專利名稱：焦磷酸測序法檢測B-raf基因多態(tài)性的試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及焦磷酸測序法檢測B-raf基因多態(tài)性的試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
B-raf是一種癌基因， 它編碼一種絲/蘇氨酸特異性激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK通路重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)反應(yīng)，如細(xì)胞生長、分化和凋亡等。研究表明，在多種人類惡性腫瘤中，如惡性黑色素瘤、結(jié)直腸癌、肺癌、甲狀腺癌、卵巢癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的B-raf基因突變，約66%惡性黑色素瘤和15%的結(jié)腸癌中B-raf基因存在體細(xì)胞錯(cuò)義突變。大約80-90%的B_raf基因突變發(fā)生在exonl5的1799核苷酸上，T突變?yōu)锳，導(dǎo)致其編碼的谷氨酸由纈氨酸取代(V600E)。在結(jié)直腸癌中，B-raf突變率約為15%，其中約有90%以上的突變形式為T1799A(V600E)，這與K-ras突變互相排斥。最新研究認(rèn)為，K-ras突變可能導(dǎo)致30%_40%的結(jié)直腸癌患者對EGFR靶向治療無效，而B-raf突變可能導(dǎo)致10%_15%的K_raf野生型患者發(fā)生耐藥。新上市的用于治療晚期轉(zhuǎn)移性或不能切除的黑色素瘤的藥物Zelboraf，只能用于B-rafV600E突變患者因此，對B-raf基因V600E多態(tài)性進(jìn)行分型檢測可預(yù)測患者對抗表皮生長因子受體的單克隆抗體的反應(yīng)性以及Zelboraf療效，為臨床醫(yī)生給結(jié)直腸癌及黑色素瘤制定藥物治療方案提供依據(jù)。開發(fā)快速、高效、準(zhǔn)確、便捷、經(jīng)濟(jì)的檢測B-raf基因多態(tài)性的試劑盒將為抗表皮生長因子受體的單克隆抗體及Zelboraf的臨床個(gè)體化治療起到積極的推動作用。焦磷酸測序(Pyro sequencing)技術(shù)是新一代DNA序列分析技術(shù),該技術(shù)無須進(jìn)行電泳，DNA片段也無須熒光標(biāo)記，是一種通用型技術(shù)平臺。該技術(shù)具有操作簡便、檢測成本低、所需樣品量小、快捷、準(zhǔn)確、高通量等特點(diǎn)，符合臨床大樣本檢測要求。

發(fā)明內(nèi)容
B-raf基因多態(tài)性是影響Zelboraf能否使用的最主要因素。本發(fā)明提供一種臨床檢測使用Zelboraf及抗表皮生長因子受體的單克隆抗體生物標(biāo)志物的用藥基因B_raf多態(tài)性的試劑盒及方法，以實(shí)現(xiàn)快速、簡便、準(zhǔn)確、高效、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)的檢測Zelboraf及抗表皮生長因子受體的單克隆抗體個(gè)體化用藥相關(guān)基因多態(tài)性。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為一種焦磷酸測序法檢測B-raf基因多態(tài)性的試劑盒，包括如下引物(I)擴(kuò)增引物B-raf■上游引物5' -CTTTCTAGTAACTCAGCAGCAT-3' (SEQ ID NO. 2)；B-raf■下游引物5' -AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCT-3' (SEQ ID NO. 3)；
其中，下游引物的5'進(jìn)行生物素標(biāo)記；(2)測序引物B-raf■測序引物5' -CCACTCCATCGAGATT-3' (SEQ ID NO. 4)；試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規(guī)試劑。一種應(yīng)用上述試劑盒檢測B-raf基因多態(tài)性的方法，包括如下步驟(I) DNA 提??；(2)聚合酶鏈反應(yīng) 配制50μ1 PCR 擴(kuò)增體系，包含10 X PCR buffer 5μ I, dNTP 3·0μ1，上游引物
O.5μ 1，下游引物O. 5μ l，rTaqO. 5μ 1，水39. 5μ 1，模板Ι.Ομ I ;按照下面的循環(huán)參數(shù)設(shè)置擴(kuò)增儀95° C 5min預(yù)變性；然后依次在95° C30S，50° C30S，72° C30S，進(jìn)行38個(gè)循環(huán)；再在72° C保持5min，最終保持在4° C，得擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物片段為163bp ；(3)焦磷酸測序單鏈樣本純化；(4)焦磷酸測序及結(jié)果分析。本發(fā)明的試劑盒對B-raf rsll3488022目標(biāo)序列進(jìn)行分析和檢測，該目標(biāo)序列包括野生型GTGAITTTGGTCTAGCTACAGAGAAATCTCGATGGAGTGGGT(SEQ ID NO. 5)和突變型GTGATTTTGGTCTAGCTACAGTGAAATCTCGATGGAGTGGGT (SEQ ID NO. 6);擴(kuò)增出的片段長為 163bp。由于設(shè)計(jì)了特異性高的引物，并且選擇了合適的方法，本發(fā)明的試劑盒適用于對抗表皮生長因子受體的單克隆抗體個(gè)體化用藥基因進(jìn)行快速檢測，可廣泛應(yīng)用于臨床上抗表皮生長因子受體的單克隆抗體個(gè)體化用藥方案制定的基因檢測。與現(xiàn)有技術(shù)相比，其應(yīng)用焦磷酸測序技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行短DNA序列分析，便于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化操作流程；具有高通量、低成本等特點(diǎn)；PCR產(chǎn)物即可直接用于測序，不需進(jìn)行產(chǎn)物純化等二次處理，操作極為簡便，所需樣品量小。


圖為本發(fā)明B-raf焦磷酸測序結(jié)果圖，結(jié)果顯示B_raf為野生型。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對上述試劑盒及檢測方法進(jìn)行詳細(xì)描述。實(shí)施例I :B-raf■上游引物5' -CTTTCTAGTAACTCAGCAGCAT-3' (SEQ ID NO. 2)；B-raf■下游引物5' -AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCT-3' (SEQ ID NO. 3)；其中，下游引物的5'進(jìn)行生物素標(biāo)記；B-raf■測序引物5' -CCACTCCATCGAGATT-3' (SEQ ID NO. 4)；I. DNA 提取I. I實(shí)驗(yàn)前試劑材料準(zhǔn)備與檢查工作如下(I)檢查試劑盒保質(zhì)期以及確保Wash Buffer I和2中已添加乙醇，并在瓶上相應(yīng)標(biāo)識處打勾V ； (2)異丙醇(如無，可用無水乙醇替代)和75%乙醇；(3)高壓滅菌有效期內(nèi)的I. 5mL Eppendorf管和各類移液槍頭。I. 2從4°C冰箱中取出裝有全血的EDTA抗凝管，上下顛倒數(shù)次混勻；
I. 3在I. 5mL Eppendorf管對應(yīng)標(biāo)本唯一性標(biāo)識做好標(biāo)記；I. 4 分別移取 900uL Cell Lysis Solution 加至滅菌的 I. 5mL Eppendorf 管；I. 5小心移取300uL全血轉(zhuǎn)移至上述加有Cell Lysis Solution的I. 5mL EP管；I. 6 蓋上 Eppendorf 管蓋，室溫孵育 IOmin ；I. 713, OOOrpm 室溫離心 20 秒；I. 8取出Eppendorf管,觀察白色沉淀；I. 9開Eppendorf管蓋，手持管底部，傾斜EP管口棄去部分紅色上清，盡量將紅色
上清吸盡；I. 10蓋上Eppendorf管,用手指彈擊EP管底部,使白色沉淀重懸；1.11移取300111^ Nuclei Lysis Solution 入上述Eppendorf 管中，蓋上管，上下顛倒數(shù)次混勻；I. 12 打開 Eppendorf 管，移取 IOOuL Protein Precipitation Solution 入上述Eppendorf管中，蓋上管管，振蕩器上劇烈振蕩20秒；13，OOOrpm室溫離心3min ；I. 13移取上清轉(zhuǎn)移到新的已滅菌I. 5mL Eppendorf管；I. 14移取300uL異丙醇入EP管，蓋上管蓋，上下顛倒數(shù)次混勻，可見白色絮狀gDNA析出；I. 1513, OOOrpm 室溫離心 Imin ；I. 16打開Eppendorf管，手捏管底部，傾斜管口棄去上清；I. 17移取300uL 75%乙醇加入Eppendorf管，蓋上管蓋，輕柔上下顛倒洗滌沉淀；I. 1813, OOOrpm 室溫離心 Imin ；I. 19打開Eppendorf管，手持管底部，傾斜管口棄去上清；I. 20在實(shí)驗(yàn)臺上放置新濾紙,倒扣Eppendorf管，吸干液體,將Eppendorf管開蓋側(cè)放風(fēng)干；I. 21 目測沉淀大小，加入 50 IOOul DNA Rehydration Solution 至沉淀；I. 22過夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度計(jì)進(jìn)行核酸濃度測定，核酸濃度大于50ng/ul視為合格，如濃度不夠，加入乙醇再次沉淀DNA，然后重新加適量的DNARehydration Solution 溶解 DNA。I. 23在管壁和管蓋上再次標(biāo)清樣本唯一性編號，并用透明膠帶纏繞保護(hù)；I. 24保存核酸標(biāo)本至4°C冰箱；2.聚合酶鏈反應(yīng)2. I在試劑準(zhǔn)備區(qū)配制50 μ I PCR擴(kuò)增體系(模板添加除外)，各組分及添加量如下
~IOXPCR buffer~5. Ομ I~
dNTP3. Ομ I~
上游引物O. 5μ權(quán)利要求
1.一種焦磷酸測序法檢測B-raf·基因多態(tài)性的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如下引物 (I)擴(kuò)增引物 上游引物5' -CTT TCT AGT AAC TCA GCA GCA T-3'； 下游引物5' -AGTAAAAATAGG TGAITT TGG TCT-3'； 其中，下游引物的5'進(jìn)行生物素標(biāo)記； (2 )測序引物5' -CCACTCCATCGAGATT-3'。
2.一種應(yīng)用權(quán)利要求I所述的試劑盒檢測B-raf基因多態(tài)性多態(tài)性的方法，包括如下步驟 (1)DNA 提?。? (2)聚合酶鏈反應(yīng) 配制50μ1 PCR擴(kuò)增體系，包含10XPCR buffer 5 μ I, dNTP 3. Ομ ，上游引物O.5μ 1，下游引物O. 5μ l，rTaqO. 5μ 1，水39. 5μ 1，模板Ι.Ομ I ;按照下面的循環(huán)參數(shù)設(shè)置擴(kuò)增儀95° C 5min預(yù)變性；然后依次在95° C30S，50° C30S，72° C30S，進(jìn)行38個(gè)循環(huán)；再在72° C保持5min，最終保持在4° C，得擴(kuò)增產(chǎn)物； (3)焦磷酸測序單鏈樣本純化； (4)焦磷酸測序及結(jié)果分析。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種焦磷酸測序法檢測B-raf基因多態(tài)性的試劑盒及方法。具體是指B-rfa基因rs113488022(V600E)單核苷酸多態(tài)性。試劑盒包含如SEQ ID NO.2—4所示的引物。本發(fā)明的試劑盒，可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快捷、高通量對B-raf基因突變進(jìn)行檢測，從而達(dá)到對抗表皮生長因子受體的單克隆抗體(如西妥昔單抗等)、黑色素瘤抑制劑Zelboraf等用藥實(shí)現(xiàn)安全合理有效的個(gè)體化給藥。
文檔編號C12Q1/68GK102876784SQ201210338530
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月13日
發(fā)明者周宏灝 申請人:周宏灝