專(zhuān)利名稱(chēng)：Il－15抗原陣列及其用途的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)、公共衛(wèi)生、免疫學(xué)、分子生物學(xué)和病毒學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明提供包含病毒樣顆粒(VLP)和至少一種抗原的組合物，其中所述抗原是分別與該VLP連接的IL-15蛋白、IL-15突變蛋白或IL-15片段。
本發(fā)明也提供一種制備所述組合物的方法。本發(fā)明的組合物可以用于制備疫苗，該疫苗特別用于治療其中IL-15介導(dǎo)或貢獻(xiàn)于其病癥的疾病，特別是用于治療炎癥和/或慢性自身免疫病。而且，本發(fā)明的組合物誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答，特別是抗原應(yīng)答。而且，本發(fā)明的組合物特別可用于在特定環(huán)境內(nèi)有效誘導(dǎo)自身特異性免疫應(yīng)答。
相關(guān)技術(shù)背景技術(shù)白介素-15(IL-15)是一種致炎細(xì)胞因子，是與IL-2在結(jié)構(gòu)和功能上相關(guān)的14-15kD的糖蛋白(Tagaya等人，Immunity，1996；4329-336)。IL-15與由γ鏈(γc)、IL-2Rβ和IL-15Rα組成的異源三聚體受體結(jié)合并通過(guò)其發(fā)出信號(hào)。IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21均利用含有γ鏈的受體，而IL-2和IL-15受體也共有IL-2Rβ?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)IL-15是與IL-15Rα結(jié)合的唯一的細(xì)胞因子。IL-15以高親和力(Ka＝1×1011M-1)與單獨(dú)的IL-15Rα結(jié)合，以中等親和力(Ka＝1×109M-1)與IL-2Rβ和γ鏈復(fù)合體結(jié)合。
已經(jīng)報(bào)道了IL-15在各種細(xì)胞和組織中的組成型表達(dá)，包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角化細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞(Waldmann和Tagaya，Annu Rev Immunol.1999；1719-49；Fehniger和Caligiuri，Blood.2001；9714-32)。其表達(dá)在炎癥條件下上調(diào)，如同對(duì)于IFN-γ和LPS刺激或病毒、細(xì)菌或原生動(dòng)物感染的單核細(xì)胞所報(bào)道的那樣(Kirman等人，Inflamm Res.1998；47285-9；Waldmann等人，Int RevImmunol.1998；16205-26.Waldmann和Tagaya，Annu Rev Immunol.1999；1719-49，F(xiàn)ehniger和Caligiuri，Blood.2001；9714-32)。此外，在諸如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等慢性炎癥疾病中，局部產(chǎn)生的IL-15可能通過(guò)滑膜T細(xì)胞的募集和活化而擴(kuò)大炎癥。已經(jīng)提出這種IL-15-誘導(dǎo)的效應(yīng)在疾病的發(fā)病機(jī)理中起作用(Kirman等人，Inflamm Res.1998；47285-9.；McInnes等人，Nat.Med.1996；2175-82.；McInnes等人，Nat.Med.1997；3189-95；McInnes和Liew，Immunol Today.1998；1975-9.；Fehniger和Caligiuri，Blood.2001；9714-32.)。
已經(jīng)提出用特異性抗IL-15單克隆抗體治療大量慢性炎癥疾病和/或自身免疫病。WO0002582公開(kāi)了使用IL-15單克隆抗體治療炎性腸病。WO03017935公開(kāi)了使用IL-15單克隆抗體抑制IL-15誘導(dǎo)的促炎效應(yīng)，特別是治療牛皮癬和關(guān)節(jié)炎。
由于單克隆抗體在人體中的半衰期只有大約2-4周，因此單克隆抗體治療的缺點(diǎn)包括需要反復(fù)注射大量抗體(Kaplan，Curr Opin Invest.Drugs.2002；31017-23.)。高劑量的抗體可能導(dǎo)致副作用，如輸注病。在患者中的同種異型反應(yīng)中也可能產(chǎn)生抗-抗體，即使是使用人或人源化抗體，導(dǎo)致療效降低或者可能引起副作用。而且，與人源化單克隆抗體的高生產(chǎn)成本和需要頻繁醫(yī)院就診相關(guān)的費(fèi)用使得這種抗體治療無(wú)法用于許多有此需要的患者。

發(fā)明內(nèi)容
現(xiàn)在，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的分別包含至少一種IL-15蛋白、至少一種IL-15突變蛋白或至少一種IL-15片段的組合物和疫苗能夠誘導(dǎo)強(qiáng)免疫應(yīng)答，特別是強(qiáng)抗體應(yīng)答，導(dǎo)致抗自身抗原IL-15的高抗體效價(jià)。而且，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的組合物和疫苗分別能夠誘導(dǎo)強(qiáng)免疫應(yīng)答，特別是強(qiáng)抗體應(yīng)答，并且針對(duì)其中IL-15起關(guān)鍵作用的炎癥和/或慢性自身免疫病(如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)的誘導(dǎo)和發(fā)展具有保護(hù)和/或治療效果。此外，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的組合物和疫苗分別能夠誘導(dǎo)強(qiáng)免疫應(yīng)答，特別是強(qiáng)抗體應(yīng)答，并且針對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的誘導(dǎo)和發(fā)展具有保護(hù)和/或治療效果。這表明本發(fā)明的組合物和疫苗分別產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，特別是抗體，能夠在體內(nèi)特異性地識(shí)別IL-15并且干擾其功能。
因此，在第一方面，本發(fā)明提供一種組合物，其包含(a)具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的病毒樣顆粒(VLP)；和(b)具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一種抗原，其中所述至少一種抗原是IL-15蛋白、IL-15突變蛋白或IL-15片段，并且其中(a)和(b)通過(guò)所述至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和所述至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)連接，優(yōu)選地形成有序且重復(fù)的抗原陣列。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，適合在本發(fā)明中使用的病毒樣顆粒包含病毒，優(yōu)選RNA噬菌體的重組蛋白，優(yōu)選重組外殼蛋白、其突變體或片段。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含至少一種IL-15突變蛋白。IL-15突變蛋白不具有IL-15的生物活性，而優(yōu)選保持與IL-15幾乎相同的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。IL-15是有力的T細(xì)胞刺激細(xì)胞因子。因此，本發(fā)明的包含IL-15突變蛋白的組合物提供在治療上有效的藥物，而通常避免將生物活性IL-15導(dǎo)入體內(nèi)。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含至少一種IL-15片段，其中該片段包含IL-15的至少一個(gè)抗原性位點(diǎn)。IL-15片段用于本發(fā)明確保了強(qiáng)有力的和保護(hù)性的免疫應(yīng)答，特別是抗體應(yīng)答，同時(shí)可以減少可能的自身特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種疫苗組合物。而且，本發(fā)明提供一種給人或動(dòng)物，優(yōu)選給哺乳動(dòng)物施用該疫苗組合物的方法。本發(fā)明的疫苗組合物在不存在至少一種佐劑的情況下能夠誘導(dǎo)強(qiáng)免疫應(yīng)答，特別是抗體應(yīng)答。因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該疫苗不含佐劑。避免使用佐劑可以減少不希望的炎性T細(xì)胞應(yīng)答的可能的發(fā)生。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，組合物和疫苗組合物中分別包含的本發(fā)明的VLP在宿主中重組產(chǎn)生，并且RNA噬菌體的VLP基本不含宿主RNA或宿主DNA，優(yōu)選宿主核酸。減少或者優(yōu)選消除宿主RNA或宿主DNA的量是有利的，可以避免不希望的T細(xì)胞應(yīng)答以及其它不希望的副作用，如發(fā)熱。
一方面，本發(fā)明提供一種治療動(dòng)脈粥樣硬化、哮喘或其中IL-15蛋白介導(dǎo)或貢獻(xiàn)于其病癥的炎癥和/或自身免疫病的方法，其中該方法包括分別給動(dòng)物或人施用本發(fā)明的組合物或本發(fā)明的疫苗組合物。其中IL-15蛋白介導(dǎo)或貢獻(xiàn)于其病癥的炎癥和/或自身免疫病是，例如但不限于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、克羅恩病。
在另一方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的組合物和可接受的藥物載體的藥物組合物。
再另一方面，本發(fā)明提供一種制備本發(fā)明的組合物的方法，包括(a)提供具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的VLP；(b)提供具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一種抗原，其中所述抗原是IL-15蛋白、IL-15突變蛋白或IL-15片段；和(c)將所述VLP與所述至少一種抗原相組合，產(chǎn)生所述組合物，其中所述至少一種抗原和所述VLP通過(guò)所述至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和所述至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)連接。


圖1示出了用QβVLP-IL-15免疫的小鼠中關(guān)節(jié)炎的平均臨床得分。圖1A示出了用50μg QβVLP-IL-15免疫的小鼠和只接受PBS的小鼠的關(guān)節(jié)炎的平均臨床得分。圖1B示出了用25μg QβVLP-IL-15免疫的小鼠和只用Qβ免疫的小鼠的關(guān)節(jié)炎的平均臨床得分。對(duì)每個(gè)接種組以平均得分畫(huà)出線(xiàn)條。
圖2示出了Apoe-/-小鼠中動(dòng)脈粥樣硬化斑塊負(fù)荷的定量和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。線(xiàn)條表示用Qβ-IL-15(黑色線(xiàn)條)或用Qβ(白色線(xiàn)條)免疫的Apoe-/-小鼠的主動(dòng)脈中平均動(dòng)脈粥樣硬化斑塊負(fù)荷的百分?jǐn)?shù)。誤差條表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。
發(fā)明詳述抗原此處所用的術(shù)語(yǔ)“抗原”指如果被MHC分子呈遞，即能夠被抗體或T細(xì)胞受體(TCR)結(jié)合的分子。此處所用的術(shù)語(yǔ)“抗原”也包括T細(xì)胞表位。抗原還能夠被免疫系統(tǒng)識(shí)別，以及/或者能夠誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答，導(dǎo)致B和/或T淋巴細(xì)胞的活化。然而，至少在某些情況下，這可能需要抗原含有或者連接于Th細(xì)胞表位，并且包含于佐劑中。一個(gè)抗原可能包含一個(gè)或多個(gè)表位(B和T表位)。上面提到的特異性反應(yīng)指抗原優(yōu)選地一般以高選擇性方式與其相應(yīng)的抗體或TCR反應(yīng)，而不與可能由其它抗原誘導(dǎo)的其它許多抗體或TCR反應(yīng)。此處所用的抗原也可以是幾種不同抗原的混合物。
抗原性位點(diǎn)術(shù)語(yǔ)“抗原性位點(diǎn)”和術(shù)語(yǔ)“抗原性表位”在本文中可以互換使用，是指一種多肽的連續(xù)或不連續(xù)的部分，它可以被抗體或在MHC分子環(huán)境內(nèi)被T細(xì)胞受體免疫特異性地結(jié)合。免疫特異性結(jié)合不包括非特異性結(jié)合，但是不一定排除交叉反應(yīng)性?？乖晕稽c(diǎn)在對(duì)于該抗原性位點(diǎn)而言獨(dú)特的空間構(gòu)象中一般包含5-10個(gè)氨基酸。
連接的如此處所用的術(shù)語(yǔ)“連接的”(或其名詞連接)是指所有可能的方式，優(yōu)選化學(xué)相互作用，通過(guò)這種方式，兩個(gè)分子連接在一起?；瘜W(xué)相互作用包括共價(jià)和非共價(jià)的相互作用。非共價(jià)相互作用的典型例子是離子相互作用、疏水相互作用或氫鍵，而共價(jià)相互作用例如基于共價(jià)鍵如酯、醚、磷酯、酰胺、肽、碳-磷鍵、碳-硫鍵如硫醚或酰亞胺鍵。
第一附著位點(diǎn)此處所用的短語(yǔ)“第一附著位點(diǎn)”是指VLP中天然存在的或者人工添加到VLP中的一種元件，第二附著位點(diǎn)可與之連接。第一附著位點(diǎn)可以是蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次級(jí)代謝物或化合物(生物素、熒光素、視黃醇、洋地黃毒苷、金屬離子、苯甲基磺酰氟)，或化學(xué)反應(yīng)基如氨基、羧基、巰基、羥基、胍基、組氨?；蚱浣M合。作為第一附著位點(diǎn)的化學(xué)反應(yīng)基的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是氨基酸如賴(lài)氨酸的氨基。第一附著位點(diǎn)一般位于VLP的表面上，優(yōu)選外表面上。多個(gè)第一附著位點(diǎn)一般以重復(fù)構(gòu)型存在于病毒樣顆粒的表面上，優(yōu)選外表面上。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一附著位點(diǎn)與VLP通過(guò)至少一個(gè)共價(jià)鍵，優(yōu)選通過(guò)至少一個(gè)肽鍵連接。
第二附著位點(diǎn)如此處使用的短語(yǔ)“第二附著位點(diǎn)”是指天然存在于或者人工添加到本發(fā)明的IL-15上的一種元件，第一附著位點(diǎn)可以與之連接。本發(fā)明的IL-15的第二附著位點(diǎn)可以是蛋白質(zhì)、多肽、肽、氨基酸、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次級(jí)代謝產(chǎn)物或化合物(生物素、熒光素、視黃醇、洋地黃毒苷、金屬離子、苯甲基磺酰氟)、或化學(xué)反應(yīng)基例如氨基、羧基、巰基、羥基、胍基、組氨?；?、或其組合。作為第二附著位點(diǎn)的化學(xué)反應(yīng)基的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是巰基，優(yōu)選氨基酸半胱氨酸的巰基。因此術(shù)語(yǔ)“具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的IL-15蛋白”、“具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的IL-15突變蛋白”、“具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的IL-15片段”或“具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的本發(fā)明的IL-15”是指包含本發(fā)明的IL-15和至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的構(gòu)建體。但是，特別是對(duì)于非天然存在于IL-15蛋白、IL-15突變蛋白或IL-15片段內(nèi)的第二附著位點(diǎn)來(lái)說(shuō)，這種構(gòu)建體典型且優(yōu)選地還含有“連接體”。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，第二附著位點(diǎn)與本發(fā)明的IL-15通過(guò)至少一個(gè)共價(jià)鍵，優(yōu)選通過(guò)至少一個(gè)肽鍵連接。在另外一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)氨基酸連接體，優(yōu)選包含半胱氨酸的連接體，通過(guò)蛋白質(zhì)融合，將第二附著位點(diǎn)人工添加到本發(fā)明的IL-15上。優(yōu)選連接體與本發(fā)明的IL-15通過(guò)肽融合。
外殼蛋白本申請(qǐng)中的術(shù)語(yǔ)“外殼蛋白”和可交換使用的術(shù)語(yǔ)“衣殼蛋白”是指能夠摻入病毒衣殼或VLP內(nèi)的病毒蛋白質(zhì)，優(yōu)選病毒(優(yōu)選RNA噬菌體)的天然衣殼的亞單位。典型且優(yōu)選地，術(shù)語(yǔ)“外殼蛋白”是指由病毒，優(yōu)選RNA噬菌體的基因組或病毒，優(yōu)選RNA噬菌體的變體的基因組編碼的外殼蛋白。更優(yōu)選地，例如，術(shù)語(yǔ)“AP205的外殼蛋白”是指SEQ ID NO14或其中從SEQ ID NO14上切下第一個(gè)甲硫氨酸的氨基酸序列。更優(yōu)選地，例如，術(shù)語(yǔ)“Qβ的外殼蛋白”是指SEQ ID NO1(″QβCP″)和SEQ ID NO2(A1)，其在N末端含有或不含甲硫氨酸。噬菌體Qβ的衣殼主要由QβCP組成，含有少量A1蛋白。
本發(fā)明的IL-15如本文所用的術(shù)語(yǔ)“本發(fā)明的IL-15”是指如這里定義的至少一種IL-15蛋白、至少一種IL-15突變蛋白或至少一種IL-15片段或其任意組合。
IL-15蛋白如本文所用的術(shù)語(yǔ)“IL-15蛋白”應(yīng)當(dāng)包括任何包含或可替代地或優(yōu)選地由以下IL-15組成的多肽SEQ ID NO23的人IL-15、SEQ ID NO24的小鼠IL-15、SEQ ID NO25的大鼠IL-15、或來(lái)自任何其他動(dòng)物的相應(yīng)的直向同源物。另外，如此處所用的術(shù)語(yǔ)“IL-15蛋白”應(yīng)當(dāng)也包括任何包含或者可替代地或優(yōu)選地由任何天然或基因工程變體組成的多肽，這些變體與SEQ ID NO23的人IL-15、SEQ ID NO24的小鼠IL-15、SEQ ID NO25的大鼠IL-15、或來(lái)自任何其他動(dòng)物的相應(yīng)直向同源物具有大于70％，優(yōu)選大于80％，優(yōu)選大于85％，甚至更優(yōu)選大于90％，更優(yōu)選大于95％，最優(yōu)選大于97％的氨基酸序列同一性。如此處所用的術(shù)語(yǔ)“IL-15蛋白”應(yīng)當(dāng)還包括翻譯后修飾，包括但不限于如上定義的IL-15蛋白的糖基化、乙酰化、磷酸化。優(yōu)選地，如本文定義的IL-15蛋白由長(zhǎng)度最多為500個(gè)氨基酸，更優(yōu)選最多300個(gè)氨基酸，更優(yōu)選最多200個(gè)氨基酸，再優(yōu)選最多150個(gè)，進(jìn)一步優(yōu)選最多130個(gè)氨基酸組成。典型且優(yōu)選地，IL-15蛋白能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生能夠與IL-15特異性結(jié)合的抗體，例如，這通過(guò)ELISA來(lái)證實(shí)。
IL-15突變蛋白本文使用的術(shù)語(yǔ)“IL-15突變蛋白”應(yīng)當(dāng)包括是IL-15蛋白但是不具有IL-15生物活性的任何多肽。更優(yōu)選地，術(shù)語(yǔ)“IL-15突變蛋白”是指與SEQ ID NO23的人IL-15、SEQ ID NO24的小鼠IL-15、SEQ ID NO25的大鼠IL-15、或來(lái)自任何其他動(dòng)物的相應(yīng)直向同源物有至少一個(gè)且最多6個(gè)，優(yōu)選最多5個(gè)，更優(yōu)選最多4個(gè)，更優(yōu)選最多3個(gè)，更優(yōu)選最多2個(gè)，最優(yōu)選最多1個(gè)氨基酸不同的任何多肽，并且所述多肽不具有IL-15的生物活性。典型且優(yōu)選地，包含IL-15突變蛋白的本發(fā)明的組合物能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)特異性結(jié)合IL-15的抗體的產(chǎn)生。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“IL-15生物活性”是指刺激T淋巴細(xì)胞增殖和/或分化的能力。
EP 0772624的實(shí)施例2中公開(kāi)了一種測(cè)定IL-15生物活性的典型且優(yōu)選的測(cè)定法，在此引用作為參考。在使用相應(yīng)野生型IL-15作為陽(yáng)性對(duì)照的相同實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)IL-15蛋白。相應(yīng)的野生型IL-15是指與IL-15蛋白相同種類(lèi)的IL-15。進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，例如Bradford測(cè)定，以確保在相同實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)在化學(xué)計(jì)量上等量的IL-15蛋白突變體和用作陽(yáng)性對(duì)照的相應(yīng)野生型IL-15。如果待測(cè)的IL-15的量與用作陽(yáng)性對(duì)照的相應(yīng)野生型IL-15的量彼此相差不超過(guò)3％，優(yōu)選不超過(guò)1％，則認(rèn)為其為等量。
如果一種特定的IL-15蛋白與等量的用作陽(yáng)性對(duì)照的相應(yīng)野生型IL-15相比具有其最多20％，優(yōu)選10％，更優(yōu)選5％，更優(yōu)選1％，更優(yōu)選0.2％的IL-15生物活性，則其不具有IL-15的生物活性。
IL-15片段在此使用的術(shù)語(yǔ)“IL-15片段”應(yīng)當(dāng)包括任何包含或可替代地或優(yōu)選地由這里定義的IL-15蛋白或IL-15突變蛋白的至少4，5，6，7，8，9，10，11，12，17，18，19，20，25，30個(gè)連續(xù)氨基酸組成的多肽，以及任何與它們具有65％以上、優(yōu)選80％以上、優(yōu)選85％以上、更優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上氨基酸序列同一性的多肽。優(yōu)選地，本文使用的術(shù)語(yǔ)“IL-15片段”應(yīng)當(dāng)包括任何包含或可替代地或優(yōu)選地由這里定義的IL-15蛋白或IL-15突變蛋白的至少6個(gè)連續(xù)氨基酸組成的多肽，以及任何與它們具有80％以上、優(yōu)選85％以上、更優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上氨基酸序列同一性的多肽。IL-15片段的優(yōu)選實(shí)施方案包括IL-15蛋白或IL-15突變蛋白的截短或內(nèi)部缺失形式。典型且優(yōu)選地，IL-15片段能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生能夠特異性結(jié)合IL-15的抗體。
多肽的氨基酸序列同一性可以使用諸如Bestfit程序的已知計(jì)算機(jī)程序常規(guī)確定。當(dāng)使用Bestfit或其它任何序列比對(duì)程序，優(yōu)選使用Bestfit確定一種特定序列與參照氨基酸序列是否例如95％相同時(shí)，將參數(shù)設(shè)置為使得在參照氨基酸序列的全長(zhǎng)上計(jì)算同一性百分?jǐn)?shù)，并且允許最多占參照序列中氨基酸殘基總數(shù)的5％的同源性缺口。上述測(cè)定多肽之間百分同一性的方法適用于本發(fā)明公開(kāi)的所有蛋白質(zhì)、多肽或其片段。
連接的如此處所用的術(shù)語(yǔ)“連接的”(或其名詞連接)是指所有可能的方式，優(yōu)選化學(xué)相互作用，通過(guò)這種方式，至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)連接在一起?；瘜W(xué)相互作用包括共價(jià)和非共價(jià)的相互作用。非共價(jià)相互作用的典型例子是離子相互作用、疏水相互作用或氫鍵，而共價(jià)相互作用例如基于共價(jià)鍵如酯、醚、磷酯、酰胺、肽、碳-磷鍵、碳-硫鍵如硫醚或酰亞胺鍵。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，第一附著位點(diǎn)和第二附著位點(diǎn)通過(guò)至少一個(gè)共價(jià)鍵連接，優(yōu)選通過(guò)至少一個(gè)非肽鍵連接，更優(yōu)選只通過(guò)非肽鍵連接。然而，如此處所用的術(shù)語(yǔ)“連接”應(yīng)當(dāng)不僅包括至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的直接連接，而且可替代地并且優(yōu)選地，包括至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)通過(guò)中間分子的間接連接，典型且優(yōu)選地通過(guò)使用至少一個(gè)，優(yōu)選一個(gè)異雙功能交聯(lián)劑連接。
連接體如此處所用的“連接體”將第二附著位點(diǎn)與本發(fā)明的IL-15連接，或者已經(jīng)包含第二附著位點(diǎn)、基本由、或由第二附著位點(diǎn)組成。優(yōu)選地，如此處所用的“連接體”已經(jīng)包含第二附著位點(diǎn)，典型且優(yōu)選地—但不是必需地—為一個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選半胱氨酸殘基。如此處所用的“連接體”也被稱(chēng)為“氨基酸連接體”，特別是當(dāng)本發(fā)明的連接體含有至少一個(gè)氨基酸殘基時(shí)。因此，術(shù)語(yǔ)“連接體”和“氨基酸連接體”在此可以交換使用。然而，這并不意味著這種連接體僅由氨基酸殘基組成，即使由氨基酸殘基組成的連接體是本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案。連接體的氨基酸殘基優(yōu)選由本領(lǐng)域已知的天然氨基酸或非天然氨基酸、其全L型或全D型或混合物組成。本發(fā)明的連接體的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案是包含巰基或半胱氨酸殘基的分子，這些分子因此也包括在本發(fā)明中?？捎糜诒景l(fā)明的其他連接體有包含C1-C6烷基、環(huán)烷基如環(huán)戊基或環(huán)己基、環(huán)烯基、芳基或雜芳基部分的分子。而且，優(yōu)選包含C1-C6烷基、環(huán)烷基(C5，C6)、芳基或雜芳基部分和其他氨基酸的連接體也可以用作本發(fā)明的連接體，并且包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。連接體與本發(fā)明的IL-15優(yōu)選通過(guò)至少一個(gè)共價(jià)鍵，更優(yōu)選通過(guò)至少一個(gè)肽鍵連接。
有序且重復(fù)的抗原陣列如此處所用的術(shù)語(yǔ)“有序且重復(fù)的抗原陣列”通常是指抗原的重復(fù)模式，或其特征在于典型且優(yōu)選地，抗原的空間排列具有與病毒樣顆粒有關(guān)的高度均一性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，這種重復(fù)模式可以是一種幾何模式。本發(fā)明的某些實(shí)施方案，例如RNA噬菌體的VLP，是合適的有序且重復(fù)的抗原陣列的典型且優(yōu)選的實(shí)例，其具有嚴(yán)格重復(fù)的類(lèi)結(jié)晶抗原排列，優(yōu)選間隔1-30納米，優(yōu)選2-15納米，更優(yōu)選2-10納米，更優(yōu)選2-8納米，進(jìn)一步更優(yōu)選1.6-7納米。
包裝如此處所用的術(shù)語(yǔ)“包裝”是指聚陰離子大分子相對(duì)于VLP的狀態(tài)。如此處所用的術(shù)語(yǔ)“包裝”包括結(jié)合，結(jié)合可以是共價(jià)的，例如化學(xué)偶聯(lián)，或者是非共價(jià)的，例如離子相互作用、疏水相互作用、氫鍵等。該術(shù)語(yǔ)也包括聚陰離子大分子的包封或部分包封。因此，聚陰離子大分子可以被VLP包封，而不需存在實(shí)際上的結(jié)合，特別是共價(jià)結(jié)合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一個(gè)聚陰離子大分子被包裝在VLP內(nèi)，最優(yōu)選地以非共價(jià)的方式。
多肽如此處所用的術(shù)語(yǔ)“多肽”是指由單體(氨基酸)通過(guò)酰胺鍵(也稱(chēng)為肽鍵)線(xiàn)性連接組成的分子。它是指氨基酸分子鏈，而不是指特定長(zhǎng)度的產(chǎn)物。因此，多肽的定義內(nèi)包括肽、二肽、三肽、寡肽和蛋白質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)也包括多肽的翻譯后修飾，例如糖基化、乙?；?、磷酸化等。
病毒顆粒在此使用的術(shù)語(yǔ)“病毒顆?！笔侵覆《镜男螒B(tài)學(xué)形式。在某些病毒類(lèi)型中，它包含由蛋白質(zhì)衣殼圍繞的基因組；另外一些具有另外的結(jié)構(gòu)(例如被膜、尾等)。
在此使用的病毒樣顆粒(VLP)涉及一種非復(fù)制性或非傳染性的，優(yōu)選非復(fù)制性且非傳染性的病毒顆粒，或者涉及一種非復(fù)制性或非傳染性的，優(yōu)選非復(fù)制性且非傳染性的類(lèi)似于病毒顆粒，優(yōu)選病毒衣殼的結(jié)構(gòu)。這里使用的術(shù)語(yǔ)“非復(fù)制性”是指不能復(fù)制VLP所含的基因組。這里使用的術(shù)語(yǔ)“非傳染性”是指不能進(jìn)入宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的病毒樣顆粒是非復(fù)制性和/或非傳染性的，因?yàn)樗狈θ炕虿糠值牟《净蚪M或基因組功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，病毒樣顆粒是其中病毒基因組已經(jīng)被物理或化學(xué)滅活的病毒顆粒。典型且更優(yōu)選地，病毒樣顆粒缺少病毒基因組的全部或部分復(fù)制性和傳染性部分。根據(jù)本發(fā)明的病毒樣顆?？赡芎信c其基因組不同的核酸。根據(jù)本發(fā)明的病毒樣顆粒的一個(gè)典型且優(yōu)選的實(shí)施方案是病毒衣殼，如相應(yīng)病毒、噬菌體，優(yōu)選RNA噬菌體的病毒衣殼。術(shù)語(yǔ)“病毒衣殼”或“衣殼”是指由病毒蛋白質(zhì)亞單位組成的大分子裝配體。典型地，有60，120，180，240，300，360和360個(gè)以上的病毒蛋白亞單位。一般且優(yōu)選地，這些亞單位的相互作用導(dǎo)致形成具有固有重復(fù)組織的病毒衣殼或病毒衣殼樣結(jié)構(gòu)，其中所述結(jié)構(gòu)一般是球形或管狀。
RNA噬菌體的病毒樣顆粒如此處使用的術(shù)語(yǔ)“RNA噬菌體的病毒樣顆粒”是指包含RNA噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段或者優(yōu)選基本由其組成或者由其組成的病毒樣顆粒。另外，RNA噬菌體的病毒樣顆粒類(lèi)似于RNA噬菌體的結(jié)構(gòu)，并且是非復(fù)制性或非傳染性的，并且至少缺少編碼RNA噬菌體的復(fù)制機(jī)制的基因，一般也缺少編碼負(fù)責(zé)病毒附著或進(jìn)入宿主的蛋白質(zhì)的基因。然而，該定義應(yīng)當(dāng)也包括上述基因仍然存在但是無(wú)活性的RNA噬菌體的病毒樣顆粒，這樣也可產(chǎn)生非復(fù)制性和/或非傳染性的RNA噬菌體的病毒樣顆粒。在本申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容中，術(shù)語(yǔ)“亞單位”和“單體”在上下文中可互換并且等同地使用。
一種或一個(gè)術(shù)語(yǔ)“一種”或“一個(gè)”在本申請(qǐng)中使用時(shí)，除非另外說(shuō)明，是指“至少一種(個(gè))”或“一種(個(gè))或一種(個(gè))以上”。
在本申請(qǐng)中，如果抗體與抗原結(jié)合的結(jié)合親和力(Ka)為106M-1或更高，優(yōu)選107M-1或更高，更優(yōu)選108M-1或更高，最優(yōu)選109M-1或更高，則該抗體被定義為特異性結(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地測(cè)定抗體的親和力(例如通過(guò)Scatchard分析)。
本發(fā)明提供增強(qiáng)動(dòng)物或人體中對(duì)IL-15的免疫應(yīng)答的組合物和方法。本發(fā)明的組合物包含(a)具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的病毒樣顆粒(VLP)；和(b)具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一種抗原，其中所述至少一種抗原是IL-15蛋白、IL-15突變蛋白或IL-15片段，并且其中(a)和(b)通過(guò)所述至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和所述至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)連接。優(yōu)選地，IL-15蛋白、IL-15突變蛋白或IL-15片段與VLP連接，從而形成有序且重復(fù)的抗原-VLP陣列。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，至少20個(gè)，優(yōu)選至少30個(gè)，更優(yōu)選至少60個(gè)，更優(yōu)選至少120個(gè)，進(jìn)一步更優(yōu)選至少180個(gè)本發(fā)明的IL-15與VLP連接。
可以選擇本領(lǐng)域公知的任何具有有序且重復(fù)的結(jié)構(gòu)的病毒作為本發(fā)明的VLP。其外殼或衣殼蛋白能夠用于制備VLP的示例性的DNA或RNA病毒已經(jīng)在WO 2004/009124的第25頁(yè)第10-21行，第26頁(yè)的第11-28行，和第28頁(yè)的第4行到第31頁(yè)的第4行公開(kāi)。這些公開(kāi)的內(nèi)容在此引入作為參考。
病毒或病毒樣顆?？梢詮牟《靖腥镜募?xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生和純化。獲得的用于疫苗目的的病毒或病毒樣顆粒需要不含毒性?？梢酝ㄟ^(guò)化學(xué)和/或物理滅活，例如紫外線(xiàn)照射、甲醛處理，產(chǎn)生無(wú)毒性的病毒或病毒樣顆粒?；蛘?，可以通過(guò)突變或刪除遺傳操作病毒基因組，使病毒不能復(fù)制。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，VLP是一種重組VLP。幾乎所有公知的病毒都已經(jīng)被測(cè)序，并且可以容易地被公眾獲得。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地確定編碼外殼蛋白的基因。通過(guò)在宿主中重組表達(dá)外殼蛋白制備VLP是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常識(shí)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，病毒樣顆粒包含或者由選自下組的病毒的重組蛋白、其突變體或片段組成a)RNA噬菌體；b)噬菌體；c)乙型肝炎病毒，優(yōu)選其衣殼蛋白(Ulrich等人，Virus Res.50141-182(1998))或其表面蛋白(WO 92/11291)；d)麻疹病毒(Warnes等人，Gene160173-178(1995))；e)辛德畢斯病毒；f)輪狀病毒(US 5,071,651和US 5,374,426)；g)口蹄疫病毒(Twomey等人，Vaccine 131603-1610，(1995))；h)諾沃克病毒(Jiang，X.等人，Science 2501580-1583(1990)；Matsui，S.M.等人，J.Clin.Invest.871456-1461(1991))；i)甲病毒；j)逆轉(zhuǎn)錄病毒，優(yōu)選其GAG蛋白(WO 96/30523)；k)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty，優(yōu)選蛋白p1；l)人乳頭瘤病毒(WO 98/15631)；m)多瘤病毒；n)煙草花葉病毒；和o)禽獸棚病毒。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，VLP包含或者由重組蛋白、其突變體或片段的一種以上的氨基酸序列，優(yōu)選兩種氨基酸序列組成。包含或者由一種以上的氨基酸序列組成的VLP在本申請(qǐng)中被稱(chēng)為嵌合VLP。
如此處使用的術(shù)語(yǔ)“重組蛋白的片段”或術(shù)語(yǔ)“外殼蛋白的片段”被定義為分別為野生型重組蛋白或外殼蛋白長(zhǎng)度的至少70％，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％，并且優(yōu)選地保留形成VLP的能力的多肽。優(yōu)選地，該片段通過(guò)至少一個(gè)內(nèi)部缺失、至少一個(gè)截短或至少一個(gè)其組合而獲得。術(shù)語(yǔ)“重組蛋白的片段”或術(shù)語(yǔ)“外殼蛋白的片段”還包括與以上定義的“重組蛋白的片段”或“外殼蛋白的片段”分別具有至少80％，優(yōu)選90％，更優(yōu)選95％的氨基酸序列同一性并且優(yōu)選能夠裝配為病毒樣顆粒的多肽。
在本發(fā)明中可以交換使用的術(shù)語(yǔ)“突變重組蛋白”或術(shù)語(yǔ)“重組蛋白突變體”，或者在本發(fā)明中可以交換使用的術(shù)語(yǔ)“突變外殼蛋白”或術(shù)語(yǔ)“外殼蛋白突變體”，分別是指具有來(lái)源于野生型重組蛋白或外殼蛋白的氨基酸序列的多肽，其中該氨基酸序列與野生型序列至少80％，優(yōu)選至少85％，90％，95％，97％或99％相同，并且優(yōu)選地保留裝配為VLP的能力。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道的，通過(guò)在大腸桿菌中表達(dá)蛋白質(zhì)，任選地通過(guò)凝膠過(guò)濾從細(xì)胞裂解物中純化衣殼，并且用免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(Ouchterlony試驗(yàn))或電子顯微鏡檢查(EM)分析衣殼的形成，可以檢測(cè)重組蛋白或外殼蛋白的片段或突變體向VLP的裝配(Kozlovska，T.M.等人，Gene 137133-37(1993))?？梢灾苯佑眉?xì)胞裂解物進(jìn)行免疫擴(kuò)散試驗(yàn)和EM。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的病毒樣顆粒是乙型肝炎病毒的病毒樣顆粒。乙型肝炎病毒樣顆粒的制備已經(jīng)在WO 00/32227、WO01/85208和WO 02/056905中公開(kāi)，所有三篇文獻(xiàn)在這里都引用以作參考。適合在本發(fā)明的實(shí)施中使用的HBcAg的其他變體在WO01/056905的第34-39頁(yè)已經(jīng)公開(kāi)。
在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，將賴(lài)氨酸殘基導(dǎo)入HBcAg多肽中，來(lái)介導(dǎo)本發(fā)明的IL-15與HBcAg的VLP的連接。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，利用包含、或由SEQ ID NO20的氨基酸1-144、或1-149、1-185組成的HBcAg制備本發(fā)明的VLP和組合物，其中該氨基酸被修飾使得第79和80位的氨基酸被替代為具有Gly-Gly-Lys-Gly-Gly氨基酸序列的肽。這個(gè)修飾將SEQ ID NO20改變?yōu)镾EQ ID NO21。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，SEQ ID NO21的第48和110位的半胱氨酸殘基，或其相應(yīng)片段，優(yōu)選1-144或1-149，被突變?yōu)榻z氨酸。本發(fā)明進(jìn)一步包括包含具有上述相應(yīng)氨基酸改變的乙型肝炎核心蛋白突變體的組合物。本發(fā)明進(jìn)一步包括分別包含HBcAg多肽的組合物和疫苗，該HBcAg多肽包含，或由與SEQID NO21至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列組成。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，病毒樣顆粒是重組甲病毒，更特別的是重組辛德畢斯病毒。甲病毒是正鏈RNA病毒，它們?cè)诟腥镜募?xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中完整復(fù)制其基因組RNA，而不需要DNA中間體(Strauss，J.和Strauss，E.，Microbiol.Rev.58491-562(1994))。甲病毒科的幾個(gè)成員，辛德畢斯病毒(Schlesinger，S.，Trends Biotechnol.1118-22(1993))、西門(mén)利啟森林病毒(SFV)(Liljestrm，P.和Garoff，H.，Bio/Technology 91356-1361(1991))及其它病毒(Davis，N.L.等人，Virology 171189-204(1989))，在作為多種不同蛋白質(zhì)的基于病毒的表達(dá)載體(Lundstrom，K.，Curr.Opin.Biotechnol.8578-582(1997))以及作為疫苗研制的候選物方面已經(jīng)受到極大關(guān)注。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的病毒樣顆粒包含、或者基本由、或者由RNA噬菌體的重組外殼蛋白、其突變體或片段組成。優(yōu)選地，該RNA噬菌體選自a)噬菌體Qβ；b)噬菌體R17；c)噬菌體fr；d)噬菌體GA；e)噬菌體SP；f)噬菌體MS2；g)噬菌體M11；h)噬菌體MX1；i)噬菌體NL95；k)噬菌體f2；l)噬菌體PP7和m)噬菌體AP205。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物包含RNA噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段，其中該外殼蛋白具有選自以下序列的氨基酸序列(a)SEQ ID NO1；涉及QβCP；(b)SEQ ID NO1和SEQID NO2的混合物(涉及QβA1蛋白)；(c)SEQ ID NO3；(d)SEQ IDNO4；(e)SEQ ID NO5；(f)SEQ ID NO6；(g)SEQ ID NO6和SEQID NO7的混合物；(h)SEQ ID NO8；(i)SEQ ID NO9；(j)SEQ IDNO10；(k)SEQ ID NO11；(l)SEQ ID NO12；(m)SEQ ID NO13；和(n)SEQ ID NO14。通常，上述外殼蛋白能夠裝配為VLP，需要或不需要存在N-末端甲硫氨酸。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，VLP是嵌合VLP，包含或者由RNA噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段的一種以上的氨基酸序列，優(yōu)選兩種氨基酸序列組成。
在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，VLP包含或者由RNA噬菌體的兩種不同的外殼蛋白組成，所述兩種外殼蛋白具有SEQ ID NO1和SEQ ID NO2，或SEQ ID NO6和SEQ ID NO7的氨基酸序列。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的病毒樣顆粒包含或者基本由或者由RNA噬菌體Qβ、fr、AP205或GA的重組外殼蛋白、其突變體或片段組成。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的VLP是RNA噬菌體Qβ的VLP。Qβ的衣殼或病毒樣顆粒顯示為二十面體噬菌體樣衣殼結(jié)構(gòu)，直徑25nm，T＝3半對(duì)稱(chēng)。該衣殼含有180個(gè)拷貝的外殼蛋白，它們通過(guò)二硫鍵連接為共價(jià)五聚體和六聚體(Golmohammadi R.等人，Structure 4543-5554(1996))，使Qβ衣殼具有顯著的穩(wěn)定性。然而，由重組Qβ外殼蛋白構(gòu)成的衣殼或VLP可能含有不通過(guò)二硫鍵與衣殼內(nèi)的其它亞單位連接的或不完全連接的亞單位。我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，高至30％的DMSO和乙腈濃度和高至1M的胍鹽濃度不影響衣殼的穩(wěn)定性。Qβ的衣殼或VLP的高穩(wěn)定性是一個(gè)有利的特征，特別是對(duì)于根據(jù)本發(fā)明免疫和接種哺乳動(dòng)物和人的用途而言。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的RNA噬菌體的，特別是Qβ和fr的病毒樣顆粒，已經(jīng)在WO02/056905中公開(kāi)，其公開(kāi)內(nèi)容在此引用作為參考。特別地，WO 02/056905的實(shí)施例18給出了由Qβ制備VLP顆粒的詳細(xì)描述。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的VLP是RNA噬菌體AP205的VLP。在本發(fā)明的實(shí)踐中也可以使用AP205 VLP的能夠裝配的突變形式，包括氨基酸5位的脯氨酸被置換為蘇氨酸的AP205外殼蛋白，導(dǎo)致本發(fā)明的其他優(yōu)選的實(shí)施方案。WO 2004/007538，特別是在實(shí)施例1和實(shí)施例2中，描述了如何獲得包含AP205外殼蛋白的VLP，以及特別是其表達(dá)和純化。WO 2004/007538在此引入作為參考。AP205 VLP具有高度免疫原性，能夠與本發(fā)明的IL-15連接，典型且優(yōu)選地產(chǎn)生展示以重復(fù)方式定向的本發(fā)明的IL-15的疫苗構(gòu)建體。產(chǎn)生針對(duì)這樣展示的本發(fā)明的IL-15的高抗體效價(jià)，這表明連接的本發(fā)明的IL-15容易與抗體分子相互作用，并且具有免疫原性。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的VLP包含或者由病毒，優(yōu)選RNA噬菌體的突變外殼蛋白組成，其中通過(guò)置換和/或通過(guò)刪除而除去至少一個(gè)賴(lài)氨酸殘基，從而修飾了該突變外殼蛋白。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的VLP包含或者由病毒，優(yōu)選RNA噬菌體的突變外殼蛋白組成，其中通過(guò)置換和/或通過(guò)插入而添加至少一個(gè)賴(lài)氨酸殘基，從而修飾了該突變外殼蛋白。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變外殼蛋白是RNA噬菌體Qβ的突變外殼蛋白，其中已經(jīng)通過(guò)置換或通過(guò)刪除除去了至少一個(gè)或至少兩個(gè)賴(lài)氨酸殘基。在一個(gè)可替代的非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變外殼蛋白是RNA噬菌體Qβ的突變外殼蛋白，其中已經(jīng)通過(guò)置換或通過(guò)插入添加了至少一個(gè)或至少兩個(gè)賴(lài)氨酸殘基。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，RNA噬菌體Qβ的突變外殼蛋白具有選自SEQ ID NO15-19中任一個(gè)的氨基酸序列。至少一個(gè)賴(lài)氨酸殘基的缺失、置換或添加可以改變偶聯(lián)程度，即病毒，優(yōu)選RNA噬菌體的每個(gè)VLP亞單位上本發(fā)明的IL-15的量，特別是，用來(lái)匹配和適應(yīng)疫苗的要求。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物和疫苗具有0.5到4.0的抗原密度。如此處所用的術(shù)語(yǔ)“抗原密度”是指VLP，優(yōu)選RNA噬菌體的VLP的每個(gè)亞單位上，優(yōu)選每個(gè)外殼蛋白上連接的本發(fā)明的IL-15的平均數(shù)。因此，該值可以計(jì)算為在本發(fā)明的組合物或疫苗中VLP，優(yōu)選RNA噬菌體的VLP的所有亞單位或單體上的平均數(shù)。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，病毒樣顆粒包含或者基本由或者由Qβ的外殼蛋白、或其突變體或片段和相應(yīng)的A1蛋白組成。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，病毒樣顆粒包含或者基本由或者由具有氨基酸序列SEQ ID NO15，16，17，18或19的突變外殼蛋白和相應(yīng)的A1蛋白組成。
AP205 VLP的能夠裝配的突變形式，包括在氨基酸5位的脯氨酸被置換成蘇氨酸、氨基酸14位的天冬酰胺置換為天冬氨酸的AP205外殼蛋白，也可以用于實(shí)施本發(fā)明，產(chǎn)生本發(fā)明另外的優(yōu)選實(shí)施方案。AP205Pro-5-Thr的克隆和VLP的純化公開(kāi)于WO 2004/007538中，特別是其實(shí)施例1和實(shí)施例2中。在此將WO 2004/007538，特別是其實(shí)施例1和實(shí)施例2的公開(kāi)內(nèi)容明確地引入作為參考。
其它一些RNA噬菌體外殼蛋白在細(xì)菌宿主中表達(dá)后也顯示自裝配(Kastelein，RA.等人，Gene 23245-254(1983)，Kozlovskaya，TM.等人，Dokl.Akad.Nauk SSSR 287452-455(1986)，Adhin，MR.等人，Virology 170238-242(1989)，Priano，C.等人，J.Mol.Biol.249283-297(1995))。特別是已經(jīng)公開(kāi)了GA(Ni，CZ，等人，Protein Sci.52485-2493(1996)，Tars，K等人，J.Mol.Biol.271759-773(1997))和fr(Pushko P.等人，Prot.Eng.6883-891(1993)，Liljas，L等人.J Mol.Biol.244279-290，(1994))的生物學(xué)和生化性質(zhì)。幾種RNA噬菌體的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)確定(Golmohammadi，R.等人，Structure 4543-554(1996))。利用這些信息，能夠確定表面暴露的殘基，從而能夠修飾RNA噬菌體的外殼蛋白，以便能夠通過(guò)插入或置換插入一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)性氨基酸殘基。來(lái)源于RNA噬菌體的VLP的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它們?cè)诩?xì)菌中的高表達(dá)產(chǎn)量，這允許以可承受的成本產(chǎn)生大量的物質(zhì)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含至少一種抗原，其中所述至少一種抗原是IL-15蛋白、IL-15片段或IL-15突變蛋白。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該IL-15蛋白、IL-15突變蛋白或IL-15片段選自以下的來(lái)源(a)人源；(b)牛來(lái)源；(c)綿羊來(lái)源；(d)狗來(lái)源；(e)貓來(lái)源；(f)小鼠來(lái)源；(g)豬來(lái)源；(h)雞來(lái)源；(i)馬來(lái)源；和(g)大鼠來(lái)源。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種抗原是IL-15蛋白。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述IL-15蛋白包含或者由選自下組的氨基酸序列組成(a)SEQ ID NO22；(b)SEQ ID NO23；(c)SEQ IDNO24；(d)SEQ ID NO25；和(e)與SEQ ID NO22-25中任一個(gè)至少80％，或者優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，或者最優(yōu)選至少95％相同的氨基酸序列。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，至少一種抗原是IL-15突變蛋白。IL-15突變蛋白不具有IL-15的生物活性，但是能夠誘導(dǎo)與IL-15特異性結(jié)合的抗體應(yīng)答。因此，使用IL-15突變蛋白作為本發(fā)明的抗原確保避免由于引入本發(fā)明的偶聯(lián)到VLP上的IL-15引起的意料之外的和不希望的副作用。在美國(guó)專(zhuān)利6013480中公開(kāi)了兩種突變蛋白，它們能夠與IL-15Rα-亞單位結(jié)合，而且不能通過(guò)IL-15受體復(fù)合體的β-或γ-亞單位轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)。沒(méi)有生物活性并且不能與α-亞單位結(jié)合的突變蛋白也已經(jīng)公開(kāi)(Bernard J.等人J Biol Chem.(2004)；279(23)24313-22)。因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，IL-15突變蛋白包含或者由選自下組的氨基酸序列組成(a)SEQ ID NO23，其中第46位不是E；(b)SEQ ID NO23，其中第50位不是I；(c)SEQ ID NO23，其中第46位不是E，并且第50位不是I；(d)SEQ ID NO31；(e)SEQ ID NO32；(f)SEQ ID NO33；(g)與SEQ ID NO23至少80％，或者優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，或者最優(yōu)選至少95％相同的氨基酸序列，其中對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO23的第46位的位點(diǎn)不是E，或者對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO23的第50位的位點(diǎn)不是I，或者對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO23的第46位的位點(diǎn)不是E并且對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO23的第50位的位點(diǎn)不是I；(h)SEQ ID NO23，其中氨基酸殘基Asp8或Gln108之一或兩個(gè)均缺失或者被置換為不同的天然存在的氨基酸；(i)SEQ ID NO23，其中氨基酸殘基Asp101或Gln108之一或兩個(gè)均缺失或者被置換為不同的天然存在的氨基酸；(j)SEQ ID NO42；(j)SEQID NO23，其中第8位不是Asp，優(yōu)選不是Asp或Glu；(k)SEQ ID NO23，其中Asp8或Gln108之一或兩個(gè)均被置換為絲氨酸或半胱氨酸；(l)SEQ IDNO23，其中第8、101、108位中的至少一個(gè)氨基酸缺失或優(yōu)選被置換。
在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，IL-15突變蛋白包含或者由SEQ ID NO23的氨基酸序列組成，其中第46位不是Glu；Asp，Gln或Asn。在另一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，IL-15突變蛋白包含或者由SEQ ID NO31的氨基酸序列組成。
在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，IL-15突變蛋白包含或者由SEQ ID NO23的氨基酸序列組成，其中第50位不是Ile或Leu。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，IL-15具有其中第50位不是Ile，Leu，Ala，Gly或Val的氨基酸序列。在另一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，IL-15突變蛋白包含或者由SEQ ID NO32的氨基酸序列組成。
在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，IL-15突變蛋白包含或者由SEQ ID NO23的氨基酸序列組成，其中第46位不是Glu；Asp，Gln或Asn，并且第50位不是Ile，Leu，Ala，Gly或Val。在另一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，IL-15突變蛋白包含或者由SEQ ID NO33的氨基酸序列組成。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種抗原是IL-15片段，其中所述IL-15片段包含或者由至少一個(gè)抗原性位點(diǎn)組成。
眾所周知，具有免疫原性通常不需要全長(zhǎng)蛋白質(zhì)，一個(gè)蛋白質(zhì)通常含有一個(gè)以上的抗原性表位，即抗原性位點(diǎn)。一個(gè)片段或短肽可能足以含有至少一個(gè)抗原性位點(diǎn)，該抗原性位點(diǎn)能夠被抗體或MHC分子環(huán)境內(nèi)的T細(xì)胞受體免疫特異性結(jié)合。一個(gè)或多個(gè)抗原性位點(diǎn)可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的大量技術(shù)確定?？梢酝ㄟ^(guò)序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)來(lái)進(jìn)行。例如，人們可以使用諸如Rasmol的程序預(yù)測(cè)可能的α-螺旋、轉(zhuǎn)角、鏈間和鏈內(nèi)二硫鍵等。人們可以進(jìn)一步預(yù)測(cè)埋藏在分子內(nèi)的序列或暴露于分子表面的序列。暴露于分子表面的序列更可能含有天然抗原性位點(diǎn)，因此在誘導(dǎo)治療性抗體中有用。在確定表面肽序列后，例如，通過(guò)飽和誘變法(如丙氨酸掃描誘變，Cunningham BC，Wells JA.Science 1989 Jun 2；244(4908)1081-5)，可以進(jìn)一步確定該序列內(nèi)的抗原性位點(diǎn)。簡(jiǎn)要地說(shuō)，將該序列內(nèi)的氨基酸一個(gè)一個(gè)地突變?yōu)楸彼?，其丙氨酸突變分別顯示與抗體(抗野生型序列)的結(jié)合降低或總體喪失結(jié)合的氨基酸可能是抗原性位點(diǎn)的成分。
測(cè)定抗原性位點(diǎn)的另一種方法是產(chǎn)生覆蓋IL-15全長(zhǎng)序列的重疊的肽(Geysen，PNAS Vol 813998-4002，(1984)和Slootstra，J.W.等人，(1996)Mol.Divers.1，87-96)。通常作為最初的篩選，可以化學(xué)合成具有5-10個(gè)氨基酸重疊、長(zhǎng)度為20-30個(gè)氨基酸的肽。用每種肽免疫小鼠，從這些小鼠中獲得多克隆血清。使用如ELISA或免疫沉淀法等各種方法可以檢測(cè)多克隆血清是否識(shí)別天然IL-15蛋白。其相應(yīng)血清識(shí)別IL-15蛋白的肽含有最可能天然的抗原性位點(diǎn)。
當(dāng)單獨(dú)用作抗原或與載體連接時(shí)，肽可以采取與其在全長(zhǎng)蛋白質(zhì)環(huán)境中不同的構(gòu)型。因此，應(yīng)當(dāng)交叉檢查肽與從IL-15免疫的小鼠中獲得的多克隆血清的結(jié)合。
此外，也用全長(zhǎng)IL-15蛋白免疫嚙齒類(lèi)動(dòng)物。通過(guò)大量方法，如ELISA、免疫沉淀法或質(zhì)譜法，檢測(cè)獲得的多克隆血清與每種單個(gè)、部分重疊的肽的交叉反應(yīng)性。(Parker和Tomer，Mol.Biotechnol.2002，20，49-62)。這些肽可以是合成的或重組來(lái)源的。
可以使用簡(jiǎn)化和促進(jìn)上述程序的技術(shù)。例如，可以隨機(jī)產(chǎn)生肽，并在噬菌體表面展示。(Nilsson，Methods Enzymol.2000；326480-505；WinterAnnu Rev Immunol.1994；12433-55；peptide phage display，Smith，Methods Enzymol.1993；217228-57)。使用SPOT技術(shù)顯著降低了所需的部分重疊肽的量(Jerini S technology；Sigma-Genosys)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，IL-15片段包含或者可替代地或優(yōu)選地由這里定義的IL-15蛋白或IL-15突變蛋白的至少5-12個(gè)連續(xù)氨基酸組成。
在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，IL-15片段由長(zhǎng)度少于60個(gè)、優(yōu)選少于50個(gè)、更優(yōu)選少于40個(gè)、優(yōu)選少于30個(gè)、優(yōu)選少于20個(gè)氨基酸組成。
在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，IL-15片段包含SEQ ID NO23的氨基酸44-52，優(yōu)選氨基酸44-54，更優(yōu)選氨基酸43-55。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，IL-15片段具有其中SEQ ID NO23的第46位不是Glu，優(yōu)選不是Glu；Asp，Gln或Asn的氨基酸序列。在一個(gè)可替代的優(yōu)選實(shí)施方案中，IL-15片段具有其中SEQ ID NO23的第50位不是Ile，優(yōu)選不是Ile，Leu，Ala，Gly或Val的氨基酸序列。
在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，IL-15片段包含SEQ ID NO23的氨基酸64-68，優(yōu)選62-70，更優(yōu)選61-73。
在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，IL-15片段包含或者由選自下組的氨基酸序列組成(a)SEQ ID NO34；(b)SEQ ID NO35；(c)SEQID NO36；(d)SEQ ID NO37；(e)SEQ ID NO38；(f)SEQ ID NO39；(g)SEQ ID NO40；和(h)與SEQ ID NO34-40中任一個(gè)至少65％，優(yōu)選至少80％，或更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，或最優(yōu)選至少95％相同的氨基酸序列。
本發(fā)明提供一種制備本發(fā)明組合物的方法，包括(a)提供具有至少一個(gè)附著位點(diǎn)的VLP；(b)提供具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一種抗原，其中所述抗原是IL-15蛋白、IL-15突變蛋白或IL-15片段；和(c)將所述VLP和所述至少一種抗原相組合，產(chǎn)生所述組合物，其中所述至少一種抗原和所述VLP通過(guò)所述第一附著位點(diǎn)和所述第二附著位點(diǎn)連接。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供具有具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一種抗原，即IL-15蛋白、IL-15突變蛋白或IL-15片段，是通過(guò)表達(dá)，優(yōu)選通過(guò)在細(xì)菌系統(tǒng)，優(yōu)選在大腸桿菌中表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。為了有利于純化過(guò)程，通常添加標(biāo)簽，如His標(biāo)簽、Myc標(biāo)簽。在另一方法中，特別可以化學(xué)合成具有不長(zhǎng)于50個(gè)氨基酸的IL-15片段。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的VLP與具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的本發(fā)明的IL-15通過(guò)至少一個(gè)肽鍵連接。編碼本發(fā)明的IL-15，優(yōu)選IL-15片段，更優(yōu)選不長(zhǎng)于50個(gè)氨基酸，更優(yōu)選不到30個(gè)氨基酸的片段的基因，符合讀框地連接到編碼VLP外殼蛋白的基因的內(nèi)部或優(yōu)選N末端或C末端。也可以通過(guò)將IL-15片段的序列插入部分外殼蛋白序列已經(jīng)缺失的外殼蛋白突變體(其進(jìn)一步稱(chēng)為截短突變體)中實(shí)現(xiàn)融合。截短突變體可以具有N末端或C末端，或者內(nèi)部缺失外殼蛋白的部分序列。例如，對(duì)于特異性VLP HBcAg，氨基酸79-80被替換為外源表位。該融合蛋白優(yōu)選保留了在表達(dá)后裝配為VLP的能力，這可以通過(guò)電鏡檢查。
可加入側(cè)翼氨基酸殘基來(lái)增加外殼蛋白和外源表位之間的距離。甘氨酸和絲氨酸殘基是用于側(cè)翼序列的特別有利的氨基酸。這種側(cè)翼序列賦予額外的柔性，可減少外源序列融合進(jìn)入VLP亞單位序列時(shí)可能的去穩(wěn)定效應(yīng)，并且可減少外源表位的存在對(duì)裝配的干擾。
在另外一些實(shí)施方案中，至少一種本發(fā)明的IL-15，優(yōu)選由少于50個(gè)氨基酸組成的IL-15片段，能夠與大量其它病毒外殼蛋白融合，例如，與Qβ的A1蛋白的截短形式的C末端融合(Kozlovska，T.M.，等人，Intervirology 399-15(1996))，或者插入CP延伸的位點(diǎn)72和73之間。作為另一個(gè)實(shí)例，IL-15片段可以插入fr CP的氨基酸2和3之間，產(chǎn)生IL-15-fr CP融合蛋白(Pushko P.等人，Prot.Eng.6883-891(1993))。此外，IL-15片段可以與RNA噬菌體MS-2的外殼蛋白的N末端突出β-發(fā)夾融合(WO 92/13081)。此外，IL-15片段也可以與乳頭瘤病毒衣殼蛋白融合，優(yōu)選與1型牛乳頭瘤病毒(BPV-1)的主要衣殼蛋白L1融合(Chackerian，B.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 962373-2378(1999)，WO 00/23955)。將BPV-1 L1的氨基酸130-136置換為IL-15片段也是本發(fā)明的實(shí)施方案。將本發(fā)明的抗原與病毒的外殼蛋白、其突變體或片段融合的實(shí)施方案已經(jīng)在WO 2004/009124的第62頁(yè)第20行至第68頁(yè)第17行公開(kāi)，在此引入作為參考。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的IL-15，優(yōu)選IL-15片段，甚至更優(yōu)選具有氨基酸序列SEQ ID NO34，35，36，37，38，39或40的IL-15片段，與RNA噬菌體AP205的外殼蛋白、其突變體或片段的N末端或C末端融合。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述融合蛋白還包括間隔區(qū)，其中所述間隔區(qū)位于AP205的外殼蛋白、其突變體或片段與本發(fā)明的IL-15之間。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，組合物包含或基本由具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的病毒樣顆粒組成，該病毒樣顆粒通過(guò)至少一個(gè)共價(jià)鍵與具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一個(gè)本發(fā)明的IL-15連接，優(yōu)選地該共價(jià)鍵是非肽鍵。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第一附著位點(diǎn)包含或優(yōu)選地是氨基，優(yōu)選賴(lài)氨酸殘基的氨基。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二附著位點(diǎn)包含，或優(yōu)選地是巰基，優(yōu)選半胱氨酸的巰基。
在本發(fā)明的一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)包含或優(yōu)選地是氨基，優(yōu)選賴(lài)氨酸的氨基，并且至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)包含，或者優(yōu)選地是巰基，優(yōu)選半胱氨酸的巰基。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)化學(xué)交聯(lián)，一般且優(yōu)選地通過(guò)使用異雙功能交聯(lián)劑，將本發(fā)明的IL-15與VLP連接。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述異雙功能交聯(lián)劑含有能夠與VLP的優(yōu)選的第一附著位點(diǎn)，優(yōu)選氨基，優(yōu)選賴(lài)氨酸殘基的氨基反應(yīng)的一個(gè)官能團(tuán)，和能夠與本發(fā)明的IL-15固有的或人工添加的優(yōu)選的第二附著位點(diǎn)，即巰基，優(yōu)選半胱氨酸殘基的巰基反應(yīng)的另一個(gè)官能團(tuán)，任選地該另一個(gè)官能團(tuán)也可通過(guò)還原用于反應(yīng)。有幾種異雙功能交聯(lián)劑在本領(lǐng)域公知。包括優(yōu)選的交聯(lián)劑SMPH(Pierce)、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、SVSB、SIA和例如可從Pierce Chemical Company獲得的，具有一個(gè)氨基反應(yīng)性官能團(tuán)和一個(gè)巰基反應(yīng)性官能團(tuán)的其它交聯(lián)劑。上述交聯(lián)劑均導(dǎo)致在與氨基反應(yīng)后形成酰胺鍵和與巰基反應(yīng)后形成硫醚鍵。適用于實(shí)施本發(fā)明的另一類(lèi)交聯(lián)劑的特征在于偶聯(lián)時(shí)在本發(fā)明的IL-15與VLP之間引入二硫鍵。屬于這一類(lèi)的優(yōu)選交聯(lián)劑包括，例如SPDP和Sulfo-LC-SPDP(Pierce)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物還包含連接體。根據(jù)本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容，通過(guò)連接優(yōu)選包含適合作為第二附著位點(diǎn)的至少一個(gè)氨基酸的連接體，實(shí)現(xiàn)向本發(fā)明的IL-15上構(gòu)建第二附著位點(diǎn)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，連接體通過(guò)至少一個(gè)共價(jià)鍵，優(yōu)選通過(guò)至少一個(gè)，通常一個(gè)肽鍵與本發(fā)明的IL-15連接。優(yōu)選地，連接體包含或者由第二附著位點(diǎn)組成。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，連接體包含巰基，優(yōu)選半胱氨酸殘基的巰基。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸連接體是半胱氨酸殘基。
連接體的選擇取決于本發(fā)明的IL-15的性質(zhì)，取決于其生化性質(zhì)，如pI、電荷分布和糖基化。柔性的氨基酸連接體通常是有利的。在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，連接體由氨基酸組成，其中進(jìn)一步優(yōu)選地，連接體由最多25個(gè)，優(yōu)選最多20個(gè)，更優(yōu)選最多15個(gè)氨基酸組成。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，氨基酸連接體含有不超過(guò)10個(gè)氨基酸。連接體的優(yōu)選實(shí)施方案選自(a)CGG或CG/GC；(b)N-端γ1連接體(例如CGDKTHTSPP，SEQ IDNO44)；(c)N-端γ3連接體(例如CGGPKPSTPPGSSGGAP，SEQ IDNO55)；(d)Ig鉸鏈區(qū)；(e)N-端甘氨酸連接體(例如GCGGGG，SEQID NO45)；(f)(G)kC(G)n，其中n＝0-12，k＝0-5；(g)N-端甘氨酸-絲氨酸連接體((GGGGS)n，n＝1-3，具有另外一個(gè)半胱氨酸(例如SEQ IDNO46，它相當(dāng)于其中n＝1的實(shí)施方案)；(h)(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n，其中n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2(例如SEQ ID NO47，它相當(dāng)于其中n＝1，k＝1，l＝1且m＝1的實(shí)施方案)；(i)GGC；(k)GGC-NH2；(l)C端γ1連接體(例如DKTHTSPPCG，SEQ IDNO48)；(m)C-端γ3連接體(例如PKPSTPPGSSGGAPGGCG，SEQ IDNO49)；(n)C-端甘氨酸連接體(GGGGCG，SEQ ID NO50)；(o)(G)nC(G)k，其中n＝0-12，k＝0-5；(p)C-端甘氨酸-絲氨酸連接體((SGGGG)n，n＝1-3，具有另外一個(gè)半胱氨酸(例如SEQ ID NO51，它相當(dāng)于其中n＝1的實(shí)施方案)；(q)(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k，其中n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2，o＝0-8(例如SEQ ID NO52，它相當(dāng)于其中n＝1，k＝1，l＝1，o＝1且m＝1的實(shí)施方案)。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，連接體添加到本發(fā)明的IL-15的N末端。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，接連體添加到本發(fā)明的IL-15的C末端。
本發(fā)明優(yōu)選的連接體是進(jìn)一步含有半胱氨酸殘基作為第二附著位點(diǎn)的甘氨酸連接體(G)n，如N-末端甘氨酸連接體(GCGGGG)和C-末端甘氨酸連接體(GGGGCG)。進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案是C-末端甘氨酸-賴(lài)氨酸連接體(GGKKGC，SEQ ID NO53)和N-末端甘氨酸-賴(lài)氨酸連接體(CGKKGG，SEQ ID NO54)，位于肽的C-末端的GGCG、GGC或GGC-NH2(″NH2″代表酰胺化)連接體或位于其N(xiāo)-末端的CGG。甘氨酸殘基通常插入大氨基酸與作為第二附著位點(diǎn)的半胱氨酸之間，以避免偶聯(lián)反應(yīng)中較大氨基酸的潛在的空間位阻。
根據(jù)上述優(yōu)選方法利用異雙功能交聯(lián)劑連接本發(fā)明的IL-15與VLP，使得本發(fā)明的IL-15以定向方式與VLP偶聯(lián)。連接本發(fā)明的IL-15和VLP的其它方法包括使用碳二亞胺EDC和NHS交聯(lián)本發(fā)明的IL-15和VLP的方法。本發(fā)明的IL-15也可以首先通過(guò)反應(yīng)，例如與SATA、SATP或亞氨硫醇(iminothiolane)反應(yīng)而硫醇化。必要時(shí)，在去保護(hù)之后，本發(fā)明的IL-15可以和VLP如下所述偶聯(lián)。在分離過(guò)量的硫醇化試劑之后，本發(fā)明的IL-15與預(yù)先用含有半胱氨酸反應(yīng)性部分的異雙功能交聯(lián)劑活化的VLP反應(yīng)，該活化的VLP展示至少一個(gè)或幾個(gè)對(duì)半胱氨酸殘基具有反應(yīng)性的官能團(tuán)，如上所述的硫醇化的本發(fā)明的IL-15能夠與該官能團(tuán)反應(yīng)。任選地，在反應(yīng)混合物中含有少量的還原劑。另外一些方法使用同型雙功能交聯(lián)劑，如戊二醛、DSG、BM[PEO]4、BS3(Pierce Chemical Company，Rockford，IL，USA)或含有對(duì)VLP的胺基或羧基有反應(yīng)性的官能團(tuán)的其它已知同型雙功能交聯(lián)劑，使本發(fā)明的IL-15與VLP連接。
在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，所述組合物包含或者基本由通過(guò)化學(xué)相互作用連接到本發(fā)明的IL-15的病毒樣顆粒組成，其中這些化學(xué)相互作用中的至少一個(gè)不是共價(jià)鍵。例如，VLP與本發(fā)明的IL-15的連接可以通過(guò)將VLP生物素化并將本發(fā)明的IL-15表達(dá)為鏈霉抗生物素蛋白-融合蛋白而實(shí)現(xiàn)。其他結(jié)合對(duì)，如配體-受體、抗原-抗體，也可以按照與生物素-抗生物素蛋白相似的方式用作偶聯(lián)試劑。
US 5,698,424描述了一種能夠形成衣殼的修飾的噬菌體MS-2外殼蛋白，其中通過(guò)向N端發(fā)夾區(qū)中插入半胱氨酸殘基，以及通過(guò)將位于N端發(fā)夾區(qū)外部的每一個(gè)半胱氨酸殘基置換為非半胱氨酸氨基酸殘基，修飾了該外殼蛋白。插入的半胱氨酸然后可以直接連接到欲呈遞的期望的分子種類(lèi)如表位或抗原性蛋白質(zhì)上。
然而我們注意到，衣殼中存在暴露的游離半胱氨酸殘基可導(dǎo)致衣殼通過(guò)形成二硫鍵而寡聚化。而且，衣殼和抗原性蛋白質(zhì)之間通過(guò)二硫鍵的連接是不穩(wěn)定的，特別是對(duì)于含有巰基部分的分子不穩(wěn)定，而且，在血清中例如比硫醚連接的穩(wěn)定性差(Martin FJ.和Papahadjopoulos D.(1982)Irreversible Coupling of Immunoglobulinfragments to Preformed Vesicles.J.Biol.Chem.257286-288)。
因此，在另一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，VLP與至少一種抗原的連接不包括二硫鍵。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)包含，或優(yōu)選地是巰基。而且，在本發(fā)明一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，VLP與至少一種抗原的連接不包括硫-硫鍵。在另一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)不是或者不包含半胱氨酸的巰基。在另一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)不是或不包含巰基。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，VLP在宿主中重組產(chǎn)生，并且其中VLP基本不含宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸，或者其中VLP基本不含宿主DNA，優(yōu)選宿主核酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，RNA噬菌體的VLP在宿主中重組產(chǎn)生，并且其中RNA噬菌體的VLP基本不含宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸。
在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物還包含至少一種與VLP結(jié)合，優(yōu)選包裝或包裹于VLP內(nèi)部的聚陰離子大分子。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚陰離子大分子是聚谷氨酸和/或聚天冬氨酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，VLP是RNA噬菌體的VLP。減少或除去宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸的量，能使不希望的T細(xì)胞應(yīng)答，如炎性T細(xì)胞應(yīng)答和細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答和其他不希望的副作用，如發(fā)熱，降至最小或者減少，而同時(shí)保持對(duì)IL-15特異性的強(qiáng)抗體應(yīng)答。
基本不含宿主RNA(或DNA)，優(yōu)選宿主核酸如此處所用的術(shù)語(yǔ)“基本不含宿主RNA(或DNA)，優(yōu)選宿主核酸”是指VLP所含的宿主RNA(或DNA)，優(yōu)選宿主核酸的量，其典型且優(yōu)選地為每mg VLP不到30μg，優(yōu)選不到20μg，更優(yōu)選不到10μg，甚至更優(yōu)選不到8μg，甚至更優(yōu)選不到6μg，甚至更優(yōu)選不到4μg，最優(yōu)選不到2μg。在上述內(nèi)容中使用的宿主是指在其中重組產(chǎn)生VLP的宿主。測(cè)定RNA(或DNA)，優(yōu)選核酸的量的常規(guī)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。根據(jù)本發(fā)明測(cè)定RNA，優(yōu)選核酸的量的典型且優(yōu)選的方法在同一受讓人于2005年10月5日提交的PCT/EP2005/055009的實(shí)施例17中描述。對(duì)于含有Qβ以外的VLP的本發(fā)明的組合物，測(cè)定RNA(或DNA)，優(yōu)選核酸的量典型且優(yōu)選地使用相同、相似或類(lèi)似的條件。最終需要的條件的改變是本領(lǐng)域技術(shù)人員的常識(shí)。
如此處所用的術(shù)語(yǔ)“聚陰離子大分子”是指包含重復(fù)負(fù)電荷基團(tuán)的高相對(duì)分子量的分子，其結(jié)構(gòu)基本包括實(shí)際上或概念上來(lái)源于低相對(duì)分子量分子的單位的多個(gè)重復(fù)。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種含有本發(fā)明的組合物的疫苗。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該疫苗組合物中與VLP連接的本發(fā)明的IL-15可能來(lái)源于動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物或人。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的IL-15來(lái)源于人、牛、狗、貓、小鼠、大鼠、豬或馬。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該疫苗組合物進(jìn)一步包含至少一種佐劑。所述至少一種佐劑的施用可以在施用本發(fā)明的組合物之前、同時(shí)或之后進(jìn)行。在此使用的術(shù)語(yǔ)“佐劑”是指免疫應(yīng)答的非特異性刺激物，或可以在宿主中產(chǎn)生一種儲(chǔ)庫(kù)(depot)的物質(zhì)，當(dāng)分別與本發(fā)明的疫苗和藥物組合物結(jié)合時(shí)能夠產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述疫苗組合物不含佐劑。本發(fā)明的一個(gè)有利的特征是組合物的高免疫原性，甚至在不含佐劑時(shí)依然如此。而且，不含佐劑使得不希望的炎性T細(xì)胞應(yīng)答的發(fā)生減至最少，這是針對(duì)自身抗原接種中的一個(gè)安全性問(wèn)題。因此，優(yōu)選地給患者施用本發(fā)明的疫苗組合物而不需在施用該疫苗之前、同時(shí)或之后給同一名患者施用至少一種佐劑。
本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了一種免疫方法，包括給動(dòng)物或人施用本發(fā)明的疫苗。所述動(dòng)物優(yōu)選哺乳動(dòng)物，如貓、綿羊、豬、馬、牛、狗、大鼠、小鼠，特別是人。疫苗可以用本領(lǐng)域所知的各種方法給動(dòng)物或人施用，但是通常通過(guò)注射、輸注、吸入、口服或其他適當(dāng)?shù)奈锢矸椒▉?lái)施用?；蛘?，偶聯(lián)物可以肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)粘膜、經(jīng)皮、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下施用。用于施用的偶聯(lián)物的成分包括無(wú)菌水溶液(例如生理鹽水)或非水溶液和懸液。非水溶劑的例子有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油、和注射用有機(jī)酯如油酸乙酯。可以利用載體或封閉敷料提高皮膚通透性并促進(jìn)抗原吸收。
如果接受個(gè)體能夠耐受本發(fā)明的疫苗的施用，則認(rèn)為該疫苗是“藥學(xué)可接受的”。進(jìn)而，本發(fā)明的疫苗將以“治療有效量”(即產(chǎn)生希望的生理學(xué)效果的量)施用。免疫應(yīng)答的性質(zhì)或類(lèi)型不是本申請(qǐng)公開(kāi)內(nèi)容的限制因素。并非意在通過(guò)以下機(jī)制的解釋來(lái)限制本發(fā)明，本發(fā)明的疫苗可以誘導(dǎo)結(jié)合IL-15，因而減少其濃度和/或干擾其生理學(xué)或病理學(xué)功能的抗體。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種包含本發(fā)明所述組合物和可接受的藥物載體的藥物組合物。當(dāng)給個(gè)體施用本發(fā)明的疫苗時(shí)，它可以是含有鹽、緩沖液、佐劑或其他改善偶聯(lián)物的效果所需的物質(zhì)的形式。適合在制備藥物組合物中使用的材料的例子在許多資料中提供，包括REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Osol，A，ed，Mack Publishing Co，(1990))。
本發(fā)明教導(dǎo)了制備本發(fā)明的組合物的方法，該方法包括以下步驟(a)提供具有至少一個(gè)附著位點(diǎn)的VLP；(b)提供具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的本發(fā)明的IL-15；和(c)將所述VLP和所述本發(fā)明的IL-15組合，產(chǎn)生組合物，其中所述本發(fā)明的IL-15和所述VLP通過(guò)所述第一附著位點(diǎn)和第二附著位點(diǎn)連接。
在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供具有至少一個(gè)附著位點(diǎn)的VLP的步驟包括以下另外的步驟(a)將所述病毒樣顆粒解裝配為所述RNA噬菌體的所述外殼蛋白、其突變體或片段；(b)純化所述外殼蛋白、其突變體或片段；(c)將所述純化的所述RNA噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段重裝配為病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒基本不含宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述純化的外殼蛋白的重裝配在至少一種聚陰離子大分子的存在下實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明提供治療和/或緩解動(dòng)物或人中IL-15發(fā)揮重要病理學(xué)作用的疾病或病癥的方法，其中所述方法包括給患有所述疾病或所述病癥的動(dòng)物或人施用本發(fā)明的組合物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，IL-15發(fā)揮重要病理學(xué)作用的所述疾病或病癥選自動(dòng)脈粥樣硬化、哮喘、移植排斥和炎癥和/或慢性自身免疫病，例如但不限于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬。此外，本發(fā)明提供本發(fā)明的組合物在制備用于治療動(dòng)物或優(yōu)選人中選自動(dòng)脈粥樣硬化、哮喘、移植排斥和炎癥和/或慢性自身免疫病的疾病的藥物中的應(yīng)用。
一方面，本發(fā)明提供治療動(dòng)物或人的疾病的方法，包括給所述動(dòng)物或人施用至少一種IL-15拮抗劑，其中所述疾病選自動(dòng)脈粥樣硬化和哮喘。此外，本發(fā)明提供至少一種IL-15拮抗劑在制備用于治療選自動(dòng)脈粥樣硬化和哮喘的疾病的藥物中的應(yīng)用。
“IL-15拮抗劑”通過(guò)各種方式抑制IL-15的功能，例如但不限于(i)降低血液中IL-15的濃度，(ii)阻止IL-15與IL-15受體復(fù)合體結(jié)合，優(yōu)選阻止IL-15與IL-15受體復(fù)合體的α亞單位結(jié)合，或(iii)阻止IL-15通過(guò)IL-15受體復(fù)合體的β或γ亞單位向細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，以此拮抗IL-15的生物活性。典型且優(yōu)選地，IL-15與IL-15受體復(fù)合體(優(yōu)選α亞單位)的結(jié)合可以通過(guò)體外結(jié)合測(cè)定來(lái)檢查，如J Biol Chem.(2004)；279(23)24313-22所述。典型且優(yōu)選地，IL-15的功能，典型且優(yōu)選地，其刺激T細(xì)胞增殖的功能，可以通過(guò)體外測(cè)定來(lái)檢查，如EP 0772624的實(shí)施例2所述。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，IL-15拮抗劑是與IL-15特異性結(jié)合的抗體?？贵w與IL-15的結(jié)合可以導(dǎo)致形成的抗原-抗體復(fù)合物被清除，從而降低了血液中IL-15的濃度。此外，抗體與IL-15的結(jié)合可以阻止IL-15與其受體結(jié)合，從而阻止IL-15通過(guò)其受體發(fā)揮其活性。另外，抗體與IL-15的結(jié)合可能不干擾IL-15與其受體的結(jié)合，但是，抗體的存在可能阻止IL-15受體復(fù)合體的β或γ亞單位介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
IL-15抗體可以是多克隆或單克隆的，并且可以通過(guò)免疫諸如小鼠、大鼠、兔或人等不同動(dòng)物種來(lái)產(chǎn)生。根據(jù)所使用的技術(shù)不同，單克隆抗體可以是鼠、嵌合、CDR移植、人源化、人或合成抗體。因此，術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”意思是具有均一抗體群體的抗體組合物。抗體的來(lái)源或其制備方式?jīng)]有限制。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述IL-15拮抗劑包括或者是所述抗體的功能片段。在本領(lǐng)域中可以獲得與IL-15特異性結(jié)合的單克隆抗體。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述IL-15拮抗劑是具有107M-1或更高、優(yōu)選108M-1或更高、更優(yōu)選109M-1或更高的結(jié)合親和力(Ka)的單克隆抗體。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述IL-15拮抗劑是以低于100nM，優(yōu)選低于10nM的IC50值抑制IL-15誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖的單克隆抗體，例如，其IC50值通過(guò)增殖抑制測(cè)定來(lái)確定，典型且優(yōu)選地可以如WO03/017935的實(shí)施例8所述進(jìn)行。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述IL-15拮抗劑是如J Clin Invest 2003，112，1571，in Arthritis & Rheumatism.2005，52，2686和WO 03/017935中所述的單克隆抗體HuMax-IL-15(也被命名為146B7，AMG714)或其片段。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述IL-15拮抗劑是從雜交瘤獲得的單克隆抗體，所述雜交瘤選自(i)ATCC保藏號(hào)M110；(ii)ATCC保藏號(hào)M111；(iii)ATCC保藏號(hào)M112，((i)-(iii)可以參考WO 9626274)；和(iv)146H5，(iv)可以參考WO03/017935。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述IL-15拮抗劑是與IL-15特異性結(jié)合的抗體，并且其中優(yōu)選地所述抗體是響應(yīng)于本發(fā)明的組合物而產(chǎn)生的。優(yōu)選地，所述抗體在接受本發(fā)明的組合物或本發(fā)明的疫苗的動(dòng)物或人體中產(chǎn)生，優(yōu)選按照本發(fā)明的免疫方法產(chǎn)生。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗體是通過(guò)用本發(fā)明的組合物免疫小鼠產(chǎn)生的單克隆抗體。優(yōu)選地，為了對(duì)于人用而優(yōu)化，利用迄今可以獲得的技術(shù)進(jìn)一步修飾或改造這樣產(chǎn)生的抗體。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述IL-15拮抗劑包含或者是IL-15可溶性受體，或其片段。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述IL-15拮抗劑包含或者是IL-15可溶性受體α亞單位或其片段。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述IL-15拮抗劑包含或者是IL-15受體α亞單位的胞外域或其片段。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述IL-15拮抗劑包含或者由SEQ IDNO41所示的氨基酸序列或與SEQ ID NO41至少80％，優(yōu)選85％，更優(yōu)選90％，更優(yōu)選95％，更優(yōu)選97％相同的氨基酸序列組成。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述IL-15拮抗劑包含或者是IL-15突變蛋白。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述IL-15突變蛋白仍然能夠與IL-15受體α亞單位結(jié)合并且阻止IL-15通過(guò)β或γ亞單位向細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述IL-15突變蛋白包含或者由SEQ IDNO23所示的氨基酸序列組成，其中SEQ ID NO23的Asp8、Gln101和Gln108中至少一個(gè)位點(diǎn)，優(yōu)選2個(gè)，更優(yōu)選全部3個(gè)位點(diǎn)被突變，優(yōu)選置換，優(yōu)選非保守置換。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述IL-15突變蛋白包含或者由SEQ ID NO23所示的氨基酸序列組成，其中Gln101和Gln108的至少一個(gè)或兩個(gè)缺失或優(yōu)選被置換。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述IL-15突變蛋白包含或者由SEQ ID NO42所示的氨基酸序列組成。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述IL-15突變蛋白包含或者由SEQ IDNO23所示的氨基酸序列組成，其中Asp8和Gln108的至少一個(gè)或優(yōu)選兩個(gè)缺失或優(yōu)選被置換，優(yōu)選被置換為不同的天然存在的氨基酸殘基，進(jìn)一步優(yōu)選絲氨酸或半胱氨酸。在一個(gè)可替代的優(yōu)選實(shí)施方案中，Gln108被置換為Asp。在一個(gè)可替代的優(yōu)選實(shí)施方案中，Asp8被置換為Arg或Lys。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述IL-15突變蛋白包含或者由與SEQ IDNO23至少80％，優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％或最優(yōu)選至少95％相同的氨基酸序列組成，并且其中對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO23的Asp8、Gln101和Gln108中至少一個(gè)位點(diǎn)，優(yōu)選2個(gè)，更優(yōu)選全部3個(gè)位點(diǎn)被突變，優(yōu)選置換，優(yōu)選非保守置換。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述IL-15突變蛋白包含或者由與SEQ ID NO42至少80％，優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，或最優(yōu)選至少95％相同的氨基酸序列組成，其中對(duì)應(yīng)于SEQ IDNO42的101和108的位點(diǎn)保持為Asp。
實(shí)施例在該實(shí)施例部分使用的術(shù)語(yǔ)QβVLP、AP205 VLP等，是指如WO 02/056905、WO 04/007538所述，通過(guò)從大腸桿菌中重組表達(dá)及隨后純化而獲得的VLP。
實(shí)施例1pM-IL-15-FL-CG的構(gòu)建通過(guò)將原始序列替換為退火的oligos B-FL-L-P R(SEQ ID NO34)和B-FL-C-P F(SEQ ID NO35)，將質(zhì)粒pModEC1(WO 03/040164 A2)從BamHI位點(diǎn)到PmeI位點(diǎn)的序列改變?yōu)閏atatggatc cgctagccct cgagga ctacaaggatgacg acgacaaggg tggttgcggt taataagttt aaacgcggcc gc(SEQ IDNO43)。獲得的構(gòu)建體被稱(chēng)為pMod-FL-CG，其在多克隆位點(diǎn)中具有NdeI，BamHI，NheI，XhoI，PmeI和NotI限制酶切位點(diǎn)。
使用下列引物IL-15-F(SEQ ID NO36)和IL-15-Xho-R(SEQ IDNO37)，通過(guò)PCR從活化的樹(shù)突細(xì)胞cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增小鼠IL-15。IL-15-F具有內(nèi)部NdeI位點(diǎn)，IL-15-XhoI具有內(nèi)部XhoI位點(diǎn)。用NdeI和XhoI消化PCR產(chǎn)物，將其連接到用相同酶消化的pMod-FL-CG中。得到的質(zhì)粒被命名為pM-IL-15-FC-CG，其編碼包含小鼠IL-15、flag標(biāo)簽和在C末端含有半胱氨酸的連接體的融合蛋白(SEQ ID NO30)。
實(shí)施例2pM-IL-15-FL-CG的表達(dá)用質(zhì)粒pM-IL-15-FL-CG轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞。來(lái)自含氨芐青霉素(Amp)瓊脂平板的單菌落在液體培養(yǎng)基(SB，含150mMMOPS，pH 7.0，100μg/ml Amp)中擴(kuò)增，并在30℃和220rpm振搖下孵育過(guò)夜。然后將過(guò)夜培養(yǎng)物以1∶50稀釋到相同的培養(yǎng)基中，在30℃下生長(zhǎng)至OD600＝2.8。用1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。在4小時(shí)的誘導(dǎo)后通過(guò)以6000rpm離心10分鐘來(lái)收集細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀物懸浮在含有0.8mg/ml溶菌酶的裂解緩沖液(10mM Na2HPO4，30mM NaCl，10mM EDTA和0.25％Tween-20)中，超聲處理，并用benzonase處理。以48000RCF離心20分鐘后，將上清液在12％PAGE凝膠中解析，在Western blot上用抗小鼠IL-15(R&D system)證實(shí)小鼠IL-15的表達(dá)，清楚地證明了IL-15-FL-CG的表達(dá)，其預(yù)期分子量為14.9KD。
實(shí)施例3IL-15-FL-CG的純化首先通過(guò)抗-FLAG M2柱純化IL-15-FL-CG。簡(jiǎn)言之，將IL-15-FL-CG裂解液加至抗-FLAG M2柱上。用TBS(50mM Tris HCl，150mM NaCl，pH 7.4)洗去未結(jié)合的污染物。然后用FLAG肽(100μg/ml)從柱上洗脫IL-15-FL-CG。通過(guò)Q Fast Flow柱進(jìn)一步純化洗脫液。
實(shí)施例4人IL-15蛋白、IL-15突變蛋白和IL-15片段的產(chǎn)生使用與實(shí)施例1所述基本相同的方案，通過(guò)PCR從活化的樹(shù)突細(xì)胞cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增人IL-15(SEQ ID NO23)，將PCR產(chǎn)物連接到pMod-FL-CG中。得到的質(zhì)粒被命名為pH-IL-15-FC-CG，其編碼包含人IL-15、flag標(biāo)簽和在C末端含有半胱氨酸的連接體的融合蛋白。
使用與實(shí)施例1所述基本相同的方案構(gòu)建表達(dá)人IL-15突變蛋白(SEQ ID NO31，32或33)的質(zhì)粒。使用與實(shí)施例2和3所述基本相同的方案表達(dá)和純化人IL-15蛋白、人IL-15突變蛋白。
按照標(biāo)準(zhǔn)程序化學(xué)合成各種IL-15片段(SEQ ID NO34-40)。將另一個(gè)半胱氨酸融合到每一個(gè)IL-15片段的序列的N末端。
實(shí)施例5在不同聚陰離子大分子的存在下，通過(guò)解裝配/重裝配制備本發(fā)明的QβVLP，產(chǎn)生重裝配的QβVLP(A)QβVLP的解裝配從大腸桿菌裂解物中純化的溶于PBS(20mM磷酸鹽，150mMNaCl，pH 7.5)中的45mg QβVLP(2.5mg/ml，通過(guò)Bradford分析測(cè)定)在攪拌條件下于室溫用10mM DTT還原15分鐘。然后加入氯化鎂至0.7M的終濃度，繼續(xù)在攪拌條件下于室溫溫育15分鐘，導(dǎo)致包裹的宿主細(xì)胞RNA被沉淀。溶液于4℃下以4000rpm離心10分鐘(Eppendorf 5810R，固定角轉(zhuǎn)頭A-4-62，在下列所有步驟中均使用)，以從溶液中除去沉淀的RNA。含有釋放的二聚Qβ外殼蛋白的上清液用于層析純化步驟。
(B)通過(guò)陽(yáng)離子交換層析和大小排阻層析純化Qβ外殼蛋白含有二聚體外殼蛋白、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和殘留的宿主細(xì)胞RNA的解裝配反應(yīng)上清液用水1∶15稀釋?zhuān)哉{(diào)節(jié)電導(dǎo)率低于10mS/cm，并加樣到SP-Sepharose FF柱(xk16/20，6ml，Amersham Bioscience)上。該柱預(yù)先用20mM磷酸鈉緩沖液pH 7平衡。用達(dá)到20mM磷酸鈉/500mM氯化鈉的分步梯度來(lái)完成對(duì)結(jié)合的外殼蛋白的洗脫，以大約25ml的級(jí)分體積收集蛋白質(zhì)。以5ml/min的流速在室溫下進(jìn)行層析，在260nm和280nm處測(cè)量吸光度。
在第二步中，將分離的Qβ外殼蛋白(從陽(yáng)離子交換柱上洗脫的級(jí)分)加樣到(分兩次進(jìn)行)用20mM磷酸鈉/250mM氯化鈉pH 6.5平衡的Sephacryl S-100 HR柱(xk26/60，320ml，Amersham Bioscience)上。以2.5ml/min的流速在室溫下進(jìn)行層析，在260nm和280nm處測(cè)量吸光度。收集5ml的級(jí)分。
(C1)QβVLP通過(guò)透析的重裝配將純化的Qβ外殼蛋白(2.2mg/ml，在20mM磷酸鈉pH 6.5中)、一種聚陰離子大分子(2mg/ml水溶液)、尿素(7.2M水溶液)和DTT(0.5M水溶液)混合至終濃度為1.4mg/ml外殼蛋白，0.14mg/ml各自的聚陰離子大分子，1M尿素和2.5mM DTT。使用3.5kDa截止值的膜將混合物(各1ml)于5℃下在20mM TrisHCl，150mM NaCl pH 8中透析2天。聚陰離子大分子是聚半乳糖醛酸(25000-50000，F(xiàn)luka)、硫酸葡聚糖(MW 5000和10000，Sigma)、聚-L-天冬氨酸(MW11000和33400，Sigma)、聚-L-谷氨酸(MW 3000，13600和84600，Sigma)和來(lái)自面包酵母和小麥胚的tRNA。
(C2)QβVLP通過(guò)滲濾的重裝配將33ml純化的Qβ外殼蛋白(1.5mg/ml，在20mM磷酸鈉pH 6.5，250mM NaCl中)與水和尿素(7.2M水溶液)、NaCl(5M水溶液)和聚-L-谷氨酸(2mg/ml水溶液，MW84600)混合?；旌衔锏捏w積為50ml，成分的終濃度為1mg/ml外殼蛋白，300mM NaCl，1.0M尿素和0.2mg/ml聚-L-谷氨酸。然后在使用Pellicon XL膜柱(Biomax 5K，Millipore)的正切流動(dòng)過(guò)濾裝置中，應(yīng)用10ml/min的橫流速和2.5ml/min的滲透流速，用500ml的20mM TrisHCl pH 8，50mM NaCl在室溫下滲濾該混合物。
實(shí)施例6AP205 VLP的體外裝配(A)AP205外殼蛋白的純化解裝配20ml的AP205 VLP溶液(1.6mg/ml，在PBS中，從大腸桿菌提取物中純化)與0.2ml的0.5M DTT混合，于室溫溫育30分鐘。加入5ml的5M NaCl，然后將該混合物于60℃下溫育15分鐘，使DTT-還原的外殼蛋白沉淀。將渾濁的混合物離心(轉(zhuǎn)頭SorvallSS34，10000g，10min，20℃)，棄去上清液，將沉淀物分散到20ml的1M尿素/20mM檸檬酸鈉pH 3.2中。于室溫下攪拌30分鐘后，加入1.5M Na2HPO4將分散液調(diào)節(jié)至pH 6.5，然后離心(轉(zhuǎn)頭Sorvall SS34，10000g，10min，20℃)，獲得含有二聚體外殼蛋白的上清液。
陽(yáng)離子交換層析用20ml水稀釋上清液(見(jiàn)上)，以調(diào)節(jié)電導(dǎo)率約為5mS/cm。將得到的溶液加至預(yù)先用20mM磷酸鈉pH 6.5緩沖液平衡的6ml SP Sepharose FF柱(Amersham Bioscience)上。加樣后，用48ml 20mM磷酸鈉pH 6.5緩沖液洗柱，然后在20倍柱體積上用達(dá)1M NaCl的線(xiàn)性梯度洗脫結(jié)合的外殼蛋白。合并主峰級(jí)分，通過(guò)SDS-PAGE和UV光譜法進(jìn)行分析。根據(jù)SDS-PAGE，分離的外殼蛋白對(duì)于其他蛋白質(zhì)污染物是基本純化的。根據(jù)UV光譜法，蛋白質(zhì)濃度為0.6mg/ml(總量12mg)，1個(gè)A280單位反映1.01mg/mlAP205外殼蛋白。此外，A280值(0.5999)與A260值(0.291)的比為2，表明該制品基本不含核酸。
(B)AP205 VLP的裝配在不含任何聚陰離子大分子的條件下的裝配將上述洗脫的蛋白質(zhì)級(jí)分滲濾并且通過(guò)TFF濃縮，至在20mM磷酸鈉pH 6.5中的蛋白質(zhì)濃度為1mg/ml。將500μl該溶液與50μl的5M NaCl溶液混合，于室溫下溫育48小時(shí)?；旌衔镏兄匮b配的VLP的形成通過(guò)非還原SDS-PAGE和大小排阻HPLC顯示。HPLC分析使用用20mM磷酸鈉，150mM NaCl pH 7.2平衡的TSKgel G5000 PWXL柱(TosohBioscience)。
在聚谷氨酸存在下的裝配將375μl純化的AP205外殼蛋白(1mg/ml，在20mM磷酸鈉pH 6.5中)與50μl的NaCl貯存溶液(5M水溶液)、50μl聚谷氨酸貯存溶液(2mg/ml水溶液，MW86400，Sigma)和25μl水混合?；旌衔镌谑覝叵聹赜?8小時(shí)?；旌衔镏兄匮b配的VLP的形成通過(guò)非還原SDS-PAGE和大小排阻HPLC顯示?；旌衔镏械耐鈿さ鞍讕缀跬耆尤氲絍LP中，表明裝配效率高于在不含任何聚陰離子大分子情況下裝配的AP205外殼蛋白。
實(shí)施例7IL-15-FL-CG與QβVLP和重裝配的QβVLP的偶聯(lián)由實(shí)施例3獲得的純化的小鼠IL-15-FL-CG(153μM)用TBS pH 7.4中的等摩爾TCEP還原1小時(shí)。還原后的IL-15-FL-CG(83μM)與59μMSMPH衍生化的Qβ在50μl的總體積中在室溫下溫育過(guò)夜。通過(guò)SDS-PAGE和使用抗-FLAG抗體的Western-Blot分析偶聯(lián)產(chǎn)物。通過(guò)Bradford測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。通過(guò)對(duì)考馬斯藍(lán)染色的SDS-PAGE進(jìn)行光密度分析來(lái)估計(jì)偶聯(lián)率。
應(yīng)用基本上相同的實(shí)驗(yàn)條件將人IL-15-FL-CG(從實(shí)施例4獲得)與實(shí)施例5獲得的重裝配的QβVLP或?qū)嵤├?獲得的重裝配的AP205VLP偶聯(lián)。
實(shí)施例8人IL-15突變蛋白與QβVLP和重裝配的QβVLP的偶聯(lián)由實(shí)施例4獲得的純化的人IL-15突變蛋白(153μM)用TBS pH 7.4中的等摩爾TCEP還原1小時(shí)。還原后的IL-15突變蛋白(83μM)與SMPH衍生化的59μM QβVLP或59μM重裝配的QβVLP在50μl的總體積中在室溫下溫育過(guò)夜。通過(guò)SDS-PAGE和使用抗-FLAG抗體的Western-Blot分析偶聯(lián)產(chǎn)物。通過(guò)Bradford測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。通過(guò)對(duì)考馬斯藍(lán)染色的SDS-PAGE進(jìn)行光密度分析來(lái)估計(jì)偶聯(lián)率。
實(shí)施例9人IL-15蛋白與HBcAg1-185-Lys的偶聯(lián)HBcAg1-185-Lys的構(gòu)建、表達(dá)和純化基本如WO 03/040164的實(shí)施例2-5所述。120μM HBcAg1-185-Lys衣殼在20mM Hepes，150mM NaClpH 7.2中的溶液與從DMSO中的貯存液稀釋得到的25倍摩爾過(guò)量的SMPH(Pierce)在25℃搖床上反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)溶液然后用1L 20mMHepes，150mM NaCl，pH 7.2在4℃下透析兩次，2小時(shí)。透析后的HBcAg1-185-Lys反應(yīng)混合物然后與實(shí)施例4獲得的人IL-15蛋白反應(yīng)。在偶聯(lián)反應(yīng)中，人IL-15蛋白相對(duì)于衍生化的HBcAg1-185-Lys衣殼為兩倍摩爾過(guò)量。偶聯(lián)反應(yīng)在25℃搖床上繼續(xù)4小時(shí)。通過(guò)SDS-PAGE分析偶聯(lián)產(chǎn)物。
實(shí)施例10免疫原性在實(shí)驗(yàn)A中，一組小鼠(n＝5)在第0、14、28天在不存在任何佐劑的情況下用與小鼠IL-15-FL-CG偶聯(lián)的50μg QβVLP皮下免疫。作為陰性對(duì)照，5只小鼠只用PBS免疫。
在實(shí)驗(yàn)B中，一組小鼠(n＝5)在第0、14、28天在不存在任何佐劑的情況下用與小鼠IL-15-FL-CG偶聯(lián)的25μg QβVLP皮下免疫。作為陰性對(duì)照，5只小鼠只用QβVLP免疫。
表1證明用Qβ-IL-15-FL-CG免疫在所有小鼠中誘發(fā)高效價(jià)的IL-15特異性IgG抗體，如通過(guò)ELISA所顯示的。這證明該疫苗無(wú)需添加任何佐劑即能夠克服對(duì)IL-15的免疫耐受。ELISA效價(jià)被定義為導(dǎo)致半數(shù)最大450nm處光密度的血清稀釋度(OD 50％)。用重組IL-15包被ELISA板。給出了5只動(dòng)物的平均值以及標(biāo)準(zhǔn)差。
應(yīng)用類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)條件，用與重裝配的QβVLP偶聯(lián)的小鼠IL-15-FL-CG免疫小鼠，通過(guò)ELISA測(cè)定抗體效價(jià)，并與利用偶聯(lián)到QβVLP上的IL-15-FL-CG誘導(dǎo)的抗體效價(jià)和陰性對(duì)照相比較。
表1A(實(shí)驗(yàn)A)

表1B(實(shí)驗(yàn)B)

實(shí)施例11QβVLP-IL-15疫苗在小鼠類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型中的效力在小鼠類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)模型中評(píng)價(jià)了QβVLP-IL-15疫苗在體內(nèi)減輕關(guān)節(jié)炎癥狀的能力。在該模型中，通過(guò)靜脈內(nèi)注射4種不同單克隆抗體的組合(關(guān)節(jié)原性單克隆抗體混合物，MD Biosciences)，并在24小時(shí)后腹膜內(nèi)注射LPS來(lái)誘導(dǎo)RA(K.Terato，等人，J.Immunology，1482102-2108，1992)。在該模型中，炎癥快速進(jìn)展，持續(xù)2周，最終達(dá)到關(guān)節(jié)強(qiáng)直和永久性關(guān)節(jié)損傷。
在實(shí)驗(yàn)A中，在第-70、-56、-42天用50μg QβVLP-IL-15免疫一組小鼠(n＝5)，只接受PBS的一組小鼠作為陰性對(duì)照。在實(shí)驗(yàn)B中，在第-42、-28、-14天用25μg QβVLP-IL-15免疫一組小鼠，只用Qβ免疫的一組小鼠作為陰性對(duì)照。在三次免疫后，在第0天通過(guò)靜脈注射2mg單克隆抗體混合物(關(guān)節(jié)原性單克隆抗體混合物，MD Biosciences)，并在24小時(shí)后注射200μl LPS在小鼠中誘導(dǎo)RA。在14-15天里監(jiān)測(cè)炎癥過(guò)程，對(duì)每肢給出臨床得分。在15天里確定關(guān)節(jié)炎的臨床得分。按照以下定義對(duì)每肢給出0-3的臨床得分0正常，1每爪為數(shù)幾個(gè)的輕度紅斑和/或腫脹，2擴(kuò)展到整個(gè)爪/關(guān)節(jié)的紅斑和腫脹，3爪/關(guān)節(jié)的嚴(yán)重的腫脹、變形，伴有關(guān)節(jié)強(qiáng)直。給出每組5只小鼠的平均值以及平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖1A示出了實(shí)驗(yàn)A的結(jié)果。接種QβVLP-IL-15的小鼠發(fā)展約0.25的平均臨床得分。相反，注射PBS的小鼠在相同時(shí)期內(nèi)發(fā)展0.97的平均臨床得分。圖1B示出了實(shí)驗(yàn)B的結(jié)果。接種QβVLP-IL-15的小鼠發(fā)展約0.18的平均臨床得分，而對(duì)照小鼠具有0.51的平均值。
實(shí)施例12QβVLP-IL-15疫苗在小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型中的效力7-8周大的雄性Apoe-/-小鼠(The Jackson Laboratory，Bar Harbor ME)在第0、14、28、49、63和113天皮下注射50μg Qβ-IL-15疫苗(n＝6)(從實(shí)施例7獲得)或50μg Qβ(n＝6)。小鼠開(kāi)始時(shí)喂以正常飲食，在第21天時(shí)更換為西式飲食(20％脂肪，0.15％膽固醇，Provimi Kliba AG)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中以定期間隔對(duì)小鼠采血，并檢測(cè)血清中的抗IL-15抗體應(yīng)答。在第159天處死，基本如以前所述分離和制備主動(dòng)脈(Tangirala R.K.等人(1995)J.Lipd.Res.362320-2328)。動(dòng)物通過(guò)心臟穿刺采血，用冷PBS灌注。然后暴露主動(dòng)脈，在原位除去血管外膜，最終從心臟上取出主動(dòng)脈。進(jìn)一步將主動(dòng)脈在充滿(mǎn)冷PBS的玻璃培養(yǎng)皿中清除殘余的外膜，從左鎖骨下動(dòng)脈下5mm切下主動(dòng)脈弓?？v向切開(kāi)主動(dòng)脈，釘在黑蠟表面，并在4％福爾馬林中固定過(guò)夜。然后用油紅O染色過(guò)夜。用圖像軟件(Motic Image Plus 2.0)對(duì)數(shù)碼照片上的斑塊進(jìn)行定量。斑塊負(fù)荷表示為到髂分支的主動(dòng)脈所有斑塊的表面的總和除以到髂分支測(cè)量的主動(dòng)脈總表面得到的百分?jǐn)?shù)。分析了Qβ-IL-15和Qβ組之間斑塊負(fù)荷平均值或中值的差異。
使用包被于ELISA板上的重組IL-15，通過(guò)經(jīng)典ELISA檢測(cè)抗體應(yīng)答。用山羊抗小鼠HRP偶聯(lián)物檢測(cè)特異性抗體的結(jié)合。第0、14、28、56、102天的抗IL-15效價(jià)計(jì)算為在該測(cè)定中獲得半數(shù)最大結(jié)合的血清稀釋度。
如Ludewig B.等人(2000)PNAS 9712752-12757所述，通過(guò)對(duì)來(lái)自主動(dòng)脈的橫切片的組織學(xué)分析進(jìn)一步評(píng)價(jià)每只動(dòng)物中動(dòng)脈粥樣硬化的程度。從出現(xiàn)所有三個(gè)瓣葉開(kāi)始，收集來(lái)自主動(dòng)脈的冷凍的系列橫切片。用油紅O染色，并用蘇木精復(fù)染，以定量病變大小。
抗體應(yīng)答的測(cè)定結(jié)果顯示在表2中，清楚地證明用偶聯(lián)到Qβ上的鼠IL-15免疫產(chǎn)生了抗IL-15的強(qiáng)特異性抗體應(yīng)答，因?yàn)樵诿庖咔?d0)血清中幾乎沒(méi)有檢測(cè)到效價(jià)。
此外，IL-15特異性抗體應(yīng)答的誘導(dǎo)導(dǎo)致Qβ-IL-15組與Qβ組相比，斑塊負(fù)荷的平均值降低(47％)且中值降低(46％)(圖2)。這證明IL-15與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)理有關(guān)，并且用Qβ-IL-15疫苗誘導(dǎo)抗IL-15抗體有利地調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化。
表2.用Qβ-IL-15免疫的Apoe-/-小鼠中抗IL-15抗體效價(jià)的幾何平均值

實(shí)施例13小鼠IL-15片段與QβVLP的偶聯(lián)
Qβ病毒樣顆粒(2mg/l)用2.8mM SMPH(Pierce，Perbio Science)在25℃下衍生化60分鐘，然后用PBS透析。IL-1561-73(250μM)和衍生化的QβVLPs(100μM)在PBS緩沖液中在15℃下溫育1小時(shí)。通過(guò)SDS-page分析偶聯(lián)產(chǎn)物。我們鑒定出了一種IL-1561-73分子與一種Qβ單體的偶聯(lián)產(chǎn)物和兩種IL-1561-73分子與一種Qβ單體的偶聯(lián)產(chǎn)物。IL-1542-55也以類(lèi)似的方式與Qβ偶聯(lián)。
實(shí)施例14疫苗在實(shí)驗(yàn)性哮喘動(dòng)物模型中的效力在基于卵白蛋白(OVA)的鼠哮喘模型中評(píng)價(jià)體內(nèi)Qβ-IL-15接種的效果。該實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了通過(guò)Qβ-IL-15接種產(chǎn)生的抗IL-15抗體下調(diào)內(nèi)源性IL-15體內(nèi)作用的能力。在3組中分析每組6只BALB/c小鼠。在第7、21、35天給小鼠接種50μg Qβ-IL-15(C組，從實(shí)施例7獲得)或只接種QβVLP(A組和B組)作為對(duì)照。在第二次接種后獲得抗Qβ或IL-15的高IgG效價(jià)。第0天，B組和C組的小鼠用吸附到2mg Al2O3上的50μg OVA(V級(jí)；Sigma-Aldrich)腹膜內(nèi)敏化。為了誘導(dǎo)肺變應(yīng)性炎癥，從第42天到第45天每天通過(guò)吸入OVA氣溶膠(在PBS中的2.5％溶液，用Pari TurboBOY；Pari霧化30分鐘)攻擊這些小鼠。作為陰性對(duì)照，A組的小鼠在第0天不用OVA和Al2O3處理，并且隨后不用OVA氣溶膠攻擊。第46天，處死小鼠，進(jìn)行支氣管肺泡灌洗(BAL)，計(jì)數(shù)BAL中的浸潤(rùn)細(xì)胞，測(cè)定氣道高反應(yīng)性(AHR)。
序列表<110>賽托斯生物技術(shù)公司M.巴克曼鄒宇A(yù).蒂索特<120>IL-15抗原陣列及其用途<130>P1039PC00<150>60/635,179<151>2004-12-13<160>55<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>132<212>PRT<213>噬菌體Q-beta<400>1Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>2<211>329<212>PRT<213>噬菌體Q-beta<400>2Met Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly1 5 10 15Lys Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30Val Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
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<212>PRT<213>噬菌體R17<400>3Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly1 5 10 15Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp20 25 30Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val35 40 45Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val50 55 60Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala65 70 75 80Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala85 90 95Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu100 105 110Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile115 120 125Tyr<210>4<211>130<212>PRT<213>噬菌體fr<400>4Met Ala Ser Asn Phe Glu Glu Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr1 5 10 15Gly Asp Val Lys Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu20 25 30Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser35 40 45Val Arg Gln Ser Ser Ala Asn Asn Arg Lys Tyr Thr Val Lys Val Glu50 55 60Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Val Gln Gly Gly Val Glu Leu Pro Val65 70 75 80Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Met Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Val Phe85 90 95Ala Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu Ile Val Lys Ala Leu Gln Gly Thr100 105 110Phe Lys Thr Gly Asn Pro Ile Ala Thr Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly
115 120 125Ile Tyr130<210>5<211>130<212>PRT<213>噬菌體GA<400>5Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly1 5 10 15Asn Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp20 25 30Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr35 40 45Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Ala Ile Lys Leu Glu Val50 55 60Pro Lys Ile Val Thr Gln Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Gly Ser65 70 75 80Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser Ile Asp Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala85 90 95Ala Thr Asp Asp Val Thr Val Ile Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe100 105 110Lys Val Gly Asn Pro Ile Ala Glu Ala Ile Ser Ser Gln Ser Gly Phe115 120 125Tyr Ala130<210>6<211>132<212>PRT<213>噬菌體SP<400>6Met Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly1 5 10 15Asp Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 40 45Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys50 55 60Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys65 70 75 80
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<223>噬菌體Q-beta 243突變體<400>16Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Lys Ile Gly Lys Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125
Asn Pro Ala Tyr130<210>17<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體Q-beta 250突變體<400>17Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Ash Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>18<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體Q-beta 251突變體<400>18Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>19<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌體Q-beta 259突變體<400>19Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>20<211>185<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>20Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg145 150 155 160Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg165 170 175Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180 185<210>21<211>188<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>21Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Gly65 70 75 80Lys Gly Gly Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val85 90 95Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr100 105 110
Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp115 120 125Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser130 135 140Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser145 150 155 160Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro165 170 175Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180 185<210>22<211>162<212>PRT<213>人<400>22Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr1 5 10 15Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His20 25 30Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala35 40 45Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile50 55 60Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His65 70 75 80Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln85 90 95Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu100 105 110Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val115 120 125Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile130 135 140Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn145 150 155 160Thr Ser<210>23<211>114<212>PRT<213>人
<400>23Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile1 5 10 15Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His20 25 30Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln35 40 45Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu50 55 60Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val65 70 75 80Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile85 90 95Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn100 105 110Thr Ser<210>24<211>114<212>PRT<213>小鼠<400>24Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp Leu Glu Lys Ile Glu Ser Leu Ile1 5 10 15Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His20 25 30Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln35 40 45Val Ile Leu His Glu Tyr Ser Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg50 55 60Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asn Ser Thr Leu Ser Ser Asn Lys Asn Val65 70 75 80Ala Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Thr Phe85 90 95Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn100 105 110Thr Ser<210>25<211>114<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)<400>25Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp Leu Glu Lys Ile Glu Ser Leu Ile1 5 10 15Gln Phe Ile His Ile Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His20 25 30Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln35 40 45Val Ile Leu His Glu Tyr Ser Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg50 55 60Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asn Ser Thr Leu Ser Ser Asn Lys Asn Val65 70 75 80Ile Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Arg Asn Phe85 90 95Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe Ile His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn100 105 110Thr Ser<210>26<211>64<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>改變限制酶切位點(diǎn)的引物<400>26gatccgctag ccctcgagga ctacaaggat gacgacgaca agggtggttg cggttaataa60gttt 64<210>27<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>改變限制酶切位點(diǎn)的引物<400>27aaacttatta accgcaacca cccttgtcgt cgtcatcctt gtagtcctcg agggctagcg60<210>28<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>克隆IL-15的引物<400>28ggaattccat atgaactgga tagatgtaag ata 33<210>29<211>31<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>克隆IL-15的引物<400>29cccgctcgag ggacgtgttg atgaacattt g 31<210>30<211>128<212>PRT<213>小鼠<400>30Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp Leu Glu Lys Ile Glu Ser Leu Ile1 5 10 15Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His20 25 30Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln35 40 45Val Ile Leu His Glu Tyr Ser Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg50 55 60Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asn Ser Thr Leu Ser Ser Asn Lys Asn Val65 70 75 80Ala Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Thr Phe85 90 95Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn100 105 110Thr Ser Leu Glu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Cys Gly115 120 125<210>31<211>114<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人IL-15 E46K<400>31Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile1 5 10 15Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His20 25 30Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Lys Leu Gln35 40 45Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu50 55 60Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile85 90 95Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn100 105 110Thr Ser<210>32<211>114<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人IL-15 I50D<400>32Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile1 5 10 15Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His20 25 30Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln35 40 45Val Asp Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu50 55 60Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val65 70 75 80Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile85 90 95Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn100 105 110Thr Ser<210>33<211>114<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人IL-15 E46K，I50D<400>33Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile1 5 10 15Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His20 25 30Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Lys Leu Gln35 40 45
Val Asp Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu50 55 60Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val65 70 75 80Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile85 90 95Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn100 105 110Thr Ser<210>34<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>IL-15片段<400>34Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His Glu Tyr Ser1 5 10<210>35<211>13<212>PRT<213>小鼠巨細(xì)胞病毒1<400>35Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asn Ser Thr1 5 10<210>36<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人片段42-55<400>36Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly1 5 10<210>37<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人片段61-73<400>37Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser1 5 10<210>38<211>13<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>人42-55 E46K<400>38Phe Leu Leu Lys Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly1 5 10<210>39<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人片段42-55 I50D<400>39Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Asp Ser Leu Glu Ser Gly1 5 10<210>40<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人片段42-55 E46K I50D<400>40Phe Leu Leu Lys Leu Gln Val Asp Ser Leu Glu Ser Gly1 5 10<210>41<211>176<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>IL-15可溶性受體<400>41Gly Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp1 5 10 15Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser20 25 30Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu35 40 45Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys50 55 60Ile Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr65 70 75 80Val Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser85 90 95Gly Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala100 105 110Thr Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser
115 120 125Pro Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly130 135 140Thr Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala145 150 155 160Ser His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr165 170 175<210>42<211>114<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>IL-15突變蛋白Q101D，Q108D<400>42Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile1 5 10 15Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His20 25 30Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln35 40 45Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu50 55 60Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val65 70 75 80Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile85 90 95Lys Glu Phe Leu Asp Ser Phe Val His Ile Val Asp Met Phe Ile Asn100 105 110Thr Ser<210>43<211>82<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>載體的克隆位點(diǎn)<400>43catatggatc cgctagccct cgaggactac aaggatgacg acgacaaggg tggttgcggt60taataagttt aaacgcggcc gc 82<210>44<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>gamma連接體1<400>44Cys Gly Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro1 5 10<210>45<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N末端甘氨酸連接體<400>45Gly Cys Gly Gly Gly Gly1 5<210>46<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-末端甘氨酸絲氨酸連接體<400>46Cys Gly Gly Gly Gly Ser1 5<210>47<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>GCGSGGGGS連接體<400>47Gly Cys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5<210>48<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C-末端gamma 1連接體<400>48Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Gly1 5 10<210>49<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C末端gamma連接體3<400>49Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gly Gly1 5 10 15
Cys Gly<210>50<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C末端甘氨酸連接體<400>50Gly Gly Gly Gly Cys Gly1 5<210>51<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C末端甘氨酸絲氨酸連接體<400>51Ser Gly Gly Gly Gly Cys1 5<210>52<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>GSGGGGSGCG連接體<400>52Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Cys Gly1 5 10<210>53<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>甘氨酸賴(lài)氨酸連接體<400>53Gly Gly Lys Lys Gly Cys1 5<210>54<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>甘氨酸賴(lài)氨酸連接體2<400>54Cys Gly Lys Lys Gly Gly1 5<210>55<211>17
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CGGPKPSTPPGSSGGAP<400>55Cys Gly Gly Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala1 5 10 15Pro
權(quán)利要求
1.一種組合物，包含(a)具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的病毒樣顆粒(VLP)；和(b)具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一種抗原，其中所述至少一種抗原是IL-15蛋白、IL-15突變蛋白或IL-15片段，并且其中(a)和(b)通過(guò)所述至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和所述至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)連接。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述IL-15蛋白包含選自下組的氨基酸序列(a)SEQ ID NO22；(b)SEQ ID NO23；(c)SEQ ID NO24；(d)SEQ ID NO25；和(e)與SEQ ID NO22-25中的任一個(gè)至少80％，優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，或最優(yōu)選至少95％相同的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述IL-15突變蛋白包含選自下組的氨基酸序列(a)SEQ ID NO23，其中第46位不是E；(b)SEQ ID NO23，其中第50位不是I；(c)SEQ ID NO23，其中第46位不是E，并且第50位不是I；(d)SEQ ID NO31；(e)SEQ ID NO32；(f)SEQ ID NO33；和(g)與SEQ ID NO23至少80％，優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，或最優(yōu)選至少95％相同，并且其中對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO23的第46位的位點(diǎn)不是E，或者對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO23的第50位的位點(diǎn)不是I，或者對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO23的第46位的位點(diǎn)不是E并且對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO23的第50位的位點(diǎn)不是I的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述IL-15片段包含選自下組的氨基酸序列(a)SEQ ID NO34；(b)SEQ ID NO35；(c)SEQ ID NO36；(d)SEQ ID NO37；(e)SEQ ID NO38；(f)SEQ ID NO39；和(g)與SEQ ID NO34-39中的任一個(gè)至少65％，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，或最優(yōu)選至少95％相同的氨基酸序列。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中所述VLP包含RNA噬菌體的重組外殼蛋白、其突變體或片段。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述RNA噬菌體是RNA噬菌體Qβ、fr、GA或AP205。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中所述第一附著位點(diǎn)與所述第二附著位點(diǎn)通過(guò)至少一個(gè)共價(jià)鍵連接，其中優(yōu)選所述共價(jià)鍵是非肽鍵。
8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中所述第一附著位點(diǎn)包含氨基，優(yōu)選賴(lài)氨酸的氨基。
9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中所述第二附著位點(diǎn)包含巰基，優(yōu)選半胱氨酸的巰基。
10.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其還包含連接體。
11.一種疫苗，包含權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的組合物。
12.權(quán)利要求11的疫苗，其中所述疫苗進(jìn)一步包含至少一種佐劑。
13.一種免疫方法，包括給動(dòng)物或人施用權(quán)利要求11-12中任一項(xiàng)的疫苗。
14.一種藥物組合物，包含(a)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的組合物或權(quán)利要求11-12中任一項(xiàng)的疫苗；和(b)可接受的藥物載體。
15.一種制備權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的組合物的方法，包括(a)提供具有至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)的VLP；(b)提供具有至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)的至少一種抗原，其中所述抗原是IL-15蛋白、IL-15突變蛋白或IL-15片段；和(c)將所述VLP與所述至少一種抗原連接，產(chǎn)生所述組合物，其中所述至少一種抗原和所述VLP通過(guò)所述至少一個(gè)第一附著位點(diǎn)和所述至少一個(gè)第二附著位點(diǎn)連接。
16.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的組合物或權(quán)利要求11-12中任一項(xiàng)的疫苗在制備用于治療動(dòng)物或優(yōu)選人的炎癥和/或慢性自身免疫病的藥物中的用途。
17.權(quán)利要求16的用途，其中所述炎癥和/或慢性自身免疫病是類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
18.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的組合物或權(quán)利要求11-12中任一項(xiàng)的疫苗在制備用于治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物中的用途。
19.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的組合物或權(quán)利要求11-12中任一項(xiàng)的疫苗在制備用于治療哮喘的藥物中的用途。
20.至少一種IL-15拮抗劑在制備用于治療選自動(dòng)脈粥樣硬化和哮喘的疾病的藥物中的用途。
21.權(quán)利要求20的用途，其中所述IL-15拮抗劑是與IL-15特異性結(jié)合的單克隆抗體。
22.權(quán)利要求20或21的用途，其中所述IL-15拮抗劑是與IL-15特異性結(jié)合的抗體，并且其中優(yōu)選地所述抗體是由于應(yīng)答權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的組合物或權(quán)利要求11-12中任一項(xiàng)的疫苗組合物而產(chǎn)生的。
23.權(quán)利要求20的用途，其中所述IL-15拮抗劑是IL-15突變蛋白。
24.權(quán)利要求23的用途，其中所述IL-15突變蛋白包括如SEQ IDNO23所示的氨基酸序列，其中SEQ ID NO23 Asp8、Gln101和Gln108中的至少一個(gè)位點(diǎn)，優(yōu)選兩個(gè)、更優(yōu)選全部三個(gè)位點(diǎn)被置換。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、病毒學(xué)、免疫學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明提供包含有序且重復(fù)的抗原陣列的組合物，其中所述抗原是IL－15蛋白、IL－15突變蛋白或IL－15片段。更具體而言，本發(fā)明提供包含病毒樣顆粒和與其連接的至少一種IL－15蛋白、IL－15突變蛋白或至少一種IL－15片段的組合物。本發(fā)明也提供一種制備上述組合物的方法。本發(fā)明的組合物可以用于制備用于治療炎癥和慢性自身免疫病的疫苗。本發(fā)明的組合物有效地誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，特別是抗體應(yīng)答。而且，本發(fā)明的組合物特別可用于在特定環(huán)境內(nèi)有效誘導(dǎo)自身特異性免疫應(yīng)答。
文檔編號(hào)A61P19/00GK101076352SQ200580042676
公開(kāi)日2007年11月21日 申請(qǐng)日期2005年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月13日
發(fā)明者M·巴克曼, 鄒宇, A·蒂索特, P·毛雷爾 申請(qǐng)人:賽托斯生物技術(shù)公司