專利名稱：用于抑制無義突變的化合物及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過給予本發(fā)明的化合物或組合物用于治療或預防與mRNA中無義突變相關(guān)的疾病的方法、化合物和組合物。更具體地，本發(fā)明涉及用于抑制與mRNA中無義突變相關(guān)的翻譯提前終止的方法、化合物和組合物。
背景技術(shù)：
細胞內(nèi)的基因表達取決于依次進行的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。這些過程一起從相應基因的核苷酸序列制得蛋白。
轉(zhuǎn)錄包括通過RNA聚合酶由DNA合成mRNA。轉(zhuǎn)錄從基因的啟動子區(qū)域開始并繼續(xù)進行直到誘導終止，例如通過在初生RNA中形成莖-環(huán)(stem-loop)結(jié)構(gòu)或者結(jié)合ρ基因產(chǎn)物。
然后，蛋白是由mRNA在tRNA、tRNA合成酶及各種其他種類蛋白和RNA的幫助下在核糖體上進行翻譯過程而制得的。翻譯包括三步起始、延伸和終止。翻譯是通過形成起始復合體而起始的，所述起始復合物由識別mRNA上的指示翻譯機器開始在mRNA上進行翻譯的信號的蛋白因子、mRNA、tRNA、輔助因子和核糖體亞基組成。一旦形成起始復合物，通過核糖體以及tRNA和tRNA合成酶的肽基轉(zhuǎn)移酶活性，重復增加氨基酸，從而多肽鏈增長。核糖體A位點的三個終止密碼子(UAA、UAG、UGA)之一的存在發(fā)出信號使多肽鏈釋放因子(RF)結(jié)合并識別終止信號。然后，位于核糖體P位點的tRNA的3′核苷酸與初生多肽鏈之間的酯鍵水解，釋放出完成的多肽鏈，核糖體亞基循環(huán)用于又一輪翻譯。
其中堿基數(shù)目發(fā)生改變的DNA序列突變歸類為插入或缺失突變(例如，移碼突變)并且使大部分基因組破裂。將一個堿基變?yōu)榱硪粋€堿基并導致氨基酸替代的DNA突變標記為錯義突變。堿基替代細分為轉(zhuǎn)換類(一個嘌呤轉(zhuǎn)換為另一嘌呤，或者一個嘧啶轉(zhuǎn)換為另一嘧啶)和顛換類(嘌呤顛換為嘧啶，或者嘧啶顛換為嘌呤)。
轉(zhuǎn)換突變和顛換突變可以導致將氨基酸密碼子變?yōu)槿N終止密碼子之一的無義突變。這些提前終止密碼子可以使翻譯提前終止從而在細胞中產(chǎn)生異常的蛋白。必要基因中的無義突變可能是致命的并且還可以導致許多人類疾病，僅舉幾個例子，如癌癥、溶酶體貯積癥、肌營養(yǎng)不良、囊性纖維化癥和血友病。
在人類癌癥中，人類p53基因是最常見的突變基因(Zambetti，G.P.以及Levine，A.，F(xiàn)ASEB 7855-865(1993))。在遺傳性癌癥和自發(fā)性癌癥中均發(fā)現(xiàn)，超過50種不同的人類癌癥含有p53突變并且全部人類癌癥的50-55％發(fā)生該基因的突變(Hollstein，M.，等，Nucleic Acids Res.223551-55(1994)；International Agency for Research on Cancer(IARC)database)。大約70％的直腸癌、50％的肺癌和40％的乳癌含有突變體p53(Koshland，D.，Science 2621953(1993))。畸形p53與不佳的預后、更加迅速蔓延的腫瘤、轉(zhuǎn)移瘤以及低于5年的存活率有關(guān)(Id.)。人們認為p53在誘導細胞生長停滯和/或DNA損傷細胞凋亡的作用對于破壞否則將獲得生長優(yōu)勢的變異細胞是必要的。此外，p53使快速分裂的細胞對調(diào)亡信號敏感。在報道的多于15,000種p53基因突變中，大約7％為無義突變。因此，對于p53無義突變需要安全有效的治療。
在具有無義突變的細菌和真核菌株中，tRNA分子之一突變以致突變體tRNA能識別無義密碼子、參與翻譯過程的蛋白的突變、核糖體(核糖體RNA或核糖體蛋白)突變、或者添加公知的改變翻譯過程的化合物(例如，環(huán)己酰亞胺或者氨基糖苷抗生素)，均可導致發(fā)生無義突變的抑制。結(jié)果是氨基酸將在無義突變位點結(jié)合到多肽鏈中，并且翻譯不再在無義密碼子處提前終止。插入的氨基酸不必與野生型蛋白的原始氨基酸相同，但是許多氨基酸替換對蛋白結(jié)構(gòu)或功能沒有總作用。因此，通過抑制無義突變而得到的蛋白可能具有與野生型蛋白接近的活性。該方案提供了通過抑制無義突變而避免翻譯提前終止以治療與無義突變有關(guān)的疾病的機會。
氨基糖苷抗生素促進連讀真核生物終止密碼子的能力已經(jīng)引起了對這些藥物作為由無義突變引起的人類疾病的潛在性治療劑的興趣。這種治療策略可行的一種疾病為典型的晚嬰兒型神經(jīng)元蠟樣質(zhì)脂褐素沉積病(late infantile neuronal ceroidlipofuscinosis，LINCL)，目前還未有效治療的致命性幼年神經(jīng)退化疾病。編碼溶酶體三肽基-肽酶1(TPP-I)的基因CLN2中的提前終止密碼子突變與大約一半的診斷患有LINCL的兒童的疾病有關(guān)。已經(jīng)考察了氨基糖苷慶大霉素恢復LINCL細胞系TPP-I活性的能力。在來自患者的一種用于常見無義突變(Arg208Stop)和不同的罕見無義突變而雜合配制的細胞系中，用慶大霉素治療最大程度地恢復大約7％的TPP-I正常水平。這些結(jié)果表明通過氨基糖苷或功能類似的藥品來藥理學抑制無義突變可能具有LINCL治療潛力(Sleat等，Eur.J.Ped.Neurol.5Suppl A 57-62(2001))。
在囊性纖維化癥橫跨膜電導調(diào)節(jié)(Cystic Fibrosis Transmembrane ConductanceRegulator，CFTR)基因具有提前終止密碼子的培養(yǎng)細胞中，用氨基糖苷治療導致生成全長CFTR(Bedwell等，Nat.Med.31280-1284(1997)；Howard等，Nat.Med.2467-469(1996))。在杜興肌營養(yǎng)不良的小鼠模型中，觀察到慶大霉素硫酸鹽在提前終止密碼子處抑制翻譯終止，導致生成全長肌養(yǎng)蛋白(Barton-Davis等，J.Clin.Invest.104375-381(1999))。全長肌養(yǎng)蛋白的少量增加提供了對mdx小鼠中收縮誘導損傷的保護。在這些研究中沒有確定插在無義密碼子位點的氨基酸。
因此，通過介導無義密碼子誤讀而抑制翻譯提前終止的小分子療法或預防法可能用于治療許多疾病?？梢詾楣妿砜捎糜诘挚褂蔁o義突變引起的疾病的廣譜選擇性療法或預防法的小分子藥物特別是口服可生物利用的藥物的發(fā)現(xiàn)才剛開始。
Clitocine(6-氨基-5-硝基-4-(β-D-核-呋喃糖基氨基)嘧啶)為首先從蘑菇卷邊杯傘(Clitocybe inversa)中分離的天然存在的外環(huán)氨基核苷(Kubo等，Tet.Lett.274277(1986))。還報道了clitocine的全合成(Moss等，J.Med.Chem.31786-790(1988)以及Kamikawa等，J.Chem.Soc.Chem.Commun.195(1988))。已經(jīng)報道clitocine具有殺蟲活性和抵抗白血病細胞系的細胞抑制活性(Kubo等，Tet.Lett.274277(1986)以及Moss等，J.Med.Chem.31786-790(1988))。但是至今還沒有公開clitocine作為用于與無義突變有關(guān)的疾病的治療劑的用途。也沒有報道開發(fā)出可用作與無義突變有關(guān)的癌癥或疾病的治療劑的clitocine類似物或衍生物。
因此，為了開發(fā)用于治療或預防與mRNA無義突變有關(guān)的疾病的新藥物，還需要開發(fā)表征并優(yōu)化前導分子。因此，本發(fā)明的目的是提供這樣的化合物。
在此提及的所有文獻都并入本發(fā)明作為參考，如同它們完全在此闡明一樣。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明，鑒定了能抑制與mRNA中無義突變相關(guān)的翻譯提前終止的化合物，并提供了它們的使用方法。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了可用于抑制與mRNA中無義突變相關(guān)的翻譯提前終止，并可用于治療與mRNA中無義突變相關(guān)的疾病的式(1)的化合物或者式1所示化合物的藥物學可接受的鹽、水合物、溶劑化物、包合物、多晶型物、外消旋物或立體異構(gòu)體 其中W、X、Y和Z獨立地選自N或C-Ra，其中Ra為氫或C1-C4的烷基，其中W、X、Y或Z中的至少一個為N；n為0、1、2或3；R1為氰基；任選地由一個或兩個C1-C4烷基取代的氨基甲?；?；或由羥基、C1-C4烷基、或C1-C4烷氧基取代的羰基；R為羥基；鹵素；任選地由一個或多個獨立地選擇的鹵素或羥基取代的C1-C4烷基；任選地由一個或多個獨立地選擇的鹵素或苯基取代的C1-C4烷氧基；任選地由一個或多個獨立地選擇的C1-C4烷基取代的C4-C8環(huán)烷基；-Rb基；-O-Rb基；任選地由一個或多個獨立地選擇的C1-C4烷基、氧代或-Rb基取代的五元到六元雜環(huán)；具有兩個環(huán)結(jié)構(gòu)的九元至十元雜環(huán)；由羥基、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基取代的羰基；任選地由一個或兩個C1-C4烷基取代的氨基甲?；?；硝基；氰基；任選地由羥基、C1-C4烷基或-Rb基取代的硫；任選地由羥基、C1-C4烷基或-Rb基取代的磺?；?；任選地由一個或兩個獨立地選擇的C1-C4烷基、磺?；⒒螋驶〈陌被渲?，所述氨基磺酰基任選地由羥基、C1-C4烷基或-Rb基取代，并且其中氨基羰基任選地由C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、苯甲酸基或任選地由-Rb基取代的氨基所取代；或兩個R基與它們連接的苯環(huán)一起形成苯并[1，3]間二氧雜環(huán)戊烯或2，3-二氫-苯并[1，4]二噁英基，其中-Rb為任選地由下列一個或多個基團取代的C6-C8芳基羥基、鹵素、C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、C1-C4烷氧基或任選地由一個或多個C1-C4烷基取代的氨基。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種用于抑制與無義突變相關(guān)的翻譯提前終止的方法，以及用于預防或治療與mRNA無義突變相關(guān)的疾病的方法。這種疾病包括但不限于由與無義突變相關(guān)的翻譯提前終止引起的基因疾病如中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(CNS disease)、炎癥性疾病、神經(jīng)退化疾病、自身免疫性疾病、心血管病或肺病；更優(yōu)選所述疾病為癌癥(或其它增殖疾病)、淀粉樣變性病、阿爾茨海默病、動脈粥樣硬化、巨人癥、侏儒癥、甲狀腺機能減退、甲狀腺機能亢進、囊性纖維化癥、衰老癥、肥胖癥、帕金森癥、尼曼匹克癥(Nieman Pick’s disease)、家族性高膽固醇血癥、視網(wǎng)膜色素變性、馬凡氏綜合癥、溶酶體貯積癥、肌營養(yǎng)不良、囊性纖維化癥、血友病、或典型的晚嬰兒型神經(jīng)元蠟樣質(zhì)脂褐素沉積病(LINCL)。
在一種實施方式中，本發(fā)明涉及用于抑制與mRNA中無義突變相關(guān)的翻譯提前終止的方法，該方法包括對有此需要的患者給藥無義抑制量的至少一種本發(fā)明的化合物。
在另一種實施方式中，提供了用于治療癌癥、溶酶體貯積癥、肌營養(yǎng)不良、囊性纖維化癥、血友病、或典型的晚嬰兒型神經(jīng)元蠟樣質(zhì)脂褐素沉積病的方法，該方法包括對有此需要的患者給藥治療有效量的至少一種本發(fā)明的化合物。
參照下面的優(yōu)選實施方式和具體描述，本發(fā)明的這些和其它方面將變得更容易理解。
1、一種治療或預防由體細胞突變引起的疾病的方法，該方法包括對有此需要的患者給藥有效量的式1化合物或者式1所示化合物的藥物學可接受的鹽、水合物、溶劑化物、包合物、多晶型物、外消旋物或立體異構(gòu)體
其中W、X、Y和Z獨立地選自N或C-Ra，其中Ra為氫或C1-C4的烷基，其中W、X、Y或Z中的至少一個為N；n為0、1、2或3；R1為氰基；任選地由一個或兩個C1-C4烷基取代的氨基甲?；?；或由羥基、C1-C4烷基、或C1-C4烷氧基取代的羰基；R獨立地選自羥基；鹵素；任選地由一個或多個獨立地選擇的鹵素或羥基取代的C1-C4烷基；任選地由一個或多個獨立地選擇的鹵素或苯基取代的C1-C4烷氧基；任選地由一個或多個獨立地選擇的C1-C4烷基取代的C4-C8環(huán)烷基；-Rb基；-O-Rb基；任選地由一個或多個獨立地選擇的C1-C4烷基、氧代或-Rb基取代的五元到六元雜環(huán)；具有兩個環(huán)結(jié)構(gòu)的九元至十元雜環(huán)；由羥基、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基取代的羰基；任選地由一個或兩個C1-C4烷基取代的氨基甲?；幌趸?；氰基；任選地由羥基、C1-C4烷基或-Rb基取代的硫；任選地由羥基、C1-C4烷基或-Rb基取代的磺酰基；任選地由一個或兩個獨立地選擇的C1-C4烷基、磺?；?、或羰基取代的氨基，其中，所述氨基磺酰基任選地由羥基、C1-C4烷基或-Rb基取代，并且其中氨基羰基任選地由C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、苯甲酸基或任選地由-Rb基取代的氨基所取代；或兩個R基與它們連接的苯環(huán)一起形成苯并[1，3]間二氧雜環(huán)戊烯或2，3-二氫-苯并[1，4]二噁英基；其中-Rb為任選地由下列一個或多個基團取代的C6-C8芳基羥基、鹵素、C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、C1-C4烷氧基或任選地由一個或多個C1-C4烷基取代的氨基。
2、根據(jù)實施方式1所述的方法，其中，所述式1的化合物或其藥物學可接受的鹽、水合物、溶劑化物、包合物、多晶型物、外消旋物或立體異構(gòu)體以含有所述化合物和藥物學可接受的載體或稀釋劑的組合物形式給藥。
3、根據(jù)實施方式1所述的方法，其中，所述給藥為靜脈內(nèi)給藥。
4、根據(jù)實施方式1所述的方法，其中，R1在間位或?qū)ξ弧?br> 5、根據(jù)實施方式1所述的方法，其中，W、Y和Z各自為N，X為C-Ra(式1-A) 6、根據(jù)實施方式5所述的方法，其中，R1為羧基，并位于間位或?qū)ξ弧?br> 7、根據(jù)實施方式5所述的方法，其中，Ra為氫。
8、根據(jù)實施方式5所述的方法，其中，n為1或2。
9、根據(jù)實施方式5所述的方法，其中，R獨立地選自鹵素、C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基或C1-C4烷氧基。
10、根據(jù)實施方式5所述的方法，其中，R位于間位和/或?qū)ξ簧稀?br> 11、根據(jù)實施方式1所述的方法，其中，Y和Z均為N，并且W和X均為C-Ra(式1-B) 12、根據(jù)實施方式11所述的方法，其中，R1為羧基，并位于間位或?qū)ξ弧?br> 13、根據(jù)實施方式11所述的方法，其中，Ra為氫。
14、根據(jù)實施方式11所述的方法，其中，n為1或2。
15、根據(jù)實施方式11所述的方法，其中，R獨立地選自鹵素、C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4鹵代烷氧基、氨基或吡咯基。
16、根據(jù)實施方式11所述的方法，其中，R位于間位和/或?qū)ξ簧稀?br> 17、根據(jù)實施方式1所述的方法，其中，W和Y均為N，并且X和Z均為C-Ra(式1-C) 18、根據(jù)實施方式17所述的方法，其中，R1為羧基，并位于間位或?qū)ξ弧?br> 19、根據(jù)實施方式17所述的方法，其中，Ra為氫。
20、根據(jù)實施方式17所述的方法，其中，n為1或2。
21、根據(jù)實施方式17所述的方法，其中，R獨立地選自C1-C4烷基。
22、根據(jù)實施方式17所述的方法，其中，R位于間位和/或?qū)ξ簧稀?br> 23、根據(jù)實施方式1所述的方法，其中，W和Z均為N，并且X和Y均為C-Ra(式1-D) 24、根據(jù)實施方式23所述的方法，其中，R1為羧基，并位于間位或?qū)ξ弧?br> 25、根據(jù)實施方式23所述的方法，其中，Ra獨立地選自氫或甲基。
26、根據(jù)實施方式23所述的方法，其中，n為1或2。
27、根據(jù)實施方式23所述的方法，其中，R位于間位和/或?qū)ξ簧稀?br> 28、根據(jù)實施方式1所述的方法，其中，W為N，并且X、Y和Z各自為C-Ra(式1-E) 29、根據(jù)實施方式28所述的方法，其中，R1為羧基，并位于間位或?qū)ξ弧?br> 30、根據(jù)實施方式28所述的方法，其中，Ra為氫。
31、根據(jù)實施方式28所述的方法，其中，n為1或2。
32、根據(jù)實施方式28所述的方法，其中，R獨立地選自C1-C4烷基。
33、根據(jù)實施方式28所述的方法，其中，R位于間位和/或?qū)ξ簧稀?br> 34、根據(jù)實施方式1所述的方法，其中，X為N，并且W、Y和Z各自為C-Ra(式1-F) 35、根據(jù)實施方式34所述的方法，其中，R1為羧基，并位于間位或?qū)ξ弧?br> 36、根據(jù)實施方式34所述的方法，其中，Ra為氫。
37、根據(jù)實施方式34所述的方法，其中，n為1或2。
38、根據(jù)實施方式34所述的方法，其中，R獨立地選自C1-C4烷基。
39、根據(jù)實施方式34所述的方法，其中，R位于間位和/或?qū)ξ簧稀?br> 40、根據(jù)實施方式1所述的方法，其中，Y為N，并且W、X和Z各自為C-Ra(式1-G)
41、根據(jù)實施方式40所述的方法，其中，R1為羧基，并位于間位或?qū)ξ弧?br> 42、根據(jù)實施方式40所述的方法，其中，Ra為氫。
43、根據(jù)實施方式40所述的方法，其中，n為1或2。
44、根據(jù)實施方式40所述的方法，其中，R獨立地選自C1-C4烷基。
45、根據(jù)實施方式40所述的方法，其中，R位于間位和/或?qū)ξ簧稀?br> 46、根據(jù)實施方式1所述的方法，其中，Z為N，并且W、X和Y各自為C-Ra(式1-H) 47、根據(jù)實施方式46所述的方法，其中，R1為羧基，并位于間位或?qū)ξ弧?br> 48、根據(jù)實施方式46所述的方法，其中，Ra為氫。
49、根據(jù)實施方式46所述的方法，其中，n為1或2。
50、根據(jù)實施方式46所述的方法，其中，R獨立地選自C1-C4烷基。
51、根據(jù)實施方式46所述的方法，其中，R位于間位和/或?qū)ξ簧稀?br> 52、一種治療或預防自身免疫性疾病、血液病、膠原疾病、糖尿病、神經(jīng)退化疾病、心血管病、肺病、炎癥性疾病或中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，該方法包括對有此需要的患者給藥有效量的式l化合物或其藥物學可接受的鹽、水合物、溶劑化物、包合物、外消旋物或立體異構(gòu)體。
53、根據(jù)實施方式52所述的方法，其中，所述給藥為靜脈內(nèi)給藥。
54、根據(jù)實施方式52所述的方法，其中，所述自身免疫性疾病為類風濕性關(guān)節(jié)炎或移植物抗宿主病。
55、根據(jù)實施方式52所述的方法，其中，所述炎癥性疾病為關(guān)節(jié)炎。
56、根據(jù)實施方式52所述的方法，其中，所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病為多發(fā)性硬化、肌營養(yǎng)不良、杜興肌營養(yǎng)不良、阿爾茨海默病、神經(jīng)退化疾病或帕金森癥。
57、根據(jù)實施方式52所述的方法，其中，所述血液病為血友病、馮·維勒布蘭德病(Von Willebrand disease)、共濟失調(diào)性毛細血管擴張癥(ataxia-telangiectasia)、β地中海貧血癥(β-thalassemia)或腎結(jié)石。
58、根據(jù)實施方式52所述的方法，其中，所述膠原疾病為成骨不全癥(osteogenesisimperfecta)或硬化。
59、一種治療或預防家族性紅細胞增多癥、免疫缺陷、腎疾病、囊性纖維化癥、家族性高膽固醇血癥、視網(wǎng)膜色素變性、淀粉樣變性病、血友病、阿爾茨海默病、家族黑蒙性癡呆(Tay Sachs disease)、尼曼匹克癥(Niemann Pick disease)、帕金森癥、動脈粥樣硬化、巨人癥、侏儒癥、甲狀腺機能亢進、衰老癥、肥胖癥、杜興肌營養(yǎng)不良或馬凡氏綜合癥(Marfan syndrome)的方法，該方法包括對有此需要的患者給藥有效量的式1化合物或其藥物學可接受的鹽、水合物、溶劑化物、包合物、外消旋物或立體異構(gòu)體。
60、根據(jù)實施方式59所述的方法，其中，所述給藥為靜脈內(nèi)給藥。
61、一種治療或預防人類癌癥的方法，該方法包括對有此需要的人類給藥有效量的式1化合物或其藥物學可接受的鹽、水合物、溶劑化物、包合物、外消旋物或立體異構(gòu)體。
62、根據(jù)實施方式61所述的方法，其中，所述給藥為靜脈內(nèi)給藥。
63、根據(jù)實施方式61所述的方法，其中，所述癌癥為頭和頸、眼、皮膚、口、咽喉、食管、胸、骨、血、肺、結(jié)腸、乙狀結(jié)腸、直腸、胃、前列腺、乳房、卵巢、腎、肝、胰腺、腦、腸、心臟或腎上腺的癌癥。
64、根據(jù)實施方式61所述的方法，其中，所述化合物或其藥物學可接受的鹽、水合物、溶劑化物、包合物、或立體異構(gòu)體包括藥物學可接受的載體或稀釋劑。
65、根據(jù)實施方式61所述的方法，其中，所述癌癥為實體瘤。
66、根據(jù)實施方式61所述的方法，其中，所述癌癥為肉瘤、癌、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰癌、乳癌(breast cancer)、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管源性癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、維爾姆斯瘤、子宮頸癌(cervical cancer)、睪丸瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、卡波西肉瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤(menangioma)、黑素瘤、成神經(jīng)細胞瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、血液產(chǎn)生的腫瘤(blood-born tumor)或多發(fā)性骨髓瘤。
67、根據(jù)實施方式61所述的方法，其中，所述癌癥為急性成淋巴細胞性白血病、急性B淋巴細胞白血病、急性T淋巴細胞白血病、急性原粒細胞白血病、急性早幼粒細胞白血病、急性單核細胞性白血病、急性紅白血病(acute erythroleukemicleukemia)、急性成巨核細胞白血病、急性髓單核細胞白血病、急性非淋巴細胞白血病(acute nonlymphocyctic leukemia)、急性未分化型白血病、慢性髓細胞性白血病、慢性淋巴細胞白血病、毛細胞白血病或多發(fā)性骨髓瘤。
68、一種治療或預防與p53基因突變相關(guān)的疾病的方法，該方法包括對有此需要的患者給藥有效量的式1化合物或其藥物學可接受的鹽、水合物、溶劑化物、包合物、外消旋物或立體異構(gòu)體。
69、根據(jù)實施方式68所述的方法，其中，所述給藥為靜脈內(nèi)給藥。
70、根據(jù)實施方式68所述的方法，其中，所述疾病為肉瘤、癌、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰癌、乳癌(breast cancer)、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管源性癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、維爾姆斯瘤、子宮頸癌(cervical cancer)、睪丸瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、卡波西肉瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤(menangioma)、黑素瘤、成神經(jīng)細胞瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、血液產(chǎn)生的腫瘤(blood-born tumor)或多發(fā)性骨髓瘤。
71、一種抑制癌細胞生長的方法，該方法包括使癌細胞與有效量的式1化合物或其藥物學可接受的鹽、水合物、溶劑化物、包合物、外消旋物或立體異構(gòu)體接觸。
72、一種在哺乳動物內(nèi)選擇性制備蛋白質(zhì)的方法，該方法包括在哺乳動物內(nèi)轉(zhuǎn)錄含有無義突變的基因；以及將有效量的本發(fā)明的化合物提供給所述哺乳動物，其中所述蛋白質(zhì)通過所述哺乳動物制得。


圖1提供了表示用于評價無義突變抑制的基于熒光素酶測定用構(gòu)建體的示意圖；圖2提供了表示為使熒光素酶蛋白質(zhì)的N-端帶有一個或多個表位標簽而制造的熒光素酶構(gòu)建體的示意圖；圖3提供了表示用于評價連讀效率(readthrough efficiency)的基于熒光素酶測定用構(gòu)建體的示意圖。
具體實施例方式
翻譯提前終止能夠產(chǎn)生可能致死或能夠引起多種疾病包括但不限于癌癥、溶酶體貯積病、肌肉萎縮、囊性纖維化癥和血友病的異常蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)鑒定了抑制無義突變的化合物并提供了它們的使用方法。
A、本發(fā)明的化合物根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了本發(fā)明的化合物，該化合物可用于抑制無義突變。在特定實施方式中，本發(fā)明的化合物特異性地抑制無義突變，而在其它實施方式中，本發(fā)明的化合物抑制無義突變的同時還治療疾病，所述疾病包括但不限于癌癥、溶酶體貯積病、肌營養(yǎng)不良、囊性纖維化癥和血友病。
可用于抑制無義突變的本發(fā)明優(yōu)選的化合物包括下式(1)所示的那些化合物或者式1所示化合物的藥物學可接受的鹽、水合物、溶劑化物、包合物、多晶型物、外消旋物或立體異構(gòu)體
其中W、X、Y和Z獨立地選自N或C-Ra，其中Ra為氫或C1-C4的烷基，其中W、X、Y或Z中的至少一個為N；n為0、1、2或3；R1為氰基；任選地由一個或兩個C1-C4烷基取代的氨基甲酰基；或由羥基、C1-C4烷基、或C1-C4烷氧基取代的羰基；R為羥基；鹵素；任選地由一個或多個獨立地選擇的鹵素或羥基取代的C1-C4烷基；任選地由一個或多個獨立地選擇的鹵素或苯基取代的C1-C4烷氧基；任選地由一個或多個獨立地選擇的C1-C4烷基取代的C4-C8環(huán)烷基；-Rb基；-O-Rb基；任選地由一個或多個獨立地選擇的C1-C4烷基、氧代或-Rb基取代的五元到六元雜環(huán)；具有兩個環(huán)結(jié)構(gòu)的九元至十元雜環(huán)；由羥基、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基取代的羰基；任選地由一個或兩個C1-C4烷基取代的氨基甲?；?；硝基；氰基；任選地由羥基、C1-C4烷基或-Rb基取代的硫；任選地由羥基、C1-C4烷基或-Rb基取代的磺?；蝗芜x地由一個或兩個獨立地選擇的C1-C4烷基、磺酰基、或羰基取代的氨基，其中，所述氨基磺?；芜x地由羥基、C1-C4烷基或-Rb基取代，并且其中氨基羰基任選地由C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、苯甲酸基或任選地由-Rb基取代的氨基所取代；或兩個R基與它們連接的苯環(huán)一起形成苯并[1，3]間二氧雜環(huán)戊烯或2，3-二氫-苯并[1，4]二噁英基，其中-Rb為任選地由下列一個或多個基團取代的C6-C8芳基羥基、鹵素、C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、C1-C4烷氧基或任選地由一個或多個C1-C4烷基取代的氨基。
在另一種式1的優(yōu)選實施方式中，優(yōu)選本發(fā)明可用于抑制無義突變的化合物包括這些式(1)化合物或者式1所示化合物的藥物學可接受的鹽、水合物、溶劑化物、包合物、多晶型物、外消旋物或立體異構(gòu)體，其中n為0、1或2；R1為氰基；氨基甲酰基；或由羥基取代的羰基；
R為獨立地選自羥基；鹵素；任選地由一個或多個獨立地選擇的鹵素取代的C1-C4烷基；任選地由一個或多個獨立地選擇的鹵素取代的C1-C4烷氧基；-Rb基；五元到六元雜環(huán)；任選地由一個或兩個獨立地選擇的C1-C4烷基取代的氨基；或兩個R基與它們連接的苯環(huán)一起形成苯并[1，3]間二氧雜環(huán)戊烯或2，3-二氫-苯并[1，4]二噁英基；其中-Rb為C6-C8芳基。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員認識到的一樣，本發(fā)明某些化合物可以包括至少一個手性中心，并因此可以存在外消旋混合物或光學異構(gòu)純組合物。在此所用“光學異構(gòu)純”表示基本由單異構(gòu)體組成優(yōu)選由90％、92％、95％、98％、99％或100％的單異構(gòu)體組成的組合物。
在此所用術(shù)語“烷基”一般指飽和直鏈、支鏈或環(huán)狀結(jié)構(gòu)烴基，包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基、環(huán)己基、正庚基、辛基、正辛基等。在某些實施方式仲，烷基取代基可以是C1-C8、C1-C6或C1-C4烷基。在某些實施方式中，烷基可以任選地由一個或多個鹵素或烷氧基取代。例如，烷基可以為鹵代烷基包括單鹵代烷基、雙鹵代烷基和三鹵代烷基。
在此所用“烯基”一般指具有一個或多個碳碳雙鍵的直鏈、支鏈或環(huán)狀烯基，例如C2-C6烯基，包括3-丙烯基。
在此所用“芳基”指碳環(huán)芳基環(huán)狀結(jié)構(gòu)。包括在芳基范圍內(nèi)為具有5-20個碳原子的芳環(huán)。芳環(huán)結(jié)構(gòu)包括具有一個或多個環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，如單、雙或三環(huán)化合物。芳基的例子包括苯基、甲苯基、蒽基(anthracenyl)、芴基、茚基、薁基(azulenyl)、菲基(phenanthrenyl)(即菲)以及萘基(即萘)環(huán)結(jié)構(gòu)。在某些實施方式中，芳基可以任選地被取代。
在此所用“雜環(huán)”指其中環(huán)上的一個或多個原子即雜原子為不同于碳原子的原子的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。雜原子一般為O、S或N原子。包括在該范圍內(nèi)的雜環(huán)可獨立地選自O、N和S雜環(huán)結(jié)構(gòu)。雜環(huán)結(jié)構(gòu)可以包括具有一個或多個環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，如單、雙或三環(huán)化合物，可以為芳環(huán)，即所述環(huán)狀結(jié)構(gòu)可以為雜芳基。雜環(huán)基的例子包括嗎啉基、吡咯烷酮基(pyrrolidinonyl)、吡咯烷基、哌啶酮基、哌嗪基、乙內(nèi)酰脲基、戊內(nèi)酰胺基(valerolactamyl)、環(huán)氧乙烷基(oxiranyl)、氧雜環(huán)丁烷基(oxetanyl)、四氫呋喃基、四氫吡喃基、四氫吡啶基、四氫嘧啶基(tetrahydroprimidinyl)、四氫噻吩基或四氫噻喃基等。在某些實施方式中，雜環(huán)可以選擇性被取代。
在此所用“雜芳環(huán)”指環(huán)中的一個或多個原子為不同于碳元素的雜原子的芳環(huán)結(jié)構(gòu)。雜原子典型的為O、S或N原子。包括在雜芳基范圍內(nèi)的可獨立選擇的是O、N和S雜芳環(huán)結(jié)構(gòu)。環(huán)結(jié)構(gòu)可以包括具有一個或多個環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，如單-、雙-或三環(huán)化合物。在某些實施方式中，雜芳基可以選自含有兩個或更多個雜原子、三個或更多個雜原子或者四個或更多個雜原子的雜芳基。雜芳基環(huán)結(jié)構(gòu)可以選自那些含有五個或更多個原子、六個或更多個原子、八個或更多個原子的雜芳基環(huán)結(jié)構(gòu)。在優(yōu)選實施方式中，雜芳基包括5-10個原子。雜芳環(huán)結(jié)構(gòu)的例子包括吖啶、苯并咪唑、苯并噁唑、苯并間二氧雜環(huán)戊烯(benzodioxole)、苯并呋喃、1，3-二嗪、1，2-二嗪、1，2-二唑、1，4-二氮萘、呋喃、呋咱(furazan)、咪唑、吲哚、異噁唑、異喹啉、異噻唑、噁唑、嘌呤、噠嗪、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、吡咯、喹啉、喹喔啉、噻唑、噻吩、1，3，5-三嗪、1，2，4-三嗪、1，2，3-三嗪、四唑和喹唑啉。
在此所用“烷氧基”一般指具有-O-R結(jié)構(gòu)的基團。在某些實施方式中，R可以為烷基，如C1-C8烷基、C1-C6烷基或C1-C4烷基。在某些實施方式中，烷氧基的R基可以任選地由至少一個鹵素取代。例如，烷氧基的R基可以為鹵代烷基，即鹵代烷氧基。
鹵素取代基可以獨立地選自鹵素如氟、氯、溴、碘和砹。
為了本發(fā)明的目的，包括優(yōu)選的實施方式，當本發(fā)明的化合物含有一個或多個官能團或取代基時，出現(xiàn)在公開的化合物的任何位置的各個官能團或取代基可以獨立地選擇，并且可以適當?shù)鬲毩⒌乇蝗〈?。另外，在本發(fā)明分子任何位置闡明的更概括性的(generic)取代基應該理解為該概括性取代基可以被更特定的取代基代替，并且所得分子也在本發(fā)明分子范圍內(nèi)。
參照式1，在一種實施方式中，R優(yōu)選在間位和/或?qū)ξ?，并且?yōu)選為鹵素、C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4鹵代烷氧基、任選地由一個或多個C1-C4烷基取代的氨基、-Rb基團、吡咯基、咪唑基、或兩個R基與它們連接的苯環(huán)一起形成苯并[1，3]間二氧雜環(huán)戊烯或2，3-二氫-苯并[1，4]二噁英基。優(yōu)選的R基團包括下表中所示基團。
在式1的一種實施方式中，R優(yōu)選為鹵素、C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4鹵代烷氧基、任選地由一個或多個C1-C4烷基取代的氨基、-Rb基團、五元到六元雜環(huán)、或兩個R基與它們連接的苯環(huán)一起形成苯并[1，3]間二氧雜環(huán)戊烯或2，3-二氫-苯并[1，4]二噁英基。
在式1的一種實施方式中，R為鹵素。在式1的另一種實施方式中，R為氟、氯或溴。
在式1的一種實施方式中，R為五元到六元雜環(huán)。在式1的另一種實施方式中，R為包括一個或多個氮的五元雜環(huán)。在式1的一種實施方式中，R為包括一個氮的五元雜環(huán)。在式1的一種實施方式中，R為包括兩個氮的五元雜環(huán)。在式1的一種實施方式中，R為包括三個氮的五元雜環(huán)。在式1的一種實施方式中，R為包括一個氧的五元雜環(huán)。在式1的一種實施方式中，R為包括兩個氧的五元雜環(huán)。在式1的一種實施方式中，R為包括三個氧的五元雜環(huán)。在式1的另一種實施方式中，R為包括一個或幾個氧和一個或幾個氮的五元雜環(huán)。
在式1的另一種實施方式中，R為包括一個或多個氮的六元雜環(huán)。在式1的一種實施方式中，R為包括一個氮的六元雜環(huán)。在式1的一種實施方式中，R為包括兩個氮的六元雜環(huán)。在式1的一種實施方式中，R為包括三個氮的六元雜環(huán)。在式1的一種實施方式中，R為包括一個氧的六元雜環(huán)。在式1的一種實施方式中，R為包括兩個氧的六元雜環(huán)。在式1的一種實施方式中，R為包括三個氧的六元雜環(huán)。在式1的另一種實施方式中，R為包括一個或幾個氧和一個或幾個氮的六元雜環(huán)。
在式1的實施方式中，特別優(yōu)選的R基團包括下表中所示基團。
在式1的實施方式中，n為2并且兩個R基團均為相同的基團。
在式1的實施方式中，n為3并且三個R基團均為相同的基團。
在式1的另一種實施方式中，R1優(yōu)選在間位或?qū)ξ?，并且?yōu)選為氰基、氨基甲?；蛴闪u基、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基取代的羰基。在另一種實施方式中，特別優(yōu)選的R1基團包括下表中所示基團。
在優(yōu)選實施方式中，W、Y和Z各自為N，并且X為C-Ra(式1-A) 參照式1-A，在實施方式中，R1優(yōu)選為羧基，并優(yōu)選位于間位或?qū)ξ?。在?-A的另一種優(yōu)選實施方式中，Ra為氫。在式1-A的另一種優(yōu)選實施方式中，R1為位于間位或?qū)ξ坏聂然⑶襌a為氫。在另一種實施方式中，Ra優(yōu)選為氫且n優(yōu)選為1或2。在另一種優(yōu)選實施方式中，Ra為氫且n為1。在式1-A的另一種優(yōu)選實施方式中，R1為位于間位或?qū)ξ坏聂然琑a為氫，并且n為1或2。在式1-A的進一步優(yōu)選實施方式中，R1為位于間位或?qū)ξ坏聂然琑a為氫，并且n為1。R優(yōu)選地獨立選自鹵素、C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基或C1-C4烷氧基，并優(yōu)選位于間位和/或?qū)ξ簧?，更?yōu)選位于對位上。在另一種優(yōu)選實施方式中，R獨立地選自甲基、氟、甲氧基、乙氧基和三氟甲基。
在另一種優(yōu)選實施方式中，Y和Z均為N，并且W和X均為C-Ra(式1-B)
參照式1-B，在優(yōu)選實施方式中，Ra為氫，并且n為0、1或2。在另一種優(yōu)選實施方式中，Ra為氫，并且n為1或2。在式1-B的進一步優(yōu)選實施方式中，Ra為氫，并且n為1。
在式1-B的另一種實施方式中，R獨立地選自鹵素、C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4鹵代烷氧基、氨基或吡咯基，并且R位于間位和/或?qū)ξ簧?，?yōu)選位于對位上。在一種優(yōu)選實施方式中，R獨立地選自鹵素、C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4鹵代烷氧基和氨基，并且R優(yōu)選位于間位和/或?qū)ξ簧?，更?yōu)選位于對位上。在式1-B的進一步優(yōu)選實施方式中，Ra為氫，n為1，并且R獨立地選自鹵素、C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4鹵代烷氧基和氨基。
在另一種優(yōu)選實施方式中，R獨立地選自氟、氯、氨基、甲基、異丙醇、叔丁基、甲基、三氟甲基、甲氧基、三氟甲氧基。在式1-B的進一步優(yōu)選實施方式中，Ra為氫，n為1，并且R獨立地選自氟、氯、氨基、甲基、異丙醇、叔丁基、甲基、三氟甲基、甲氧基、三氟甲氧基。
在另一種優(yōu)選實施方式中，W和Y均為N，并且X和Z均為C-Ra(式1-C)
參照式1-C，在實施方式中，R1優(yōu)選為羧基，并優(yōu)選位于間位或?qū)ξ弧Ｔ谑?-C的另一種實施方式中，Ra優(yōu)選為氫，并且n為1或2。在式1-C的另一種實施方式中，Ra優(yōu)選為氫，并且n優(yōu)選為1。在一種實施方式中，R優(yōu)選為C1-C4烷基，并優(yōu)選位于間位和/或?qū)ξ簧?，更?yōu)選為對位。在式1-C的一種優(yōu)選實施方式中，R為甲基。在式1-C的另一種優(yōu)選實施方式中，Ra優(yōu)選為氫，n優(yōu)選為1，并且R為C1-C4烷基。在式1-C的另一種優(yōu)選實施方式中，Ra優(yōu)選為氫，n優(yōu)選為1，并且R為甲基。
在另一種優(yōu)選實施方式中，W和Z均為N，并且X和Y均為C-Ra(式1-D) 參照式1-D，在優(yōu)選實施方式中，R1為羧基，并優(yōu)選位于間位或?qū)ξ?。在一種實施方式中，X為C-CH3并且Y為CH。在另一種實施方式中，X為CH并且Y為C-CH3。在式1-D的一種優(yōu)選實施方式中，Ra優(yōu)選獨立地選自氫或C1-C4烷基，并且n優(yōu)選為1或2。在式1-D的另一種優(yōu)選實施方式中，Ra優(yōu)選獨立地選自氫或C1-C4烷基，并且n優(yōu)選為1。
在進一步優(yōu)選實施方式中，Ra獨立地選自氫或甲基，并且n為1或2。在另一種優(yōu)選實施方式中，Ra獨立地選自氫或甲基，并且n為1。
在另一種優(yōu)選實施方式中，W為N，并且X、Y和Z各自為C-Ra(式1-E)
參照式1-E，在一種實施方式中，R1優(yōu)選為羧基，并優(yōu)選位于間位或?qū)ξ?。在另一種實施方式中，Ra優(yōu)選為氫，并且n優(yōu)選為1或2。在優(yōu)選實施方式中，Ra為氫，并且n為1。在式1-E的一種優(yōu)選實施方式中，R優(yōu)選獨立地選自C1-C4烷基，并且位于間位和/或?qū)ξ簧?，更?yōu)選位于對位上。在另一種實施方式中，Ra優(yōu)選為氫，n優(yōu)選為1，并且R優(yōu)選為C1-C4烷基。在式1-E的另一種實施方式中，R優(yōu)選獨立地選自甲基或異丙基，并且位于間位和/或?qū)ξ簧?，更?yōu)選位于對位上。在另一種實施方式中，Ra優(yōu)選為氫，n優(yōu)選為1，并且R優(yōu)選為甲基或異丙基。
在另一種優(yōu)選實施方式中，X為N，并且W、Y和Z各自為C-Ra(式1-F) 參照式1-F，在一種實施方式中，R1優(yōu)選為羧基，并優(yōu)選位于間位或?qū)ξ?。在?-F的一種實施方式中，Ra優(yōu)選為氫，并且n優(yōu)選為1或2。在式1-F的一種優(yōu)選實施方式中，Ra為氫，并且n為1。在另一種優(yōu)選實施方式中，R優(yōu)選獨立地選自C1-C4烷基，并且優(yōu)選位于間位和/或?qū)ξ簧?，更?yōu)選位于對位上。在另一種優(yōu)選實施方式中，Ra為氫，n為1，并且R為C1-C4烷基。在另一種優(yōu)選實施方式中，R獨立地選自甲基和異丙基，并且優(yōu)選位于間位和/或?qū)ξ簧?，更?yōu)選位于對位上。在另一種優(yōu)選實施方式中，Ra為氫，n為1，并且R優(yōu)選選自甲基和異丙基。
在另一種優(yōu)選實施方式中，Y為N，并且W、X和Z各自為C-Ra(式1-G) 參照式1-G，在一種優(yōu)選實施方式中，R1為羧基，并優(yōu)選位于間位或?qū)ξ?。在另一種優(yōu)選實施方式中，Ra優(yōu)選為氫，并且n優(yōu)選為1或2。在進一步優(yōu)選實施方式中，Ra優(yōu)選為氫，并且n優(yōu)選為1。在一種優(yōu)選實施方式中，R優(yōu)選獨立地選自C1-C4烷基，并且優(yōu)選位于間位和/或?qū)ξ簧?，更?yōu)選位于對位上。在另一種優(yōu)選實施方式中，Ra為氫，n為1，并且R為C1-C4烷基。在一種優(yōu)選實施方式中，R優(yōu)選獨立地選自甲基和異丙基，并且優(yōu)選位于間位和/或?qū)ξ簧?，更?yōu)選位于對位上。在另一種優(yōu)選實施方式中，Ra為氫，n為1，并且R為甲基和異丙基。
在另一種優(yōu)選實施方式中，Z為N，并且W、X和Y各自為C-Ra(式1-H) 參照式1-H，在一種優(yōu)選實施方式中，R1優(yōu)選為羧基，并優(yōu)選位于間位或?qū)ξ?。在進一步優(yōu)選實施方式中，Ra為氫，并且n優(yōu)選為0或1。在一種優(yōu)選實施方式中，n為1并且R為C1-C4烷基，并且R優(yōu)選位于間位和/或?qū)ξ簧?，更?yōu)選位于對位上。在另一種優(yōu)選實施方式中，n為1，R為甲基或異丙基，并且R優(yōu)選位于間位和/或?qū)ξ簧?，更?yōu)選位于對位上。
在另一種實施方式中，本發(fā)明優(yōu)選的化合物還包括式2的化合物或者式2所示化合物的藥物學可接受的鹽、水合物、溶劑化物、包合物、多晶型物、外消旋物或立體異構(gòu)體 其中W、X、Y和Z獨立地選自N或C-Ra，其中Ra為氫或C1-C4的烷基；R1為氰基；任選地由一個或兩個C1-C4烷基取代的氨基甲?；?；或由羥基、C1-C4烷基、或C1-C4烷氧基取代的羰基；R2獨立地選自氫、鹵素、C1-C4烷基或C1-C4鹵代烷基；R3和R4獨立地選自氫；鹵素；C1-C4烷基；C1-C4鹵代烷基；C1-C4烷氧基；C1-C4鹵代烷氧基；任選地由一個或多個C1-C4烷基取代的氨基；-Rb基；吡咯基；咪唑基；或兩個R基與它們連接的苯環(huán)一起形成苯并[1，3]間二氧雜環(huán)戊烯或2，3-二氫-苯并[1，4]二噁英基，其中-Rb為任選地由下列一個或多個基團取代的C6-C8芳基羥基、鹵素、C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、C1-C4烷氧基或任選地由一個或多個C1-C4烷基取代的氨基。
參照式2，R1優(yōu)選為氰基、氨基甲?；?、或羧基，并且優(yōu)選在間位或?qū)ξ簧稀Ｔ谑?的一種實施方式中，優(yōu)選R2、R3、和R4基團為獨立地選自下表的基團。

在式2的一種優(yōu)選實施方式中，W、Y和Z各自為N，并且X為C-Ra(式2-A) 參照式2-A，在優(yōu)選實施方式中，R1優(yōu)選為羧基，并優(yōu)選位于間位或?qū)ξ弧Ｔ谑?-A的另一種優(yōu)選實施方式中，Ra和R2優(yōu)選為氫。在式2-A的一種優(yōu)選實施方式中，R3獨立地選自氫、鹵素和C1-C4烷氧基。在式2-A的另一種優(yōu)選實施方式中，R3獨立地選自氫、氟和甲氧基。在式2-A的一種優(yōu)選實施方式中，R4為氫、鹵素、C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基或C1-C4烷氧基。在式2-A的另一種優(yōu)選實施方式中，R4為氟、甲基、三氟甲烷、甲氧基或乙氧基。
在式2的另一種優(yōu)選實施方式中，Y和Z均為N，并且W和X均為C-Ra(式2-B)
參照式2-B，在優(yōu)選實施方式中，R1為羧基，并優(yōu)選位于間位或?qū)ξ?。在?-B的進一步優(yōu)選實施方式中，Ra為氫。在式2-B的一種優(yōu)選實施方式中，R2獨立地選自氫、鹵素、C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基和C1-C4鹵代烷氧基。在式2-B的另一種優(yōu)選實施方式中，R2獨立地選自氫、氟、氯、甲基、三氟甲基和三氟甲氧基。
在式2-B的一種實施方式中，R3優(yōu)選獨立地選自氫、鹵素、C1-C4烷氧基和C1-C4鹵代烷氧基。在式2-B的一種優(yōu)選實施方式中，R3獨立地選自氫、氟、氯、甲氧基和三氟甲氧基。
在式2-B的一種實施方式中，R4為氫、鹵素、C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4鹵代烷氧基、氨基或吡咯基。在式2-B的另一種實施方式中，R4優(yōu)選為氫、鹵素、C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4鹵代烷氧基或氨基。在式2-B的一種優(yōu)選實施方式中，R4為氫、氟、氯、甲基、異丙基、叔丁基、三氟甲基、甲氧基、三氟甲氧基或氨基。
在式2的另一種優(yōu)選實施方式中，W和Y均為N，并且X和Z均為C-Ra(式2-C)
參照式2-C，在優(yōu)選實施方式中，R1為羧基，并優(yōu)選位于間位或?qū)ξ?。在?-C的一種優(yōu)選實施方式中，Ra為氫。在式2-C的另一種優(yōu)選實施方式中，R3獨立地選自氫或C1-C4烷基。在式2-C的進一步優(yōu)選實施方式中，R3獨立地選自氫或甲基。在式2-C的另一種優(yōu)選實施方式中，R4為氫或C1-C4烷基。在式2-C的進一步優(yōu)選實施方式中，R4為氫或甲基。
在式2的另一種優(yōu)選實施方式中，W和Z均為N，并且X和Y均為C-Ra(式2-D)
參照式2-D，在一種實施方式中，R1優(yōu)選為羧基，并優(yōu)選位于間位或?qū)ξ?。在?-D的另一種實施方式中，Ra優(yōu)選獨立地選自氫或甲基。在一種實施方式中，X為C-CH3并且Y為CH。在另一種實施方式中，X為CH并且Y為C-CH3。
在式2-D的一種實施方式中，R2優(yōu)選獨立地選自氫或鹵素。在式2-D的一種優(yōu)選實施方式中，R2獨立地選自氫或氟。在式2-D的一種實施方式中，R3優(yōu)選獨立地選自氫、鹵素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4鹵代烷氧基或與R4及R3和R4所連接的苯環(huán)一起形成苯并[1，3]間二氧雜環(huán)戊烯或2，3-二氫-苯并[1，4]二噁英基。在式2-D的另一種實施方式中，R3獨立地選自氫、鹵素、C1-C4烷氧基或與R4及R3和R4所連接的苯環(huán)一起形成苯并[1，3]間二氧雜環(huán)戊烯或2，3-二氫-苯并[1，4]二噁英基。在式2-D的一種優(yōu)選實施方式中，R3優(yōu)選獨立地選自氫、氟、甲基、三氟甲基、甲氧基或與R4及R3和R4所連接的苯環(huán)一起形成苯并[1，3]間二氧雜環(huán)戊烯或2，3-二氫-苯并[1，4]二噁英基。
在式2-D的一種實施方式中，R4優(yōu)選為氫、鹵素、C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4鹵代烷氧基、任選地由一個或兩個C1-C4烷基取代的氨基、-Rb基、咪唑基、嗎啉基、或與R3及R3和R4所連接的苯環(huán)一起形成苯并[1，3]間二氧雜環(huán)戊烯或2，3-二氫-苯并[1，4]二噁英基。在式2-D的另一種實施方式中，R4優(yōu)選為氫、鹵素、C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4鹵代烷氧基、任選地由一個或兩個C1-C4烷基取代的氨基、-Rb基、咪唑基或與R3及R3和R4所連接的苯環(huán)一起形成苯并[1，3]間二氧雜環(huán)戊烯或2，3-二氫-苯并[1，4]二噁英基。在式2-D的一種優(yōu)選實施方式中，R4選自下列基團氟、溴、甲基、異丙基、三氟甲基、甲氧基、三氟甲氧基、苯基、咪唑基、嗎啉基、以及由兩個甲基取代的氨基。
在式2的另一種優(yōu)選實施方式中，W為N，并且X、Y和Z各自為C-Ra(式2-E) 參照式2-E，在一種實施方式中，R1優(yōu)選為羧基，并優(yōu)選位于間位或?qū)ξ弧Ｔ谑?-E的另一種實施方式中，Ra、R2和R3優(yōu)選為氫。在式2-E的一種優(yōu)選實施方式中，R4為C1-C4烷基。在式2-E的另一種優(yōu)選實施方式中，R4為甲基或異丙基。
在式2的另一種優(yōu)選實施方式中，X為N，并且W、Y和Z各自為C-Ra(式2-F)
參照式2-F，在一種實施方式中，R1優(yōu)選為羧基，并優(yōu)選位于間位或?qū)ξ?。在?-F的一種優(yōu)選實施方式中，Ra、R2和R3優(yōu)選為氫。在式2-F的另一種優(yōu)選實施方式中，R4為C1-C4烷基。在式2-F的另一種優(yōu)選實施方式中，R4為甲基或異丙基。
在式2的另一種優(yōu)選實施方式中，Y為N，并且W、X和Z各自為C-Ra(式2-G) 參照式2-G，在一種實施方式中，R1優(yōu)選為羧基，并優(yōu)選位于間位或?qū)ξ?。在?-G的一種優(yōu)選實施方式中，Ra、R2和R3優(yōu)選為氫。在式2-G的另一種優(yōu)選實施方式中，R4為C1-C4烷基。在式2-G的另一種優(yōu)選實施方式中，R4為甲基或異丙基。
在式2的另一種優(yōu)選實施方式中，Z為N，并且W、X和Y各自為C-Ra(式2-H)
參照式2-H，在一種實施方式中，R1優(yōu)選為羧基，并優(yōu)選位于間位或?qū)ξ?。此外，在?-H的一種優(yōu)選實施方式中，Ra、R2和R3優(yōu)選為氫。在另一種優(yōu)選實施方式中，R4為氫或C1-C4烷基。在另一種優(yōu)選實施方式中，R4為氫或甲基或異丙基。在進一步優(yōu)選實施方式中，R4為氫。在另一種優(yōu)選實施方式中，R4為甲基或異丙基。
本發(fā)明的優(yōu)選化合物包括以下化合物








尤其優(yōu)選的化合物為化合物編號10、33、35、36、37、40、42、43、56、60、63、64、65、66和71。
列出上述化合物僅僅是為了提供可以用于本發(fā)明方法的例子?；谏鲜鲋苯庸_，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到的也包括在本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)的其它化合物可用于在此所述的方法中。
B、本發(fā)明化合物的制備本發(fā)明的化合物可以以本領(lǐng)域公知的任何方式制備。通過舉例，本發(fā)明的化合物可以根據(jù)下述關(guān)于單個吖嗪環(huán)核心結(jié)構(gòu)的通用路線進行制備。例如，式1-A和式2-A的三嗪化合物可以按照下述路線A所示的方法制備 路線A根據(jù)路線A，式A1的苯甲酰胺底物用式(RN)2NCH(O烷基)2的試劑處理，其中RN通常為小烷基，或者兩個RN基團一起形成五元或六元環(huán)(例如，吡咯烷、哌嗪、嗎啉等)；O烷基為小烷氧基基團例如甲氧基或乙氧基。所述縮合反應既可以通過純甲酰胺乙縮醛試劑，又可以在諸如乙醇或乙酸的較高沸點溶劑中進行，以得到式A2的苯甲?；纂弋a(chǎn)物。
在單獨的反應中，式A3的氰基苯甲酸試劑可以轉(zhuǎn)變成式A4的酯化合物。RP基團可以代表直鏈或支鏈烷基。所述酯化反應為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，包括但不限于a)轉(zhuǎn)化成苯甲酰氯，然后用相應的式RpOH的醇試劑在堿存在下處理；b)用如碳二亞胺的脫水試劑原位激活；或c)應用Mitsunobu條件，使用膦化合物和重氮羧酸酯(diazocarboxylate)試劑。優(yōu)選Rp越大越好，可以為叔丁基，可以通過酸催化的反應與異丁烯結(jié)合，或者如上所述通過叔丁醇和苯甲酰氯縮合。在另一種實施方式中，固體支持物可以用作Rp，這樣有助于中間產(chǎn)物的純化?？梢允褂媒M合合成化學中常用的固體支持物，包括Wang樹脂、Janda樹脂等。
式A4化合物中的腈基然后可轉(zhuǎn)化為脒基以得到式A5的化合物。這種轉(zhuǎn)化可以通過用諸如六甲基二硅疊氮(hexamethyldisilazide)鋰、六甲基二硅疊氮鈉或六甲基二硅疊氮鉀的試劑在諸如四氫呋喃、1，4-二噁烷的非質(zhì)子溶劑中，在從零下到回流的溫度范圍內(nèi)處理完成。然后可使用水處理(aqueous workup)和中和作用移除硅基(silicon group)并產(chǎn)生脒產(chǎn)物。其他這種轉(zhuǎn)換可以包括酸催化的腈基氨化作用。
式A2和A5的化合物然后可以允許經(jīng)歷環(huán)化縮合反應形成式A6化合物中的三嗪環(huán)。該反應可以在諸如乙酸、甘醇二甲醚等較高沸點的溶劑中酸催化。該反應還可以通過使用微波反應器加速。如果需要，合成的最終步驟一般包括式A6化合物中的羧酸酯基團的脫保護。對非立體受阻(sterically-unhindered)的Rp基團，優(yōu)選用氫氧化物鹽(如氫氧化鋰或氫氧化鈉)在諸如乙醇、四氫呋喃等的溶劑中，通常在少量水存在下、于環(huán)境溫度至高溫的條件下處理完成。小的Rp基團(尤其是甲基)可以用諸如碘化鋰的親核試劑，在諸如二甲基亞砜或吡啶的極性溶劑中去除。最后，諸如叔丁基的對酸敏感的Rp基團可以在先前的反應(即得到A6)條件下斷裂以直接提供羧酸，如果必要，采用強酸條件。
路線B中展示了用于嘧啶(式1-B和式2-B)合成中的通用方法。
路線B式B1的苯乙酮底物可以與甲酰胺乙縮醛試劑以與A1到A2轉(zhuǎn)化相似的方式反應，得到式B2的產(chǎn)物。在單獨的反應中，式B3的芐腈化合物可以以與A4到A5的轉(zhuǎn)化類似的方式轉(zhuǎn)化為式B4的脒。然后，式B2和式B4化合物的縮合反應可以產(chǎn)生式1-B或式2-B的嘧啶產(chǎn)物。該反應可以在堿(例如氫化鈉、乙醇鈉)存在下，在極性溶劑(例如乙醇或1，4-二噁烷)中在較高溫度完成。通過式B5的腈化合物的反應，例證了R1基團的相互轉(zhuǎn)換是可能的。該腈可以用強酸(鹽酸或硫酸)的水溶液水解成羧酰胺(carboxamide)以得到式B6的化合物。同樣地，堿性條件(例如，氫氧化鈉)可以將所述腈基水解成式B7產(chǎn)物中的羧基。
路線C中展示了用于式1-C和式2-C的4，6-二芳基嘧啶合成中的通用方法。
路線C式C1的4，6-二鹵代嘧啶可以用于與兩個芳基基團的硼酸衍生物的連續(xù)Suzuki反應，其中X代表可以在芳基交叉偶聯(lián)反應中被代替的基團，例如氯、溴、碘或三氟甲磺?；榱颂岣呖傓D(zhuǎn)化的選擇性，可能必需使用具有不同鹵素的底物(即X≠X′)。另一途徑可以包括使用為被掩蔽的鹵素的X′基團；例如可以通過重氮化作用然后被鹵素代替而轉(zhuǎn)化成鹵素的芳基氨基。在式C2或C3的化合物不能市售獲得的情況下，它們可以通過金屬-鹵素交換(溴或碘與鋰、鎂、鋅等)、然后用諸如三甲基硼酸酯或三異丙基硼酸酯的硼源淬滅(quenching)來制備。
所述交叉偶聯(lián)反應可以通過諸如四(三苯基膦)、乙酸鈀、二(三苯基膦)鈀二氯化物的化合物，任選地加入諸如三苯基膦、BINAP等的膦配體而催化。所述反應還要求諸如碳酸鈉、三磷酸鉀或氟化銫的堿的存在。對Suzuki-型交叉偶聯(lián)反應適用的試劑包括乙醇、甲苯、1，4-二噁烷或甘醇二甲醚，并且所述反應優(yōu)選在無氧條件下進行，因此溶劑優(yōu)選地脫氣。所述中間產(chǎn)物單偶聯(lián)化合物的分離有利于最終產(chǎn)物純化。并且，如果需要，在最后一步可以移除羧酸酯保護基團，以得到式1-C和2-C的終產(chǎn)物。
如下面路線D中所示，在路線B中討論的通用方法可以適用于式1-D和式2-D的相反的嘧啶區(qū)域異構(gòu)體(regioisomer)。
路線D式D1的苯乙酮可以用于制備式D2的氨基丙烯?；衔铮珼2然后可以與式D3的脒試劑(其合成上面已討論)縮合產(chǎn)生式D4的嘧啶。如前面，如果需要，式1-D和式2-D的化合物中受保護的羧酸酯然后可以用于釋放游離的羧基。
芳基交叉偶聯(lián)途徑與上述路線C類似，可以用于制備式1-E和式2-E的吡啶化合物(參見下面路線E)。
路線E式E1的吡啶試劑可以用作起始物質(zhì)，其中X代表在芳基交叉偶聯(lián)反應中能被代替的基團，例如氯、溴、碘或三氟甲磺酰基。所述偶聯(lián)反應可以與諸如式E2的硼酸的試劑進行。在式E2化合物不能市售獲得的情況下，它們可以通過金屬-鹵素交換(溴或碘與鋰、鎂、鋅等)、然后與諸如三甲基硼酸酯或三異丙基硼酸酯的硼源驟冷制備。所述交叉偶聯(lián)反應可以通過諸如四(三苯基膦)、乙酸鈀、或二(三苯基膦)鈀二氯化物的化合物，任選地加入諸如三苯基膦、BINAP等的膦配體而催化。所述反應還要求諸如碳酸鈉、三磷酸鉀或氟化銫的堿的存在。對Suzuki-型交叉偶聯(lián)反應適用的試劑包括乙醇、甲苯、1，4-二噁烷或甘醇二甲醚。并且所述反應優(yōu)選在無氧條件下進行，因此溶劑優(yōu)選脫氣。
一旦獲得式E3的吡啶化合物，氮原子可以氧化成式E4的吡啶N氧化物化合物。用于這種轉(zhuǎn)換的試劑包括間氯過苯甲酸(perbenzoic acid)或過氧化氫(加上各種添加劑)。然后所述氧化物可進行重排反應以產(chǎn)生式E5的化合物。用于這種轉(zhuǎn)換的試劑包括磷酰氯、三溴化磷或三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯。X′基團代表鹵素或擬鹵素(Cl、Br、OTf)，并且取決于所用的吡啶氧化物激活反應條件以及試劑。如果反應提供了2-吡啶酮，則可將其容易地轉(zhuǎn)化成2-X′-吡啶；例如吡啶酮與磷酰氯反應得到2-氯吡啶。然后所述2-鹵代吡啶可以用在與式E6的硼酸化合物的交叉偶聯(lián)反應中，如上所述用Suzuki型鈀催化的反應以產(chǎn)生式E7的2，4-二芳基吡啶化合物。如果需要，然后羧酸酯可以如上所述脫保護以產(chǎn)生式1-E和式2-E的終產(chǎn)物。
另一種雙重交叉偶聯(lián)路線與上述路線E相似，可用于式1-F和式2-F的吡啶化合物的合成(路線F)。
路線F式F1的3，5-二芳基吡啶與兩種芳基的硼酸衍生物(式F2和式F3)用于連續(xù)Suzuki反應中。中間體單偶聯(lián)的化合物的分離有利于最終產(chǎn)品純化。為了提高總轉(zhuǎn)化的選擇性，需要使用具有不同鹵素的底物(即X≠X′)。另一途徑可以包括使用為被掩蔽的鹵素的X′基團；例如芳基氨基可以通過重氮化作用然后被鹵素代替而轉(zhuǎn)化成鹵素。如前所述，用于偶聯(lián)反應的催化劑主要為Pd(0)或Pd(2)基。同樣，如果需要，可以在最后步驟去除羧酸酯保護基團產(chǎn)生式1-F和式2-F的終產(chǎn)物。
式1-G和式2-G的吡啶化合物(路線G)可以用類似于式1-F和式2-F(路線F)的區(qū)域異構(gòu)體的合成方式制備。
路線G制備式1-G和式2-G(路線G)的吡啶3，5-異構(gòu)體的方法能夠用于式1-H和式2-H(路線H)的2，6-異構(gòu)體。如前所述，取決于怎樣更方便，兩個偶聯(lián)反應能以任何順序進行。
路線H在某些優(yōu)選實施方式中，可以使用本領(lǐng)域任何方法將本發(fā)明化合物拆分成光學純組合物或合成為光學純組合物。通過實例的方式，本發(fā)明的化合物可以如下拆分通過對映體混合物的直接結(jié)晶，通過對映體的非對映體鹽的形成，通過非對映體的形成和分離，或者通過外消旋混合物的酶拆分。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認識到的一樣，這些和其它反應方法可以用于制備本發(fā)明的化合物。對上述路線和方法的各種改變對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是很顯然的，本發(fā)明并不限于通過特定方法制備本發(fā)明的化合物。
C、本發(fā)明的方法本發(fā)明的另一方面提供了用于抑制可能與無義突變相關(guān)的翻譯提前終止的方法，以及用于預防或治療疾病的方法。在優(yōu)選實施方式中，所述疾病與mRNA突變特別是無義突變相關(guān)。示例性的疾病包括但不限于癌癥、溶酶體貯積癥、肌營養(yǎng)不良、囊性纖維化癥、血友病、大皰性表皮松解癥以及典型的晚嬰兒型神經(jīng)元蠟樣質(zhì)脂褐素沉積病。在該實施方式中，提供了用于治療癌癥、溶酶體貯積癥、肌營養(yǎng)不良、囊性纖維化癥、血友病、或典型的晚嬰兒型神經(jīng)元蠟樣質(zhì)脂褐素沉積病的方法，該方法包括對有此需要的患者給藥治療有效量的至少一種本發(fā)明的化合物。
在一種實施方式中，本發(fā)明涉及用于增加一種或多種特異性、功能性蛋白表達的方法。本發(fā)明的任何化合物能用于特異性地增加功能性蛋白的表達。在另一種實施方式中，當翻譯提前終止通過對有此需要的患者給藥治療有效量的至少一種本發(fā)明的化合物而被抑制時，發(fā)生了功能性蛋白表達的特異性增加。在優(yōu)選實施方式中翻譯提前終止與mRNA中的無義突變相關(guān)。在另一種實施方式中，當mRNA衰變(decay)在患者中減少時，發(fā)生了功能性蛋白表達的特異性增加。在優(yōu)選實施方式中，患者異常由突變介導的mRNA衰變引起。在特別優(yōu)選的實施方式中，突變介導的mRNA衰變?yōu)闊o義突變的結(jié)果。本發(fā)明的方法不限于任何特殊的理論。
本發(fā)明包括治療和預防患者可通過抑制翻譯提前終止、無義介導的mRNA衰變，或翻譯提前終止和無義介導的mRNA衰變而改善的疾病或病癥的方法，所述方法包括向需要這類治療或預防的患者給藥治療有效量的本發(fā)明化合物。
在一種實施方式中，本發(fā)明包括治療或預防與呈現(xiàn)翻譯提前終止、無義介導的mRNA衰變，或翻譯提前終止和無義介導的mRNA衰變的基因相關(guān)的任何疾病。在一種實施方式中，所述疾病部分地歸因于由提前終止密碼子引起的基因表達的缺乏或降低?？赡艹尸F(xiàn)翻譯提前終止和/或無義介導的mRNA衰變的基因以及與翻譯提前終止和/或無義介導的mRNA衰變相關(guān)的疾病的具體實例見2002年6月21日提交的美國臨時專利申請60/390747，題目為“Methods For Identifying Small Molecules ThatModulate Premature Translation Termination And Nonsense Mediated mRNA Decay”；以及于2003年6月23日提交的國際申請PCT/US03/19760。這兩篇一并完整引入作為參考。
可以通過抑制翻譯提前終止、無義介導的mRNA衰變，或翻譯提前終止和無義介導的mRNA衰變而改善的疾病包括但不限于遺傳疾病、軀體疾病(somaticdiseases)、癌癥、自身免疫性疾病、血液病、膠原疾病、糖尿病、神經(jīng)退化疾病、增殖疾病(proliferative diseases)、心血管病、肺病、炎癥性疾病或中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
在一種實施方式中，要通過對有此需要的患者給藥治療有效量的本發(fā)明的化合物進行治療或預防的疾病包括但不限于淀粉樣變性病、血友病、阿爾茨海默病、家族黑蒙性癡呆、尼曼匹克癥、動脈粥樣硬化、巨人癥、侏儒癥、甲狀腺機能減退、甲狀腺機能亢進、衰老癥、肥胖癥、帕金森癥、囊性纖維化癥、肌營養(yǎng)不良、心臟病、腎結(jié)石、共濟失調(diào)性毛細血管擴張癥、家族性高膽固醇血癥、視網(wǎng)膜色素變性、杜興肌營養(yǎng)不良、大皰性表皮松解癥和馬凡氏綜合癥。在一種實施方式中，所述疾病與無義突變相關(guān)。
在一種實施方式中，本發(fā)明所述化合物可用于治療或預防自身免疫疾病。在一種實施方式中，所述自身免疫疾病與無義突變相關(guān)。在優(yōu)選實施方式中，所述自身免疫性疾病為類風濕性關(guān)節(jié)炎或移植物抗宿主病。
在另一種實施方式中，本發(fā)明所述化合物可用于治療或預防血液病。在一種實施方式中，所述血液病與無義突變相關(guān)。在優(yōu)選實施方式中，所述血液病為血友病、馮·維勒布蘭德病、共濟失調(diào)性毛細血管擴張癥、β地中海貧血癥或腎結(jié)石。
在另一種實施方式中，本發(fā)明所述化合物可用于治療或預防膠原疾病。在一種實施方式中，所述膠原疾病與無義突變相關(guān)。在優(yōu)選實施方式中，所述膠原疾病為成骨不全癥或硬化。
在另一種實施方式中，本發(fā)明所述化合物可用于治療或預防糖尿病。在一種實施方式中，所述糖尿病與無義突變相關(guān)。
在另一種實施方式中，本發(fā)明所述化合物可用于治療或預防炎癥性疾病。在一種實施方式中，所述炎癥性疾病與無義突變相關(guān)。在優(yōu)選實施方式中，所述炎癥性疾病為關(guān)節(jié)炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎。
在另一種實施方式中，本發(fā)明所述化合物可用于治療或預防中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。在一種實施方式中，所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病與無義突變相關(guān)。在一種實施方式中，所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病為神經(jīng)退化疾病。在優(yōu)選實施方式中，所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病為多發(fā)性硬化、肌營養(yǎng)不良、杜興肌營養(yǎng)不良、阿爾茨海默病、家族黑蒙性癡呆、尼曼匹克癥、晚嬰兒型神經(jīng)元蠟樣質(zhì)脂褐素沉積病(LINCL)或帕金森癥。
在另一種實施方式中，本發(fā)明所述化合物可用于治療或預防癌癥，特別是人類癌癥。在優(yōu)選實施方式中，所述癌癥為頭和頸、眼、皮膚、口、咽喉、食管、胸、骨、血、肺、結(jié)腸、乙狀結(jié)腸、直腸、胃、前列腺、乳房、卵巢、腎、肝、胰腺、腦、腸、心臟或腎上腺的癌癥。在一種實施方式中，所述癌癥為實體瘤。在一種實施方式中，所述癌癥與無義突變相關(guān)。在另一種實施方式中，所述癌癥與遺傳的無義突變相關(guān)。在另一種實施方式中，所述癌癥與體細胞突變相關(guān)。不受任何理論的限制，本發(fā)明的化合物的抗癌用途可能與其抗p53基因突變的作用有關(guān)。
在一種實施方式中，所述癌癥不是血液癌。在另一種實施方式中，所述癌癥不是白血病。在另一種實施方式中，所述癌癥不是多發(fā)性骨髓瘤。在另一種實施方式中，所述癌癥不是白血病。在另一種實施方式中，所述癌癥不是前列腺癌。
在另一種優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明所述化合物可用于治療或預防與腫瘤抑制基因變異有關(guān)的癌癥。這種基因包括但不限于PTEN、BRCA1、BRCA2、Rb和p53基因。在一種實施方式中，所述突變?yōu)檫z傳突變。在另一種實施方式中，所述突變?yōu)轶w細胞突變。本發(fā)明的方法可特別用于治療或預防與腫瘤抑制基因中的無義突變相關(guān)的癌癥。在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的方法可特別用于治療或預防與p53基因相關(guān)的歸因于p53在細胞凋亡中的作用的癌癥。不受任何理論的限制，認為通過用有效量的本發(fā)明化合物接觸細胞導致無義突變的抑制，又允許全長p53的產(chǎn)生，從而能誘導細胞凋亡。無義突變已經(jīng)在p53基因中鑒定，并且與癌癥相關(guān)。p53基因中的幾個無義突變已經(jīng)被鑒定出來(參見例如Masuda等，2000，Tokai J Exp Clin Med.25(2)69-77；Oh等，2000，Mol Cells 10(3)275-80；Li等，2000，Lab Invest.80(4)493-9；Yang等，1999，Zhonghua Zhong Liu Za Zhi 21(2)114-8；Finkelstein等，1998，Mol Diagn.3(1)37-41；Kajiyama等，1998，Dis Esophagus.11(4)279-83；Kawamura等，1999，LeukRes.23(2)115-26；Radig等，1998，Hum Pathol.29(11)1310-6；Schuyer等，1998，Int JCancer 76(3)299-303；Wang-Gohrke等，1998，Oncol Rep.5(1)65-8；Fulop等，1998，JReprod Med.43(2)119-27；Ninomiya等，1997，J Dermatol Sci.14(3)173-8；Hsieh等，1996，Cancer Lett.100(1-2)107-13；Rall等，1996，Pancreas.12(1)10-7；Fukutomi等，1995，Nippon Rinsho.53(11)2764-8；Frebourg等，1995，Am J Hum Genet.56(3)608-15；Dove等，1995，Cancer Surv.25335-55；Adamson等，1995，Br J Haematol.89(1)61-6；Grayson等，1994，Am J Pediatr Hematol Oncol.16(4)341-7；Lepelley等，1994，Leukemia.8(8)1342-9；McIntyre等，1994，J Clin Oncol.12(5)925-30；Horio等，1994，Oncogene.9(4)1231-5；Nakamura等，1992，Jpn J Cancer Res.83(12)1293-8；Davidoff等，1992，Oncogene.7(1)127-33以及Ishioka等，1991，Biochem Biophys Res Commun.177(3)901-6；其公開全文并入此處作為參考)。與p53基因相關(guān)的編碼翻譯提前密碼子的任何疾病，包括但不限于上述引用參考文獻中所述的無義突變，均能通過本發(fā)明化合物得到治療或預防。
在其它的實施方式中，要通過對有此需要的患者給藥有效量的本發(fā)明化合物進行治療或預防的疾病包括但不限于實體瘤諸如肉瘤、癌、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管源性癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、維爾姆斯瘤、子宮頸癌、睪丸瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、卡波西肉瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、黑素瘤、成神經(jīng)細胞瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、血液產(chǎn)生的腫瘤或多發(fā)性骨髓瘤。
在另一種實施方式中，要通過對有此需要的患者給藥有效量的本發(fā)明的化合物進行治療或預防的疾病包括但不限于血液產(chǎn)生的腫瘤，如急性成淋巴細胞性白血病、急性B淋巴細胞白血病、急性T淋巴細胞白血病、急性原粒細胞白血病、急性早幼粒細胞白血病、急性單核細胞性白血病、急性紅白血病、急性成巨核細胞白血病、急性髓單核細胞白血病、急性非淋巴細胞白血病、急性未分化型白血病、慢性髓細胞性白血病、慢性淋巴細胞白血病、毛細胞白血病或多發(fā)性骨髓瘤。參見例如，Harrison′s Principles of Internal Medicine，Eugene Braunwald等，eds.，pp.491-762(15thed.2001)。
在另一種實施方式中，本發(fā)明包括對患有實體瘤和血液腫瘤的人類的治療。
在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明包括一種治療或預防可通過調(diào)節(jié)翻譯提前終止、無義介導的mRNA衰變，或翻譯提前終止和無義介導的mRNA衰變而改善的疾病，或改善一種或多種與之相關(guān)的癥狀的方法，該方法包括使細胞與治療有效量的本發(fā)明化合物接觸。包括在本發(fā)明方法中的細胞包括動物細胞、哺乳動物細胞、細菌細胞以及病毒感染的細胞。在一種實施方式中，所述無義突變?yōu)檫z傳突變(即在祖DNA(progenitor DNA)中存在無義密碼子)。在另一種實施方式中，所述無義密碼突變?yōu)轶w細胞突變(即所述無義密碼子自發(fā)或通過誘變產(chǎn)生)。
在一些實施方式中，本發(fā)明化合物作為對抗與翻譯提前終止、無義介導的mRNA衰變，或翻譯提前終止和無義介導的mRNA衰變相關(guān)的疾病的預防措施向?qū)ο蠼o藥，所述對象包括但不限于植物、爬行動物、鳥類、兩棲動物或優(yōu)選哺乳動物更優(yōu)選人類。
在優(yōu)選的實施方式中，首先確定患者患有與翻譯提前終止和/或無義介導的mRNA衰變相關(guān)的疾病。在另一種實施方式中，患者經(jīng)過篩選過程以確定存在無義突變，所述篩選過程包括通過可接受無義突變篩選測定，篩選對象或從所述對象中提取的細胞的步驟。在優(yōu)選實施方式中，所述患者的DNA能通過測定其序列或進行DNA印跡(Southern Blot)、聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)、應用短串聯(lián)重復(short tandem repeat，STR)或限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析，以確定是否在患者的DNA中存在無義突變。在一種實施方式中，通過與祖DNA對比確定所述無義突變是遺傳突變還是體細胞突變。選擇性地，能通過蛋白質(zhì)印跡或其他免疫測定法，測定患者表達的無義突變蛋白水平是否變化來確定所述無義突變是遺傳突變還是體細胞突變。在另一種實施方式中，所述患者為在子宮中接受無義突變存在篩選的未出生的孩子。本發(fā)明的化合物既可以在出生前也可以在出生后給藥。在相關(guān)的實施方式中，所述治療個人化，其中篩選患者進行無義突變篩選測定，并通過給藥本發(fā)明化合物治療；特別地，可以用例如依照疾病類型、細胞類型以及有問題的基因而定的特別適于所述的突變的化合物治療所述患者。這種方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。
在另一種實施方式中，用例如如上所述的方法(即細胞的DNA能通過測定其序列或進行DNA印跡、聚合酶鏈式反應(PCR)、應用短串聯(lián)重復(STR)或限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)，以確定是否在患者的DNA中存在無義突變；細胞的RNA可以通過定量實時PCR以測定轉(zhuǎn)錄豐度)篩選出翻譯提前終止和/或無義介導的mRNA衰變的細胞(例如動物細胞、哺乳動物細胞、細菌細胞、植物細胞以及病毒感染的細胞)。
本發(fā)明的具體方法還包括給藥另外的治療劑(即不同于本發(fā)明化合物的治療劑)。在本發(fā)明的特定實施方式中，本發(fā)明的化合物可以與至少一種其他治療劑結(jié)合使用。治療劑包括但不限于非阿片類鎮(zhèn)痛藥、非甾體抗炎劑、甾類化合物、止吐劑、β-腎上腺素能阻滯劑、抗驚厥劑、抗抑郁藥、Ca2+通道阻滯劑、抗癌劑及抗生素以及它們的混合物。
在特定實施方式中，本發(fā)明的化合物可以與抗癌劑聯(lián)合給藥或配制。合適的抗癌劑包括但不限于烷化劑、氮芥、葉酸拮抗劑(folate antagonists)、嘌呤拮抗劑、嘧啶拮抗劑、紡錘體抑制劑、拓撲異構(gòu)酶抑制劑、細胞凋亡誘導劑、血管生成抑制劑、鬼臼毒素、亞硝基脲、順鉑、卡鉑、干擾素、天冬酰胺酶(asparginase)、他莫昔芬、亮丙瑞林、氟他米特、甲地孕酮、絲裂霉素、博來霉素、阿霉素、依立替康和紫杉酚。
在特定實施方式中，本發(fā)明的化合物可以與抗生素聯(lián)合給藥或配制。在特定實施方式中，所述抗生素為氨基糖苷(例如妥布霉素)、頭孢菌素(例如頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢呋新、頭孢丙烯、頭孢克洛、頭孢克肟或頭孢羥氨芐)、克拉霉素(例如克拉霉素)、大環(huán)內(nèi)酯(例如紅霉素)、青霉素(例如青霉素V)或喹諾酮(例如氧氟沙星、環(huán)丙沙星或諾氟沙星)。在優(yōu)選實施方式中，所述抗生素具有抗綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)活性。
不受理論限制，認為本發(fā)明的方法通過抑制無義突變的聯(lián)合機制起作用。在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明方法包括給藥治療有效量的至少一種本發(fā)明的化合物例如式1所示的化合物。本發(fā)明化合物的相對活性可以通過本領(lǐng)域公知的任何方法測定，包括這里實施例2描述的測定。
本發(fā)明的化合物可以用體外熒光素酶無義突變抑制測定表征。熒光素酶測定包括在本發(fā)明的方法中。熒光素酶可以用作功能報道基因測定(只有蛋白有功能才產(chǎn)生光)，并且熒光素酶極端靈敏(光密度在nM范圍與熒光素酶濃度成比例)。在一種實施方式中，本發(fā)明的測定為基于細胞的熒光素酶報道測定。在優(yōu)選基于細胞的熒光素酶報道測定中，含有提前終止密碼子(UGA、UAA或UAG)的熒光素酶報道構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入293人胚腎細胞中。
在本發(fā)明的另一個測定中，優(yōu)選的測定為由兔網(wǎng)織紅細胞溶胞產(chǎn)物和含有無義密碼子的熒光素酶報道m(xù)RNA組成的生物化學測定。在本發(fā)明的另一個測定中，所述測定為由制備并優(yōu)化的細胞提取物組成的生物化學測定(Lie & Macdonald，1999，Development 126(22)4989-4996以及Lie & Macdonald，2000，Biochem.Biophys.Res.Commun.270(2)473-481)。在生物化學測定中，含有提前終止密碼子(UGA、UAA或UAG)的mRNA在體外翻譯反應中用作報道基因，使用補加有tRNA、氯高鐵原卟啉(hemin)、肌酸激酶、氨基酸、KOAc、Mg(OAc)2以及磷酸肌酸的兔網(wǎng)織紅細胞溶胞產(chǎn)物。mRNA的翻譯在病毒來源的前導序列中起始，因為不需要加帽的RNA，因此顯著降低了測定的成本。使用T7啟動子和MegaScript體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ambion，Inc.；Austin，Texas)在體外制備合成mRNA。在本發(fā)明的測定中，添加已知的允許連讀提前終止密碼子的氨基糖苷慶大霉素導致增強的熒光素酶活性，并能用作內(nèi)標。本發(fā)明的測定用于高通量篩選中。成百上千的化合物能夠在本發(fā)明基于細胞的生物化學測定中篩選。在優(yōu)選的方面，基于細胞的功能性測定與所述的測定類似。
本發(fā)明的化合物包括能提高特異性功能蛋白從包括提前終止密碼子的mRNA分子表達的化合物。在一種實施方式中，本發(fā)明的化合物能優(yōu)選抑制翻譯提前終止。例如，如果突變產(chǎn)生UAA，則本發(fā)明的化合物能抑制該無義突變；但是如果突變產(chǎn)生UAG，則本發(fā)明的化合物不能抑制該無義突變。能發(fā)生的另一種非限定性的實例是，如果突變產(chǎn)生UAA并且在框內(nèi)+1位置繼之以胞嘧啶，則本發(fā)明的化合物能抑制該無義突變，但是如果突變產(chǎn)生UAA并且在框內(nèi)+1位置繼之以腺嘌呤，則本發(fā)明的化合物不能抑制該無義突變。
帶有含UGA無義密碼子熒光素酶基因的穩(wěn)定細胞系可以用待測化合物處理。在此方面，細胞可以生長在補加有1％青霉素-鏈霉素(P/S)和10％胎牛血清的標準培養(yǎng)基中至70％鋪滿，并在處理前一天1∶1拆分。第二天，胰蛋白酶化細胞，并且在96孔組織培養(yǎng)皿的每一孔中加入40,000個細胞。制備每種化合物的系列稀釋液，以產(chǎn)生跨越2個對數(shù)(30μM至0.3μM)的六個點的劑量響應曲線。二甲亞砜溶劑的終濃度保持恒定于每孔1％。用1％二甲亞砜處理后的細胞作為本底標準(backgroundstandard)，并且用慶大霉素處理后的細胞作為陽性對照。
為闡述特定遺傳疾病中改變的mRNA上的無義抑制化合物(nonsense-suppressingcompound)的效果，可用本發(fā)明的化合物處理在1282氨基酸處(W 1282X)帶有無義密碼子的支氣管上皮細胞系，并且用硫丙基喹啉(sulfopropylquinolinium，SPQ)測定監(jiān)測作為cAMP激活的氯化物通道的囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)因子的功能(Yang等，Hum.Mol.Genet.2(8)1253-1261(1993)以及Howard等，Nat.Med.2(4)467-469(1996))。將在用本發(fā)明化合物處理的細胞中SPQ熒光的增加與用cAMP處理的細胞以及未經(jīng)處理細胞的SPQ熒光進行比較。細胞中SPQ熒光的增加與CFTR介導的鹵化物流出的刺激以及無義密碼子連讀的增加一致。全長CFTR從用本發(fā)明化合物處理后的含無義密碼子的等位基因的表達證明，當用本發(fā)明化合物處理時，囊性纖維化細胞系提高了氯化物通道活性。
D、本發(fā)明化合物的代謝產(chǎn)物這里所述的化合物在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物同樣落入本發(fā)明范圍。這種產(chǎn)物可以源于主要歸因于酶促過程的例如所給藥的化合物的氧化、還原、水解、酰胺化、酯化等。因此，本發(fā)明包括通過如下方法產(chǎn)生的化合物，該方法包括使本發(fā)明的化合物與哺乳動物組織或哺乳動物接觸足以產(chǎn)生該化合物的代謝產(chǎn)物的一段時間。這種化合物通常如下鑒定通過制備放射性標記的(例如C14或H3)本發(fā)明化合物，以可測劑量(高于約0.5毫克/千克)向諸如大鼠、小鼠、豚鼠、猴子的哺乳動物或者人給藥，允許發(fā)生新陳代謝的足夠的時間(通常約為30秒至30小時)，并且從尿、血或其他生物學樣品中分離轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。這些產(chǎn)物由于被標記因此很容易分離(通過使用能結(jié)合在代謝產(chǎn)物上留存的表位的抗體分離其它物質(zhì))。所述代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)以常規(guī)的方式鑒定，例如質(zhì)譜(MS)或核磁共振(NMR)分析。一般而言，代謝產(chǎn)物的分析可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的與常規(guī)藥物代謝研究相同的方法完成。所述轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，只要它們不在體內(nèi)存在，即可用于本發(fā)明化合物治療劑量的診斷測定，即使它們本身沒有生物學活性。
E、本發(fā)明的藥物組合物雖然可能以純的本發(fā)明化合物給藥，但是優(yōu)選將化合物配制成藥物組合物。從而，在本發(fā)明另一個方面，提供了用于本發(fā)明方法中的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物可以根據(jù)特定的給藥方式以及劑型，與諸如載體、溶劑、穩(wěn)定劑、佐劑(adjuvant)、稀釋劑等的藥物學可接受的賦形劑—同配制。所述藥物組合物一般應當配制成達到生理適合的pH，根據(jù)劑型以及給藥途徑，范圍可以從pH約3至pH約11，優(yōu)選pH約3至pH約7。在另一種實施方式中，本發(fā)明藥物組合物的pH可以調(diào)節(jié)到pH約4至pH約7的范圍。在可選的實施方式中，優(yōu)選地調(diào)節(jié)pH的范圍為pH約5至pH約8。
更具體地，本發(fā)明的藥物組合物包括治療或預防有效量的至少一種本發(fā)明化合物，以及一種或多種藥物學可接受的賦形劑。任選地，本發(fā)明的藥物組合物可以包括本發(fā)明化合物的組合，或可以包括可用于治療癌癥、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、滲出性黃斑變性的第二活性成分。
例如用于非胃腸道或口服給藥的本發(fā)明的制劑通常多為固體、液體溶液、乳劑或混懸劑，而用于肺給藥的可吸入制劑一般為液體或粉末，一般優(yōu)選粉末制劑。本發(fā)明優(yōu)選的藥物組合物還可以配制成凍干固體制劑，在給藥前用生理學可接受的溶劑復溶。可選的本發(fā)明藥物組合物可以配制成糖漿劑、乳膏、軟膏劑、片劑等。
本發(fā)明的藥物組合物能通過現(xiàn)有技術(shù)公知的任何藥物傳遞途徑向?qū)ο蠼o藥。具體的示例性給藥途徑包括口、眼(ocular)、直腸、頰、局部、鼻、眼(ophthalmic)、皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)(推注和滴注)、腦內(nèi)、經(jīng)皮，以及肺部給藥。
術(shù)語“藥物學可接受的賦形劑”是指用于給藥諸如本發(fā)明化合物的藥物的賦形劑。該術(shù)語指任何可給藥而沒有過度毒性的藥物賦形劑。藥物學可接受的賦形劑部分地由所給藥的具體組合物以及用于給藥該組合物的具體方法決定。因此，本發(fā)明藥物組合物存在廣泛多樣的適合的制劑(參見例如Remington′s PharmaceuticalSciences，18thEd.，Mack Publishing Co.，1990)。
合適的賦形劑可以是包括大型、代謝慢的大分子例如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物以及滅活病毒顆粒的載體分子。其他示例性的賦形劑包括抗氧化劑如抗壞血酸，螯合劑如EDTA，碳水化合物如糊精、羥烷基纖維素、羥烷基甲基纖維素、硬脂酸，液體如油、水、生理鹽水、甘油和乙醇，潤濕或乳化劑，pH緩沖物質(zhì)等。脂質(zhì)體也包括在藥物學可接受的賦形劑的定義內(nèi)。
本發(fā)明藥物組合物可以配制成任何適于所欲給藥方法的形式。當意欲用于口服使用時，可以制備例如片劑、錠劑、糖錠、水混懸劑或油混懸劑、非水溶液、可分散性粉末或顆粒(包括微粉化的顆粒或納米顆粒)、乳劑、硬膠囊或軟膠囊、糖漿劑、或酏劑。意欲口服使用的組合物可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的任何制備藥物組合物的方法制備，并且所述組合物可以含有一種或多種包括甜味劑、調(diào)味劑、著色劑和防腐劑的試劑以提供可口的制劑。
特別適于與片劑結(jié)合使用的藥物學可接受的賦形劑包括例如諸如纖維素、碳酸鈉或碳酸鈣、乳糖、磷酸鈉或磷酸鈣的惰性稀釋劑，諸如交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、交聯(lián)聚維酮、玉米淀粉或褐藻酸的崩解劑，諸如聚維酮、淀粉、明膠或阿拉伯膠的粘合劑，以及諸如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石的潤滑劑。片劑可以不包衣，或者用包括微囊法的公知技術(shù)包衣以延遲在胃腸道中的崩解以及吸收，從而在較長的時期里提供持續(xù)作用。例如可以單獨或與蠟一起使用諸如單硬酯酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯的時間延遲物質(zhì)。
口服使用的制劑還可以為硬明膠膠囊，其中活性成分與例如纖維素、乳糖、磷酸鈣或高嶺土的惰性固體稀釋劑混合，或者為軟明膠膠囊，其中活性成分與例如甘油、丙二醇、聚乙二醇、花生油、液體石蠟或橄欖油的非水或油性介質(zhì)混合。
在另一種實施方式中，本發(fā)明藥物組合物可以配制為混懸劑，所述混懸劑包括與至少一種適于制備混懸劑的藥物學可接受的賦形劑混合的本發(fā)明化合物。在另一種實施方式中，本發(fā)明的藥物組合物可以通過加入適宜的賦形劑配制成適于制備混懸劑的可分散粉末以及顆粒。
適合用于混懸劑的賦形劑包括助懸劑如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、西黃蓍膠、阿拉伯膠，分散劑或濕潤劑如天然存在的磷脂(如卵磷脂)、烯烴氧化物與脂肪酸的縮合產(chǎn)物(如聚氧乙烯硬脂酸酯)、環(huán)氧乙烷與長鏈脂肪族醇的縮合產(chǎn)物(如十七烷乙烯氧基十六醇)、環(huán)氧乙烷與得自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的縮合產(chǎn)物(如聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯)，以及增稠劑如卡波姆、蜂蠟、固體石蠟或鯨蠟醇。所述混懸劑還可以含有一種或多種諸如乙酸、對羥基苯甲酸甲酯和/或?qū)αu基苯甲酸正丙酯的防腐劑，一種或多種著色劑，一種或多種調(diào)味劑以及一種或多種諸如蔗糖或糖精的甜味劑。
本發(fā)明藥物組合物還可以為水包油型乳劑的形式。所述油相可以為例如橄欖油或花生油的植物油，例如液體石蠟的礦物油，或者它們的混合物。適合的乳化劑包括諸如阿拉伯膠或西黃蓍膠的天然存在的膠，諸如大豆卵磷脂的天然存在的磷脂，得自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯例如脫水山梨醇單油酸酯，以及這些偏酯與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物例如聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯。所述乳劑還可以包括甜味劑和調(diào)味劑。糖漿劑和酏劑可以用諸如甘油、山梨醇或蔗糖的甜味劑配制。所述制劑還可以包括緩和劑、防腐劑、調(diào)味劑或著色劑。
此外，本發(fā)明的組合物可以配制成無菌可注射制劑的形式，例如無菌可注射水性乳劑或油狀混懸劑。該乳劑或混懸劑可以根據(jù)已知的現(xiàn)有技術(shù)使用如上所述的合適的分散劑或濕潤劑以及助懸劑配制。所述無菌可注射制劑還可以為無毒的非胃腸道可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或混懸劑，如在1，2-丙二醇中的溶液。所述無菌可注射制劑還可以制備成凍干粉末?？梢允褂玫目山邮茌d體和溶劑中包括水、林格氏液(Ringer′s solution)和等滲氯化鈉溶液。此外，無菌不揮發(fā)油可以用作溶液或混懸劑介質(zhì)。為此目的，可以使用任何溫和不揮發(fā)油，包括合成單酸甘油酯或二酸甘油酯。此外，諸如油酸的脂肪酸同樣可以用于制備可注射制劑。
一般而言，可用于本發(fā)明方法中的本發(fā)明化合物基本上不溶于水，并且在大多數(shù)藥物學可接受的質(zhì)子溶劑以及植物油中微溶。然而，所述化合物通?？扇苡谥墟溨舅?例如辛酸和癸酸)或三酸甘油酯介質(zhì)中，并在中鏈脂肪酸的丙二醇酯中具有高溶解度。本發(fā)明中還考慮了被取代或添加化學或生物化學部分(moiety)而修飾的化合物，所述部分使所述化合物更適合于給藥(例如增加溶解度、生物活性、可口性、減少不良反應等)，例如，通過酯化作用、糖基化作用、聚乙二醇化作用等。
在優(yōu)選實施方式中，在適合于低溶解度化合物的基于脂質(zhì)的制劑中，本發(fā)明所述化合物可以配制成用于口服給藥?；谥|(zhì)的制劑一般能提高這種化合物的口服生物利用度。因此，優(yōu)選的本發(fā)明藥物組合物包括治療或預防有效量的本發(fā)明化合物以及至少一種藥物學可接受的賦形劑，所述藥物學可接受的賦形劑選自中鏈脂肪酸或其丙二醇酯(例如，諸如辛酸和癸酸的可食用脂肪酸的丙二醇酯)、以及諸如聚氧乙烯40氫化蓖麻油的藥物學可接受的表面活性劑。
在可選的優(yōu)選實施方式中，環(huán)糊精可以作為水溶解度增加劑加入。優(yōu)選的環(huán)糊精包括α-、β-和γ-環(huán)糊精的羥丙基、羥乙基、葡萄糖基、麥芽糖基和麥芽三糖基衍生物。特別優(yōu)選的環(huán)糊精水溶解度增加劑為羥丙基β-環(huán)糊精(hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HPBC)，其可以加入上述任何組合物組中，以進一步提高本發(fā)明化合物的水溶解度特性。在一種實施方式中，所述組合物包括0.1％至20％的羥丙基β-環(huán)糊精，更優(yōu)選1％至15％的羥丙基β-環(huán)糊精，甚至更優(yōu)選2.5％至10％的羥丙基β-環(huán)糊精。使用的溶解度增加劑的量將取決于本發(fā)明的化合物在組合物中的量。
這里所用的治療有效量是指本發(fā)明藥物組合物治療、改善或調(diào)節(jié)已鑒定的疾病或病癥、或者顯示出可測的治療或抑制效果的量。所述效果能夠通過例如本發(fā)明的測定法測得。所述效果還可以為預防在個體或高百分率的人群中預測到的疾病或病癥。
用于對象的精確的有效量取決于對象的體重、體型(size)以及健康狀況；病癥的性質(zhì)和程度；選擇給藥的治療或治療的組合、蛋白質(zhì)的半衰期、mRNA的半衰期以及蛋白質(zhì)的定位。給定情況下的治療有效量可以通過臨床醫(yī)生技能和判斷范圍內(nèi)的常規(guī)實驗確定。
對于任何化合物，所述治療有效量最初能夠在例如腫瘤細胞的細胞培養(yǎng)測定中評估，或者在通常為大鼠、小鼠、兔、犬或豬的動物模型中評估。所述動物模型還可以用于測定合適的濃度范圍和給藥途徑。然后上述信息能被用于測定人類中的有效劑量和給藥途徑。治療/預防的有效性和毒性可以通過標準藥學方法在細胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游镏袦y定，例如ED50(在50％群體中治療有效的劑量)和LD50(在50％群體中致死的劑量)。毒性和治療效果的劑量比為治療指數(shù)，并且可以表達為比例LD50/ED50。優(yōu)選顯示出治療指數(shù)大的藥物組合物。得自細胞培養(yǎng)測定以及動物研究的數(shù)據(jù)可以用于計算用于人類的劑量范圍。在這種組合物中含有的劑量優(yōu)選為在包括低毒或無毒ED50的循環(huán)濃度的范圍內(nèi)。所述劑量可以根據(jù)所用劑型、患者敏感度以及給藥途徑在此范圍內(nèi)變化。
更具體地，觀察到的與本發(fā)明化合物有關(guān)的濃度-生物學作用關(guān)系表明初始的靶血漿濃度的范圍為從約5微克/毫升至約100微克/毫升，優(yōu)選為從約10微克/毫升至約50微克/毫升，更優(yōu)選為約10微克/毫升至約25微克/毫升。為了達到上述血漿濃度，根據(jù)給藥途徑，本發(fā)明化合物以從1毫克/千克至150毫克/千克的變化劑量給藥。文獻中提供了關(guān)于具體給藥劑量和給藥方法的指導，并且所述文獻為本領(lǐng)域從業(yè)者普遍可得。一般而言，所述劑量范圍為約1毫克/天至約10克/天，或者為約0.1克/天至約3克/天，或者為約0.3克/天至約3克/天，或者為約0.5克/天至約2克/天，以單次劑量、分份劑量或連續(xù)劑量向體重約40至約100千克的患者給藥(其中劑量可以為高于或低于此體重范圍的患者，特別是低于40千克的兒童進行調(diào)整)。
然而，本發(fā)明特定活性成分在處理急性或慢性疾病或病癥中的預防或治療劑量的大小將隨疾病或病癥的性質(zhì)和嚴重程度，以及活性成分的給藥途徑而變化。所述劑量以及可能的劑量頻率也將根據(jù)個體患者的年齡、體重和反應而變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地根據(jù)對上述因素適當考慮，而選擇出合適的劑量方案。一般而言，對于這里所述的病癥，推薦的每日劑量在每天約1毫克/千克至約150毫克/千克范圍內(nèi)。在一種實施方式中，本發(fā)明的化合物作為一天一次的單次劑量給予。在另一種實施方式中，本發(fā)明的化合物作為一天中的分劑量給予。更具體地，以單次劑量或相等的分劑量給予每日劑量。優(yōu)選地，每日劑量范圍應該為每天約5毫克/千克到約100毫克/千克，更優(yōu)選地，為每天約10毫克/千克到約90毫克/千克，甚至更優(yōu)選為每天20毫克/千克到60毫克/千克。在對患者進行處理中，所述治療應該以較低劑量開始，可能約200毫克至約300毫克，根據(jù)患者的整體反應情況，如果必要作為單次劑量或分劑量增加至最多每天約600毫克至約4000毫克。對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見，在某些情況下，可能必需使用超出這里公開的范圍的活性成分劑量。此外，值得注意的是臨床醫(yī)師或治療內(nèi)科醫(yī)師將了解如何以及何時結(jié)合個體患者的反應而中斷、調(diào)整或終止治療。
這里所用的詞組“治療有效量”、“預防有效量”和“治療或預防有效量”包括上述劑量和劑量頻率表。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員很容易了解不同的治療有效量可以用于不同的疾病和病癥。類似地，足以治療或預防所述疾病，但是不足以引起或足以減少伴隨常規(guī)治療的不利效果的量也包括在上述劑量的量和劑量頻率表中。
精確劑量將由醫(yī)師根據(jù)與要求治療的對象相關(guān)的因素確定。調(diào)節(jié)劑量和給藥以提供足夠水平的活性物質(zhì)或保持所需的效果。需要考慮的因素包括疾病狀態(tài)的嚴重程度、對象的全身健康狀態(tài)、對象的年齡、體重以及性別、飲食、時間、所述蛋白的半衰期、所述RNA的半衰期、給藥的頻率、藥物組合、反應敏感性以及對治療的耐受/反應。長效藥物組合物可以根據(jù)具體制劑的半衰期和清除率每3至4天、每周或每兩周給藥一次。
F、聯(lián)合療法任何本發(fā)明的化合物均可與一種或多種可用于治療這里所述的與mRNA無義突變相關(guān)的疾病的其它活性成分聯(lián)合，包括用于同時或連續(xù)向需要治療的患者給藥的單一劑型、或單獨的劑型中的化合物。當連續(xù)給藥時，所述藥物聯(lián)合可能給藥兩次或者更多次。在可選實施方式中，本發(fā)明的一種或多種化合物以及一種或多種另外的活性成分可能以不同途徑給藥。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到可能起到增強或協(xié)同增強本發(fā)明化合物的抑制無義突變活性的各種活性成分均可與本發(fā)明化合物聯(lián)合給藥。
根據(jù)本發(fā)明的方法，活性成分的組合可以是(1)共同配制并且給藥，或在組合制劑中同時給藥；(2)作為單獨制劑交替給藥或平行給藥；或(3)本領(lǐng)域公知的任何其它組合治療方案。當在交替治療中給藥時，本發(fā)明所述方法可以包括連續(xù)給予或遞送活性成分，例如在單獨的溶液、乳劑、混懸劑、片劑、丸劑或膠囊劑中，或者通過單獨的注射器進行不同的注射。一般而言，在交替治療中，連續(xù)地，即順次地給藥每種活性成分的有效劑量，而在同時治療中，一起給藥兩種或更多種活性成分的有效劑量。也可以使用各種順序的間隔組合治療。
G、基因治療本發(fā)明的化合物或其它無義化合物(nonsense compound)能與基因治療聯(lián)合應用。在此實施方式中，基因可以被引入或提供給在所需基因中含有特定無義突變的哺乳動物，優(yōu)選人類。在優(yōu)選方面，所需基因選自由IGF1、EPO、p53、p19ARF、p21、PTEN、EI24和ApoAI組成的組中。當全長多肽是所需的多肽時，為了在患者或哺乳動物中得到該多肽的表達，向所述患者或哺乳動物提供有效量的本發(fā)明化合物或其它無義化合物。
主要有兩種途徑使含有無義突變的核苷酸(任選地包含于載體中)進入患者的細胞中體內(nèi)和先體外后體內(nèi)。對于體內(nèi)給藥，如果已知，通常在需要所述多肽的位點，即該多肽的合成位點，以及需要所述多肽的生物學活性的位點(例如實體瘤)直接將核苷酸注射給患者。對于先體外后體內(nèi)治療，移出患者細胞，將核苷酸引入所述分離的細胞，并將修飾的細胞直接給予患者，或者例如包被在多孔膜中植入患者(參見例如第4892538和5283187號美國專利)。有多種技術(shù)可供將核苷酸引入活細胞。所述技術(shù)根據(jù)核苷酸是轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的細胞，或是在體內(nèi)轉(zhuǎn)入預期宿主的細胞內(nèi)而不同。適合于體外轉(zhuǎn)移核苷酸進入哺乳動物細胞的技術(shù)包括應用脂質(zhì)體、電致孔、顯微注射、轉(zhuǎn)導、細胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸鈣沉淀法等。轉(zhuǎn)導包括復制缺陷重組病毒(優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄病毒)顆粒與細胞報道基因的結(jié)合，然后將含在所述顆粒中的核苷酸引入細胞。通常用于基因先體外后體內(nèi)傳遞的載體為逆轉(zhuǎn)錄病毒。
現(xiàn)有的優(yōu)選的體內(nèi)核及轉(zhuǎn)導技術(shù)包括用病毒或非病毒載體(例如腺病毒、慢病毒、單純皰疹I(lǐng)型病毒或腺病毒相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV))以及基于脂質(zhì)的系統(tǒng)(可用于脂質(zhì)介導的基因轉(zhuǎn)移的脂質(zhì)為例如DOTMA、DOPE和DC-Chol；參見例如，Tonkinson等，Cancer Investigation，14(1)54-65(1996))的轉(zhuǎn)染。用于基因治療最優(yōu)選的載體為病毒，最優(yōu)選腺病毒、AAV、慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒。例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的病毒載體包括至少一個轉(zhuǎn)錄啟動子/增強子或基因座定義元件(locus-defining element)，或者通過諸如交替剪接、核RNA導出、或者翻譯后修飾信使的另外方式來控制基因表達的其它元件。此外，諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的病毒載體包括核酸序列，當轉(zhuǎn)錄編碼多肽的基因時，該核酸序列可操作地連接于所述編碼序列，并起翻譯起始序列作用。這種載體構(gòu)建體還包括包裝信號，長末端重復(longterminal repeats，LTRs)或其部分，以及適合于所用病毒的正義鏈和反義鏈引物結(jié)合位點(如果這些沒有存在于病毒載體中)。此外，這種載體通常包括用于從多肽所在的宿主細胞中分泌該多肽的信號序列。優(yōu)選所述用于此目的的信號序列為哺乳動物信號序列，更優(yōu)選為該多肽的天然(native)信號序列。任選地，所述載體構(gòu)建體還可以包括指導多腺苷酸化的信號，以及一種或多種限制位點和翻譯終止序列。舉例而言，這種載體通常包括5’LTR、tRNA結(jié)合位點、包裝信號、第二鏈DNA合成起始點，以及3’LTR或其部分?？梢允褂玫钠渌d體為非病毒載體，例如陽離子脂質(zhì)、聚賴氨酸和樹枝狀大分子。
在某些情況下，需要向核酸源提供靶向靶細胞的物質(zhì)，如特異性細胞表面膜蛋白或靶細胞的抗體、靶細胞上受體配基等。在使用脂質(zhì)體時，結(jié)合細胞表面膜蛋白的與內(nèi)吞作用相關(guān)的蛋白可以用來靶向和/或促進攝取，例如趨向于特定細胞類型的殼體蛋白或其片段，在循環(huán)中經(jīng)受細胞內(nèi)攝作用的蛋白的抗體，以及靶向細胞內(nèi)定位并提高細胞內(nèi)半衰期的蛋白。受體介導(recpto-mediated)的內(nèi)吞作用技術(shù)記載于例如Wu等，J.Biol.Chem.2624429-4432(1987)和Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，873410-3414(1990)。為了回顧現(xiàn)有已知的基因標記和基因治療方案，參見Anderson等，Science 256808-813(1992)，還參見WO 93/25673，以及其中引用的文獻。
適合的基因治療以及制備逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒和結(jié)構(gòu)蛋白的方法可見例如US5,681,746、US 6,800,604和US 6,800,731。
提供以下實施例以輔助理解本發(fā)明。關(guān)于本發(fā)明的實驗當然不應當解釋為對本發(fā)明的具體限定，并且在本領(lǐng)域技術(shù)人員眼界中的現(xiàn)在已知或者以后發(fā)展出的本發(fā)明的變化都落入這里所述以及在下文中要求保護的本發(fā)明的范圍中。
實施例參照下面的非限定性實施例來更詳細地描述本發(fā)明，這些實施例用于更充分地說明本發(fā)明，而不應被認為是限定本發(fā)明的范圍。這些實施例闡述了本發(fā)明某些化合物的制備，這些化合物的體內(nèi)和/或體外測試。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解這些實施例所述的技術(shù)代表本發(fā)明人描述的能用于很好地實施本發(fā)明的技術(shù)，因此構(gòu)成實施本發(fā)明的優(yōu)選模式。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應當理解的是，根據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容，對于公開的具體方法可以做出改變，并且仍可獲得類似的結(jié)果，而不背離本發(fā)明的精神和范圍。
實施例1本發(fā)明化合物的制備A3，5-三嗪的制備式1-A和2-A的三嗪一般可以根據(jù)路線A制備如下。
3-(4-p-甲苯基-[1，3，5]三嗪-2-基)苯甲酸(化合物43)的制備步驟A向10毫升微波管中加入4-甲基苯甲酰胺(0.99g、7.32mmol)和N，N-二甲基甲酰胺二甲基乙縮醛(2.23g、18.67mmol)。將所述微波管在250psi、300W下加熱到150℃10分鐘。通過加入醚/己烷(1∶1)沉淀出白色固體。通過過濾并用己烷洗滌收集所需產(chǎn)物(1.26g、91％產(chǎn)率)。通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)測定，所得化合物N-二甲基氨基亞甲基-4-甲基-苯甲酰胺純度＞90％，MS(ES+)m/e191.17。
步驟B向二氯甲烷(15mL)中叔丁醇(3.50g，47.22mmol)、吡啶(3.72g，46.78mmol)以及催化劑DMAP的混合物中在0℃下逐滴加入二氯甲烷(10mL)中的3-氰基苯甲酰氯(6.81g，41.07mmol)和吡啶(3mL)。所得混合物在室溫下攪拌20小時。蒸發(fā)溶劑，用快速分離色譜(1∶1二氯甲烷/己烷)純化殘留物得到白色固體3-氰基-苯甲酸叔丁基酯(6.84g，82.1％產(chǎn)率)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.24(1H，s)，8.20(1H，dd，J＝7.9，1.2Hz)，7.78(1H，dd，J＝6.7，1.1Hz)，7.52(1H，m)，1.58(9H，s)。
步驟C在氮氣保護下，向3-氰基-苯甲酸叔丁基酯(6.54g，31.98mmol)的15毫升四氫呋喃(無水)溶液中加入六甲基二硅氮烷鋰(8.65g，51.17mmol，1.0M四氫呋喃中)。在室溫下攪拌溶液3小時，直到起始物質(zhì)耗盡(TLC監(jiān)測)。反應混合物倒入硅膠(80g)的四氫呋喃(120mL)漿狀物中，并攪拌5分鐘，然后過濾硅膠。用四氫呋喃/甲醇(2∶1)進一步洗滌濾餅。在真空中蒸發(fā)濾液并結(jié)晶殘留物產(chǎn)生所需產(chǎn)品，3-甲脒基(carbamimidoyl)-苯甲酸叔丁基酯(5.80g，82.5％產(chǎn)率)。LC-MS測得所得化合物純度＞90％。MS(ES+)m/e 212.20。
步驟D將N-二甲基氨基亞甲基-4-甲基-苯甲酰胺(221.9mg，1.15mmol)和3-甲脒基-苯甲酸叔丁基酯(196.0mg，0.89mmol)的混合物在無水乙酸中(8mL)在150W、250psi下于微波反應器中加熱至115℃30分鐘，直到用TLC測定全部起始物質(zhì)耗盡。通過加入1N HCl沉淀白色固體，并通過過濾收集，然后用水和己烷洗滌。所得固體用快速柱色譜純化，用甲醇/二氯甲烷(1∶20)洗脫得到目標產(chǎn)物(23.1mg，5.3％產(chǎn)率)，熔點298-300℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.40(1H，s)，8.63(2H，d，J＝8.3Hz)，8.48(2H，d，J＝8.0Hz)，8.13(2H，d，J＝8.0Hz)，7.41(2H，m)，2.41(3H，s)。MS(ES+)m/e 292.30。
上述實施例A中的方法可以用于制備下列本發(fā)明的化合物化合物443-[4-(4-氟-苯基)-[1，3，5]三嗪-2-基]-苯甲酸熔點266-269℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.43(1H，s)，9.08(1H，s)，8.77(1H，dd，J＝6.1，0.9Hz)，8.62(2H，m)，8.20(1H，dd，J＝6.2，1.0Hz)，7.74(1H，m)，7.43(2H，m)。MS(ES+)m/e 297.25(20)，296.28(100)。MS(ES-)m/e 295.24(20)，294.26(100)。
化合物453-[4-(4-乙氧基-苯基)-[1，3，5]三嗪-2-基]-苯甲酸熔點269-272℃。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.33(1H，s)，9.09(1H，s)，8.74(1H，dd，J＝7.4，1.0Hz)，8.50(2H，d，J＝8.8Hz)，8.20(1H，dd，J＝6.4，0.8Hz)，7.71(1H，t，J＝7.9Hz)，7.13(2H，d，J＝8.8Hz)，4.14(2H，q，J＝6.6Hz)，1.36(3H，t，J＝6.8Hz)。MS(ES+)m/e 323.30(20)，322.33(100)。MS(ES-)m/e 321.30(20)，320.28(100)。
化合物464-(4-p-甲苯基-[1，3，5]三嗪-2-基)-苯甲酸熔點288-290℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.41(1H，s)，8.65(2H，d，J＝8.5Hz)，8.47(2H，d，J＝8.3Hz)，8.13(2H，d，J＝8.5Hz)，7.42(2H，d，J＝8.3Hz)，2.06(3H，s)。MS(ES+)m/e 293.31(20)，292.30(100)。MS(ES-)m/e 291.28(20)，290.30(100)。
化合物474-[4-(4-氟-苯基)-[1，3，5]三嗪-2-基]-苯甲酸熔點295-298℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.44(1H，s)，8.65(4H，m)，8.13(2H，d，J＝8.3Hz)，7.45(2H，m)。MS(ES+)m/e 297.24(20)，296.22(100)。MS(ES-)m/e 295.23(20)，294.21(100)。
化合物483-[4-(4-甲氧基-苯基)-[1，3，5]三嗪-2-基]-苯甲酸熔點307-309℃。MS(ES+)m/e309.27(20)，308.26(100)。MS(ES-)m/e 307.26(20)，306.25(100)。
化合物493-[4-(3-氟-苯基)-[1，3，5]三嗪-2-基]-苯甲酸熔點273-276℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.49(1H，s)，8.68(2H，m)，8.43(1H，dd，J＝7.7，1.1Hz)，8.31(1H，dd，J＝8.8，1.4Hz)，8.14(2H，m)，7.67(1H，m)，7.55(1H，m)。MS(ES+)m/e 297.27(20)，296.25(100)。MS(ES-)m/e 295.26(20)，294.24(100)。
化合物503-[4-(4-三氟甲基-苯基)-[1，3，5]三嗪-2-基]-苯甲酸熔點290-293℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.53(1H，s)，8.67(2H，d，J＝8.3Hz)，8.52(2H，m)，8.11(2H，m)，7.97(2H，d，J＝8.3Hz)。MS(ES+)m/e 347.23(20)，346.22(100)。MS(ES-)m/e345.21(20)，344.24(100)。
化合物513-[4-(3-甲氧基-苯基)-[1，3，5]三嗪-2-基]-苯甲酸熔點227-229℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.44(1H，s)，8.65(2H，m)，8.15(3H，m)，8.06(1H，s)，7.54(1H，t，J＝7.7Hz)，7.24(1H，dd，J＝8.0，1.2Hz)，3.87(3H，s)。MS(ES+)m/e 309.27(20)，308.26(100)。MS(ES-)m/e 307.26(20)，306.23(100)。
化合物534-[4-(4-甲氧基-苯基)-[1，3，5]三嗪-2-基]-苯甲酸熔點＞300℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.35(1H，s)，8.64(2H，d，J＝8.5Hz)，8.53(2H，d，J＝8.9Hz)，8.12(2H，d，J＝8.5Hz)，7.13(2H，d，J＝8.9Hz)，3.87(3H，s)。MS(ES+)m/e 309.27(20)，308.26(100)。MS(ES-)m/e 307.26(20)，306.25(100)。
B4，2-嘧啶的制備本發(fā)明的嘧啶一般可以根據(jù)路線B制備如下。
3-[2-(4-氨基-苯基)-嘧啶-4-基]-芐腈(化合物1)步驟A將裝有無水乙醇(10mL)的燒瓶冷卻到0℃，加入氫化鈉(42mg，60％w/w以及礦物油1.05mmol)。攪拌0.5小時后，所述溶液用4-氨基芐脒二鹽酸鹽(104mg，0.50mmol)處理，所得混合物攪拌5分鐘。然后加入3-(3-二甲基氨基-丙烯?；?-芐腈(100mg，0.50mmol)，所得混合物加熱回流3小時，然后冷卻至環(huán)境溫度，并攪拌至60小時。蒸發(fā)所述混合物，所得混合物與乙醚研磨并過濾。蒸發(fā)濾液得到黃色油，用柱色譜(1∶1乙酸乙酯-己烷)分離得到產(chǎn)物3-[2-(4-氨基-苯基)-嘧啶-4-基]-芐腈(76mg，56％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.75(1H，d，J＝6Hz)，8.49(1H，t，J＝2Hz)，8.37-8.31(3H，m)，7.75(1H，dt，J＝8，2Hz)，7.59(1H，t，J＝8Hz)，7.40(1H，d，J＝6Hz)，6.76(2H，d，J＝9Hz)，4.03(2H，br s)。13C NMR(CDCl3)δ164.6，160.8，158.0，149.2，138.2，133.6，131.0，130.7，129.8(2C)，129.5，127.2，118.5，114.5(2C)，113.0，112.9。MS(ES+)m/e 274(20)，273(100)。
3-[2-(4-異丙基-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酰胺(化合物4)的制備將3-[2-(4-異丙基-苯基)-嘧啶-4-基]-芐腈(50mg，0.167mmol)和H2SO4水溶液(257μL，0.65M)的混合物加熱到70℃12小時。冷卻混合物并用氫氧化鈉水溶液(1M)調(diào)節(jié)至pH7。所述混合物分配在水和乙酸乙酯中，所得有機層用飽和氯化鈉溶液洗滌，硫酸鎂干燥，過濾并蒸發(fā)得到目標化合物白色結(jié)晶固體(52mg，98％)，熔點167-169℃。1H NMR(300MHz，丙酮-d6)δ8.91(1H，d，J＝6Hz)，8.87(1H，t，J＝2Hz)，8.54(2H，d，J＝9Hz)，8.52(1H，ddd，J＝8，2，1Hz)，8.15(1H，ddd，J＝8，2，1Hz)，7.93(1H，d，J＝6Hz)，7.80(1H，br s)，7.68(1H，t，J＝8Hz)，7.41(2H，d，J＝9Hz)，6.96(1H，br s)，3.01(1H，七重峰，J＝7Hz)，1.30(6H，d，J＝7Hz)。13C NMR(丙酮-d6)δ205.9，168.4，164.8，163.4，159.0，152.4，137.8，136.2，135.9，130.6(2C)，129.7，128.9，127.2(2C)，126.8，115.4，34.7，24.1(2C)。MS(ES+)m/e 319(25)，318(100)。
4-[2-(4-異丙基-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸(化合物5)的制備步驟A將4-乙?；郊姿峒柞?1.00g，5.61mmol)和二甲基甲酰胺-二甲基乙縮醛(746μL，5.61mmol)在乙醇(5mL)中的溶液加熱回流12小時。冷卻并蒸發(fā)所述溶液，所得殘留物用柱色譜分離得到產(chǎn)物4-(3-二甲基氨基-丙烯?；?苯甲酸甲酯和4-(3-二甲基氨基-丙烯酰基)苯甲酸乙酯的混合物(679mg)。部分所述物質(zhì)(121mg)溶解于乙醇(5mL)中并用4-異丙基-芐脒(81mg)。所述溶液加熱回流12小時，冷卻，并通過硅藻土(celite)過濾，蒸發(fā)。所得殘留物通過柱色譜(硅膠，1∶4乙酸乙酯-己烷)分離可得到產(chǎn)物4-[2-(4-異丙基-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸乙酯。
步驟B將4-[2-(4-異丙基-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸乙酯在四氫呋喃-水-乙醇(2mL/2mL/1mL)中的溶液用氫氧化鋰水合物(60mg)處理，攪拌12小時。蒸發(fā)所述溶液，所得殘留物分配在1M鹽酸水溶液和乙酸乙酯中。所得有機相用水(20mL)洗滌，在硫酸鎂上干燥，過濾并蒸發(fā)以獲得目標化合物白色固體(65mg，41％)，熔點262-264℃。1H NMR(300MHz，丙酮-d6)δ8.96(1H，d，J＝6Hz)，8.48(2H，d，J＝9Hz)，8.23(2H，d，J＝9Hz)，8.12(2H，d，J＝9Hz)，7.98(1H，d，J＝6Hz)，7.44(2H，d，J＝9Hz)，3.02(1H，七重峰，J＝7Hz)，1.33(6H，d，J＝7Hz)。MS(ES+)m/e 320(20)，319(100)。MS(ES-)m/e 318(20)，317(100)。
下列化合物可以參考上述化合物5以類似的方式制備。
化合物104-(2-p-甲苯基-嘧啶-4-基)-苯甲酸熔點＞310℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.96(1H，d，J＝6Hz)，8.43(2H，d，J＝9Hz)，8.40(2H，d，J＝9Hz)，8.10(2H，d，J＝9Hz)，8.03(1H，d，J＝6Hz)，7.35(2H，d，J＝9Hz)，2.39(3H，s)。MS(ES+)m/e 292(20)，291(100)。MS(ES-)m/e 290(20)，289(100)。
3-(2-p-甲苯基-嘧啶-4-基)-苯甲酸(化合物9)的制備步驟A以上述方法用4-甲基芐腈制備4-甲基芐脒，并與3-(3-二甲基氨基-丙烯?；?-芐腈一起在前述條件下，用于合成3-(2-p-甲苯基-嘧啶-4-基)-芐腈。
步驟B將3-(2-p-甲苯基-嘧啶-4-基)-芐腈(87mg，0.321mmol)在乙醇(2mL)中的溶液用氫氧化鈉水溶液(1mL，10N)處理，所得溶液加熱回流直至通過LC/MS檢測起始物質(zhì)耗盡。冷卻后，蒸發(fā)所述溶液，并且進行水處理(aqueous workup)。所得萃取物含有酰胺和酸化合物的混合物，用柱色譜分離得到純目標化合物(11mg)白色固體，熔點225-226℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.94(1H，d，J＝6Hz)，8.82(1H，s)，8.53(1H，d，J＝8Hz)，8.39(2H，d，J＝9Hz)，8.11(1H，d，J＝8Hz)，8.03(1H，d，J＝6Hz)，7.71(1H，t，J＝8Hz)，7.37(2H，d，J＝9Hz)，2.40(3H，s)。MS(ES+)m/e 292(20)，291(100)。MS(ES-)m/e 290(20)，289(100)。
下列化合物可以參考上述化合物9以類似的方式制備。
化合物164-[2-(3-甲氧基-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸熔點270-273℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.22(1H，br s)，9.00(1H，d，J＝5Hz)，8.44(2H，d，J＝8Hz)，8.14-8.03(5H，m)，7.48(1H，t，J＝8Hz)，7.16-7.11(1H，m)，3.86(3H，s)。MS(ES+)m/e 307.11(100)。MS(ES-)m/e 305.13(100)。
化合物174-[2-(4-叔丁基-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸熔點293-296℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.23(1H，br s)，8.97(1H，d，J＝5Hz)，8.43(4H，d，J＝8Hz)，8.12(2H，d，J＝8Hz)，8.03(1H，d，J＝5Hz)，7.57(2H，d，J＝8Hz)。MS(ES+)m/e 333.18(100)。MS(ES-)m/e 331.15(100)。
化合物184-[2-(4-氟-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸熔點＞300℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.21(1H，br s)，8.99(1H，d，J＝5Hz)，8.57(2H，dd，J＝8，6Hz)，8.44(2H，d，J＝8Hz)，8.11(2H，d，J＝8Hz)，8.08(1H，d，J＝5Hz)，7.38(2H，t，J＝8Hz)。MS(ES+)m/e295.10(100)。MS(ES-)m/e 293.06(100)。
化合物194-[2-(3-三氟甲氧基-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸熔點＞300℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.07-9.04(1H，m)，8.37(2H，d，J＝8Hz)，8.18-8.16(1H，m)，8.13-8.08(3H，m)，7.71-7.53(3H，m)。MS(ES+)m/e 361.09(100)。MS(ES-)m/e 359.05(100)。
化合物20
4-[2-(3-氯-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸熔點291-294℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.03(1H，d，J＝5Hz)，8.49-8.43(4H，m)，8.14-8.11(3H，m)，7.65-7.60(2H，m)。MS(ES+)m/e 311.07(100)。MS(ES-)m/e 309.06(100)。
化合物214-[2-(4-三氟甲基-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸熔點＞300℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.22(1H，br s)，9.06(1H，d，J＝5Hz)，8.70(2H，d，J＝8Hz)，8.46(2H，d，J＝8Hz)，8.15(1H，d，J＝5Hz)，8.12(2H，d，J＝8Hz)，7.93(2H，d，J＝8Hz)。MS(ES+)m/e 345.16(100)。
化合物614-[2-(2-三氟甲氧基-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸熔點258-261℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.05(1H5d，J＝5Hz)，8.36(2H，d，J＝8Hz)，8.16-8.06(4H，m)，7.70-7.51(3H，m)。MS(ES+)m/e 361.12(100)。
化合物224-[2-(4-氯-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸熔點＞300℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.24(1H，br s)，9.01(1H，d，J＝5Hz)，8.52(2H，d，J＝8Hz)，8.44(2H，d，J＝8Hz)，8.13-8.08(3H，m)，7.62(2H，d，J＝5Hz)。MS(ES+)m/e 311.11(100)。
化合物234-[2-(2-氟-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸熔點＞300℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.22(1H，br s)，9.04(1H，d，J＝5Hz)，8.39(2H，d，J＝8Hz)，8.14-8.08(4H，m)，7.62-7.58(1H，m)，7.40-7.36(2H，m)。MS(ES+)m/e 295.15(100)。
化合物624-[2-(3-三氟甲基-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.04(1H，d，J＝5Hz)，8.82(1H，d，J＝8Hz)，8.76(1H，s)，8.42(2H，d，J＝8Hz)，8.16(1H，d，J＝5Hz)，8.07(2H，d，J＝8Hz)，7.94(1H，d，J＝8Hz)，7.82(1H，d，J＝8Hz)，7.55(1H，s)。MS(ES+)m/e 345.21(100)。
化合物254-[2-(3-氟-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸熔點300-303℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.22(1H，br s)，9.00(1H，d，J＝5Hz)，8.45-8.09(7H，m)，7.59(1H，m)，7.39(1H，m)。MS(ES+)m/e 295.15(100)。
化合物26
4-(2-o-甲苯基-嘧啶-4-基)-苯甲酸熔點198-200℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.21(1H，br s)，9.02(1H，d，J＝5Hz)，8.37(2H，d，J＝8Hz)，8.11-8.07(2H，m)，7.89(1H，d，J＝5Hz)，7.38-7.33(3H，m)，2.58(3H，s)。MS(ES+)m/e 291.20(100)。
化合物274-[2-(4-三氟甲氧基-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸熔點299-302℃。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.02(1H，d，J＝5Hz)，8.62(2H，d，J＝8Hz)，8.44(2H，d，J＝8Hz)，8.12(1H，d，J＝5Hz)，8.11(2H，d，J＝8Hz)，7.54(2H，d，J＝8Hz)。MS(ES+)m/e 361.18(100)。
化合物284-(2-苯基-嘧啶-4-基)-苯甲酸熔點＞300℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.00(1H，d，J＝5Hz)，8.54-8.50(2H，m)，8.45(2H，d，J＝8Hz)，8.11(2H，d，J＝8Hz)，8.08(1H，d，J＝5Hz)，7.57-7.54(3H，m)。MS(ES+)m/e 277.22(100)。
化合物304-[2-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸熔點＞300℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.20(1H，br s)，8.93(1H，d，J＝5Hz)，8.46(2H，d，J＝8Hz)，8.42(2H，d，J＝8Hz)，8.11(2H，d，J＝8Hz)，7.98(1H，d，J＝5Hz)，7.09(2H，d，J＝8Hz)，3.84(3H，s)。MS(ES+)m/e 307.27(100)。MS(ES-)m/e 305.23(100)。
化合物314-[2-(2-三氟甲基-苯基)-嘧啶-4-基]-苯甲酸熔點251-252℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.04(1H，d，J＝5Hz)，8.35(2H，d，J＝8Hz)，8.19(1H，d，J＝5Hz)，8.08(2H，d，J＝8Hz)，7.92-7.73(4H，m)。MS(ES+)m/e 345.29(100)。
實施例C4，6-嘧啶式1-C和2-C的4，6-嘧啶一般可以根據(jù)路線C制備如下。
4-(6-m-甲苯基-嘧啶-4-基)-苯甲酸(化合物2)的制備步驟A在50mL三頸圓底燒瓶中裝入2，4-二氯嘧啶(0.58g，3.89mmol)、3-甲基苯基硼酸(0.31g，2.28mmol)、Na2CO3(0.73g，6.88mmol)、四(三苯基膦)鈀(13.0mg，1.12×10-2mmol)。將所述燒瓶抽真空，用氮氣再充滿。然后向燒瓶中加入二甲基甲酰胺(DMF)(15mL，無水)。將所述燒瓶再次抽真空，用氮氣再充滿，反復兩次。所述反應加熱至100℃過夜。所述反應混合物在乙醚和水中分離。所得有機層用鹽水洗滌，在MgSO4上干燥，然后移出。所得殘留物用快速柱色譜純化，用二氯甲烷/己烷(1∶10)洗脫得到45.7mg(5.8％產(chǎn)率)需要的產(chǎn)物。LC-MS測定所得化合物(4-氯-6-m-甲苯基-嘧啶)純度＞80％。MS(ES+)m/e 205.23。
步驟B將4-氯-6-m-甲苯基-嘧啶(45.7mg，0.22mmol)、4-羧基苯基硼酸(39.2mg，0.23mmol)、(235.3mg，2.22mmol)、Na2CO3(70.6mg，0.67mmol)、四丁基碘化銨(83.0mg，0.22mmol)、乙酸鈀(0.5mg，2.2×10-3mmol)和2mL水裝入10mL微波管中。反應混合物在60W、250psi下于微波反應器中加熱至150℃10分鐘。將所得反應混合物加入到5mL的6N鹽酸中，并用乙酸乙酯(10mL)萃取。所得有機部分用飽和NaHCO3和鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮。油狀殘留物懸浮在乙酸乙酯/己烷(1∶1)中得到9.8mg(15.1％產(chǎn)率)白色粉末所需產(chǎn)物，熔點211-213℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.31(1H，s)，8.66(1H，s)，8.46(2H，d，J＝8.3Hz)，8.20(1H，s)，8.15(1H，dd，J＝8.0，1.2Hz)，8.09(2H，d，J＝8.3Hz)，7.45(1H，t，J＝7.7Hz)，7.38(1H，dd，J＝7.7，1.0Hz)。MS(ES+)m/e 291.58。
下列化合物可以參考上述化合物2以類似的方式制備。
化合物33-(6-p-甲苯基-嘧啶-4-基)-苯甲酸熔點201-203℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.19(1H，s)，8.69(1H，s)，8.30(1H，dd，J＝7.9，1.1Hz)，8.11(1H，dd，J＝7.7，1.0Hz)，8.06(1H，s)，7.97(2H，d，J＝8.2Hz)，7.52(1H，t，J＝7.7Hz)，7.25(2H，d，J＝8.2Hz)。MS(ES+)m/e 292.40(20)，291.37(100)。MS(ES-)m/e 291.46(20)，290.47(100)。
實施例D2，4-嘧啶的制備式1-D和2-D的2，4-嘧啶一般可以根據(jù)路線D制備如下。
3-[4-(4-氟-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸(化合物32)的制備。
步驟A將4-氟苯乙酮(1.01g，7.31mmol)和N，N-二甲基甲酰胺二甲基乙縮醛(0.87g，7.32mmol)裝入10mL微波管中。將所述微波管在250psi、300W下加熱至100℃10分鐘。通過加入己烷沉淀黃色固體。通過過濾和用己烷洗滌來收集所需產(chǎn)物(1.03g，73.0％產(chǎn)率)。用LC-MS測定所得化合物3-二甲基氨基-1-(4-氟-苯基)-丙烯酮純度＞90％。MS(ES+)m/e 194.14。
步驟B向3-甲脒基-苯甲酸叔丁基酯(220.2mg，0.94mmol)、3-二甲基氨基-1-(4-氟-苯基)-丙烯酮(182.6mg，0.95mmol)和氫化鈉(39.2mg，1.63mmol，60％己烷中)的混合物中加入無水乙醇(5.0mL)。所得混合物攪拌回流8小時直到用TLC測定起始物質(zhì)完全消耗。移除溶劑，并向殘留物加入1N鹽酸(15mL)沉淀黃色固體。用水和乙醚順序洗滌之后，產(chǎn)生目標產(chǎn)物(137.8mg，41.3％產(chǎn)率)，熔點239-241℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.05(1H，s)，8.97(1H，d，J＝5.0Hz)，8.73(1H，dd，J＝7.7，1.2Hz)，8.38(2H，m)，8.11(1H，dd，J＝8.0，1.2Hz)，8.04(1H，d，J＝5.3Hz)，7.68(1H，t，J＝7.8Hz)，7.43(2H，m)。MS(ES+)m/e 295.27。
下列化合物可以參考上述化合物32以類似的方式制備。
化合物334-[4-(4-溴-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔點302-305℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.00(1H，d，J＝5.1Hz)，8.60(2H，d，J＝8.3Hz)，8.30(2H，d，J＝8.5Hz)，8.10(3H，m)，7.85(2H，d，J＝8.5Hz)。MS(ES+)m/e 358.13(20)，357.12(100)。MS(ES-)m/e 356.01(20)，355.08(100)。
化合物344-[4-(4-三氟甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔點234-236℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.01(1H，d，J＝5.4Hz)，8.58(2H，d，J＝8.3Hz)，8.46(2H，d，J＝8.8Hz)，8.09(3H，m)，7.57(2H，d，J＝8.3Hz)。MS(ES+)m/e 362.22(20)，361.23(100)。MS(ES-)m/e 360.20(20)，359.20(100)。
化合物354-(4-p-甲苯基-嘧啶-2-基)-苯甲酸熔點287-289℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.94(1H，d，J＝5.4Hz)，8.60(2H，d，J＝8.3Hz)，8.23(2H，d，J＝8.3Hz)，8.10(2H，d，J＝8.5Hz)，8.02(1H，d，J＝5.4Hz)，7.38(2H，d，J＝8.1Hz)，2.40(3H，s)。MS(ES+)m/e292.29(20)，291.26(100)。MS(ES-)m/e 290.24(20)，289.26(100)。
化合物364-[4-(4-異丙基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔點243-245℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.95(1H，d，J＝5.1Hz)，8.60(2H，d，J＝8.0Hz)，8.25(2H，d，J＝8.3Hz)，8.10(2H，d，J＝8.3Hz)，8.01(1H，d，J＝5.1Hz)，7.45(2H，d，J＝8.0Hz)，2.97(1H，m)，1.25(6H，d，J＝5.1Hz)。MS(ES+)m/e 320.30(20)，319.29(100)。MS(ES-)m/e 318.30(20)，317.30(100)。
化合物374-[4-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔點263-265℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.89(1H，d，J＝5.5Hz)，8.59(2H，d，J＝7.2Hz)，8.32(2H，d，J＝7.5Hz)，8.10(2H，d，J＝7.2Hz)，8.00(1H，d，J＝5.5Hz)，7.12(2H，d，J＝7.5Hz)，3.84(3H，s)。MS(ES+)m/e 308.26(20)，307.25(100)。MS(ES-)m/e 306.34(20)，305.25(100)。
化合物384-[4-(3-氟-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔點249-252℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.02(1H，d，J＝5.5Hz)，8.61(2H，d，J＝8.0Hz)，8.12(5H，m)，7.65(1H，m)，7.41(1H，m)。MS(ES+)m/e 296.22(20)，295.20(100)。MS(ES-)m/e 294.26(20)，293.21(100)。
化合物394-(4-聯(lián)苯基-4-基-嘧啶-2-基)-苯甲酸熔點293-296℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.01(1H，d，J＝5.2Hz)，8.63(2H，d，J＝8.5Hz)，8.45(2H，d，J＝8.0Hz)，8.12(3H，m)，7.89(2H，d，J＝8.3Hz)，7.77(2H，d，J＝8.3Hz)，7.44(3H，m)。MS(ES+)m/e 354.26(20)，353.24(100)。MS(ES-)m/e 352.25(20)，351.23(100)。
化合物404-[4-(2，3-二氫-苯并[1，4]二噁英-6-基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔點272-274℃。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.89(1H，d，J＝5.3Hz)，8.58(2H，d，J＝8.4Hz)，8.09(2H，d，J＝8.4Hz)，7.97(1H，d，J＝5.3Hz)，7.87(2H，m)，7.03(1H，d，J＝9.1Hz)，4.32(4H，t，J＝1.2Hz)。MS(ES+)m/e 336.27(20)，335.25(100)。MS(ES-)m/e 334.31(20)，333.29(100)。
化合物414-[4-(4-咪唑-1-基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔點＞305℃。MS(ES+)m/e 344.25(20)，343.23(100)。MS(ES-)m/e 342.28(20)，341.27(100)。
化合物634-[4-(3-三氟甲基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔點271-273℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.04(1H，d，J＝5.2Hz)，8.60(4H，m)，8.20(1H，d，J＝5.2Hz)，8.10(2H，d，J＝8.3Hz)，7.95(1H，dd，J＝7.4，0.9Hz)，7.82(1H，t，J＝7.4Hz)。MS(ES+)m/e 346.28(20)，345.26(100)。MS(ES-)m/e 344.25(20)，343.25(100)。
化合物644-(4-m-甲苯基-嘧啶-2-基)-苯甲酸熔點220-222℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.97(1H，d，J＝4.3Hz)，8.60(2H，d，J＝7.4Hz)，8.12(4H，m)，8.06(1H，d，J＝4.3Hz)，7.45(2H，m)，2.43(3H，s)。MS(ES+)m/e 292.29(20)，291.28(100)。MS(ES-)m/e 290.29(20)，289.29(100)。
化合物654-[4-(2-氟-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔點234-236℃。MS(ES+)m/e 296.22(20)，295.20(100)。MS(ES-)m/e 294.25(20)，293.23(100)。
化合物664-[4-(4-三氟甲基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔點282-285℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.05(1H，d，J＝5.2Hz)，8.59(2H，d，J＝7.7Hz)，8.51(2H，d，J＝8.3Hz)，8.14(1H，d，J＝5.2Hz)，8.09(2H，d，J＝7.7Hz)，7.92(2H，d，J＝8.3Hz)。MS(ES+)m/e346.39(20)，345.42(100)。MS(ES-)m/e 344.45(20)，343.45(100)。
化合物674-[4-(4-嗎啉-4-基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔點289-291℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.83(1H，d，J＝5.5Hz)，8.58(2H，d，J＝8.3Hz)，8.22(2H，d，J＝8.5Hz)，8.08(2H，d，J＝8.3Hz)，7.90(1H，d，J＝5.5Hz)，7.08(2H，d，J＝8.5Hz)，3.74(4H，t，J＝1.2Hz)，3.26(4H，t，J＝1.2Hz)。MS(ES+)m/e 363.32(20)，362.31(100)。MS(ES-)m/e361.31(20)，360.29(100)。
化合物683-[4-(4-溴-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔點＞300℃。MS(ES+)m/e 357(100)，355(100)。
化合物693-[4-(4-三氟甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔點241-243℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.05(1H，s)，9.00(1H，d，J＝5.5Hz)，8.73(1H，dd，J＝8.0，1.1Hz)，8.43(2H，d，J＝8.6Hz)，8.07(2H，m)，7.68(1H，t，J＝8.0Hz)，7.57(2H，d，J＝8.6Hz)。MS(ES+)m/e 362.24(20)，361.23(100)。MS(ES-)m/e 360.25(20)，359.25(100)。
化合物703-[4-(4-異丙基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔點242-244℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.07(1H，s)，8.94(1H，d，J＝5.2Hz)，8.73(1H，dd，J＝7.7，1.0Hz)，8.23(2H，d，J＝8.4Hz)，8.10(1H，dd，J＝8.0，1.2Hz)，7.98(1H，d，J＝5.2Hz)，7.69(1H，t，J＝7.7Hz)，7.45(2H，d，J＝8.4Hz)，2.95(1H，m)，1.23(6H，d，J＝6.9Hz)。MS(ES+)m/e320.30(20)，319.29(100)。MS(ES-)m/e 318.40(20)，317.30(100)。
化合物713-[4-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔點243-244℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.06(1H，s)，8.89(1H，d，J＝5.2Hz)，8.72(1H，dd，J＝7.4，1.0Hz)，8.30(2H，d，J＝9.0Hz)，8.09(1H，dd，J＝7.4，1.0Hz)，7.95(1H，d，J＝5.5Hz)，7.66(1H，t，J＝7.7Hz)，7.13(2H，d，J＝9.0Hz)，3.85(3H，s)。MS(ES+)m/e 308.30(20)，307.29(100)。MS(ES-)m/e 306.26(20)，305.25(100)。
化合物723-[4-(2-氟-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔點201-203℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.01(2H，m)，8.70(1H，dd，J＝7.7，1.0Hz)，8.23(1H，t，J＝6.9Hz)，8.10(1H，dd，J＝7.7，0.9Hz)，7.85(1H，d，J＝3.6Hz)，7.61(2H，m)，7.41(2H，m)。MS(ES+)m/e 296.27(20)，295.27(100)。MS(ES-)m/e 294.28(20)，293.26(100)。
化合物423-[4-(2，3-二氫-苯并[1，4]二噁英-6-基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔點239-241℃。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.05(1H，s)，8.88(1H，d，J＝5.2Hz)，8.70(1H，dd，J＝8.0，1.2Hz)，8.09(1H，d，J＝7.4Hz)，7.95(1H，d，J＝5.0Hz)，7.86(1H，s)，7.82(1H，m)，7.67(1H，t，J＝7.7Hz)，7.01(1H，dd，J＝8.3，1.3Hz)，4.32(4H，t，J＝1.2Hz)。MS(ES+)m/e336.27(20)，335.25(100)。MS(ES-)m/e 334.22(20)，333.23(100)。
化合物733-(4-p-甲苯基-嘧啶-2-基)-苯甲酸熔點252-253℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.06(1H，s)，8.93(1H，d，J＝5.0Hz)，8.73(1H，dd，J＝7.4，1.0Hz)，8.22(2H，d，J＝7.7Hz)，8.09(1H，dd，J＝6.9，0.8Hz)，7.99(1H，d，J＝5.2Hz)，7.68(1H，t，J＝7.4Hz)，7.39(2H，d，J＝7.7Hz)，2.38(3H，s)。MS(ES+)m/e 292.30(20)，291.28(100)。MS(ES-)m/e290.33(20)，289.15(100)。
化合物743-[4-(3-氟-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔點253-255℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.05(1H，s)，9.00(1H，d，J＝5.0Hz)，8.74(1H，dd，J＝7.2，1.0Hz)，8.18(4H，m)，7.68(2H，m)，7.43(1H，m)。MS(ES+)m/e 296.41(20)，295.39(100)。MS(ES-)m/e 294.41(20)，293.42(100)。
化合物753-(4-聯(lián)苯基-4-基-嘧啶-2-基)-苯甲酸熔點296-299℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.18(1H，s)，9.00(1H，d，J＝5.4Hz)，8.77(1H，dd，J＝7.8，1.1Hz)，8.43(2H，d，J＝8.0Hz)，8.17(2H，m)，7.95(2H，d，J＝8.0Hz)，7.87(3H，m)，7.43(3H，m)。MS(ES+)m/e 354.28(20)，353.31(100)。MS(ES-)m/e 352.29(30)，351.21(100)。
化合物763-(4-m-甲苯基-嘧啶-2-基)-苯甲酸熔點217-219℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.06(1H，s)，8.96(1H，d，J＝5.5Hz)，8.77(1H，dd，J＝7.9，1.0Hz)，8.13(3H，m)，8.02(1H，d，J＝5.5Hz)，7.69(1H，t，J＝7.0Hz)，7.41(2H，m)，2.43(3H，s)。MS(ES+)m/e 292.30(20)，291.28(100)。MS(ES-)m/e 290.18(20)，289.26(100)。
化合物773-[4-(3-三氟甲基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔點271-273℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.02(2H，m)，8.70(1H，dd，J＝8.8，1.2Hz)，8.68(2H，m)，8.15(1H，d，J＝5.2Hz)，8.08(1H，dd，J＝7.2，1.0Hz)，7.91(1H，m)，7.80(1H，m)，7.67(1H，t，J＝7.0Hz)。MS(ES+)m/e 346.26(20)，345.26(100)。MS(ES-)m/e 344.26(20)，343.25(100)。
化合物783-[4-(4-三氟甲基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔點271-273℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.04(2H，m)，8.72(1H，dd，J＝7.7，1.0Hz)，8.49(2H，d，J＝8.3Hz)，8.10(2H，m)，7.93(2H，d，J＝8.3Hz)，7.68(1H，t，J＝7.4Hz)。MS(ES+)m/e 346.26(20)，345.26(100)。MS(ES-)m/e 344.22(20)，343.24(100)。
化合物793-[4-(4-咪唑-1-基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔點＞310℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.64(1H，s)，9.03(2H，m)，8.73(1H，dd，J＝7.8，1.0Hz)，8.52(2H，d，J＝8.3Hz)，8.32(1H，s)，8.15(4H，m)，7.70(2H，m)。MS(ES+)m/e 344.30(20)，343.30(100)。MS(ES-)m/e 342.27(20)，341.27(100)。
化合物574-[4-(3，4-二甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔點250-252℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.89(1H，d，J＝5.5Hz)，8.59(2H，d，J＝8.5Hz)，8.10(2H，d，J＝8.5Hz)，8.01(1H，d，J＝5.5Hz)，7.93(1H，d，J＝8.5Hz)，7.88(1H，s)，7.12(1H，d，J＝8.5Hz)，3.90(3H，s)，3.84(3H，s)。MS(ES+)m/e 338.27(20)，337.22(100)。MS(ES-)m/e336.26(20)，335.26(100)。
化合物583-[4-(3，4-二甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔點240-243℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.90(1H，d，J＝5.2Hz)，8.60(2H，m)，8.09(2H，m)，8.02(1H，d，J＝5.2Hz)，7.86(1H，dd，J＝8.5，1.3Hz)，7.70(1H，s)，7.14(1H，dd，J＝8.3，1.2Hz)，3.91(3H，s)，3.84(3H，s)。MS(ES+)m/e 338.28(20)，337.25(100)。MS(ES-)m/e 336.27(20)，335.26(100)。
化合物594-[4-(4-二甲基氨基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔點292-295℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.78(1H，d，J＝5.5Hz)，8.58(2H，d，J＝8.5Hz)，8.21(2H，d，J＝9.1Hz)，8.09(2H，d，J＝8.5Hz)，7.85(1H，d，J＝5.5Hz)，6.84(2H，d，J＝9.1Hz)，3.02(6H，s)。MS(ES+)m/e 321.32(20)，320.30(100)。MS(ES-)m/e 319.33(20)，318.30(100)。
化合物603-[4-(4-二甲基氨基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔點281-283℃。MS(ES+)m/e321.32(50)，320.30(100)。MS(ES-)m/e 319.33(20)，318.29(100)。
4-[4-甲基-6-(4-三氟甲基-苯基)-嘧啶-2-基]-苯甲酸(化合物52)[PTC-0169003]的制備步驟A將4-三氟甲基苯乙酮(0.95g，7.32mmol)和二甲基甲酰胺二甲基乙縮醛(1.60g，12.01mmol).裝入10mL微波管中。將所述微波管在250psi、300W下加熱至140℃30分鐘。通過加入己烷沉淀白色固體。通過過濾和己烷洗滌來收集所需產(chǎn)物(290.1mg，22.1％產(chǎn)率)。用LC-MS測定所得化合物3-二甲基氨基-1-(4-三氟甲基-苯基)-丁-2-烯-1-酮純度＞90％。MS(ES+)m/e 258.20。
步驟B向3-二甲基氨基-1-(4-三氟甲基-苯基)-丁-2-烯-1-酮(290.1mg，1.13mmol)、4-甲脒基-苯甲酸叔丁基酯(220.3mg，1.00mmol通過與3-甲脒基-苯甲酸叔丁基酯相同的方法制備)和氫化鈉(79.9mg，2.00mmol，60％己烷中)的混合物中加入無水乙醇(5.0mL)。所得混合物攪拌回流14小時直到用TLC測定起始物質(zhì)完全消耗。移除溶劑，并用1N鹽酸(15mL)中和殘留物直至pH＜7沉淀白色固體。通過過濾收集沉淀然后用水和乙醚/己烷(1∶1)洗滌。所得固體用快速柱色譜進一步純化，用甲醇/二氯甲烷(1∶40)洗脫，得到目標產(chǎn)物(10.7mg，2.7％產(chǎn)率)，熔點272-275℃。1H NMR(300MHz，CDCl3+2滴DMSO-d6)δ8.54(2H，d，J＝8.3Hz)，8.23(2H，d，J＝8.6Hz)，8.09(2H，d，J＝8.3Hz)，7.71(2H，d，J＝8.6Hz)，7.48(1H，s)，2.61(3H，s)。MS(ES+)m/e 359.27。
下列化合物可以參考上述化合物52以類似的方式制備。
化合物56
3-[4-(4-氟-苯基)-6-甲基-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔點305-307℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.60(2H，d，J＝8.0Hz)，8.41(2H，m)，8.08(2H，d，J＝8.0Hz)，7.96(1H，s)，7.41(2H，m)，2.60(3H，s)。MS(ES+)m/e 310.34(20)，309.34(100)。MS(ES-)m/e308.30(20)，307.32(100)。
3-[4-(4-氟-苯基)-5-甲基-嘧啶-2-基]-苯甲酸(化合物55)步驟A將4-氟苯丙酮(1.83g，10.60mmol)和N，N-二甲基甲酰胺二甲基乙縮醛(4.45g，37.35mmol)的混合物加熱回流16小時。除去溶劑得到的殘留物(含有3-二甲基氨基-1-(4-氟-苯基)丙-1-酮)無需提純，用于下一個步驟。
步驟B將無水乙酸(8mL)中的3-二甲基氨基-1-(4-氟-苯基)丙-1-酮(641.9mg，3.10mmol)和3-甲脒基-苯甲酸叔丁基酯(426.1mg，1.91mmol)的混合物在300W、250psi下于微波反應器中加熱至130℃30分鐘。通過加入1N鹽酸沉淀白色固體，并且通過過濾收集后用水和己烷洗滌。所得固體用快速柱色譜進一步純化，用甲醇/二氯甲烷(1∶40)洗脫，得到目標產(chǎn)物(114.1mg，12.0％產(chǎn)率)，熔點272-275℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.50(2H，d，J＝8.0Hz)，8.06(2H，d，J＝8.0Hz)，7.85(2H，m)，8.13(2H，m)，7.38(2H，m)，2.40(3H，s)。MS(ES+)m/e 309.34。
下列化合物可以參考上述化合物55以類似的方式制備。
化合物543-[4-(2-氟-苯基)-5-甲基-嘧啶-2-基]-苯甲酸熔點279-281℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.92(1H，s)，8.46(2H，m)，8.05(2H，m)，7.43(2H，m)，7.38(2H，m)，2.22(3H，s)。MS(ES+)m/e 310.29(20)，309.27(100)。MS(ES-)m/e 308.29(20)，307.27(100)。
實施例E2，4-吡啶的制備式1-E和2-E的2，4-吡啶一般可以根據(jù)路線E制備如下。
3-[4-(4-異丙基-苯基)-吡啶-2-基]-苯甲酸(化合物7)的制備步驟A將4-溴吡啶鹽酸鹽(1.0g，6.3mmol)在乙腈-水(50mL/20mL)中的溶液用4-異丙基苯基硼酸(1.04g，6.3mmol)和碳酸鈉(2.1g，25.2mmol)處理。所得混合物脫兩次氣，并且加入催化量的四(三苯基膦)鈀。所得混合物加熱回流12小時，然后冷卻倒入水(50mL)中。然后過濾并用乙酸乙酯萃取所得混合物(3×50mL)?；旌纤幂腿∥铮⒂名}水洗滌，在硫酸鎂上干燥，過濾并蒸發(fā)得到1.01克足夠純的產(chǎn)物，4-(4-異丙基-苯基)-吡啶。
步驟B將4-(4-異丙基-苯基)-吡啶(1.01g，5.1mmol)在二氯甲烷(20mL)中的溶液冷卻至0℃，并逐滴加入間氯過氧化苯甲酸(1.33g，7.6mmol)在二氯甲烷(20mL)中的溶液。所得混合物允許在12小時內(nèi)于攪拌下暖至環(huán)境溫度，然后加熱回流2小時。加入間氯過氧化苯甲酸(0.5g)，并繼續(xù)回流2小時。所述溶液冷卻并依次用10％亞硫酸鈉水溶液、10％碳酸鈉水溶液和飽和鹽水洗滌。有機相在無水硫酸鎂上干燥并且蒸發(fā)。殘留物用快速色譜分離，得到4-(4-異丙基-苯基)-吡啶-N-氧化物(0.85g，78％)。
步驟C將4-(4-異丙基-苯基)-吡啶-N-氧化物(126mg，0.59mmol)和磷酰氯(5mL)加熱回流12小時。冷卻并蒸發(fā)所述混合物，并將殘留物溶于水，用飽和碳酸鈉水溶液中和，并用乙酸乙酯萃取。所得萃取物用鹽水洗滌，在硫酸鎂上干燥，過濾并蒸發(fā)。所得殘留物用柱色譜分離，得到2-氯-4-(4-異丙基-苯基)-吡啶(110mg，81％)。
步驟D將2-氯-4-(4-異丙基-苯基)-吡啶(110mg，0.48mmol)在乙腈-水(1mL/0.5mL)中的溶液用3-乙氧羰苯基硼酸(186mg，0.96mmol)、碳酸鈉(153mg，1.44mmol)以及四(三苯基膦)鈀(催化量)處理?；旌衔锛訜峄亓?2小時，然后冷卻并在水和乙酸乙酯中分配。有機相用鹽水洗滌，在硫酸鎂上干燥，過濾并蒸發(fā)。所得殘留物通過柱色譜分離，得到3-[4-(4-異丙基-苯基)-吡啶-2-基]-苯甲酸乙酯(116mg，70％)。
步驟E3-[4-(4-異丙基-苯基)-吡啶-2-基]-苯甲酸乙酯(116mg，0.34mmol)在甲醇-水(3mL/1mL)中的溶液用氫氧化鋰水合物(41mg，1.7mmol)處理?；旌衔镌诃h(huán)境溫度(ambiemperature)下攪拌12小時，然后在水和二乙基醚中分離。所得水相用3N鹽酸水溶液中和至pH7，并用乙酸乙酯萃取。所得萃取物用鹽水洗滌，在硫酸鎂上干燥，過濾并蒸發(fā)，得到目標產(chǎn)物白色粉末(92mg，85％)，熔點233-234℃。1H NMR(300MHz，甲醇-d4)δ8.66(1H，s)，8.65(1H，d，J＝8Hz)，8.25(1H，d，J＝8Hz)，8.14-8.11(2H，m)，7.78(2H，d，J＝9Hz)，7.69-7.62(2H，m)，7.42(2H，d，J＝9hz)，3.00(1H，七重峰，J＝7Hz)，1.30(6H，d，J＝7Hz)。MS(ES+)m/e x。MS(ES-)m/e 319(20)，318(100)。
下列化合物可以參考上述化合物7以類似的方式制備。
化合物134-(4-p-甲苯基-吡啶-2-基)-苯甲酸熔點288-291℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.78(1H，d，J＝7Hz)，8.42(1H，s)，8.30(2H，d，J＝9Hz)，8.08(2H，d，J＝9Hz)，7.94-7.90(3H，m)，7.38(2H，d，J＝9Hz)，2.39(3H，s)。MS(ES+)m/e 291(19)，290(100)。
實施例F3，5-吡啶式1-F和2-F的3，5-吡啶一般可以根據(jù)路線F制備如下。
3-[5-(4-異丙基-苯基)-吡啶-3-基]-苯甲酸(化合物11)的制備步驟A將3，5-二溴吡啶(1.0g，4.2mmol)和4-異丙基苯基硼酸(346mg，2.1mmol)在乙醇-甲苯-水(10mL/5mL/3mL)混合物中的溶液用碳酸鈉(450mg)處理。所得混合物脫兩次氣，并且用催化量的四(三苯基膦)鈀處理，并在攪拌下加熱至80℃12小時。所得混合物冷卻、過濾并蒸發(fā)。所得殘留物在水和乙酸乙酯中分配，有機相用鹽水洗滌，在硫酸鈉上干燥，過濾并蒸發(fā)。所得殘留物用柱色譜分離，得到3-溴-5-(4-異丙基-苯基)-吡啶(300mg，55％)。
步驟B將3-溴-5-(4-異丙基-苯基)-吡啶(300mg，1.1mmol)和3-乙氧羰苯基硼酸(180mg，1.1mmol)在乙醇-甲苯-水(10mL/5mL/3mL)中的溶液用碳酸鈉(345mg)處理，脫兩次氣，用催化量的四(三苯基膦)鈀處理。所得混合物在攪拌下加熱至80℃至TLC測定起始物質(zhì)耗盡。然后，所述混合物冷卻、過濾并蒸發(fā)，并且殘留物在水和乙酸乙酯中分配。所得有機相用鹽水洗滌，在硫酸鈉上干燥，過濾并蒸發(fā)。殘留物用柱色譜分離，得到3-[5-(4-異丙基-苯基)-吡啶-3-基]-苯甲酸乙酯(252mg，79％)。
步驟C將3-[5-(4-異丙基-苯基)-吡啶-3-基]-苯甲酸乙酯(100mg)在甲醇-水(3mL/1mL)中的溶液用水合氫氧化鋰(50mg)處理，所得溶液加熱至40-50℃12小時。冷卻后，所得溶液用3N鹽酸中和至pH7，并用乙酸乙酯萃取。所得萃取物用鹽水洗滌，在硫酸鈉上干燥、過濾并蒸發(fā)得到目標化合物粉末(80mg，87％)，熔點155-156℃。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.93-8.90(2H，m)，8.44(1H，s)，8.21-8.19(2H，m)，7.89(1H，d，J＝7Hz)，7.64(1H，t，J＝8Hz)，7.61(2H，d，J＝9Hz)，7.39(2H，d，J＝9Hz)，3.00(1H，七重峰，J＝7Hz)，1.30(6H，d，J＝7Hz)。MS(ES+)m/e 319(22)，318(100)。
下列化合物可以參考上述化合物11以類似的方式制備。
化合物154-(5-p-甲苯基-吡啶-3-基)-苯甲酸熔點260-262℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.92(2H，s)，8.38(1H，s)，8.05(2H，d，J＝9Hz)，7.98(2H，d，J＝9Hz)，7.75(2H，d，J＝9Hz)，7.33(2H，d，J＝9Hz)，2.36(3H，s)。MS(ES+)m/e 291(20)，290(100)。
實施例G4，2-吡啶式1-G和2-G的4，2-吡啶一般可以根據(jù)路線G制備如下。
3-[2-(4-異丙基-苯基)-吡啶-4-基]-苯甲酸(化合物8)的制備步驟A將4-溴吡啶(1.0g，5.2mmol)在乙腈-水(10mL/5mL)中的溶液用3-乙氧羰苯基硼酸(0.93g，5.2mmol)、碳酸鈉(2.2g，21mmol)以及催化的四(三苯基膦)鈀處理。所得溶液加熱回流12小時，然后冷卻并用乙酸乙酯萃取。所得萃取物用鹽水洗滌，在硫酸鈉上干燥，過濾并蒸發(fā)。所得殘留物用快速色譜分離，得到3-吡啶-4-基-苯甲酸乙酯(1.0g，86％)。
步驟B將3-吡啶-4-基-苯甲酸乙酯(150mg，0.66mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液用間氯過氧化苯甲酸(340mg，2.0mmol)處理。攪拌2天后，所得混合物進一步用350mg間氯過氧化苯甲酸處理，并且反應混合物加熱回流過夜。所得溶液冷卻并依次用10％亞硫酸鈉水溶液、10％碳酸鈉和鹽水洗滌。所述有機相用無水硫酸鎂干燥，過濾并蒸發(fā)，得到足夠純的3-吡啶-4-基-苯甲酸乙酯-N氧化物。所述物質(zhì)溶解在磷酰氯中，加熱回流12小時。所得反應混合物冷卻并蒸發(fā)，并且殘留物溶于乙酸乙酯。所得溶液用飽和碳酸鈉水溶液、水和鹽水洗滌，然后在硫酸鎂上干燥，過濾并蒸發(fā)。所得殘留物用快速色譜分離，得到3-(2-氯-吡啶-4-基)-苯甲酸乙酯(81mg，47％全部)。
步驟C將3-(2-氯-吡啶-4-基)-苯甲酸乙酯(81mg，0.31mmol)、碳酸鈉(99mg，0.93mmol)以及4-異丙基苯基硼酸(60mg)在乙腈-水(2mL/5mL)中的溶液用催化量的四(三苯基膦)鈀處理，并加熱回流24小時。混合物倒入水(60mL)中，并且所述混合物用二乙基醚(3×60mL)萃取。合并萃取物，用鹽水洗滌，在硫酸鎂上干燥，過濾并蒸發(fā)，得到3-[2-(4-異丙基-苯基)-吡啶-4-基]-苯甲酸乙酯(75mg，76％)。
步驟D使用標準氫氧化鋰酯水解方法，將3-[2-(4-異丙基-苯基)-吡啶-4-基]-苯甲酸乙酯轉(zhuǎn)化成目標化合物，熔點247-249℃。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.80(1H，d，J＝8Hz)，8.45(1H，s)，8.21(1H，d，J＝8hz)，7.99(2H，d，J＝9Hz)，7.98-7.94(2H，m)，7.64(1H，t，J＝8Hz)，7.52-7.48(1H，m)，7.37(2H，d，J＝9Hz)，2.99(1H，七重峰，J＝7Hz)，1.30(6H，d，J＝7Hz)。MS(ES+)m/e 319(24)，318(100)。
下列化合物可以參考上述化合物8以類似的方式制備。
化合物12
4-(2-p-甲苯基-吡啶-4-基)-苯甲酸熔點286-289℃。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ8.71(1H，br d，J＝6Hz)，8.22(1H，s)，8.12-8.02(6H，m)，7.30(2H，d，J＝9Hz)，2.36(3H，s)。MS(ES+)m/e 291(20)，290(100)。
實施例H2，6-吡啶式1-H和2-H的4，2吡啶一般可以根據(jù)路線H制備如下。
3-[6-(4-異丙基-苯基)-吡啶-2-基]-苯甲酸(化合物6)的制備。
步驟A將2，6-二溴吡啶(6.16g，26mmol)和3-乙氧羰苯基硼酸(0.5g，2.6mmol)在乙腈(20mL)中的溶液用碳酸鈉(0.88g)在水(5mL)中的溶液處理。混合物脫兩次氣，并加入催化量的四(三苯基膦)鈀。反應混合物攪拌下加熱至80℃12小時，然后冷卻、過濾并蒸發(fā)。所得殘留物在水和乙酸乙酯中分配，有機相用飽和鹽水洗滌，在硫酸鈉上干燥，過濾并蒸發(fā)。所得殘留物用柱色譜分離，得到3-(6-溴-吡啶-2-基)-苯甲酸乙酯(154mg，20％)。
步驟B將3-(6-溴-吡啶-2-基)-苯甲酸乙酯(154mg，0.5mmol)和4-異丙基苯基硼酸(83mg，0.5mmol)在乙腈中的溶液用碳酸鈉(160mg)在水(1mL)中的溶液處理?；旌衔锩搩纱螝?，并在氮氣保護下，加入催化量的四(三苯基膦)鈀。反應混合物在80℃下攪拌直至通過TLC觀察起始物質(zhì)耗盡。所得混合物冷卻、過濾并蒸發(fā)，并且所得殘留物在水和乙酸乙酯中分配。有機相用鹽水洗滌，在硫酸鈉上干燥，過濾并蒸發(fā)。所得殘留物用柱色譜提純，得到3-[6-(4-異丙基-苯基)-吡啶-2-基]-苯甲酸乙酯(120mg，69％)。
步驟C將3-[6-(4-異丙基-苯基)-吡啶-2-基]-苯甲酸乙酯(90mg)在3mL甲醇-1mL水中的溶液用氫氧化鋰水合物(50mg)處理。溶液攪拌下加熱至40-50℃12小時，然后冷卻，并用3N鹽酸水溶液中和至pH7。所得混合物用乙酸乙酯萃取，并且所得萃取物用鹽水洗滌，在硫酸鈉上干燥、過濾并蒸發(fā)得到目標產(chǎn)物粉末(70mg，85％)，熔點215-216℃。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.86(1H，s)，8.47(1H，d，J＝8Hz)，8.18(1H，d，J＝8Hz)，8.08(2H，d，J＝9Hz)，7.85(1H，t，J＝7Hz)，7.77(1H，d，J＝7Hz)，7.76(1H，d，J＝7Hz)，7.62(1H，t，J＝8Hz)，7.38(2H，d，J＝9Hz)，2.99(1H，七重峰，J＝7Hz)，1.30(6H，d，J＝7Hz)。MS(ES+)m/e 319(20)，318(100)。
下列化合物可以參考上述化合物6以類似的方式制備。
化合物144-(6-p-甲苯基-吡啶-2-基)-苯甲酸熔點283-284℃。
3-(6-苯基-吡啶-2-基)-苯甲酸(化合物24)的制備步驟A將4-乙酰基苯甲酸甲酯(5.00g，28.1mmol)在乙醇(50mL)中的混懸劑用雙(二甲基氨基)-甲氧基甲烷(7.50mL，56.1mmol)處理，并且所得混合物攪拌加熱至80℃2天。在減壓下移除溶劑，得到所需產(chǎn)物白色固體(4-(3-二甲基氨基-丙烯酰基)-苯甲酸甲酯)。
步驟B將4-(3-二甲基氨基-丙烯?；?-苯甲酸甲酯(100mg)在乙酸(5mL)中的溶液用苯乙酮和乙酸銨(77mg)處理。所得混合物在氮氣保護下，加熱至80℃18小時，然后冷卻并蒸發(fā)。所得固體在乙酸乙酯-己烷中重結(jié)晶，得到3-(6-苯基-吡啶-2-基)-苯甲酸甲酯。MS(ES+)m/e 290.2(100)。
步驟C3-(6-苯基-吡啶-2-基)-苯甲酸甲酯用氫氧化鈉皂化，并且處理得到酸目標產(chǎn)物。MS(ES+)m/e 276(100)。
本發(fā)明某些優(yōu)選化合物的熔點和質(zhì)譜數(shù)據(jù)示于下表中。


















實施例2無義抑制活性以熒光素酶介導的化學發(fā)光為基礎的基于細胞的翻譯的功能性測定(于2003年7月23日提交的國際申請PCT/US2003/023185，全文引入作為參考)可以定量地評價無義抑制的水平。在含有胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人胚腎細胞(293細胞)。這些細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有在氨基酸190位點含有提前終止密碼子的熒光素酶基因。通過定點誘變引入3個可能的無義密碼子(TAA、TAG或TGA)之一，以及緊隨所述無義密碼子的重要下游+1位點引入4個可能的核苷酸(腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鳥嘌呤)之一，以代替熒光素酶基因在該位點正常存在的蘇氨酸密碼子(ACA)。從而，含有提前終止密碼子的熒光素酶基因中的氨基酸190為TAA、TAG或TGA。對于每一個終止密碼子，在含有提前終止密碼子的熒光素酶基因中的氨基酸190之后的核苷酸可被腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鳥嘌呤(A、T、C、G)之一取代，這樣這些突變不會改變熒光酶基因的閱讀框。在圖1中展示了這些構(gòu)建體的示意圖。
由基于細胞的熒光素酶報道基因測定的如上所述的本發(fā)明的無義抑制活性如下表2所示。人胚腎293細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有在190位點含有UGA無義突變的熒光素酶報道基因構(gòu)建體，該無義突變密碼子框內(nèi)接著為腺苷酸。
由含有UGA提前終止密碼子的本發(fā)明構(gòu)建體的基于細胞的熒光素酶報道基因測定，測得表2中活性測量結(jié)果。已知氨基糖苷抗生素慶大霉素允許提前終止密碼子的連讀，將其用作內(nèi)標?；钚詼y量基于在細胞內(nèi)產(chǎn)生給定蛋白所需的化合物的最小濃度與在該濃度下細胞產(chǎn)生的蛋白的量的定性比。發(fā)現(xiàn)具有非常高效價和非常高蛋白質(zhì)合成效能任一或兩者的化合物分類為“*****”。發(fā)現(xiàn)具有中等的效能和/或蛋白質(zhì)合成效率的化合物分類為“****”、“***”或“**”。類似地，發(fā)現(xiàn)具有較低的效能和/或蛋白質(zhì)合成效率的化合物分類為“*”。




在如上所述測定中的對以下構(gòu)建體的無義抑制活性示于下表3中在190位點具有在框內(nèi)繼之以腺苷酸的UAG無義突變構(gòu)建體(UAGA)；在190位點具有在框內(nèi)繼之以腺苷酸的UAA無義突變的構(gòu)建體(UAAA)?！癙OS WB”指當本發(fā)明化合物用在本發(fā)明帶有繼之以胞嘧啶核苷酸的UGA無義突變(UGAC)的測定中時，在蛋白質(zhì)印跡中產(chǎn)生陽性信號。
表3

實施例3連讀測定以熒光素酶介導的化學發(fā)光為基礎的基于細胞的翻譯功能性測定(于2003年7月23日提交的國際申請PCT/US2003/023185全文引入作為參考)可以評價mRNA中正常終止密碼子的翻譯連讀。在含有胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人胚腎細胞(293細胞)。這些細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有在氨基酸190位點含有提前終止密碼子的熒光素酶基因。通過定點誘變引入3個可能的無義密碼子(TAA、TAG或TGA)之一，以及在緊隨所述無義密碼子的重要下游+1位點引入4個可能的核苷酸(腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鳥嘌呤)之一，以代替熒光素酶基因在該位點正常存在的蘇氨酸密碼子(ACA)。從而，含有提前終止密碼子的熒光素酶基因中的氨基酸190為TAA、TAG或TGA。對于每一個終止密碼子，在含有提前終止密碼子的熒光素酶基因中的氨基酸190之后的核苷酸可被腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鳥嘌呤(A、T、C、G)之一取代，這樣這些突變不會改變熒光酶基因的閱讀框。在圖1中展示了這些構(gòu)建體的示意圖。
本發(fā)明的另一測定可以評估促進無義突變抑制的化合物。如上所述在圖1中展示的熒光素酶構(gòu)建體在熒光素酶蛋白的N-端設計為帶有兩個表位標簽?；跓晒馑孛傅鞍椎漠a(chǎn)生，所述構(gòu)建體定性地評價翻譯-連讀的水平。通過免疫沉淀被抑制的熒光素酶蛋白(使用抗His標簽的抗體)后，使用抗第二表位(the XpressTMepitope；Invitrogen；Carlsbad，California)抗體進行蛋白質(zhì)印跡(western blotting)來測定通過所述提前終止密碼子的抑制而產(chǎn)生的全長熒光素酶蛋白的存在。所述構(gòu)建體在圖2中展示。
當用本發(fā)明化合物處理帶有圖2構(gòu)建體的細胞時，顯示出全長蛋白產(chǎn)量增加。在處理20小時后，收集含有圖2構(gòu)建體的細胞，并使用識別His表位的抗體免疫沉淀熒光素酶蛋白。免疫沉淀后，使用XpressTM表位的抗體(Invitrogen；Carlsbad，California)進行蛋白質(zhì)印跡以檢測截短的熒光素酶(當沒有無義抑制發(fā)生時產(chǎn)生)，并檢測全長蛋白(由無義密碼子的抑制產(chǎn)生)。用測試化合物處理的細胞產(chǎn)生全長蛋白而不是連讀蛋白(例如見圖3)。如果正常終止密碼子的抑制發(fā)生，則產(chǎn)生所述連讀蛋白。本發(fā)明的化合物抑制提前終止密碼子即無義突變，但并不抑制熒光素酶mRNA中的正常終止密碼子。
本發(fā)明的化合物選擇性地作用于哺乳動物中的提前終止密碼子，而不作用于正常終止密碼子。
通過強飼法(口服)給予大鼠和犬高劑量化合物(達1800毫克/千克)，每天一次，共14天。治療之后，收集組織，制備溶胞產(chǎn)物并進行蛋白質(zhì)印跡分析。用于評價正常終止密碼子連讀的蛋白的選擇，主要基于相應的在3’-UTR內(nèi)具有與正常終止密碼子在框內(nèi)的第二終止密碼子的mRNA。在該兩個終止密碼子之間，每一被選蛋白都具有核苷酸間插序列，該序列編碼第一個終止密碼子的核糖體連讀事件中蛋白的延伸。如果所述化合物具有誘導非特異性、核糖體連讀的能力，延伸的蛋白得以用蛋白質(zhì)印跡與野生型蛋白區(qū)分開。收集大鼠的組織，并分析波形蛋白mRNA中正常終止密碼子(UAA)的抑制。沒有跡象表明發(fā)生抑制。收集用本發(fā)明化合物治療的犬的組織。沒有證據(jù)表明帶有UAG終止密碼子的β-肌動蛋白的正常終止密碼子受抑制。
在健康人志愿者中，口服給予單次劑量(200毫克/千克)本發(fā)明化合物。收集血液樣品，制備血漿，并用來自女性和男性受試者的血漿樣品進行蛋白質(zhì)印跡。使用帶有UGA終止密碼子的C-反應性蛋白(C-reactive protein，CRP)檢測用本發(fā)明化合物治療受試者是否導致了CRP mRNA中正常終止密碼子的抑制。熒光素酶測定結(jié)合提前終止測定表明了提前終止密碼子而不是正常終止密碼子的選擇性抑制。
實施例4動物模型動物模型系統(tǒng)還能用于指示本發(fā)明化合物的安全性和有效性。用感興趣的疾病、病癥或綜合癥的動物模型測試本發(fā)明化合物的生物學活性。所述動物模型包括設計含有靶RNA元件的連接功能性讀出系統(tǒng)的動物，例如轉(zhuǎn)基因小鼠。
囊性纖維化癥囊性纖維化癥的動物模型實例包括但不限于cftr(-/-)小鼠(參見例如，F(xiàn)reedman等，2001，Gastroenterology 121(4)950-7)、cftr(tmlHGU/tmlHGU)小鼠(參見例如，Bernhard等，2001，Exp Lung Res 27(4)349-66)、伴隨缺陷環(huán)磷腺苷介導的Cl(-)轉(zhuǎn)導(Cl(-)conductance)的囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)因子(CFTR)缺陷小鼠(參見例如，Stotland等，2000，Pediatr Pulmonol 30(5)413-24)和C57BL/6-Cftr(mlUNC)/Cftr(mlUNC)敲除小鼠(參見例如，Stotland等，2000，Pediatr Pulmonol30(5)413-24)。
肌營養(yǎng)不良肌營養(yǎng)不良的動物模型實例包括但不限于小鼠、倉鼠、貓、犬及線蟲(C.elegans)。肌營養(yǎng)不良的小鼠模型實例包括但不限于dy-/-(參見例如，Connolly等，2002，J Neuroimmunol 127(1-2)80-7)、肌營養(yǎng)不良伴隨肌炎(muscular dystrophywith myositis，mdm)小鼠突變(參見例如，Garvey等，2002，Genomics 79(2)146-9)、mdx小鼠(參見例如，Nakamura等，2001，Neuromuscul Disord 11(3)251-9)、utrophin-肌養(yǎng)蛋白敲除(utrophin-dystrophin knockout，dko)小鼠(參見例如，Nakamura等，2001，Neuromuscul Disord 11(3)251-9)、dy/dy小鼠(參見例如，Dubowitz等，2000，Neuromuscul Disord 10(4-5)292-8)、mdx(Cv3)小鼠模型(參見例如，Pillers等，1999，Laryngoscope 109(8)1310-2)以及肌強直的ADR-MDX突變小鼠(參見例如，Kramer等，1998，Neuromuscul Disord 8(8)542-50)。肌營養(yǎng)不良的倉鼠模型實例包括但不限于肌聚糖-缺陷(sarcoglycan-deficient)倉鼠(參見例如，Nakamura等，2001，Am J Physiol Cell Physiol 281(2)C690-9)和BIO 14.6營養(yǎng)不良倉鼠(參見例如，Schlenker & Burbach，1991，J Appl Physiol 71(5)1655-62)。肌營養(yǎng)不良的貓模型實例包括但不限于貓肥大性肌營養(yǎng)不良模型(參見例如，Gaschen & Burgunder，2001，ActaNeuropathol(Berl)101(6)591-600)。肌營養(yǎng)不良的犬模型實例包括但不限于金毛尋回犬(golden retriever)肌營養(yǎng)不良(參見例如，F(xiàn)letcher等，2001，Neuromuscul Disord11(3)239-43)和犬X-連鎖肌營養(yǎng)不良(參見例如，Valentine等，1992，Am J Med Genet42(3)352-6)。肌營養(yǎng)不良的線蟲模型在Chamberlain & Benian，2000，Curr Biol10(21)R795-7以及Culette & Sattelle，2000，Hum MoI Genet 9(6)869-77中描述。
家族性高膽固醇血癥家族性高膽固醇血癥的動物模型實例包括但不限于缺乏功能性低密度脂蛋白受體報道基因的小鼠(參見例如，Aji等，1997，Circulation 95(2)430-7、Yoshida大鼠(參見例如，F(xiàn)antappie等，1992，Life Sci 50(24)1913-24)、JCRLA-cp大鼠(參見例如，Richardson等，1998，Atherosclerosis 138(1)135-46)、豬(參見例如，Hasler-Rapacz等，1998，Am J Med Genet 76(5)379-86)和Watanabe遺傳性高脂血癥兔(參見例如，Tsutsumi等，2000，Arzneimittelforschung 50(2)118-21；Harsch等，1998，Br J Pharmacol124(2)227-82；和Tanaka等，1995，Atherosclerosis 114(1)73-82)。
人類癌癥人類癌癥動物模型實例一般包括但不限于伙伴動物(companion animals)的自發(fā)性產(chǎn)生腫瘤(參見例如，Vail & MacEwen，2000，Cancer Invest 18(8)781-92)。肺癌的動物模型實例包括但不限于Zhang和Roth描述的肺癌動物模型(1994，In Vivo8(5)755-69)以及p53功能喪失的轉(zhuǎn)基因小鼠(參見例如，Morris等，1998，J La StateMed Soc 150(4)179-85)。乳癌的動物模型實例包括但不限于過度表達細胞周期蛋白D1的轉(zhuǎn)基因小鼠(參見例如，Hosokawa等，2001，Transgenic Res 10(5)471-8)。結(jié)腸癌的動物模型實例包括但不限于TCRβ和p53雙敲除小鼠(參見例如，Kado等，2001，Cancer Res 61(6)2395-8)。胰腺癌的動物模型實例包括但不限于Panc02鼠胰腺癌轉(zhuǎn)移性模型(參見例如，Wang等，2001，Int J Pancreatol 29(1)37-46)和產(chǎn)生皮下胰腺腫瘤的裸鼠(nu-nu mice)(參見例如，Ghaneh等，2001，Gene Ther 8(3)199-208)。非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma)的動物模型實例包括但不限于重度聯(lián)合免疫缺陷癥(severe combined immunodeficiency，″SCID″)小鼠(參見例如，Bryant等，2000，Lab Invest 80(4)553-73)以及IgHmu-HOX11轉(zhuǎn)基因小鼠(參見例如，Hough等，1998，Proc Natl Acad Sci USA 95(23)13853-8)。食管癌的動物模型實例包括但不限于轉(zhuǎn)有人乳頭瘤病毒屬型16E7致癌基因的轉(zhuǎn)基因小鼠(參見例如，Herber等，1996，J Virol 70(3)1873-81)。結(jié)腸直腸癌的動物模型實例包括但不限于Apc小鼠模型(參見例如，F(xiàn)odde & Smits，2001，Trends MoI Med 7(8)369-73和Kuraguchi等，2000，Oncogene 19(50)5755-63)。多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤的動物模型實例包括但不限于突變體NF1小鼠(參見例如，Cichowski等，1996，Semin Cancer Biol 7(5)291-8)。成視網(wǎng)膜細胞瘤的動物模型實例包括但不限于在視網(wǎng)膜內(nèi)表達猿猴病毒40T抗原轉(zhuǎn)基因小鼠(參見例如，Howes等，1994，Invest Ophthalmol Vis Sci 35(2)342-51和Windle等，1990，Nature 343(6259)665-9)和近親交配大鼠(參見例如，Nishida等，1981，CurrEye Res 1(1)53-5和Kobayashi等，1982，Acta Neuropathol(Berl)57(2-3)203-8)。維爾姆斯氏腫瘤(Wilm′s tumor)的動物模型實例包括但不限于WT1敲除小鼠(參見例如，Scharnhorst等，1997，Cell Growth Differ 8(2)133-43)、具有腎胚細胞瘤高發(fā)病率的大鼠亞系(參見例如，Mesfin & Breech，1996，Lab Anim Sci 46(3)321-6)和具有維爾姆斯氏腫瘤的Wistar/Furth大鼠(參見例如，Murphy等，1987，Anticancer Res7(4B)717-9)。
視網(wǎng)膜色素變性視網(wǎng)膜色素變性的動物模型實例包括但不限于皇家外科醫(yī)師學會(RoyalCollege of Surgeons，″RCS″)大鼠(參見例如，Vollrath等，2001，Proc Natl Acad SciUSA 98(22)；12584-9和Hanitzsch等，1998，Acta Anat(Basel)162(2-3)119-26)、視紫紅質(zhì)敲除大鼠(參見例如，Jaissle等，2001，Invest Ophthalmol Vis Sci 42(2)506-13)和Wag/Rij大鼠(參見例如，Lai等，1980，Am J Pathol 98(1)281-4)。
肝硬化肝硬化的動物模型實例包括但不限于四氯化碳暴露(CCl4-exposed)大鼠(參見例如，Kloehn等，2001，Horm Metab Res 33(7)394-401)以及細菌細胞成分或大腸炎引發(fā)的嚙鼠動物模型(參見例如，Vierling，2001，Best Pract Res Clin Gastroenterol15(4)591-610)。
血友病血友病的動物模型實例包括但不限于血友病A的嚙鼠動物模型(參見例如，Reipert等，2000，Thromb Haemost 84(5)826-32；Jarvis等，1996，Thromb Haemost 75(2)318-25；以及Bi等，1995，Nat Genet 10(1)119-21)、血友病A的犬模型(參見例如，Gallo-Penn等，1999，Hum Gene Ther 10(11)1791-802和Connelly等，1998，Blood91(9)；3273-81)、血友病B的鼠類模型(參見例如，Snyder等，1999，Nat Med 5(1)64-70；Wang等，1997，Proc Natl Acad Sci USA 94(21)11563-6；以及Fang等，1996，Gene Ther3(3)217-22)、血友病B的犬模型(參見例如，Mount等，2002，Blood 99(8)2670-6；Snyder等，1999，Nat Med 5(1)64-70；Fang等，1996，Gene Ther 3(3)217-22)；以及Kay等，1994，Proc Natl Acad Sci USA 91(6)2353-7)和血友病B的獼猴模型(參見例如，Lozier等，1999，Blood 93(6)1875-81)。
馮·維勒布蘭德病馮·維勒布蘭德病的動物模型實例包括但不限于近親交配鼠品系RIIIS/J(參見例如，Nichols等，1994，83(11)3225-31和Sweeney等，1990，76(11)2258-65)、注射美洲矛頭蝮毒蛋白的大鼠(參見例如，Sanders等，1988，Lab Invest 59(4)443-52)以及馮·維勒布蘭德病的豬模型(參見例如，Nichols等，1995，Proc Natl Acad Sci USA92(7)2455-9；Johnson & Bowie，1992，J Lab Clin Med 120(4)553-8)；以及Brinkhous等，1991，Mayo Clin Proc 66(7)733-42)。
β地中海貧血癥β地中海貧血癥的動物模型實例包括但不限于珠蛋白基因突變的鼠類模型(參見例如，Lewis等，1998，Blood 91(6)2152-6；Raja等，1994，Br J Haematol 86(1)156-62；Popp等，1985，445432-44；和Skow等，1983，Cell 34(3)1043-52)。
腎結(jié)石腎結(jié)石的動物模型實例包括但不限于遺傳性高鈣尿大鼠(genetic hypercalciuricrats)(參見例如，Bushinsky等，1999，Kidney Int 55(1)234-43以及Bushinsky等，1995，Kidney Int 48(6)1705-13)、化學處理的大鼠(參見例如，Grases等，1998，Scand J UrolNephrol 32(4)261-5；Burgess等，1995，Urol Res 23(4)239-42；Kumar等，1991，J Urol146(5)1384-9；Okada等，1985，Hinyokika Kiyo 31(4)565-77；和Bluestone等，1975，Lab Invest 33(3)273-9)、高草酸尿的大鼠(參見例如，Jones等，1991，J Urol 145(4)868-74)、單側(cè)退行性可曲腎鏡檢查(flexible nephroscopy)的豬(參見例如，Seifmah等，2001，57(4)832-6)以及上泌尿道梗阻的兔(參見例如，Itatani等，1979，Invest Urol17(3)234-40)。
共濟失調(diào)性毛細血管擴張癥共濟失調(diào)性毛細血管擴張癥的動物模型實例包括但不限于共濟失調(diào)性毛細血管擴張癥的鼠類模型(參見例如，Barlow等，1999，Proc Natl Acad Sci USA 96(17)9915-9和Inoue等，1986，Cancer Res 46(8)3979-82)。
溶酶體貯積癥溶酶體貯積癥的動物模型實例包括但不限于粘多糖增多癥VII型小鼠模型(參見例如，Brooks等，2002，Proc Natl Acad Sci USA.99(9)6216-21；Monroy等，2002，Bone 30(2)352-9；Vogler等，2001，Pediatr Dev Pathol 4(5)421-33；Vogler等，2001，Pediatr Res.49(3)342-8；以及Wolfe等，2000，Mol Ther.2(6)552-6)、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良小鼠模型(參見例如，Matzner等，2002，Gene Ther.9(1)53-63)、桑德霍夫病(Sandhoff disease)小鼠模型(參見例如，Sango等，2002，Neuropathol Appl Neurobiol28(1)23-34)、粘多糖增多癥III A型小鼠模型(參見例如，Bhattacharyya等，2001，Glycobiology ll(1)99-10和Bhaumik等，1999，Glycobiology 9(12)1389-96.)、芳基硫酸酯酶A(arylsulfatase A，ASA)缺陷小鼠(參見例如，D′Hooge等，1999，Brain Res.847(2)352-6和D′Hooge等，1999，Neurosci Lett.273(2)93-6)、天冬氨酰葡糖胺尿癥的突變小鼠(參見例如，Jalanko等，1998，Hum Mol Genet.7(2)265-72)、粘多糖增多癥VI型貓模型(參見例如，Crawley等，1998，J Clin Invest.101(1)109-19和Norrdin等，1995，Bone 17(5)485-9)、尼曼匹克癥C型貓模型(參見例如，March等，1997，ActaNeuropathol(Berl).94(2)164-72)、酸性鞘磷脂酶缺陷小鼠(參見例如，Otterbach &Stoffel，1995，Cell 81(7)1053-6)和甘露糖苷過多癥牛(參見例如，Jolly等，1975，BirthDefects Orig Arctic Ser.11(6)273-8)。
結(jié)節(jié)性硬化癥(Tuberous Sclerosis)結(jié)節(jié)性硬化癥的動物模型實例包括但不限于TSC1小鼠模型(參見例如，Kwiatkowski等，2002，Hum Mol Genet.11(5)525-34)、Tsc1(TSC1同系物)敲除小鼠(參見例如，Kobayashi等，2001，Proc Natl Acad Sci USA.2001 Jul 17；98(15)8762-7)、TSC2基因突變體(Eker)大鼠模型(參見例如，Hino 2000，Nippon Rinsho 58(6)1255-61；Mizuguchi等，2000，J Neuropathol Exp Neurol.59(3)188-9；以及Hino等，1999，ProgExp Tumor Res.3595-108)和Tsc2(+/-)小鼠(參見例如，Onda等，1999，J Clin Invest.104(6)687-95)。
實施例5mdx小鼠動物模型研究已經(jīng)證明引起427kDa肌養(yǎng)蛋白多肽翻譯提前終止的mdx小鼠中的突變是在外顯子23中3185位置上C到T的轉(zhuǎn)變(Sicinski等，Science 244(4912)1578-1580(1989))。按照以前記載的方法制備得自1天齡mdx小鼠的原代骨髂肌培養(yǎng)物(Barton-Davis等，J.Clin.Invest.104(4)375-381(1999))。細胞在本發(fā)明化合物存在下培養(yǎng)10天。每四天更換培養(yǎng)基，并且通過以前記載的免疫染色法(Barton-Davis等，J.Clin.Invest.104(4)375-381(1999))測定成肌細胞培養(yǎng)物中肌養(yǎng)蛋白的存在。使用未經(jīng)稀釋的肌養(yǎng)蛋白C-端的第一單克隆抗體，結(jié)合抗鼠IgG的若丹明用作第二抗體。所述抗體檢測通過抑制無義密碼子產(chǎn)生的全長蛋白。用Leica DMR顯微鏡、數(shù)碼相機以及關(guān)聯(lián)的成像軟件觀察染色。
如以前記載(Barton-Davis等，J.Clin.Invest.104(4)375-381(1999))，通過植入麻醉小鼠皮下的Alzet滲透泵來傳遞化合物。本發(fā)明的每種化合物給藥兩個劑量。慶大霉素作為陽性對照，并且僅裝有溶劑的泵作為陰性對照。泵中裝載適量的化合物，從而暴露于組織的計算劑量為10mM和20mM。計算所述慶大霉素的濃度達到組織暴露大約200mM。在試驗初期，治療小鼠14天，之后用氯胺酮(ketamine)麻醉動物并放血。然后離體分離、冷凍實驗動物的脛骨前肌(tibialis anterior，TA)，并用于免疫熒光分析橫紋肌中的肌養(yǎng)蛋白的摻入。通過以前記載的免疫染色(Barton-Davis等，J.Clin.Invest.104(4)375-381(1999))檢測TA肌肉中肌養(yǎng)蛋白的存在。
蛋白印跡分析使用市售的肌養(yǎng)蛋白抗體，通過蛋白印跡分析得自本發(fā)明化合物治療4周的mdx小鼠的四頭肌。提取自野生小鼠四頭肌的蛋白作為陽性對照。觀察在受治療小鼠中全長肌養(yǎng)蛋白的產(chǎn)生。全長肌養(yǎng)蛋白產(chǎn)生的量，作為無義抑制的結(jié)果但不限于此理論，大約為野生表達水平的10％。
免疫熒光用本發(fā)明不同的化合物(每一種化合物至少n＝2)治療雄性mdx小鼠(9-11周齡)。每天注射一次25毫克/千克的適量所述化合物，注射兩周。在兩周治療后，處死小鼠移出肌肉檢測肌養(yǎng)蛋白連讀效率。
使用肌養(yǎng)蛋白抗體，在10微米冷凍切片上完成免疫熒光(Immunofluorescence，IF)。所述抗體識別mdx小鼠中發(fā)現(xiàn)的提前終止突變體C-端表位。圖像分析以同樣的方式在所有切片上分析。分析來自治療或未治療小鼠的圖像，信號強于未治療對照上的信號認為陽性，表明提前終止密碼子抑制在肌養(yǎng)蛋白mRNA中發(fā)生。
肌肉力學離體全面肌肉力學在來自動物的長伸肌(extensor digitorum longus，EDL)肌肉上進行。最適肌肉長度(Optimum muscle length，Lo)定義為產(chǎn)生最大顫搐張力(twitchtension)的長度。最適肌肉長度處的最大強直性張力使用120赫茲、500毫秒脈沖在超大電壓下測量。監(jiān)測通過一系列5個偏心性強直收縮誘導的抗機械性損傷的保護。所述測量利用700毫秒刺激周期完成，在該期間內(nèi)肌肉最初500毫秒保持等長收縮，然后以0.5Lo/秒的速率伸長8％或10％的Lo?？箼C械性損傷的保護在80赫茲刺激頻率下評定。以在第一次和最后一次偏心性收縮之間的力量損失測定損傷。
實施例6p53基因中的無義突變抑制為制備動物模型系統(tǒng)，將CAOV-3細胞(1×107)注射到裸鼠(nude/nude mice)的側(cè)腹。12天后，小鼠隨機分組(每組10只小鼠)，并用3毫克/千克本發(fā)明化合物皮下治療(每周5天)，或用30毫克/千克本發(fā)明化合物腹膜內(nèi)治療(每周1天)。每周測量腫瘤體積。通過本發(fā)明的化合物在p53基因中的無義突變抑制能抑制癌癥在體內(nèi)生長。
實施例7本發(fā)明化合物能修飾對特異性核苷酸28S rRNA的接近以前的研究已經(jīng)證明慶大霉素以及其他降低翻譯忠實度的氨基糖苷家族的成員結(jié)合16S rRNA的A位點。通過化學足跡法(chemical footprinting)、紫外交聯(lián)以及核磁共振，已證實慶大霉素在核苷酸1406、1407、1494和1496處結(jié)合所述16S rRNA的A位點(包括核苷酸1400-1410和1490-1500，大腸桿菌編號)(Moazed & Noller，Nature 327(6121)389-394(1978)；Woodcock等，EMBO J.10(10)3099-3103(1991)；以及Schroeder等，EMBO J.191-9(2000))。
從海拉細胞制備的核糖體與小分子(在100mM濃度下)孵育，然后用化學修飾劑(硫酸二甲酯(dimethyl sulfate，DMS)和乙氧丁酮醛(kethoxal，KE))處理?；瘜W修飾后，用苯酚-氯仿萃取rRNA，并用乙醇沉淀，在引物延伸反應中使用末端標記的雜交三種rRNA不同區(qū)域的寡聚核苷酸分析，并在6％聚丙烯酰胺凝膠上拆分。引物延伸探針覆蓋全部18S(7寡聚核苷酸引物)、28S(24寡聚核苷酸引物)和5S(一個引物)的rRNA。這些實驗中的對照包括二甲亞砜(二甲亞砜誘導的rRNA中可接近性的變化對照)、巴龍霉素(18S rRNA結(jié)合標記)以及茴香霉素(28S rRNA結(jié)合標記)。
這里引用的所有出版物以及專利申請在此全文引入作為參考，如同每一單獨出版物或?qū)＠暾埦唧w地且個別地表明引入作為參考一般。
雖然一定的實施方式已在上文詳細描述，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠清楚地理解實施方式中許多可能的不背離其教導的變化。所有這些變化均包含在本發(fā)明的權(quán)利要求內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種治療或預防由體細胞突變引起的疾病的方法，該方法包括對有此需要的患者給藥有效量的式1化合物或者式1所示化合物的藥物學可接受的鹽、水合物、溶劑化物、包合物、多晶型物、外消旋物或立體異構(gòu)體 其中W、X、Y和Z獨立地選自N或C-Ra，其中Ra為氫或C1-C4的烷基，其中W、X、Y或Z中的至少一個為N；n為0、1、2或3；R1為氰基；任選地由一個或兩個C1-C4烷基取代的氨基甲酰基；或由羥基、C1-C4烷基、或C1-C4烷氧基取代的羰基；R獨立地選自羥基；鹵素；任選地由一個或多個獨立地選擇的鹵素或羥基取代的C1-C4烷基；任選地由一個或多個獨立地選擇的鹵素或苯基取代的C1-C4烷氧基；任選地由一個或多個獨立地選擇的C1-C4烷基取代的C4-C8環(huán)烷基；-Rb基；-O-Rb基；任選地由一個或多個獨立地選擇的C1-C4烷基、氧代或-Rb基取代的五元到六元雜環(huán)；具有兩個環(huán)結(jié)構(gòu)的九元至十元雜環(huán)；由羥基、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基取代的羰基；任選地由一個或兩個C1-C4烷基取代的氨基甲酰基；硝基；氰基；任選地由羥基、C1-C4烷基或-Rb基取代的硫；任選地由羥基、C1-C4烷基或-Rb基取代的磺酰基；任選地由一個或兩個獨立地選擇的C1-C4烷基、磺?；⒒螋驶〈陌被?，其中，所述氨基磺?；芜x地由羥基、C1-C4烷基或-Rb基取代，并且其中所述氨基羰基任選地由C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、苯甲酸基或任選地由-Rb基取代的氨基所取代；或兩個R基與它們連接的苯環(huán)一起形成苯并[1，3]間二氧雜環(huán)戊烯或2，3-二氫-苯并[1，4]二噁英基；其中-Rb為任選地由下列一個或多個基團取代的C6-C8芳基羥基、鹵素、C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、C1-C4烷氧基或任選地由一個或多個C1-C4烷基取代的氨基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述式1的化合物或其藥物學可接受的鹽、水合物、溶劑化物、包合物、多晶型物、外消旋物或立體異構(gòu)體以含有所述化合物和藥物學可接受的載體或稀釋劑的組合物形式給藥。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述給藥為靜脈內(nèi)給藥。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，R1在間位或?qū)ξ弧?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，W、Y和Z各自為N，而X為C-Ra(式1-A).
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，R1為羧基，并位于間位或?qū)ξ弧?br> 7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，Ra為氫。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，n為1或2。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，n為1。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，R獨立地選自鹵素、C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基或C1-C4烷氧基。
11.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，R位于一個或多個間位、一個或多個對位、或者一個或多個間位及對位。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，Y和Z均為N，并且W和X均為C-Ra(式1-B)
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，R1為羧基，并位于間位或?qū)ξ弧?br> 14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，Ra為氫。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，n為0、1或2。
16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，n為1或2。
17.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，n為0或1。
18.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，R獨立地選自鹵素、C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4鹵代烷氧基或氨基。
19.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，R位于一個或多個間位、一個或多個對位、或者一個或多個間位及對位。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，W和Y均為N，并且X和Z均為C-Ra(式1-C)
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，R1為羧基，并位于間位或?qū)ξ弧?br> 22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，Ra為氫。
23.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，n為1或2。
24.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，n為1。
25.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，R獨立地選自C1-C4烷基。
26.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，R位于一個或多個間位、一個或多個對位、或者一個或多個間位及對位。
27.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，W和Z均為N，并且X和Y均為C-Ra(式1-D)
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中，R1為羧基，并位于間位或?qū)ξ弧?br> 29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中，Ra獨立地選自氫或甲基。
30.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中，n為1或2。
31.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中，R位于一個或多個間位、一個或多個對位、或者一個或多個間位及對位。
32.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，W為N，并且X、Y和Z各自為C-Ra(式1-E)
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中，R1為羧基，并位于間位或?qū)ξ弧?br> 34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中，Ra為氫。
35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中，n為1或2。
36.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中，n為1。
37.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中，R獨立地選自C1-C4烷基。
38.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中，R位于一個或多個間位、一個或多個對位、或者一個或多個間位及對位。
39.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，X為N，并且W、Y和Z各自為C-Ra(式1-F)
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中，R1為羧基，并位于間位或?qū)ξ弧?br> 41.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中，Ra為氫。
42.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中，n為1或2。
43.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中，n為1。
44.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中，R獨立地選自C1-C4烷基。
45.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中，R位于一個或多個間位、一個或多個對位、或者一個或多個間位及對位。
46.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，Y為N，并且W、X和Z各自為C-Ra(式1-G)
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中，R1為羧基，并位于間位或?qū)ξ弧?br> 48.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中，Ra為氫。
49.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中，n為1或2。
50.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中，n為1。
51.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中，R獨立地選自C1-C4烷基。
52.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中，R位于一個或多個間位、一個或多個對位、或者一個或多個間位及對位。
53.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，Z為N，并且W、X和Y各自為C-Ra(式1-H)
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中，R1為羧基，并位于間位或?qū)ξ弧?br> 55.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中，Ra為氫。
56.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中，n為0、1或2。
57.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中，n為1或2。
58.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中，n為0或1。
59.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中，R獨立地選自C1-C4烷基。
60.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中，R位于一個或多個間位、一個或多個對位、或者一個或多個間位及對位。
61.一種治療或預防自身免疫性疾病、血液病、膠原疾病、糖尿病、神經(jīng)退化疾病、心血管病、肺病、炎癥性疾病或中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，該方法包括對有此需要的患者給藥有效量的式1化合物或其藥物學可接受的鹽、水合物、溶劑化物、包合物、外消旋物或立體異構(gòu)體。
62.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中，所述給藥為靜脈內(nèi)給藥。
63.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中，所述自身免疫性疾病為類風濕性關(guān)節(jié)炎或移植物抗宿主病。
64.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中，所述炎癥性疾病為關(guān)節(jié)炎。
65.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中，所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病為多發(fā)性硬化、肌營養(yǎng)不良、杜興肌營養(yǎng)不良、阿爾茨海默病、神經(jīng)退化疾病或帕金森癥。
66.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中，所述血液病為血友病、馮·維勒布蘭德病、共濟失調(diào)性毛細血管擴張癥、β地中海貧血癥或腎結(jié)石。
67.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中，所述膠原疾病為成骨不全癥或硬化。
68.一種治療或預防家族性紅細胞增多癥、免疫缺陷、腎疾病、囊性纖維化癥、家族性高膽固醇血癥、視網(wǎng)膜色素變性、淀粉樣變性病、血友病、阿爾茨海默病、家族黑蒙性癡呆(Tay Sachs disease)、尼曼匹克癥、帕金森癥、動脈粥樣硬化、巨人癥、侏儒癥、甲狀腺機能亢進、衰老癥、肥胖癥、杜興肌營養(yǎng)不良或馬凡氏綜合癥的方法，該方法包括對有此需要的患者給藥有效量的式1化合物或其藥物學可接受的鹽、水合物、溶劑化物、包合物、外消旋物或立體異構(gòu)體。
69.根據(jù)權(quán)利要求68所述的方法，其中，所述給藥為靜脈內(nèi)給藥。
70.一種治療或預防人類癌癥的方法，該方法包括對有此需要的人類給藥有效量的式1化合物或其藥物學可接受的鹽、水合物、溶劑化物、包合物、外消旋物或立體異構(gòu)體。
71.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中，所述給藥為靜脈內(nèi)給藥。
72.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中，所述癌癥為頭和頸、眼、皮膚、口、咽喉、食管、胸、骨、血、肺、結(jié)腸、乙狀結(jié)腸、直腸、胃、前列腺、乳房、卵巢、腎、肝、胰腺、腦、腸、心臟或腎上腺的癌癥。
73.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中，所述化合物或其藥物學可接受的鹽、水合物、溶劑化物、包合物、外消旋物或立體異構(gòu)體包括藥物學可接受的載體或稀釋劑。
74.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中，所述癌癥為實體瘤。
75.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中，所述癌癥為肉瘤、癌、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管源性癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、維爾姆斯瘤、子宮頸癌、睪丸瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、卡波西肉瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤(menangioma)、黑素瘤、成神經(jīng)細胞瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、血液產(chǎn)生的腫瘤或多發(fā)性骨髓瘤。
76.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中，所述癌癥為急性成淋巴細胞性白血病、急性B淋巴細胞白血病、急性T淋巴細胞白血病、急性原粒細胞白血病、急性早幼粒細胞白血病、急性單核細胞性白血病、急性紅白血病、急性成巨核細胞白血病、急性髓單核細胞白血病、急性非淋巴細胞白血病、急性未分化型白血病、慢性髓細胞性白血病、慢性淋巴細胞白血病、毛細胞白血病或多發(fā)性骨髓瘤。
77.一種治療或預防與p53基因突變相關(guān)的疾病的方法，該方法包括對有此需要的患者給藥有效量的式1化合物或其藥物學可接受的鹽、水合物、溶劑化物、包合物、外消旋物或立體異構(gòu)體。
78.根據(jù)權(quán)利要求77所述的方法，其中，所述給藥為靜脈內(nèi)給藥。
79.根據(jù)權(quán)利要求77所述的方法，其中，所述疾病為肉瘤、癌、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管源性癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、維爾姆斯瘤、子宮頸癌、睪丸瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、卡波西肉瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、黑素瘤、成神經(jīng)細胞瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、血液產(chǎn)生的腫瘤或多發(fā)性骨髓瘤。
80.一種抑制癌細胞生長的方法，其包括使癌細胞與有效量的式1化合物或其藥物學可接受的鹽、水合物、溶劑化物、包合物、外消旋物或立體異構(gòu)體接觸。
81.一種在哺乳動物內(nèi)選擇性制備蛋白質(zhì)的方法，其包括在哺乳動物內(nèi)轉(zhuǎn)錄含有無義突變的基因；以及將有效量的式1化合物提供給所述哺乳動物，其中所述蛋白質(zhì)通過所述哺乳動物制得。
82.式1的化合物或者式1所示化合物的藥物學可接受的鹽、水合物、溶劑化物、包合物、多晶型物、外消旋物或立體異構(gòu)體 其中W、X、Y和Z獨立地選自N或C-Ra，其中Ra為氫或C1-C4的烷基，其中W、X、Y或Z中的至少一個為N；n為0、1、2或3；R1為氰基；任選地由一個或兩個C1-C4烷基取代的氨基甲酰基；或由羥基、C1-C4烷基、或C1-C4烷氧基取代的羰基；R獨立地選自羥基；鹵素；任選地由一個或多個獨立地選擇的鹵素或羥基取代的C1-C4烷基；任選地由一個或多個獨立地選擇的鹵素或苯基取代的C1-C4烷氧基；任選地由一個或多個獨立地選擇的C1-C4烷基取代的C4-C8環(huán)烷基；-Rb基；-O-Rb基；任選地由一個或多個獨立地選擇的C1-C4烷基、氧代或-Rb基取代的五元到六元雜環(huán)；具有兩個環(huán)結(jié)構(gòu)的九元至十元雜環(huán)；由羥基、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基取代的羰基；任選地由一個或兩個C1-C4烷基取代的氨基甲?；幌趸?；氰基；任選地由羥基、C1-C4烷基或-Rb基取代的硫；任選地由羥基、C1-C4烷基或-Rb基取代的磺酰基；任選地由一個或兩個獨立地選擇的C1-C4烷基、磺酰基、或羰基取代的氨基，其中，所述氨基磺?；芜x地由羥基、C1-C4烷基或-Rb基取代，并且其中所述氨基羰基任選地由C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、苯甲酸基或任選地由-Rb基取代的氨基所取代；或兩個R基與它們連接的苯環(huán)一起形成苯并[1，3]間二氧雜環(huán)戊烯或2，3-二氫-苯并[1，4]二噁英基；其中-Rb為任選地由下列一個或多個基團取代的C6-C8芳基羥基、鹵素、C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、C1-C4烷氧基或任選地由一個或多個C1-C4烷基取代的氨基。
83.根據(jù)權(quán)利要求83所述的化合物，其中，所述化合物選自化合物1-89。
84.具有下式的化合物(化合物No1)
全文摘要
本發(fā)明涉及通過給予本發(fā)明的化合物或組合物用于治療或預防與mRNA無義突變相關(guān)的疾病的方法、化合物和組合物。更具體地，本發(fā)明涉及用于抑制與mRNA中無義突變相關(guān)的翻譯提前終止的方法、化合物和組合物。
文檔編號A61K31/495GK101076337SQ200580042808
公開日2007年11月21日 申請日期2005年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月13日
發(fā)明者N·阿爾姆斯戴德, G·M·卡普, R·懷爾德, E·韋爾奇, 任洪玉 申請人:Ptc醫(yī)療公司