它可以來源于例如人、動物、植物、 細菌、病毒、孢子、真菌或原生動物、或來源于合成原料或生物原料的 有機或無機材料，但不限于此。因此，所述方法可以處理下列任何樣品， 所述樣品選自土壤樣品、空氣樣品、環(huán)境樣品、細胞培養(yǎng)物樣品、骨髓 樣品、降雨樣品、沉降物樣品、污水樣品、地下水樣品、磨蝕樣品(abrasion sample)、考古學(xué)樣品、食物樣品、血液樣品、血清樣品、血漿樣品、尿 樣品、糞便樣品、精液樣品、淋巴液樣品、腦脊髓液樣品、鼻咽清洗樣 品、痰液樣品、口腔抹片樣品、咽喉抹片樣品、鼻抹片樣品、支氣管肺 泡灌洗樣品、支氣管分泌物樣品、乳樣品、羊水樣品、活組織檢查樣品、 癌樣品、腫瘤樣品、組織樣品、細胞樣品、細胞培養(yǎng)物樣品、細胞裂解 液樣品、病毒培養(yǎng)物樣品、指甲樣品、毛發(fā)樣品、皮膚樣品、法醫(yī)樣品、 感染樣品、醫(yī)院感染樣品、產(chǎn)品樣品、藥物制劑樣品、生物分子制備樣 品、蛋白制劑樣品、脂質(zhì)制劑樣品、碳水化合物制劑樣品、太空樣品、
地球外樣品或其任意組合，但不限于此。若有需要，可將各樣品預(yù)處理 到任意程度。 一個示例是，在用于本發(fā)明的設(shè)備之前，組織樣品可以被 消化、勻漿或離心。所述樣品還可以制備成流體形式例如溶液。這些例 子包括如下物質(zhì)的溶液或漿液核苷酸、多聚核苷酸、核酸、肽、多肽、 氨基酸、蛋白質(zhì)、合成聚合物、生化組合物、有機化學(xué)組合物、無機化 學(xué)組合物、金屬、脂質(zhì)、碳水化合物、組合化學(xué)產(chǎn)物、候選藥物分子、 藥物分子、藥物代謝物或其任意組合，但不限于此。進一步的例子包括 金屬懸浮液、合金懸浮液及金屬離子溶液或其任意組合，以及細胞懸浮 液、病毒懸浮液、微生物懸浮液、病原體懸浮液、放射性化合物的懸浮 液或其任意組合，但不限于此?？梢岳斫獾氖?，樣品還可包括前述例子 的任意組合。通常但非必需，所述樣品包括或希望包括目標物或其前體物。 將通過多個例子來說明所述實施方式例如目標物可以是添加或包含在 樣品中的細胞或分子，并且希望以純化或富集的形式獲得所述目標物。 另一個例子是，目標物可以是已知的化合物或是理論上通過化學(xué)方法可 由前體化合物獲得的化合物。在這種情況下，所述樣品可包括例如這種 前體化合物的溶液。進一步的例子是，可懷疑細胞培養(yǎng)基被污染。在這 種情況下，本發(fā)明的方法可用于鑒別污染物的類型。因此，目標物或其前體物可具有任何性質(zhì)。所述物質(zhì)的例子 包括核苷酸、寡核苷酸、多聚核苷酸、核酸、肽、多肽、氨基酸、蛋白 質(zhì)、合成聚合物、生化組合物、糖蛋白、放射性化合物、聚電解質(zhì)、聚 陽離子、聚陰離子、病原體、有機化學(xué)組合物、無機化學(xué)組合物、脂質(zhì)、 碳水化合物、組合化學(xué)產(chǎn)物、候選藥物分子、藥物分子、藥物代謝物、 細胞、病毒、微生物或其任意組合，但不限于此。在目標物例如是蛋白 質(zhì)、多肽、肽、核酸、多聚核苷酸或寡核苷酸的實施方式中，所述目標 物可含有親和標簽。親和標簽的例子包括生物素、二硝基酚或毛地黃毒 苷，但不限于此。對于目標物是蛋白質(zhì)、多肽或肽的情況，親和標簽一 步的例子包括寡聚組氨酸(例如五聚組氨酸或六聚組氨酸-標簽)、多聚
組氨酸、結(jié)合鏈霉親和素的標簽(例如在美國專利申請US 2003/0083474、 美國專利US 5,506,121或6,103,493中記載的STREP-TAGS )、免疫球
蛋白結(jié)構(gòu)域、麥芽糖結(jié)合蛋白、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)、鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽(CBP ) 、 FL AG-肽(例如，序列Asp-Tyr-Ly s-Asp-Asp-Asp-Asp-Ly s-Gly 的肽)、T7抗原決定簇(Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly)、麥 芽糖結(jié)合蛋白(MBP )、單純皰疹病毒糖蛋白D的序列 Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp的HSV抗原決定簇、序列 Tyr-Thr-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys的水皰性口炎病毒糖蛋白 (VSV-G)抗原決定簇、序列Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala的紅 血球凝集素(HA)抗原決定簇和序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu的轉(zhuǎn)錄因子c-myc的"myc"抗原決定簇，但不限于此。對于目 標物是核酸、多聚核苷酸或寡核苷酸的情況，親和標簽還可以是寡核苷 酸標簽。所述寡核苷酸標簽例如可以用互補序列與固定化的寡核苷酸雜 交。各親和標簽可位于目標物內(nèi)或連接于目標物的任何部位。 一個示例 是，可操作地將親和標簽融合到前述任意示例性蛋白質(zhì)的氨基端或羧基 端。本發(fā)明的方法中，生物樣品和/或化學(xué)樣品包含在流體滴(例 如液滴)中。 一個示例是，它可包含在所述流體滴的內(nèi)相(參照下文)。 可通過任何方式將所述樣品放置到流體滴中(參照下文)。本發(fā)明的方法包括提供流體滴。另一方面，本發(fā)明還涉及本 文所述的流體滴。從下文可明顯看出，本文所述的流體滴起自組織的虛 擬反應(yīng)室(virtual reaction chamber)的作用。所述流體滴可具有任意所需 的體積。例如約1 pl 約1 ml范圍內(nèi)的體積、約0.1 nl 約500 pl范圍內(nèi) 的體積、或約100nl 約100nl范圍內(nèi)的體積。在某些實施方式中，在空 氣中處理體積為lml以上的流體滴需要進一步還需適應(yīng)流體滴環(huán)境。在 這一點上，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白當使用較大體積(例如2ml)的流 體滴時，各流體滴在接觸表面時會分裂成更小流體滴。當實施本發(fā)明的 方法時不希望發(fā)生所述分裂時，通過實驗很容易確定所選流體滴的適宜 體積。流體滴包含磁吸性物質(zhì)。通常流體滴只有一個相(即所述流 體滴的外相或內(nèi)相)含有磁吸性物質(zhì)。 一個示例是，在有些實施方式中， 磁流體例如鐵磁流體可包含在流體滴中。例如，可從Ferrotec (Nashua，
NH，美國)商購得到的鐵磁流體，其以亞域磁吸性粒子在液體載體中的 膠狀懸浮液形式存在。各鐵磁流體例如可基于非極性液體并形成流體滴 的外相。在這種情況下，所述內(nèi)相例如可以是水溶液。另一個示例是， 富鐵細菌可包含在流體滴的相中。許多菌種含有其代謝所需要的鐵。大 量的菌種包括腦膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌具有例如鐵傳遞蛋白和/或乳 鐵傳遞蛋白的鐵吸收系統(tǒng)。只在某些實施方式中，所述細菌才含有本發(fā) 明方法所用的足量的鐵。其它細菌還原或氧化鐵，因此含有較高量的鐵。
鐵還原細菌(厭氧性的)的示例是異化金屬還原菌(Geo6""w meto////^^cew)。不管是液滴的內(nèi)相還是外相，該菌通?？砂谒?中。當所選流體滴的外相例如是非極性液體時，該菌通常會包含在各流 體滴的內(nèi)相中(還可參照下文)。各細菌例如可通過重組表達技術(shù)含有能 吸引目標物的表面蛋白。再一個示例是，磁吸性粒子可包含在流體滴內(nèi)。所述粒子能 吸引目標物。在有些實施方式中，磁吸性粒子可被功能化為對目標物具 有特異親和力并捕獲目標物，因此，所述磁吸性粒子可用作結(jié)合手段(見 下文)。出于方便，磁吸性粒子在本文中稱為"磁粒"或"磁珠"。磁 ?？珊蟹创判圆牧稀㈣F磁性材料、順磁性材料或超順磁性材料。超順 磁性材料響應(yīng)于具有感應(yīng)磁場的磁場而不發(fā)生永久磁化。基于氧化鐵的 磁粒例如是可商購得到的來自Dynal Biotech的Dynabeads 、來自 MiltenyiBiotec的微磁珠、來自CPG Inc.的多孔玻璃磁珠，還有各種其它 來源，例如Roche Applied Science、 BIOCLON、 BioSource International Inc.、 micromod、 AMBION、 Merck、 Bangs Laboratories、 Polysciences或 Novagenlnc.，僅舉幾個為例。基于超順磁性Co和FeCo的磁性納米粒， 以及鐵磁性Co納米晶已有記載，例如Hiitten， A.等對此有記載(J. Biotech. (2004)， 112， 47~63)?？蓪⒋胖樵O(shè)計成具有通過化學(xué)吸附(例如共價鍵)或物理吸 附(例如靜電引力)吸引目標物的功能。在這些實施方式中使用的磁粒 可提供對某物質(zhì)具有親和力的表面，從而例如可以吸附/解吸蛋白質(zhì)、肽、 核酸和其它化合物。例子包括物理方式(例如7U-堆積、偶極-偶極、誘導(dǎo)
偶極-偶極、范德華力、相反電荷或氫鍵)的吸引，例如抗體-抗原的結(jié)合 吸引，和對目標物有結(jié)合活性的配體與目標物之間(例如配體與金屬) 形成的親和吸引，但不限于此。另兩個示例是，可依賴于物理化學(xué)鍵(例 如金與硫醇之間的鍵)、或幾何學(xué)方式(例如尺寸排阻方式)。還可對同 一磁?；驍?shù)個磁粒的不同區(qū)域進行設(shè)計以吸引或"捕獲"目標物。在有些實施方式中，所述磁粒包含能結(jié)合目標物的配體，懷 疑所述目標物包含在或已知包含在生物樣品和/或化學(xué)樣品中。在有些實 施方式中，所述配體能選擇性地結(jié)合所述目標物，所述目標物例如離子、
聚離子、金屬、DNA、 RNA、蛋白質(zhì)(包括其合成類似物)、細菌細胞、 孢子、病毒、小分子量有機分子或無機化合物等，但不限于此。各配體 可以固定化到至少一個磁吸性粒子的表面。圖5是目標物與固定化到磁 粒上的配體相結(jié)合的例子的示意圖。所述目標物為攜帶細胞表面標記物
(例如CD45/15)的白細胞。所述磁粒包括Y_Fe203、 Fe304以及聚甲基 丙烯酸甲酯接枝的聚苯乙烯，在磁粒上固定化的是針對細胞表面標記物
(例如抗CD45/15)的抗體。圖15顯示了標記的目標物(熒光抗體)與 磁粒的結(jié)合。各配體例如可以是基于烴的(包括聚合體的)配體并且包括 含氮基團、含磷基團、含硫基團、含碳基團、含鹵素基團或含擬卣素基 團。配體可以是醇、有機酸、無機酸、胺、膦、硫醇、二硫化物、垸烴、 氨基酸、肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、糖、寡糖或多糖。另 一例子是，配體還可以是陽離子、陰離子、聚陽離子、聚陰離子、電解 質(zhì)、聚電解質(zhì)、碳納米管、碳納米泡沫、二氧化硅粒子、玻璃粒子或鋁 硅酸鹽(alumosilicate)。通常，所述配體對目標物的親和力比對其它物 質(zhì)高。各配體的例子包括冠醚、抗體、抗體片段及具有類抗體功能的蛋 白結(jié)合分子，但不限于此。(重組)抗體片段的例子是Fab片段、Fv片 段、單鏈Fv片段(scFv)、雙功能抗體(diabodies)或域抗體(Holt， LJ 等，Trends Biotechnol. 21 (11)， 2003， 484~柳)。具有類抗體功能的蛋 白結(jié)合分子的例子是基于脂質(zhì)運載蛋白(lipocallin)家族的多肽的突變 蛋白。參見例如Beste等，Proc.Natl. Acad. Sci.USA96， 1999， 1898~1903 和WO 99/16873、 WO 00/75308、 WO 03/029471、 WO 03/029462、 WO
03/029463、 WO 2005/019254、 WO 2005/019255或WO 2005/019256。這 些文獻中記載的脂質(zhì)運載蛋白例如后膽色素結(jié)合蛋白、人中性粒細胞明 膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白、人載脂蛋白D、人淚脂質(zhì)運載蛋白或免疫抑制 性糖蛋白，這些脂質(zhì)運載蛋白具有可被修飾的天然配體結(jié)合位點，使得 它們結(jié)合到所選的已知為半抗原的小蛋白區(qū)域。蛋白結(jié)合分子其它不受 限制的例子是所謂的能結(jié)合多種小分子配體的蛋白質(zhì)(glubody)(參見 WO 96/23879 )、基于錨蛋白支架(ankyrin scaffold )
(Hryniewicz-Jankowska， A等，F(xiàn)olia Histochem. Cytobiol. 40， 2002， 239~249)或晶體蛋白支架(crystalline scaffold) (WO 01/04144)的蛋白、 記載在Skerra， J Mol. Recognit. 13， 2000， 167~187中的蛋白和高親和性 多聚體(avimers)。高親和性多聚體含有所謂的A結(jié)構(gòu)域，作為數(shù)個細 胞表面受體中的多個結(jié)構(gòu)域的繩索(strings)出現(xiàn)(Silverman， J,等，(2005) Nature Biotechnology, 23， 1556-1561)。適宜配體的其它例子包括分子 印跡結(jié)構(gòu)、細胞外基質(zhì)、外源凝集素、蛋白A、蛋白G、金屬、金屬離 子、次氮基三乙酸(NTA)衍生物、RGD基序、右旋糖苷、聚乙烯亞胺
(PEI)、聚電解質(zhì)、氧化還原聚合物、糖蛋白、適配體、酶、染料、鏈 霉親和素、直鏈淀粉、麥芽糖、纖維素、甲殼素、谷胱甘肽、鈣調(diào)蛋白、 明膠、多粘菌素、肝素、NAD、 NADP、賴氨酸、精氨酸、芐脒、多聚 尿噴啶(poly U)或寡脫氧胸苷(oligo-dT)，但不限于此。已知外源凝 集素例如伴刀豆球蛋白A與多糖類和糖基化的蛋白質(zhì)相結(jié)合。染料的示 例是三嗪染料，例如特異性結(jié)合NADH依賴性酶的活性藍(Cibacron blue F3G-A， CB)或活性紅(RedHE-3B)。染料Green A與CoA蛋白、人血 清白蛋白和脫氫酶相結(jié)合。染料7-氨基放線菌素D和4',6-二脒基-2-苯基 口引哚與DNA相結(jié)合。金屬例如Ni、 Cd、 Zn、 Co或Cu的陽離子通常用 于結(jié)合親和標簽，所述親和標簽例如含有序列的寡聚組氨酸，包括六聚 組氨酸或His-Asn-His-Arg-His-Lys-His-Gly-Gly-Gly-Cys標簽(MAT標 簽)、六肽His-Ser-Gln-Lys-Val-Phe (結(jié)合鎘)和N-甲基丙烯?；?(L)-半 胱氨酸甲酯。此外，可以用修飾劑涂敷磁粒，進一步增大底物對任何或 某種形式、種類等的目標物的親和力。在有些實施方式中，目標物是懷疑或己知存在于其它(不需 要的)物質(zhì)內(nèi)、需要從所述物質(zhì)中提取出來的分子。從有機體、部分有
機體或胚胎中提取分子例如可包括使用一種化合物，所述化合物能促進 所需分子從有機體或部分有機體向流體內(nèi)轉(zhuǎn)移。從部分有機體中提取分 子的示例是對整合到細胞膜中的蛋白質(zhì)(全部或部分)進行提取。常常 希望將所述蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到水溶液中作進一步處理。促進所述蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移 到水溶液中的化合物是洗滌劑。用添加洗滌劑的水溶液接觸各細胞膜通 常導(dǎo)致膜蛋白的提取。在使用磁粒時，它們同時可作為目標物的載體，或者，它們
本身作為標簽或在傳感器技術(shù)中用作放大器。例子包括巨磁電阻(GMR) [Chiriac， H等,(2005) Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 293， 671~676]、表面增強拉曼光譜(SERS)、增強的表面等離子體共振(eSPR) 和二維毛細管電泳，但不限于此。 一個示例是，目標物可與固定化在本 發(fā)明流體滴中的不同磁粒上的配體相結(jié)合。通過另外的親和配體，目標 物無論是結(jié)合到固定相上、溶液中還是其它物質(zhì)上，它都可以和與其相 結(jié)合的磁粒一起被分離出來。當磁粒受磁場作用時，它們形成偶極磁場。 這種偶極磁場可用偶極傳感器來檢測。通過定量測定傳感器阻抗的振幅， 可確定目標物的量。所述流體滴還包括內(nèi)相和外相。所述外相包圍所述內(nèi)相。在 有些實施方式中，所述外相是容納所述內(nèi)相的體相。在其它實施方式中， 所述外相作為膜包圍所述內(nèi)相。所述外相的流體可以是液體或氣體。所 述內(nèi)相的流體通常是液體。在外相為膜的實施方式中，其體積通常處于內(nèi)相體積的幾個 數(shù)量級以上至幾個數(shù)量級以下的范圍內(nèi)。內(nèi)相與外相的體積比可以在例 如約1000:1~約1:1000的范圍內(nèi)(例如在約10:1~約1:10的范圍內(nèi))選擇。 一個例子是，在室溫下使用一個以上液滴時，希望選擇內(nèi)相與外相的大 體積比，例如體積比約為1000:1。在約100°C的溫度范圍內(nèi)使用一個以 上液滴時，希望選擇內(nèi)相與外相的小體積比，例如體積比約為1:1000。 在有些實施方式中，各膜厚度還是均一的。在其它實施方式中，膜包括 不規(guī)則體(例如圓錐體)。例如已知各不規(guī)則界面是水與有些離子液體(例 如辛基取代的六氟磷酸鹽)之間的界面。所述外相與所述內(nèi)相不混溶。通常，所述外相的流體與所述 內(nèi)相的流體不混溶。任何流體均可用于各相，只要滿足以下條件(a)
流體與其它相不混溶，從而可以形成兩個分離的相，并且(b)所述流體 不阻止進行所需的處理。兩種不混溶氣體的示例是氦氣和二氧化碳，只 要溫度低于二元混合物臨界溫度、壓力高于純的液態(tài)二氧化碳蒸汽壓力， 它們通常在很寬組成范圍內(nèi)都能形成不混溶的兩相。通常在內(nèi)相中進行 處理(還可參照下文)。因此，所選流體可具有任何性質(zhì)。當所選相為液 體或氣體時，其可以分別是例如極性或非極性的液體或氣體，為了表征 與其它液體的性質(zhì)(例如可溶性和混溶性)，常常將液體分為極性液體和
非極性液體。極性液體通常含有電子密度不均勻分布的分子。相同的分 類也可適用于氣體。分子的介電常數(shù)或偶極矩反映其極性。極性分子通 常還分為質(zhì)子與非質(zhì)子分子。因此，在很大程度上含有極性質(zhì)子分子的 流體例如液體，可稱為極性質(zhì)子流體。在很大程度上含有極性非質(zhì)子分 子的流體例如液體，可稱為極性非質(zhì)子流體。當分子溶于例如水或醇中 時，質(zhì)子分子含有氫原子，所述氫原子可為酸性氫。非質(zhì)子分子不含有 這樣的氫原子。非極性液體的例子包括己垸、庚垸、環(huán)己垸、苯、甲苯、二 氯甲烷、四氯化碳、二硫化碳、二噁垸、乙醚或二異丙醚，但不限于此。 偶極非質(zhì)子液體的例子是甲基乙基酮、氯仿、四氫呋喃、乙二醇單丁醚、 吡啶、甲基異丁基酮、丙酮、環(huán)己酮、乙酸乙酯、異丁酸異丁酯、乙二 醇二乙酸酯、二甲基甲酰胺、乙腈、N,N-二甲基乙酰胺、硝基甲烷、N-甲基吡咯垸酮、甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、N,N-二異丙基乙胺 和二甲亞砜。極性質(zhì)子液體的例子是水、甲醇、異丙醇、叔丁醇、甲酸、 鹽酸、硫酸、乙酸、三氟乙酸、二甲基次胂酸[(CH3)2AsO(OH)]、乙腈、 苯酚或氯苯酚。離子液體通常具有有機陽離子和陰離子，所述陰離子可 以是有機或無機的。據(jù)知，離子液體的極性(參照下文例子)主要由相 關(guān)陰離子決定。例如鹵化物、擬鹵化物、BF厶硫酸二甲酯、N(V或C104— 是極性液體，而六氟磷酸鹽、AsF6—、雙(全氟烷基)-酰亞胺和[C4F6S03;r 是非極性液體。每個相還可含有一種以上的流體。例如，如果一種以上 的液體用作內(nèi)相或外相，則所選的這些液體的混合物仍能形成與液滴其 它各相分離的相，并且通常這些液體可以按照所選比例彼此混溶。 一個示例是，極性氣體氨易溶于極性液體水，使得這兩種流體可以包含在一 個共同的相中。兩個不混溶的相例如可通過如下方法獲得，即選擇極性流體 (例如親水性液體(參照下文))為一相，選擇非極性流體(例如疏水性 液體)為另一相。 一個示例是，非極性氣體二氧化碳(C02)不溶于(除 痕量外)極性液體水。然而，在某些情況下，例如在加壓下，二氧化碳 會溶于水(例如參照碳酸飲料)。在有些實施方式中，流體滴的內(nèi)相流體 可以是極性液體，而流體滴的外相流體可以是非極性液體。適宜的極性 液體包括水、氧化氘、氧化氚、醇、有機酸(包括其鹽)、無機酸(包括 其鹽)、有機酸酯、無機酸酯、醚、胺(包括其鹽)、酰胺、腈、酮、離 子洗滌劑、非離子洗滌劑、二氧化碳、二甲基砜、二甲亞砜、硫醇、二 硫化物和極性離子液體，但不限于此。適宜的非極性液體包括礦物油、 硅氧烷油、天然油、全氟化碳液體、部分鹵化(例如氟化)碳液體、烷 烴、烯烴、炔烴、環(huán)烷烴、芳族化合物、二硫化碳和非極性離子液體， 但不限于此。 —個示例是，所述流體滴的內(nèi)相流體可以是親水性液體，而
所述流體滴的外相流體可以是疏水性液體。親水性("親水的")液體， 也稱為疏脂性("疏脂的")液體，含有能與水分子形成偶極-偶極相互作 用并由此溶于水分子中的分子。疏水性("憎水的")液體，也稱為親脂 的液體，趨于從水中分離出來。親水性液體的例子包括水、丙酮、甲醇、 乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、四氫呋喃、吡啶、氯仿、乙二醇單丁醚、
吡啶、乙酸乙酯、乙腈、二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡 咯垸酮、甲酸、甲酰胺以及極性離子液體，但不限于此。極性離子液體 的例子包括l-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽、N-丁基-4-甲基吡啶四氟硼酸 鹽、1，3-二烷基咪唑-四氟硼酸鹽、1,3-二垸基咪唑-六氟硼酸鹽、1-乙基-3-甲基咪唑雙(五氟乙基)亞膦酸酯、l-丁基-3-甲基咪唑四(3,5-雙(三氟甲基 苯基)硼酸鹽、四丁基銨雙(三氟甲基)-酰亞胺、乙基-3-甲基咪唑三氟甲垸 磺酸酯、l-丁基-3-甲基咪唑甲基硫酸鹽、l-正丁基-3-甲基咪唑([bmim]) 辛基硫酸鹽以及l(fā)-正丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽，但不限于此。非極性 液體的例子包括礦物油、己烷、庚垸、環(huán)己烷、苯、甲苯、二氯甲烷、
氯仿、四氯化碳、二硫化碳、二噁烷、乙醚、二異丙醚、甲基丙基酮、 甲基異戊基酮、甲基異丁基酮、環(huán)己酮、異丁酸異丁酯、乙二醇二乙酸 酯及非極性離子液體，但不限于此。非極性離子液體的例子包括1-乙基 _3_甲基咪唑雙[(三氟甲基)_磺酰]酰胺雙(三氟甲磺?；?酰胺、l-乙基-3-甲
基咪唑雙[(三氟甲基)-磺酰]酰胺三氟乙酸鹽、l-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸 鹽、l-己基-3-甲基咪唑雙(三氟甲基磺酰)酰亞胺、l-丁基-3-甲基咪唑雙 -(三氟甲基磺酰)酰亞胺、三己基(十四垸基)膦雙[草酸(2-)]硼酸鹽、1-己基 -3-甲基咪唑三(五氟乙基)三氟磷酸鹽、l-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽、 三(五氟乙基)三氟磷酸鹽、三己基-(十四垸基)膦、N"-乙基-N，N,N'，N'-四 甲基胍鹽、l-丁基-l-甲基吡咯垸三(五氟乙基)三氟磷酸鹽、l-丁基-l-甲基 吡咯烷雙(三氟甲基磺酰)酰亞胺、l-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽、1-乙基 _3-甲基咪唑雙(三氟甲基磺酰)酰亞胺及l(fā)-正丁基-3-甲基-咪唑鑰鹽，但不 限于此。流體滴的相可包括例如溶解、乳化或懸浮于流體滴中的其它 物質(zhì)。 一個示例是，在使用水相時，它可包括一種或多種緩沖化合物。 本領(lǐng)域使用了很多緩沖化合物，也可以用它們進行本文所述的各種處理。 緩沖劑的例子包括下列鹽溶液，即磷酸鹽、碳酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸 鹽、乙酸鹽、甲酸鹽、巴比妥酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、 馬來酸鹽、卡可酸鹽、硼酸鹽、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基-乙烷磺酸酯(也 稱為ACES)、 N-(2-羥乙基)-吡嗪-N'-2-乙烷磺酸(也稱為HEPES)、 4-(2-羥乙基)-l-卩比嗪-丙烷磺酸(也稱為HEPPS)、吡嗪-l,4-雙(2-乙烷磺酸)(也 稱為PIPES)、 2-[三(羥甲基)-甲基氨基]-l-乙烷磺酸(也稱為TES)、 2-環(huán) 己基氨基-乙垸磺酸(也稱為CHES)及N-(2-乙酰氨基)-亞氨基二乙酸鹽 (也稱為ADA)，但不限于此。任何反離子均可以用于這些鹽；示例可 以是銨、鈉及鉀。緩沖劑的其它例子包括三乙醇胺、二乙醇胺、乙基胺、 三乙基胺、氨基乙酸、甘氨酰甘氨酸、組氨酸、三(羥甲基)氨基甲垸(也 稱為TRIS)、雙(2-羥乙基)-亞氨基-三(羥甲基)甲垸(也稱為雙TRIS)及 N-[三(羥甲基)-甲基]-氨基乙酸(也稱為TRICINE)，僅舉幾個為例，并 不限于此。緩沖劑可以是這些緩沖化合物的水溶液或適宜的極性有機溶 劑的溶液。 一個示例是，緩沖劑可以固體形式(例如凍干形式)保存。 在這種情況下，固態(tài)緩沖劑(例如粉末)可以通過合并和/或混合，例如
通過超聲波技術(shù)輔助或使用超聲波技術(shù)而溶解于水相。在這種情況下， 各水相的使用體積例如可用于獲得所需的最終緩沖劑濃度。流體滴的相中所包含物質(zhì)的其它例子包括進行化學(xué)或生物處 理所用的試劑、催化劑和反應(yīng)物，但不限于此。 一個示例是，為保持細 胞或蛋白質(zhì)處于完整狀態(tài)，可以加入鹽、底物或洗滌劑。另一個示例是， 可需要螯合化合物例如來防止有機體接觸痕量的其它有毒鹽或提高化學(xué)
反應(yīng)收率。其它示例是，為保持蛋白質(zhì)、RNA或DNA處于完整狀態(tài)， 可加入蛋白酶抑制劑、核糖核酸酶抑制劑或脫氧核糖核酸酶抑制劑?？?作為流體滴的相的添加劑的另一個例子包括磁吸性粒子(如上所述)。所述流體滴的內(nèi)相通過所述外相與環(huán)境隔離。因此所述外相 例如可用作屏障或密封層。術(shù)語"環(huán)境"指的是任何流體或固體物質(zhì)， 例如氣體(具有任意所需的密度或壓力)或液體，它不是內(nèi)相、外相或 表面(流體滴放置于該表面上)的一部分。 一個示例是，所述外相可以 防止或減少所述內(nèi)相向周圍大氣蒸發(fā)。另一個例子，所述外相可以為接 觸或擴散等提供屏障。所述外相例如可以防止接觸固體物質(zhì)(例如沙或 塵粒)或防止與所述流體滴內(nèi)相可混溶的流體相接觸。流體滴的外相還 可以提供獲得能量的方式，例如向內(nèi)相提供一定波長的電磁輻射。所述 外相還可以用于防止流體滴所處的表面受到所述流體滴內(nèi)相組分的污 染。此外，所述外相可以使樣品例如體液(例如血液、痰液等)在非極 性表面(例如PTFE)移動。在有些實施方式中，甚至當流體滴作為整體 在非滅菌條件下或處于非滅菌條件下進行處理時，所述外相還可以保持 內(nèi)相的無菌性。所述外相還可以使得與另一包括具有相似極性(例如相 似疏水性)的兩相的流體滴相接觸和融合。這種情況的例子是，當外相 是疏水性液體而內(nèi)相是親水性液體時，所述外相可以與其它流體滴的外 相合并，所述其它流體滴的外相是疏水性的并包圍親水性內(nèi)相。在這種 情況下，這兩個示例性的液滴可發(fā)生自發(fā)融合?？梢愿鞣N方式提供流體滴。流體滴的形成包括提供內(nèi)相流體、 提供外相流體以及提供樣品。本發(fā)明所用的包括兩相的流體滴是自組織 系統(tǒng)，由表面能來驅(qū)使其形成。因此，可以在第一步、第二步或最后一 步提供內(nèi)相或外相、或樣品。或者，可以同時提供內(nèi)相、外相或樣品三
者中的任意一個或多個(或部分)。 一個示例是，流體滴的形成可包括提 供第一流體和提供與該第一流體不混溶的第二流體。流體滴的形成還可 包括將第一流體的一部分(例如一滴)分配給第二流體，由此形成被第 二流體包圍的第一流體的一個或多個流體滴，由此形成包括內(nèi)相和外相 的一個或多個流體滴。在有些實施方式中，流體滴的形成還可包括從形 成外相的所述第二流體中收集出所述第一流體的流體滴或其一部分。在 這種情況下，可以形成包括作為膜包圍內(nèi)相的外相的流體滴。在有些實 施方式中，可通過在第二流體中形成第一流體的流體滴來形成初始的較 大的滴。在這些實施方式中，可從此初始的較大的滴收集數(shù)個較小的滴。 因為流體滴是自組織系統(tǒng)，通常不需要其它方式去獲得具有初始體積的 各個等份。在這方面，本發(fā)明還涉及一種如上所述形成流體滴的方法。 所述方法包括剛剛所述的形成流體滴，即通過提供彼此不混溶的兩種流 體，使第一流體與第二流體接觸，由此形成被第二流體包圍的第一流體 的流體滴(如前所述)。在所述方法的一個實施方式中，使第一流體與第 二流體接觸包括將第一流體的滴分配到第二流體中。在有些實施方式中， 所述方法還可包括從第二流體中收集出第一流體的滴，由此形成包括內(nèi) 相和外相且外相作為膜包圍內(nèi)相的流體滴。第一流體形成內(nèi)相，第二流 體形成外相。所述方法還包括提供至少一個磁吸性粒子，所述磁吸性粒 子包括能結(jié)合目標物的配體(如前所述)。所述方法還包括將所述的至少 一個磁吸性粒子放置到形成所述流體滴內(nèi)相的第一流體中。如上所示， 因為流體滴是自組織系統(tǒng)，在此方法進行過程中，可以在任何時候?qū)⑺?述的至少一個磁吸性粒子放置到第一流體或第二流體中。例如在將第一 流體滴分配給第二流體中之前，可以將磁粒處理到滴中，例如第一流體 的滴中。如上所述，流體滴的內(nèi)相可與流體滴所處的或?qū)⒁胖玫降?至少一個表面中包含的物質(zhì)直接接觸。兩個示例是固體表面或流體表面。 只要所述至少一個表面具有使與其接觸的流體滴保持完整的質(zhì)地(例如 粗糙度和波紋)，則其可以具有任何形狀和幾何結(jié)構(gòu)。 一個示例是，通常 需要提供一種具有粗糙度的表面，所述粗糙度對流體滴內(nèi)相的流體小到
足以使與其接觸的流體滴保持完整。術(shù)語"完整的"是指存在所定義的 包括兩相的流體滴。因此，當所述流體滴例如鋪展到所需程度或與另一 流體滴合并時，可理解為它是保持完整的。所述至少一個表面例如可以 是凹圓形或凸圓形(參照圖1D和IE)或其組合(圖4C)。在一個實施
方式中，所述至少一個表面基本上是平的(例如參照圖1A 1C)。在另一
實施方式中，所述至少一個表面是圓柱形的，流體滴可以沿所述圓柱形 的表面旋轉(zhuǎn)。本發(fā)明的方法包括提供至少一個表面，例如，如上所述的表 面。在有些實施方式中，提供一個以上的表面，例如兩個表面、三個表 面、四個表面等。在一個實施方式中，至少兩個表面彼此相對。只要表 面對所述流體滴內(nèi)相的流體的浸潤性能使與其接觸的流體滴保持完整， 則所述表面可以是任何材料制成的。在提供一個以上表面(例如兩個彼 此相對的表面)的一個實施方式中，各表面對所述內(nèi)相流體具有能使與 其接觸的流體滴保持完整的質(zhì)地和浸潤性。當例如所述流體滴的內(nèi)相是極性液體(例如含水流體)時， 所述至少一個表面可以是非極性的。在一個實施方式中，所述流體滴的 內(nèi)相是含水流體(例如水)，所述至少一個表面是非極性的。在有些實施 方式中，各非極性表面可以選自聚硅氧垸(silicone)(包括表面修飾的聚 硅氧烷)、聚合物例如塑料(無論生物聚合物還是合成聚合物，包括部分 氟化聚合物、全氟化聚合物及表面修飾聚合物等)、表面修飾的氧化硅、 表面修飾的氫化硅、表面修飾的紙、表面修飾的玻璃(例如表面修飾的 耐熱玻璃)、表面修飾的石英、表面修飾的云母、表面修飾的金屬、表面 修飾的合金、表面修飾的金屬氧化物、表面修飾的陶瓷及其任意的復(fù)合 材料。另一個示例是，所述流體滴的內(nèi)相可以是親水性而所述至少一個 表面可以是疏水性或疏油性的。另一個示例是，所述流體滴的內(nèi)相可以 是非極性的，而所述至少一個表面可以是極性的。通常通過處理來改變固體表面性能從而獲得表面修飾。所述 處理可包括各種方式，例如物理方式(例如機械方式、熱方式或電學(xué)方 式)、化學(xué)方式或電化學(xué)方式等。 一個例子是，塑料材料表面通過用稀硫 酸、鉻酸、高錳酸鉀溶液或稀硝酸處理可變成親水性的。另一個例子是，
通過氧或空氣等離子體的氧化可使聚二甲基硅氧烷(PDMS)表面變成親
水性的。如Kim等(2003 ECI Conference on Heat Exchanger Fouling and Cleaning: Fundamentals and Applications [2003]， Vol. RPl， 107~114)所記
載，在反應(yīng)氣體存在下，通過離子輻射可使疏水性聚合物(例如聚甲基 丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯和聚碳酸酯)的表面 變成親水性的。通過將硅浸入H20/H202/NH4OH中，可使其變成親水性 的。此外，通過涂敷親水性自組裝單層膜、親水性聚合物或通過使用表 面活性劑處理或使用聚合體前體物進行等離子處理，任何疏水性表面的 表面性質(zhì)均可變得更為親水。當本發(fā)明的方法與其它方法(例如分析方法或制備方法)組 合使用時(還可參見下文)，優(yōu)選提供允許或利于實施所述其它方法和本 發(fā)明方法的表面。在實施所述其它方法期間或之前，流體滴兩相的完整 性可能受到影響或破壞。結(jié)果是，存在于所述流體滴內(nèi)相的物質(zhì)可能暴 露于其它流體相并且與所述表面接觸。本發(fā)明所用的流體滴可以使用各 種適宜的內(nèi)相和外相，這通常允許靈活選擇化學(xué)表面處理的方式，包括 涂敷。因此，經(jīng)?？稍诒景l(fā)明的方法和后續(xù)的方法中使用同一表面。 —個示例是，例如可優(yōu)選例如通過對磁粒進行電泳分離或等 電聚焦操作，無論磁粒是否包含在本發(fā)明所用的流體滴中。例如可優(yōu)選 提供一種與所存在的任何物質(zhì)發(fā)生最小相互作用的表面，通過所選方法 能檢測到所述物質(zhì)。例如當需要使用電磁場(例如電泳方法)來分析所 分離的蛋白純度時，與蛋白相互作用顯著的表面會使分析結(jié)果發(fā)生錯誤。 用相互作用最小的蛋白涂敷的適宜表面的兩個示例是極性聚合物聚N-羥 乙基丙烯酰胺以及聚乙二醇封端的烷基三氯硅烷。同樣可知，等電聚焦 所用設(shè)備的表面性質(zhì)影響聚焦和遷移過程中獲得窄的分離區(qū)的效率。為 獲得高分離度，在等電聚焦中使用pH梯度的表面處理的例子包括涂敷例 如聚丙烯酰胺、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯基醇等高極性聚 合物或涂敷碳氟化合物，但不限于此?；瘜W(xué)表面處理的例子包括與下列物質(zhì)接觸或與下列物質(zhì)反 應(yīng)，這些物質(zhì)包括六甲基二硅氮烷、2-羥基-4-(3-三乙氧基-甲硅烷基丙氧 基)二苯基酮、(3-三乙氧基甲硅垸基)丙基琥珀酸酐、2-[甲氧基(聚氧乙烯)
丙基]三甲氧基硅垸、(十七氟代-l,l,2,2-四氫癸基)三乙氧基硅烷、(十三 氟代-l，l，2,2-四氫辛基)三乙氧基硅垸、(十七氟代-l，l,2,2-四氫癸基)三氯 硅垸、(十三氟代-l,l,2,2-四氫辛基)三氯硅烷、甲基丙烯酰氧基甲基三(三 甲基硅氧基)硅烷、PlusOne Repel-Silane ES (溶解于八甲基環(huán)八硅烷中 的2。/。的二甲基二氯硅烷溶液，GE Healthcare)、 SIGMACote (在庚烷中 的氯化有機聚硅氧烷)、3-巰基-丙基三甲氧基硅烷、十八垸基硅烷、十八 垸基三甲氧基硅烷、環(huán)氧基丙氧基丙基-三甲氧基硅垸、2-(二苯基膦基) 乙基三乙氧基硅烷、雙(2-羥乙基)-3-氨基丙基-三乙氧基硅垸、氨基丁基 三乙氧基硅烷、(3-丙烯酰氧基丙基)三甲氧基硅垸、三甲基氯硅垸、二甲 基二氯硅垸、丙基三氯硅垸、四乙氧基硅垸、環(huán)氧丙氧基丙基三甲氧基 硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅垸、2-(3,4-環(huán)氧基環(huán)己基)乙基三甲氧基硅 烷、3-(2,3-環(huán)氧基丙氧基)丙基三甲氧基硅烷、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、 ，(3,4-環(huán)氧基環(huán)己基)乙基三甲氧基硅垸、聚(甲基丙烯酸甲酉旨)或聚甲基丙 烯酸酯共聚物、氨基甲酸乙酯、聚氨基甲酸乙酯、氟代聚丙烯酸酯、特 氟龍AF1600、 2400及2200、聚(丙烯酸)(PAA)、聚(甲氧基聚乙二醇甲 基丙烯酸酯)、聚(二甲基丙烯酰胺)、聚N-丙烯酰基-氨基乙氧基乙醇
(AAEE)、 二苯甲酮和Pluronic-F-68接枝的聚丙烯酰胺(Li等， Electrophoresis 2005， 26， 1800-1806)、聚[N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺]
(PHPMA)、 a-磷酸膽堿-鄰-(N,N-二乙基二硫代氨基甲?；?十一垸基寡 (N,N-二甲基丙烯酰胺)-寡-ST嵌段共寡聚物(oligoDMAAm-oligo-STblock co-oligomer)(參照例如Matsuda， T等，Biomaterials， (2003)， 24， 4517-4527)、聚(3,4-環(huán)氧基-l-丁烯)、3,4-環(huán)氧基-環(huán)己基甲基丙烯酸甲酯、 2，2-雙[4-(2,3-環(huán)氧基丙氧基)苯基]丙烷、3,4-環(huán)氧基-甲基丙烯酸環(huán)己酯、 (3'，4'-環(huán)氧基環(huán)己基甲基)-3,4-環(huán)氧基環(huán)己基甲酸酯、己二酸二-(3,4-環(huán)氧 基環(huán)己基甲基)酯、聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物例如UCON (Analabs， Norwalk， CT，美國)、雙酚A (2,2-雙-(對-(2,3-環(huán)氧基丙氧基)苯基)丙烷)、 2,3-環(huán)氧基-1-丙醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯垸酮、右旋糖苷、表面活性劑 例如十二烷基二甲基(3-磺基丙基)氫氧化銨(C12N3S03)、十六烷基二甲 基(3-磺基丙基)氫氧化銨(C16N3S03)及椰油(酰胺丙基)羥基二甲基磺基 甜菜堿(RCONH(CH2)3N+(CH3)2 CH2CH(OH)CH2S03-，其中R=C8-C18) 等，包括例如Supelcoat PS2 (Supelco， Bellefonte， PA，美國)、甲基纖
維素、羥丙基纖維素、羥乙基纖維素或羥丙基甲基纖維素等聚合物表面
活性劑，但不限于這些物質(zhì)。如美國專利申請2005/0249882所公開的， 例如可通過化學(xué)氣相沉積或通過表面聚合，然后使表面接觸雙功能試劑 來使用聚合物進行涂敷。在后一種情況下，表面與涂敷聚合物之間形成 了穩(wěn)定的共價鍵。在表面粗糙或表面含微孔或納米孔的實施方式中，例 如可優(yōu)選選擇這種技術(shù)。此外，所述至少一個表面可以提供具有不同表面性能的區(qū)域。 在流體滴的內(nèi)相是極性(例如親水性)液體的上述示例中，例如表面有 些區(qū)域的非極性(例如疏水性)可以比其它區(qū)域更大，或有些區(qū)域可以 是極性(例如親水性)的。 一個示例是，為了實現(xiàn)流體滴在用于雜交的 DNA陣列上得到鋪展，優(yōu)選極性增大的表面區(qū)域。還可以按照分別提供 極性或非極性表面性能的方式處理所述至少一個表面的任何部位。例如 可以分別處理固體表面。定義流體(例如液體)表面浸潤性的一般方式是處于熱力學(xué) 平衡狀態(tài)的流體滴與水平表面之間的接觸角(也稱為潤濕角)，所述水平 表面通常是光滑和均勻的，通常被例如空氣等氣體包圍。在這一點上， 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知道的事實是表面粗糙度增加，則接觸角通常增 大。根據(jù)表面和流體的類型不同，流體滴可以有各種形狀(例如 圖l所示)。另外，圖1還顯示了所示的流體滴的內(nèi)相的各接觸角e。通 常單獨測量所關(guān)注的各個相，例如本發(fā)明所用流體滴的內(nèi)相和外相的接 觸角(參照下文)。在有些實施方式中，可以以相同方式來測定包括內(nèi)相 和外相的流體滴的表面浸潤性，尤其對于外相是體相的情況。然而，更
為方便的是分別測量每個相的接觸角。接觸角e是流體滴界面與水平表 面之間的角。所述接觸角e是與所涉及表面的界面張力相關(guān)的熱力學(xué)可 變的角。它反映了流體滴內(nèi)部分子之間的相互引力與流體滴分子朝向表 面分子所受到的引力或斥力的受力平衡。測量接觸角最常用的技術(shù)是單相結(jié)構(gòu)中的所謂靜態(tài)法或座滴 法(sessile drop method),所述單相類似于圖l所示的內(nèi)相。測量通常包 括連續(xù)滴加流體滴，直至接觸角達到穩(wěn)定狀態(tài)。各穩(wěn)定狀態(tài)的值稱為前
進接觸角。在這一點上，被認為意義較小的其它值就是所謂的后退接觸 角。所述后退接觸角通過繼續(xù)進行前進接觸角的實驗，即通過隨后立即 監(jiān)測當?shù)润w積流體滴從所述流體滴不斷縮回時的接觸角而得到。測量接
觸角的其它方式包括Wilhemly平板法(Wilhemly Plate)法、捕泡法、毛 細管上升法及傾斜滴測量法。接觸角e為o度時形成浸潤，而接觸角e在約0~約90度之間
時，尤其是對于在約45度以下范圍內(nèi)的數(shù)值，流體滴通常形成鋪展。接
觸角e大于約卯度時，則顯示流體趨于成珠或從固體表面收縮(參照圖
1C的示例)。如上所示，通常測量流體單相的接觸角。因此，通常單獨
測量所述流體滴的內(nèi)相和外相的接觸角。在有些實施方式中，本發(fā)明所 用的至少一個表面對流體滴內(nèi)相的流體具有這樣的浸潤性，將由各流體
組成的單相流體滴被放置到所述表面上時，其特征是前進接觸角e為約
50度以上。因此，所述表面的浸潤性具有如下特點由上述定義的流體
滴內(nèi)相的流體組成的流體滴與所述至少一個表面的界面處的前進接觸角
為約50度以上。在有些實施方式中，本發(fā)明所用的至少一個表面對流體
滴外相的流體具有這樣的浸潤性，由外相流體組成的流體滴具有如下特
點各流體滴與所述至少一個表面在界面處的前進接觸角e為約50度以
上。在有些實施方式中，本發(fā)明所用的至少一個表面對流體滴整體具有
浸潤性，所述浸潤性很低使得其特征為所述流體滴與所述至少一個表
面在界面處的前進接觸角e為約50度以上。在有些實施方式中，表面(例如固體表面)還對流體滴的內(nèi)
相或外相的流體呈惰性。這些實施方式使得可以多次重復(fù)使用設(shè)備。對 腐蝕性最強的介質(zhì)呈惰性的材料的示例是氟聚合物，例如氟化乙丙烯
(FEP)、聚四氟乙烯(PFTE，特氟龍)、乙烯-四氟乙烯(ETFE)、四氟 乙烯-全氟代-甲基乙烯基醚(MFA)、偏氟乙烯-六氟丙烯共聚物、四氟乙 烯-六氟丙烯共聚物、偏氟乙烯-六氟丙烯-四氟乙烯三元共聚物、全氟甲 基乙烯基醚-四氟乙烯共聚物、全氟烷氧基共聚物(PFA)、聚氟乙烯、聚 氯三氟乙烯、氟硅氧'烷類或氟代膦嗪類(fluorophosphazenes)。此外，尤其當各相是液相時，所述流體滴的內(nèi)相或外相可包 括離子表面活性劑或非離子表面活性劑，例如全氟碳表面活性劑。在適用情況下，表面活性劑通常主要吸附在接觸線區(qū)域附近的固-液、液-液和 液-氣界面。 一個示例是，可優(yōu)選使用表面活性劑來減少所述流體滴內(nèi)相 所包含的樣品與表面之間的非特異性相互作用。很多部分親水且部分親 脂的表面活性劑用于本領(lǐng)域中，例如烷基苯磺酸鹽類、烷基苯氧基聚乙
氧基乙醇類、烷基葡糖苷類、仲胺和叔胺(例如二乙醇胺)、吐溫、Triton 100及三乙醇胺，或例如氟表面活性劑(例如ZONYL FSO-100 (DuPont))。本發(fā)明方法還包括將流體滴放置到所述至少一個表面上?？?以任何方式放置所述流體滴。 一個例子是，可以提供分配器來處理。為 了提供和分配所需尺寸的流體滴，所述分配器可以采用任何適宜的設(shè)備 或機械裝置。所述分配器的例子包括壓電吸移器、基于注射泵的吸移器、 蠕動泵、觸壓式分配器、調(diào)壓式分配器、噴墨式(inkjet)分配器(包括 注射器螺線管分配器)、針轉(zhuǎn)移式分配器(參照Rose， D， Drug Discovery Today (1999)， 4,411-419的評論)，但不限于此。流體滴的放置還可以 依賴于或借助于它所包括的磁吸性物質(zhì)的性質(zhì)。因此，可以使用磁場、 電磁場、電場或靜電場。 一個示例是，在磁場、電磁場或電場作用下， 例如可以使用雙向電泳從毛細管注射磁塞。在一個實施方式中，通過分 配器可以將流體滴放置到表面上而不接觸分配器。在另一實施方式中， 通過接觸分配，可以將流體滴直接分配到表面上。如需要，例如美國專 利申請2003/0209560所公開的那樣，可以使用照相機測量分配量。圖7、 16和18顯示了本發(fā)明所用流體滴在表面上的示例。在 表面上分配流體滴之前、期間或之后，所述表面相對于地面可以具有任 何取向。在表面基本上是平面以及流體滴是在氣體例如空氣中處理的實 施方式中，出于方便，可優(yōu)選將流體滴放置到各個表面上。同樣，在這 種情況下，為了幫助控制流體滴的位置，特別是當需要通過磁場方式將 流體滴進行定位并在此之后終止磁場時，可優(yōu)選保持各表面處于基本水 平的位置。在這種情況下，如圖3A和圖3B所示，通常將所述流體滴處 理到各表面之下或之上。在所提供的表面是凹面或凸面并且流體滴是在 氣體例如空氣中處理的實施方式中，出于方便，例如相對于重力作用方 向，可優(yōu)選將流體滴處理到凹部的頂部或底部的位置。本發(fā)明的方法通常不需要任何機械部件，所以它依賴于靈活的強有力的微流體系統(tǒng)。本發(fā)明的方法通常也不需要閥，因而不產(chǎn)生死 體積。因此，本發(fā)明的方法很適合處理納升級以及小于納升級體積的樣 品(如前所述)而沒有任何材料損耗。通常本發(fā)明的方法包括控制流體滴的位置，尤其是相對于所 述的至少一個表面的位置。例如，可以通過幾何學(xué)方式(例如凹的表面) 來控制所述位置(參照圖1E)?？刂屏黧w滴位置的另一方式包括機械力。 例如可以用其它表面(例如移液管尖的表面)接觸流體滴施加這種機械 力?？刂屏黧w滴位置的其它方式包括Guttenberg， Z,等，Lab on a Chip (2005) 5， 308-317所公開的聲波的應(yīng)用。控制流體滴位置的另一方式 包括熱梯度，例如所述的至少一個表面的熱梯度的應(yīng)用。例如可以通過 紅外激光器獲得各熱梯度。在有些實施方式中，本發(fā)明的控制所述流體滴相對于所述至 少一個表面的位置的方法還包括使磁場或電磁場作用于該流體滴。由此 產(chǎn)生作用于磁粒上的力，迫使所述流體滴作為整體跟隨磁粒的任何運動。 由此可以控制流體滴的位置。在實施本發(fā)明方法的過程中，有些實施方 式施加的磁場或電磁場是恒定的，而其它實施方式中施加的磁場或電磁 場是變化的。在有些實施方式中，控制流體滴的位置包括例如在恒定的 磁場或電磁場作用下移動表面。結(jié)果可以改變流體滴相對于表面的位置。 在有些實施方式中，可以組合使用控制流體滴位置的幾種方式(還可參 照下文進一步的實施例)。在有些實施方式中，只有當流體滴已經(jīng)通過磁 場或電磁場得到定位時，才進行處理。在這些實施方式的一個方案中， 當將流體滴置于所需位置之后，終止磁場或電磁場。 一個示例是，可以 將所述至少一個表面的區(qū)域處于下列條件下，例如改變的溫度、(改變的) 磁場、(改變的)電場(包括靜電場)、(改變的)電磁場、改變的壓力、 (改變的)波長、(改變的)頻率、(改變的)振幅、(改變的)化學(xué)濃度、 (改變的)化學(xué)組成(例如氣流)等。在這種情況下，控制流體滴的位 置可包括將流體滴移動到處于該條件下的至少一個表面的所述區(qū)域。在本發(fā)明方法的有些實施方式中，電場/磁場對流體滴的作用 包括排斥該流體滴。在這些方式的某些方案中以及在其它實施方式中，
電場/磁場對流體滴的作用包括吸引該流體滴。例如可以通過磁棒、電磁 體、磁棒或電磁體陣列或其任意組合實現(xiàn)磁場或電場對流體滴的吸引或 排斥。為了移動一個或多個流體滴，可以移動各磁體。為了控制流體滴 的位置，還可以改變磁體陣列中一個或多個磁體的引力或斥力。在提供上述所定義的至少兩個表面的某些實施方式中，流體
滴可以從一個表面轉(zhuǎn)移到另一個表面并且可在這兩個表面之間移動。在 這些實施方式中，控制流體滴的位置可包括通過磁場或電磁場，在兩個 表面之間移動流體滴。本發(fā)明的方法還包括處理流體滴中的生物樣品和/或化學(xué)樣 品。可以進行能夠在流體滴中進行的任何處理。可以進行處理的例子包 括下列處理，物理檢測懷疑包含在或已知包含在樣品中的目標物、化學(xué) 反應(yīng)、細胞裂解、從有機體或部分有機體中提取分子、從有機體中釋放 分子及其任意組合，但不限于此。物理檢測的例子包括光譜檢測、光化 學(xué)檢測、光度法檢測、熒光法檢測、放射線學(xué)檢測、聲學(xué)檢測、電化學(xué) 檢測、比色法檢測、衍射法檢測、干涉測量法檢測、橢圓偏光測量法檢 測和熱力學(xué)檢測，并包括使用例如光活性標記、熒光標記、放射性標記
或酶標記等。光譜法的兩個示例是顯微拉曼光譜法和相干反斯托克斯拉 曼散射(CARS)顯微術(shù)。例如，后一技術(shù)適合于所關(guān)注的特定分子的選 擇性成像?；瘜W(xué)反應(yīng)的例子包括化學(xué)合成、化學(xué)降解、酶催化合成、酶 催化降解、化學(xué)修飾、酶催化修飾、與結(jié)合分子的相互作用及其任意組 合，但不限于此。酶催化合成的例子包括蛋白合成、核酸合成、肽合成、 藥物化合物合成及其任意組合，但不限于此。本發(fā)明的方法與例如任何 生化轉(zhuǎn)化或檢測形式，例如酵母雙雜交系統(tǒng)、小干涉RNA (siRNA)、轉(zhuǎn) 染、連接等相容。例如對于被引發(fā)或催化的處理，進行處理可包括處于能量的 作用之下。施加的能量的例子可包括紅外輻射、微波輻射或光解能量， 但不限于此。 一個示例是，可將表面和流體滴一起放置于生物芯片上， 所述生物芯片位于薄膜冷卻器/加熱器上。因此，例如可通過調(diào)節(jié)流體滴 的環(huán)境溫度來分別進行由升高溫度或需要降低溫度來驅(qū)動的化學(xué)合成。 另一個例子是，可進行4~100°C之間控制溫度的生物化學(xué)反應(yīng)。因此，
例如可以保存溫度敏感型的生物樣品。其它例子包括細胞分離(參照圖9)、細胞培養(yǎng)、細胞裂解(圖6)、反轉(zhuǎn)錄、聚合酶鏈反應(yīng)(圖10、圖12) 以及焦磷酸測序(圖13)，但不限于此。焦磷酸測序是一種實時的核酸測序技術(shù)，它基于核酸聚合反應(yīng)期間所釋放的焦磷酸鹽的測定(例如可參照Ronaghi， M， Genome Research (2001 )， 11， 3~11的綜述)。此外， 各種光學(xué)檢測系統(tǒng)的使用，例如光電二極管(PD)、光電倍增器(PMT)、 光子計數(shù)探測器(PCM)、分光光度計以及電荷耦合器件(CCD)，使得 并行、實時監(jiān)測這些生物化學(xué)反應(yīng)得以進行?！獋€示例是，使用本發(fā)明可檢測病原體、細菌、病毒或DNA 序列從而鑒定疾病狀態(tài)?？蓽y定的疾病包括傳染性疾病例如嚴重急性呼 吸道綜合征(SARS)、肝炎A、 B和C、艾滋病(HIV/AIDS)、登革熱、 豬瘟、口蹄疫、禽流感、炭疽病、沙門氏菌病、瘧疾、脊髓灰質(zhì)炎、肺 結(jié)核以及流感，但不限于此；可以在出生前檢測(例如通過染色體異常 檢測)先天性病癥例如鐮刀型細胞貧血病、心臟畸形癥(例如房間隔缺 損、主動脈瓣上狹窄、心肌癥)、唐氏(Down)綜合癥、畸足癥、多指 趾畸形癥、并指趾癥、萎縮性指癥、螯狀爪形手足等。本方法還適于測 定和篩査癌癥、例如通過DNA標記鑒定動物血緣、或測定和分析血液中 的物質(zhì)例如興奮劑(doping)。在其它實施方式中，本發(fā)明方法可用于一種或多種藥學(xué)化合 物(例如藥物)的檢測、反應(yīng)(包括與生物細胞或部分生物細胞的結(jié)合 反應(yīng))、合成或其任意組合?；衔?例如藥學(xué)化合物)的合成例如可在 衍生珠上以固相反應(yīng)的形式進行。例如藥物化合物可以按照文庫的形式 使用。所述文庫的例子是化學(xué)合成的作為模型化合物的各種有機小分子 的集合，或者是含有大量序列突變的核酸分子的集合。 一個例子是，所 述文庫的每種化合物都可以放置成一個流體滴?？赏ㄟ^商購設(shè)備自動獲 得所述流體滴，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。本發(fā)明的方法可用于例 如藥物篩選或用于檢測尿樣或血樣中藥物的存在。另一個例子是，懷疑細胞培養(yǎng)基被污染(如前所述)。在這種 情況下，可優(yōu)選鑒別污染物的類型，并為此目的而使用本發(fā)明設(shè)備。在 這些實施方式中，例如磁吸性物質(zhì)可以是攜帶配體的磁吸性粒子，所述
配體對污染物具有親和性或與對污染物具有親和性的其它物質(zhì)具有親和 性。在需要除去物質(zhì)(例如樣品副產(chǎn)物或樣品的不需要的物質(zhì)) 的實施方式中，所述處理可以是清洗處理或包括清洗步驟的處理。所述 處理還可包括將流體滴分裂成至少兩個子流體滴。
一個示例是，可以從 細胞中提取核酸并與連接于磁粒的配體結(jié)合，同時棄去細胞碎片和試劑。
圖4A示出了使用了其它另外的流體滴對流體滴進行清洗的步驟的實施
例。所述其它的流體滴還可包括兩個或更多流體相。所述其它的流體滴 可以按照包括兩相、磁性物質(zhì)和樣品的流體滴的形式提供在同一表面上，
或者所述其它的流體滴可以提供在另一表面上(圖4B)。所述其它的流 體滴向包括兩相、磁性物質(zhì)和樣品的流體滴移動(圖4A(1))。圖4A中 的箭頭顯示了永磁體當時的位置。兩個流體滴合并(圖4A (2))并形成 了一個較大的流體滴(圖4A (3))。為確保完全混合和清洗，例如可以 施加足以抬起流體滴內(nèi)的磁粒而不抬起整個流體滴的弱磁力。通過使磁 粒進一步移向一邊(圖4A (4))而引發(fā)流體滴分裂(圖4A (5))。磁粒 /外相之比、相互作用的流體滴的體積比、它們的生化組成、表面形態(tài)、 表面化學(xué)以及(電)磁場梯度強度指示相應(yīng)的流體滴是否移動、合并、"被 清洗"或是分裂。盡管處理的體積是納升，但是在這些操作過程中，死 體積為0，即沒有材料損耗。如需要，在本發(fā)明的方法中，還可容易地使 用其它功能單元，例如輔助混合或?qū)崿F(xiàn)混合的基于壓電的驅(qū)動器?？梢允褂萌魏瘟黧w例如溶劑、酸或堿清洗或交換流體滴的內(nèi) 相(例如參見圖18)，只要所述流體允許(a)所述內(nèi)相基本上保持完整； 并且，(b)保持磁體對所述磁粒的吸引。在外相形成包圍內(nèi)相(如前所 述)的膜的實施方式中，可進一步優(yōu)選使外相作為膜而保持完整。在使 用連接于磁粒的配體結(jié)合目標物的實施方式中，可進一步優(yōu)選使配體保 持完整并與所需目標物結(jié)合的流體。在處理之前、期間或之后的任何時 間點，例如可使用超聲波作用于流體滴而混合流體滴。因為所述流體滴 基于自組織系統(tǒng)，這種混合不影響流體滴的完整性，而是有助于流體滴 相內(nèi)物質(zhì)的均勻分布?？梢赃M行物質(zhì)轉(zhuǎn)移(例如清洗)，使復(fù)雜的處理得以進行。所
需目標物可以結(jié)合到固定化于磁粒的配體上，因此可以添加、除去或交
換流體(例如液體)，使例如肽、蛋白質(zhì)、DNA、 RNA、有機小分子、金 屬離子等(如前所述)的任何物質(zhì)能在任何所需階段或步驟中得以分離， 并且可以依次進行復(fù)雜的生化轉(zhuǎn)化(圖4)。此外，流體滴的體積可以改 變幾個數(shù)量級。因此，本發(fā)明的方法提供無需任何技術(shù)突破的、介于宏 觀與微觀世界之間的界面。如需要，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的技術(shù)(例如凝膠過濾、超濾或透 析)，可以通過減小體積來增大樣品中目標物的濃度。因為本發(fā)明的方法 所用的體積小，尤其與目標物的高濃度相結(jié)合時，可以對絕對數(shù)目少的 生物分子產(chǎn)生生物感應(yīng)。另一示例性的、但不受限制的例子是，本發(fā)明方法可用于實 施夾心型酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已熟知這種檢測方 法的用途和性能。通過組合使用數(shù)個流體滴，其中每個流體滴含有至少 一種或多種用于結(jié)合、清洗以及測定步驟的必需試劑，可檢測樣品中目 標物的存在。如上所述，捕獲試劑可以偶聯(lián)到磁珠上。在一個特定實施 方式中，所述捕獲試劑是對所關(guān)注的抗原具有耙向性的抗體。更具體而 言，所述抗體可以針對HIV病毒中以及懷疑含有這種HIV病毒的樣品血 液或血清中存在的抗原。通過比色分析和/或光譜分析可以監(jiān)測抗原的測 定。該過程可發(fā)生在洗脫探針上捕獲的底物之后或在發(fā)生在設(shè)備本身內(nèi) 部而不需依靠洗脫步驟。圖6示出本發(fā)明的方法用于聚合酶鏈反應(yīng)的用途。通過薄膜 加熱器和溫度傳感器可實現(xiàn)溫度控制。模塊1表示用配體修飾的超順磁 粒子矩陣。這些配體是針對不同的細胞表面標記物的受體。如上所述， 任何關(guān)注的細胞可以此方式從體液或組織中分離出來?？捎昧~刀剌破 手指得到一滴人毛細管全血。將這滴血液置于模塊2上。依據(jù)白細胞的 細胞表面標記物與固定化到磁粒上的配體的結(jié)合，可以將所述白細胞分 離出來(參照上文，另外請參見圖5和圖7)。圖8通過放大示出白細胞 與固定化到磁粒上的配體相結(jié)合的例子。白細胞可以在模塊3中的四個 薄膜加熱器中的一個上發(fā)生細胞熱裂解。通過將樣品引導(dǎo)于三個不同的
溫度區(qū)上，使聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)以順時針方向進行(參照圖6中的
模塊3)。圖17顯示使用本發(fā)明的方法測量的溫度輪廓線。圖ll證實用 本發(fā)明的方法所得的PCR產(chǎn)物與使用本領(lǐng)域常規(guī)方法所得的產(chǎn)物具有相 同的性質(zhì)?？梢岳脮r空變換使樣品多元化。可以產(chǎn)生生物素化的PCR 產(chǎn)物，所述PCR產(chǎn)物可結(jié)合到涂敷鏈霉親和素的超順磁粒子上。擴增產(chǎn) 物可以在模塊4上進行化學(xué)變性并退火為焦磷酸測序(PSQ)的測序引 物，焦磷酸測序可以通過移動樣品使其經(jīng)過含有堿基G、 A、 T和C的四 個不同VRC，在模塊5上以順時針方向進行。圖13示出了分析的例子。 可以利用時空變換使樣品多元化。若需要，在焦磷酸測序后，可在模塊6 上再以類矩陣的形式保存樣品?；蛘哌€可進一步處理這些樣品。處理流體滴中的生物樣品和/或化學(xué)樣品的另一個例子是使流 體滴的內(nèi)部混合。術(shù)語"混合"是指被動混合，即通過擴散達到混合， 或者是指主動混合，例如通過施加外部能量或作用力達到混合，或者是 指其組合。固定的流體滴或移動的流體滴內(nèi)的主動混合例如可包括攪動 超順磁粒子。例如可通過改變作用于流體滴的磁場或電磁場實現(xiàn)所述攪 動。還可以通過移動各表面從而改變流體滴在恒定磁場或電磁場中的相 對位置(如前所述)實現(xiàn)所述攪動。另一種方式的主動混合依賴于超聲 波，這種混合在所附實施例中有所說明。處理流體滴中的生物樣品和/或化學(xué)樣品的另一個例子是使所 述流體滴濾穿過又一個流體滴，如圖18所示。通常通過使較小流體滴移 動穿過較大流體滴進行所述濾穿，所述較小流體滴包含帶有固定目標物 的功能化超順磁粒子。以此方式，可稀釋較大流體滴中不需要的組分， 例如副產(chǎn)物、雜質(zhì)、底物、試劑、溶劑或溶劑組分、鹽、酶、廢物或緩 沖劑等。對于從較大流體滴中進一步移出磁粒的情況，從較大流體滴中 實質(zhì)上只移出包含固定目標物的超順磁粒子，而大多數(shù)不需要的物質(zhì)仍 留在所述流體滴中。由于系統(tǒng)的自組織性，同樣也從較大流體滴中除去 外相或部分外相。當外相是膜的形式時，外相的薄膜例如可包圍少量剩 余的內(nèi)相。以此方式，基本上可從流體滴中除去沒有被磁珠固定的物質(zhì) (參照實施例和圖20)。潛在的純化效應(yīng)類似于已知的親和色譜機理，其 中目標物被組成固定相的功能化柱材料保留，并用組成流動相的清洗液
沖洗/清洗幾次。與親和色譜相反，本發(fā)明的方法中，清洗液是固定相， 而功能化材料是流動相。還需要注意的是，使用本發(fā)明的方法不產(chǎn)生死 體積。此外，與親和色譜相反，本發(fā)明的方法允許以納升的體積洗脫目 標物。該優(yōu)點在應(yīng)用于例如生物傳感時很重要，例如當高濃度的目標物 存在于小體積中或要對快速動力學(xué)進行分析時?？梢酝ㄟ^手動或自動方式實施本發(fā)明方法的任何部分。本領(lǐng) 域己經(jīng)成熟地建立了化合物、流體和試劑的自動分配器、自動培養(yǎng)箱和 高效熒光讀數(shù)器(包括板式讀數(shù)器)。通常，所述裝備可直接與本發(fā)明的 裝置一起使用。如需要，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易地將所述裝備或本 發(fā)明的裝置進行改裝以用于特殊的應(yīng)用。實時檢測可給出熒光信號對以循環(huán)次數(shù)表示的反應(yīng)時間的擴 增圖(參見圖10)。熒光增加到基線以上表明檢測到積聚的擴增產(chǎn)物。當
固定的熒光閾值設(shè)定于基線以上時，熒光信號會在某個時間點跨過該閾
值。因為時間以循環(huán)次數(shù)表示，得到所謂的循環(huán)閾值次數(shù)(或值)或Ct 值。該次數(shù)越小，擴增圖中的各熒光曲線越向左并且擴增發(fā)生得越快。 該次數(shù)越大，擴增發(fā)生得越慢，與非特異性的背景反應(yīng)越難以區(qū)別。圖 IO顯示了用本發(fā)明的方法所得的熒光信號的一個示例。本發(fā)明的方法可以與下列分析方法和制備方法組合使用，例 如表面等離子共振、共振鏡技術(shù)、反射干涉、巨磁電阻、質(zhì)譜、橢圓偏 光法、等電聚焦法、色譜法、電色譜法、電動色譜法和電泳法等。電泳 法的例子例如自由流電泳法(FFE)、脈沖場凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠 電泳(PAGE)、毛細管區(qū)帶或毛細管凝膠電泳。例如已知使用帶電蛋白 質(zhì)對磁粒表面固定化使其電泳遷移率升高到幾倍。組合使用所述方法可 包括共同的步驟或共同的設(shè)備。 一個例子是，例如可以使用等電聚焦法 在微芯片上進行蛋白質(zhì)分離。隨后，已知含有或懷疑含有所關(guān)注的物質(zhì) (例如蛋白質(zhì))的分離介質(zhì)樣品(例如兩性電解質(zhì)水溶液)可被用作例 如本發(fā)明流體滴的內(nèi)相。在分離介質(zhì)是凝膠的情況下，可優(yōu)選提取所關(guān) 注的物質(zhì)。適宜用作本發(fā)明所使用的流體滴內(nèi)相和外相的流體種類通常 允許選擇那些很適宜用作等電聚焦表面的表面材料。結(jié)果是，在需要時， 兩種方法可共用一個共同的表面。色譜法的例子包括例如凝膠過濾法、
尺寸排除色譜法、離子交換色譜法、親和色譜法、疏水相互作用色譜法 或疏水電荷誘導(dǎo)色譜法。 一個示例是，在使用本發(fā)明的方法處理樣品之 前或之后，可實施各分析或制備方法。為了易于理解本發(fā)明并付諸實踐，通過以下不受限制的實施 例來說明具體實施方式
。
實施例
流體滴的操控使用由雙面膠(3M)固定到類似鬧鐘(Citizen)針柄上的房 式排列的電磁體M1219-X釹鐵硼碟式永磁體(Assemtech)(參照圖18A) 或相對于固定的釹鐵硼碟式永磁體(Farnell)移動并且受操控桿或 Lab VIEW 8-軟件(National Instruments )控制ProScanII-機動臺系統(tǒng)(Prior) 操控含有超順磁粒子的流體滴(參照圖19)。流體滴含有極性液體內(nèi)相和非極性液體外相。內(nèi)相為水溶液 并含有緩沖劑、試劑和超順磁粒子(參照下文)。使用超濾后的礦物油 (Fluka)作為形成外相的不混溶液體，所述外相為包圍內(nèi)相的薄膜形式。 在室溫(rt)下應(yīng)用時，水相與不混溶相的體積比為10:1，而對于需要在 升高的溫度下應(yīng)用時，例如焦磷酸測序(PSQ)、反轉(zhuǎn)錄(RT)、細胞裂 解和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，該體積比為1:5。微流控操控包括流體滴的合并、混合、清洗/過濾和分裂。通 過改變磁場/電磁場從而攪動超順磁粒子或通過超聲波引起的聲空化/聲 流來實現(xiàn)在流體滴內(nèi)的混合。在有些情況下，組合使用兩種技術(shù)。為了產(chǎn)生超聲波，使用配有房式放大器的33250A 80 MHz函 數(shù)/任意波形發(fā)生器(Agilent)和用環(huán)氧粘合劑(Alteco)粘到基底上的 鋯鈦酸鉛(PZT)片(Phillips)。根據(jù)實驗，kHz范圍內(nèi)的不同波形實現(xiàn) 了快速而有效的混合。除PCR溶液之外，在實驗開始時，將所有液滴， 即血液、功能化超順磁粒子、礦物油、加帽溶液(capping solution)、清 洗液、底物等放置到表面上，并且隨后用這些液滴合并、混合、清洗/過 濾和分裂含有超順磁粒子的液滴。圖18顯示了使用功能化的超順磁粒子，從人新鮮毛細管全血 中分離白血細胞的下列實施例的移動、合并、清洗/過濾和分裂過程(見
下文)。因為白血細胞在其細胞膜上表達CD15和CD45抗原(細胞表面 標記物)，所以可使用抗CD15和抗CD45的抗體涂敷的超順磁粒子通過 免疫反應(yīng)有選擇地去除所述白血細胞。圖18A:使用由雙面膠(3M)固 定到類似鬧鐘(Citizen)針柄上的M1219-l釹鐵硼碟式永磁體
(Assemtech)，移動、合并、清洗/過濾和分裂含有功能化超順磁粒子(1) 的液滴，所述液滴置于上述磁鐵上的特氟龍AF (DuPont)涂敷的載玻片
(24x60mm，厚度約180 )im， vfm CoverSlips， CellPath)上；為了使下 圖有較好的可見度，在鬧鐘與玻璃基底間放置白紙。圖18B:含有100 nl Dynabeads CD15和CD45 (Dynal Biotech)的液滴(26)移向含有100 nl 人新鮮毛細管全血的液滴(27)并且合并(圖18C、圖18D)。兩個液滴 合并后，合并液滴(28)移向含有10pl清洗液(0.01M PBS/0.1% BSA) 的液滴(29)(圖18E、圖18F);在此培養(yǎng)步驟中，白血細胞固定化到功 能化的粒子之上，由此，移動的超順磁粒子引起的攪動維持著主動混合。 此外，為達到此目的，可使用超聲波引起的聲流來縮短培養(yǎng)時間。應(yīng)該 注意的是，上述作法用于許多希望避免較高振幅聲空化的應(yīng)用中，因為 較高振幅聲空化引起白血細胞的破裂/裂解。合并后(圖18G)，清洗/過 濾固定化的白血細胞。術(shù)語"清洗"/ "過濾"指的是使固定化有白血細 胞的功能化超順磁粒子移動穿過含有清洗液的較大液滴(圖18H、圖 181)。經(jīng)此處理，只有含有固定化有白血細胞的超順磁粒子和通過自組 織的外相的不混溶液體薄膜離開較大液滴(圖18J)。較大液滴中的所有 其它物質(zhì)，例如雜質(zhì)如紅血球、緩沖劑、鹽、EDTA (用作抗凝血劑)、 肝素、核糖核酸酶、脫氧核糖核酸酶等仍留在較大液滴中。存在的紅血 球使清洗液變?yōu)榧t色(參見殘留液滴的暗污點)。與此同時，離開較大液 滴的雜質(zhì)被稀釋，所述雜質(zhì)是固定化有白血細胞的功能化超順磁粒子的 部分漿體。因此，稀釋因子取決于相互作用的液滴的體積比例如如果 0.1 pi固定化有白血細胞的功能化超順磁粒子的液滴用lOpl清洗液清洗 三次，則漿體內(nèi)的殘留雜質(zhì)被稀釋百萬倍[(1:100)3]。此后，固定化有白 血細胞的功能化超順磁粒子離開清洗液(29)(圖18J)并移向第二清洗 液(30)(圖18K、圖18L)進行第二清洗步驟。為加強清洗，固定化有
白血細胞的功能化超順磁粒子在清洗液內(nèi)來回移動幾次(圖18M至圖
18U)，才離開清洗液(圖18V、圖18W)。最后，準備好純化的白血細 胞進行下游處理，例如RT-PCR。通過使用Neubauer血球計對紅血球進 行計數(shù)來估計清洗液除去紅血球(血液的主要組分，由于受核糖核酸酶 和脫氧核糖核酸酶污染，干擾下游處理)的過濾效率(圖20A、圖20B)， 效率為約100,000倍，即組合使用兩份10 pl清洗液可除去體積達1 ml 的樣品中的所有紅血球(1 ml樣品中紅血球的絕對數(shù)目為5xl09)。
熱處理構(gòu)建于房式結(jié)構(gòu)內(nèi)的溫度控制模塊，包括鉑(Pt)薄膜加熱器 和溫度傳感器以及專用集成電路(ASIC)控制器(參照圖17)?；蛘撸?在配有Slide GriddleTM適配器(MJ Research)的PCT-200 Peltier熱循環(huán) 儀(MJ Research)上進行PCR實驗(沒有光學(xué)檢測)。熱處理設(shè)施類似 于本領(lǐng)域的其它設(shè)備，例如，Guttenberg， Z.等所公開的(如前所述)。 發(fā)現(xiàn)可商購訂制的、包括控制器/軟件的PCR-芯片適合用于本發(fā)明的方 法。在有些試驗中，使用來自Advalytix ( Brunnthal ，德國， www.advalytix.com)禾口 Institute for Physical High Technology e.V. (Jena， 德國)的PCR芯片。
光學(xué)檢測使用配有X-Cite 120熒光照明系統(tǒng)(EXFO Life Sciences)、 HE 38 FITC濾光組件(Zeiss)禾卩5784-20光電倍增管(Hamamatsu)的 Axiotech vario熒光顯微鏡(Zeiss)來檢測熒光并根據(jù)廠商說明書使用 TDS50054B數(shù)字熒光示波器(Tektronix)進行記錄。對于生物發(fā)光檢測，代替使用的是H7421-40光子記數(shù)探測器 (Hamamatsu )。
表面修飾通過在150。C和0.5Mbar下，于15E烘箱(Yield Engineering Systems)中對玻璃(Schott)或硅(Silicon Sense)基底用(十七氟代-l，l,2,2-四氫癸基)三乙氧基硅垸(Gelest)進行2小時的化學(xué)氣相沉積(CVD)， 或通過用溶于FC-70的1。/。特氟龍AF (DuPont)溶液(3M)對玻璃、硅 或聚合物基底(General Electric)進行旋涂而獲得疏水性和疏油性的表面。
使用OCA 30接觸角測量設(shè)備(DataPysiscs)測得與水以及與礦物油 (Fluka)的靜態(tài)接觸角分別為>110°和>70°。在無任何用戶干擾的條件下，相繼進行以下系列過程，從人 全血中分離白血細胞(WBC)、 WBC細胞裂解、PCR禾nPSQ (圖6)。
分離白血細胞將含有0.1 pl 200嗎pl"Dynabeads CD15禾卩CD45 (Dynal Biotech)的1:1懸浮液(Dynabeads CD15和CD45處于0.01M磷酸鹽緩 沖鹽水PBS (Sigma-Aldrich) /1%牛血清白蛋白(BSA) (Roth)中)的 液滴與含有15 ^人新鮮毛細管全血的液滴合并、混合、在室溫下培養(yǎng) 10分鐘，并相繼在兩個含有10 pi 0.01 M PBS/1 % BSA的液滴和一個含 有10 ^ PCR混合物的液滴中清洗(圖7)。準備好連接于超順磁粒子上 的白血細胞(WBC)進行細胞裂解。為對分離后的WBC進行計數(shù)，將含有超順磁粒子的液滴與含 有10 ^114%多聚甲醛(Roth)溶液(多聚甲醛溶于0.01 M PBS/1 %BSA) 的液滴合并(參照下文)、混合(參照下文)，并在4。C下培養(yǎng)30分鐘， 相繼在三個含有10 ^ 0.01 M PBS/1 %BSA的液滴中清洗。將WBC固定 后，含有超順磁粒子的液滴與含有1 pi VECTASHIELD 封固劑(所述封 固劑含有4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI) (Vector))的液滴合并、混合 并在4。C下培養(yǎng)過夜。最后，用方格尺寸為500x50(Him的、高分辨率印 制的聚合物箔(Infinite Graphics)蓋住DAPI-染色的WBC，置于BX51 系統(tǒng)顯微鏡(Olympus)下，用DP70數(shù)碼照相機(Olympus)照相，轉(zhuǎn) 換為灰度模式(圖8)并使用MetaMorph—V6.1 (Molecular Devices)軟 件輔助計數(shù)(圖9)。
細胞裂解在分離WBC后，將含有超順磁粒子的液滴與含有1 ^ PCR 混合物的液滴合并、混合并且在95°C下培養(yǎng)5分鐘。在WBC熱裂解后， 從含有PCR混合物的液滴中除去超順磁粒子。準備好釋放的染色體DNA 進行PCR。
PCR管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)用作目標物，由此 得到的擴增子長度為208 bp(Maxim Biotech)。生物素CTC ATT TCC TGG TAT GAC AAC GA ( SEQ ID NO: 1 )禾n GTC TAC ATG GCA ACT GTG AGGAG (Research Biolabs， SEQ ID NO: 2)分別被用作正向引物和反向 引物?；?0pl儲備液中的TaqPCRCore試劑盒(QIAGEN)制備單重 PCR混合物，該混合物具有以下組成23.0pl焦碳酸二乙酯(DEPC)處 理的水(Invitrogen)、 10.0 pi 5xQ-溶液、5.0 pi 5xPCR緩沖液、5.0^110 %BSA、 1.0 pi lOmM脫氧核苷三磷酸(dNTP)、 0.5 pi 1:100 SYBR Green (Invitrogen)、各2.50 ^ 10 的正向引物和反向引物以及0.5 pi 5 u pi'1 TaqDNA聚合酶。對于該特定的PCR，使用上述分離的約1400個WBC 作為模板。熱循環(huán)條件如下95°C下1分鐘、58°C下1分鐘、72°C下1 分鐘和80°C下15秒鐘，共45個循環(huán)。在該80°C間隔期間采集熒光強 度平均值以實時追蹤PCR (圖10)。為進行熔解曲線分析，將樣品冷卻 到65。C保持l分鐘，然后以斜率為0.01Ks"持續(xù)升溫到95。C (圖11)。 最后，使用Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies)對PCR產(chǎn)物進行毛 細管電泳分析(圖12)。 PCR結(jié)束后，準備好生物素化的PCR產(chǎn)物進行 PSQ。
PSQ為進行PSQ，使用包括耗材的5x96 PSQ 96 MA Pyro Gold Reagent試劑盒(Biotage)。 CAT GGC AAC TGT GAG GAG (SEQ ID NO: 3)用作測序引物。將含有1 ^ 300 Dynabeads My One 鏈霉親
和素的懸浮液(所述Dynabeads My One 鏈霉親和素溶于2x結(jié)合緩沖 液)的液滴與含有PCR混合物的液滴合并(如前所述)、混合并在65。C 下培養(yǎng)15分鐘。將生物素化的PCR產(chǎn)物固定后，將含有超順磁粒子的 液滴與含有10^1x變性溶液的液滴合并、混合，在室溫下培養(yǎng)l分鐘， 并相繼在兩個含有10pllx清洗緩沖液的液滴中清洗?；蛘撸p鏈(ds) DNA可在95。C、 l分鐘條件下發(fā)生熱變性。雙鏈DNA變性后，將含有 超順磁粒子的液滴與含有溶于lx退火緩沖液的1 pi 0.3 ]iM的測序引物溶
液的液滴合并、混合，在80。C下培養(yǎng)2分鐘，并冷卻到室溫。準備好連
接于超順磁粒子上的單鏈(ss) DNA進行PSQ。為了證實單鏈DNA確已固定化到超順磁粒子上，將含有超順 磁粒子的液滴懸浮于50 pl lx退火緩沖液中并且在商購的PSQ 96MA系 統(tǒng)(Biotage)中測序(圖13)。最后，將含有超順磁粒子的液滴與含有2.5 ^ dGTP溶液的液 滴合并、混合，然后與含有10 pl 1:1的酶和底物混合物的溶液的液滴合 并(圖14)。
蛋白質(zhì)的親和純化(綠色熒光蛋白)此實施例說明如何使用本發(fā)明的方法純化蛋白質(zhì)。用0.01 M磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)對標記的瓊脂糖磁珠進行 清洗后，可制備含有內(nèi)相為1 pl水溶液以及外相為超濾后礦物油(Fluka) 的流體滴，所述內(nèi)相含有50mM、pH7.7的Tris-HC1、200 mMNaCl、5mM EDTA和鏈霉親和素修飾的瓊脂糖磁珠(QIAGEN，相當于4% (w/v)懸 浮液)?？蓪⒑腥苡? ^溶于上述緩沖液(50 mM、 pH 7.7的Tris-HCl 、 200mMNaCl、 5mMEDTA)的粗細菌溶菌液(￡. co//)的液滴與含有瓊 脂糖磁珠的液滴合并，所述溶菌液含有生物素化的重組綠色熒光蛋白 (GFP)?？蓪⑺靡旱卧谑覝叵屡囵B(yǎng)45分鐘。此后，相繼在三個含有 10 nl上述緩沖液(50mM、pH7.7的Tris-HC1、200 mM NaC1、5 mM EDTA) 的液滴中清洗所述液滴。通過與含有25 ^溶于上述緩沖液的10 mM生 物素的液滴合并且通過超聲波作用進行混合，將l ^處于所得液滴中的 純化GFP進行洗脫，隨后去除瓊脂糖磁珠?？墒褂萌魏螛藴史椒▉矶浚?例如根據(jù)Layne的280 nm和260 nm波長下UV吸收比進行定量、例如 根據(jù)Bradford的通過在參比液滴中進行顏色反應(yīng)進行定量、通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和其后的染色進行分離、或使用已知濃度的GFP參 比溶液通過熒光檢測進行定量。
酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)將含有1 pl溶于0.1M2-嗎啡啉乙磺酸(MES) (Lancaster)中 的羧基功能化的超順磁粒子懸浮液的液滴與含有10 pl溶于0.1MMES的0.2MN-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(Lancaster)與0.02 M N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) (AlfaAesar)的溶液的液滴合并(如前所 述)、混合，在室溫下培養(yǎng)l分鐘，并在含有10nl0.01M磷酸鹽緩沖鹽 水(PBS) (Sigma-Aldrich)的一個液滴中清洗。在羧基活化后，將含有 超順磁粒子的液滴與含有溶于0.01 M PBS的1 1嗎pi'1熒光素(FITC) 標記的羊抗小鼠IgG (全分子)(GtxMs IgG FITC) (Sigma-Aldrich)溶 液的液滴合并、混合，在室溫下培養(yǎng)l分鐘，并在含有l(wèi)OplO.OlMPBS 的一個液滴中清洗。在與GtxMsIgGFITC偶聯(lián)后(圖15)，將含有超順 磁粒子的液滴與含有10 pi 0.1M 2-氨基乙醇(Sigma-Aldrich)的液滴合 并、混合，在室溫下培養(yǎng)1分鐘，并相繼在含有10 ^10.01 MPBS/1 %BSA 的三個液滴中清洗。在使琥珀酰亞胺酯殘基加帽后，將含有超順磁粒子 的液滴與含有1 ^U1嗎itU"辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗羊IgGFc (RbtxGtlgGFcHRP) (Chemicon)溶液(所述辣根過氧化物酶(HRP) 標記的兔抗羊IgGFc (RbtxGtlgGFcHRP)溶于0.01 M PBS/1 % BSA) 的液滴合并、混合，在室溫下培養(yǎng)1分鐘，并相繼在含有10 ^ 0.01 M PBS/1% BSA或10 pi 0.01 M PBS/0.05 %吐溫20 (Sigma-Aldrich)的五 個液滴中清洗。在GtxMs IgG FITC與RbtxGt IgG Fc HRP發(fā)生免疫反應(yīng) 后，將含有超順磁粒子的液滴與含有10 pi 1:1過氧化物酶底物溶液A和 B (Bethyl)溶液的液滴合并、混合，培養(yǎng)1~10分鐘，并分裂(參照圖 16)。
權(quán)利要求
1.一種處理生物樣品和/或化學(xué)樣品的方法，所述方法包括提供流體滴，所述流體滴包括內(nèi)相和外相，其中所述外相與所述內(nèi)相不混溶，并且所述外相包圍所述內(nèi)相，以及其中所述內(nèi)相包含所述生物樣品和/或化學(xué)樣品，所述內(nèi)相通過所述外相與環(huán)境隔離，以及其中所述流體滴包含磁吸性物質(zhì)；提供至少一個表面，所述表面對于所述流體滴內(nèi)相的流體具有使所述流體滴在與其接觸時仍保持完整的質(zhì)地和浸潤性；將所述流體滴放置到所述至少一個表面上；以及對所述流體滴中的生物樣品和/或化學(xué)樣品進行處理。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中所述流體滴的外相作為膜包圍 所述內(nèi)相。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述流體滴內(nèi)相的流體是 液體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述流體滴內(nèi)相的流體是液體， 所述流體滴外相的流體是液體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項所述的方法，其中所述磁吸性物質(zhì)選 自至少一個磁吸性粒子、磁流體、富鐵細菌及其組合。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1~5中任一項所述的方法，所述方法還包括控制所 述流體滴相對于所述至少一個表面的位置。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中控制所述流體滴相對于所述至 少一個表面的位置包括使磁場或電磁場作用于所述流體滴。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其中控制所述流體滴相對于所述至少一個表面的位置還包括通過改變所述磁場或電磁場來移動所述流 體滴、移動所述至少一個表面及其組合中的一種。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中改變磁場包括改變至少一個磁 體的位置。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1~9中任一項所述的方法，其中所述至少一個表 面對于所述流體滴內(nèi)相的流體的浸潤性具有如下特點由所述流體滴內(nèi) 相的流體組成的流體滴與所述至少一個表面的界面處的前進接觸角為約 50度以上。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1 10中任一項所述的方法，其中所述至少一個表 面選自基本上平的基底、凹的基底、凸的基底及其任意組合。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1~11中任一項所述的方法，其中所述流體滴內(nèi)相 的流體是極性液體，所述至少一個表面是非極性表面。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述非極性表面選自聚硅氧 垸、塑料、表面修飾的氧化硅、表面修飾的氫化硅、表面修飾的紙、表 面修飾的玻璃、表面修飾的石英、表面修飾的云母、表面修飾的金屬、 表面修飾的金屬氧化物、表面修飾的陶瓷及其任意的復(fù)合材料。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1~11中任一項所述的方法，其中所述流體滴內(nèi)相 的流體是非極性液體，所述至少一個表面是極性表面。
15. 根據(jù)權(quán)利要求l-14中任一項所述的方法，其中，提供所述流體 滴包括提供第一流體，提供與所述第一流體不混溶的第二流體，以及 使所述第一流體滴分配到所述第二流體上，由此形成包括內(nèi)相和外 相的流體滴，所述第一流體形成所述內(nèi)相，被形成所述外相的所述第二 流體包圍。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中首先提供所述第一流體。
17. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中同時提供所述第一流體、所述第二流體和所述樣品。
18. 根據(jù)權(quán)利要求15~17中任一項所述的方法，其中提供所述流體滴還包括從形成所述外相的所述第二流體中收集出包括內(nèi)相和外相的所述流體滴或其一部分，由此形成包含作為膜包圍所述內(nèi)相的外相的流體滴。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1 13中任一項所述的方法，其中所述流體滴的內(nèi) 相是極性液體，所述流體滴的外相是非極性液體。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述流體滴的內(nèi)相是親水性 液體，所述流體滴的外相是疏水性液體。
21. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述內(nèi)相的流體選自水、氧 化氖、氧化氚、醇、有機酸、無機酸、有機酸酯、無機酸酯、醚、胺、 酰胺、腈、酮、離子洗滌劑、非離子洗滌劑、二氧化碳、二甲基砜、二 甲亞砜、硫醇、二硫化物和極性離子液體。
22. 根據(jù)權(quán)利要求19~21中任一項所述的方法，其中所述外相的流 體選自礦物油、硅氧烷油、天然油、全氟化碳液體、部分鹵化碳液體、 烷烴、烯烴、炔烴、芳族化合物、二硫化碳和非極性離子液體。
23. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述至少一個磁吸性粒子選 自反磁粒子、鐵磁粒子、順磁粒子和超順磁粒子。
24. 根據(jù)權(quán)利要求5或23所述的方法，其中所述至少一個磁吸性粒 子包含能結(jié)合目標物的配體，懷疑所述目標物包含在所述生物樣品和/或 化學(xué)樣品中。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述配體能選擇性地結(jié)合目 標物，懷疑所述目標物包含在所述生物樣品和/或化學(xué)樣品中。
26. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中使所述配體固定化到所述至 少一個磁吸性粒子的表面上。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述配體選自冠醚、肽、抗 體、基于脂質(zhì)運載蛋白家族的多肽的突變蛋白、基于錨蛋白支架或晶體 蛋白支架的蛋白質(zhì)、高親和性多聚體、能結(jié)合多種小分子配體的蛋白質(zhì)、 外源凝集素、核酸、蛋白A、蛋白G、酶、金屬原子、碳納米管、碳納 米泡沫、染料、鏈霉親和素、直鏈淀粉、麥芽糖、纖維素、甲殼素、細 胞外基質(zhì)、谷胱甘肽、鈣調(diào)蛋白、明膠、多粘菌素、肝素、NAD、 NADP、 賴氨酸、精氨酸、芐脒和鋁硅酸鹽。
28. 根據(jù)權(quán)利要求6~9中任一項所述的方法，還包括將所述至少一 個表面的區(qū)域處于下列條件下，所述條件選自改變的溫度、磁場、電 場、電磁場、壓力、波長、頻率、振幅、化學(xué)濃度和化學(xué)組成，以及其 中控制所述流體滴相對于所述至少一個表面的位置包括將所述流體滴移 動到處于所述條件下的所述至少一個表面的區(qū)域內(nèi)。
29. 根據(jù)權(quán)利要求1~28中任一項所述的方法，還包括提供彼此相對 的至少兩個表面，所述表面對于所述流體滴內(nèi)相的流體具有使與其接觸 的所述流體滴保持完整的質(zhì)地和浸潤性。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中控制所述流體滴的位置包括 通過所述磁場或電磁場和/或通過移動所述表面中的至少一個，在所述至 少兩個表面之間移動所述流體滴。
31. 根據(jù)權(quán)利要求1 30中任一項所述的方法，其中處理生物樣品和 /或化學(xué)樣品包括下列步驟，所述步驟選自將所述流體滴與另一流體滴合 并、使所述流體滴的內(nèi)部混合、使所述流體滴濾穿過又一流體滴以及將 所述流體滴分裂成至少兩個子流體滴。
32. 根據(jù)權(quán)利要求1~31中任一項所述的方法，其中使所述生物樣品 和/或化學(xué)樣品進行下列處理，所述處理選自懷疑包含在所述樣品中的目 標物的物理檢測、化學(xué)反應(yīng)、生物化學(xué)反應(yīng)、細胞裂解、從有機體或部 分有機體中提取分子及其任意組合。
33. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述物理檢測選自光譜檢測、 光化學(xué)檢測、光度法檢測、熒光法檢測、放射線學(xué)檢測、電學(xué)檢測、聲 學(xué)檢測、電化學(xué)檢測、比色法檢測、干涉測量法檢測、衍射法檢測和熱 力學(xué)檢測。
34. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述化學(xué)反應(yīng)選自化學(xué)合成、 化學(xué)降解、酶催化合成、酶催化降解、化學(xué)修飾、酶催化修飾、與結(jié)合 分子的相互作用以及其任意組合。
35. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述酶催化合成選自蛋白合 成、核酸合成、肽合成、藥物化合物合成及其任意組合。
36. 根據(jù)權(quán)利要求1~35中任一項所述的方法，其中所述樣品選自土 壤樣品、空氣樣品、環(huán)境樣品、細胞培養(yǎng)物樣品、骨髓樣品、降雨樣品、 沉降物樣品、太空樣品、地球外樣品、污水樣品、地下水樣品、磨蝕樣 品、考古學(xué)樣品、食物樣品、血液樣品、血清樣品、血漿樣品、尿樣品、 糞便樣品、精液樣品、淋巴液樣品、腦脊髓液樣品、鼻咽清洗樣品、痰 液樣品、口腔抹片樣品、咽喉抹片樣品、鼻抹片樣品、支氣管肺泡灌洗 樣品、支氣管分泌物樣品、乳樣品、羊水樣品、活組織檢查樣品、指甲 樣品、毛發(fā)樣品、皮膚樣品、癌樣品、腫瘤樣品、組織樣品、細胞樣品、 細胞裂解液樣品、病毒培養(yǎng)物樣品、法醫(yī)樣品、感染樣品、醫(yī)院感染樣 品、產(chǎn)品樣品、藥物制劑樣品、生物分子制備樣品、蛋白制劑樣品、脂 質(zhì)制劑樣品、碳水化合物制劑樣品、核苷酸溶液、多聚核苷酸溶液、核 酸溶液、肽溶液、多肽溶液、氨基酸溶液、蛋白質(zhì)溶液、合成聚合物溶 液、生化組合物溶液、有機化學(xué)組合物溶液、無機化學(xué)組合物溶液、脂 質(zhì)溶液、碳水化合物溶液、組合化學(xué)產(chǎn)物溶液、候選藥物分子溶液、藥 物分子溶液、藥物代謝物溶液、細胞懸浮液、病毒懸浮液、微生物懸浮 液、金屬懸浮液、合金懸浮液、金屬離子溶液及其任意組合。
37. —種流體滴，包括內(nèi)相和外相、以及至少一個磁吸性粒子， 其中所述外相與所述內(nèi)相不混溶，所述外相包圍所述內(nèi)相，以及 其中所述內(nèi)相通過所述外相與環(huán)境隔離，以及其中所述磁吸性粒子包括能結(jié)合懷疑包含在生物樣品和/或化學(xué)樣 品中的目標物的配體。
38. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的流體滴，其中所述流體滴的外相作為膜 包圍所述內(nèi)相。
39. 根據(jù)權(quán)利要求37或38所述的流體滴，其中所述流體滴內(nèi)相的 流體是液體。
40. 根據(jù)權(quán)利要求37~39中任一項所述的流體滴，其中所述流體滴 內(nèi)相的流體是液體，所述流體滴外相的流體是液體。
41. 根據(jù)權(quán)利要求37 40中任一項所述的流體滴，其中所述流體滴 的內(nèi)相是極性液體，所述流體滴的外相是非極性液體。
42. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的流體滴，其中所述流體滴的內(nèi)相是親水 性液體，所述流體滴的外相是疏水性液體。
43. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的流體滴，其中所述內(nèi)相的流體選自水、 氧化氘、氧化氚、醇、有機酸、無機酸、有機酸酯、無機酸酯、醚、胺、 酰胺、腈、酮、離子洗滌劑、非離子洗滌劑、二氧化碳、二甲基砜、二 甲亞砜、硫醇、二硫化物和極性離子液體。
44. 根據(jù)權(quán)利要求41~43中任一項所述的流體滴，其中所述外相的 流體選自礦物油、硅氧烷油、天然油、全氟化碳液體、部分鹵化碳液體、 垸烴、烯烴、炔烴、芳族化合物、二硫化碳和非極性離子液體。
45. 根據(jù)權(quán)利要求37~44中任一項所述的流體滴，其中所述至少一 個磁吸性粒子選自反磁粒子、鐵磁粒子、順磁粒子和超順磁粒子。
46. 根據(jù)權(quán)利要求37~45中任一項所述的流體滴，其中使所述配體 固定化到所述至少一個磁吸性粒子的表面上。
47. 根據(jù)權(quán)利要求46所述的流體滴，其中所述配體選自冠醚、肽、 抗體、基于脂質(zhì)運載蛋白家族的多肽的突變蛋白、基于錨蛋白支架或晶 體蛋白支架的蛋白質(zhì)、高親和性多聚體、能結(jié)合多種小分子配體的蛋白 質(zhì)、外源凝集素、核酸、蛋白A、蛋白G、酶、金屬原子、碳納米管、 碳納米泡沫、染料、鏈霉親和素、直鏈淀粉、麥芽糖、纖維素、甲殼素、 細胞外基質(zhì)、谷胱甘肽、鈣調(diào)蛋白、明膠、多粘菌素、肝素、NAD、 NADP、 賴氨酸、精氨酸、芐脒和鋁硅酸鹽。
48. —種形成流體滴的方法，所述流體滴包括內(nèi)相、外相和至少一 個磁吸性粒子，所述方法包括提供第一流體，提供與所述第一流體不混溶的第二流體， 使所述第一流體與所述第二流體接觸，由此形成包括內(nèi)相和外相的 流體滴，所述第一流體形成所述內(nèi)相，被形成外相的所述第二流體包圍， 提供至少一個磁吸性粒子，將所述至少一個磁吸性粒子放置到所述流體滴中，其中所述磁吸性粒子包括能結(jié)合懷疑包含在生物樣品和/或化學(xué)樣 品中的目標物的配體。
49. 根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中首先提供所述第一流體。
50. 根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中同時提供所述第一流體和所 述第二流體。
51. 根據(jù)權(quán)利要求48~50中任一項所述的方法，其中在將所述第一 流體滴分配到所述第二流體中之前，將所述至少一個磁吸性粒子放置到 所述第一流體中。
52. 根據(jù)權(quán)利要求48~51中任一項所述的方法，其中使所述第一流 體與所述第二流體接觸包括將所述第一流體滴分配到所述第二流體上。
全文摘要
本發(fā)明提供一種處理生物樣品和/或化學(xué)樣品的方法。所述方法包括提供流體滴，所述流體滴包括內(nèi)相和外相。所述外相與所述內(nèi)相不混溶，并且所述外相包圍所述內(nèi)相。所述內(nèi)相包含所述生物樣品和/或化學(xué)樣品。所述流體滴還包含磁吸性物質(zhì)。所述方法還包括提供至少一個表面，所述表面對于所述流體滴內(nèi)相的流體具有使所述流體滴在與其接觸時保持完整的質(zhì)地和浸潤性。所述方法還包括將所述流體滴放置到所述至少一個表面上。所述方法還包括對所述流體滴中的生物樣品和/或化學(xué)樣品進行處理。
文檔編號C12Q1/68GK101371124SQ200680052763
公開日2009年2月18日 申請日期2006年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月13日
發(fā)明者于爾根·皮珀爾, 帕維爾·諾伊茨爾, 謝錚鳴 申請人:新加坡科技研究局