專利名稱：馬鈴薯病毒病兩步法多重rt－pcr固相化檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種農業(yè)生物技術，具體的說，涉及一種同步擴增多種馬鈴薯病毒的簡單、快速的固相化核酸檢測試劑盒，適合于植物保護、農產品質量技術監(jiān)督等部門使用。
背景技術：
馬鈴薯是世界性的高產作物，我國的種植面積和產量都居世界第一位。馬鈴薯病毒病是馬鈴薯生產中的一個重要制約因素，是引起馬鈴薯品種退化的主要原因，嚴重影響了馬鈴薯的產量和質量。在我國，危害馬鈴薯的幾種主要病毒和類病毒是馬鈴薯X病毒(簡稱PVX)、馬鈴薯Y病毒(簡稱PVY)、馬鈴薯卷葉病毒(簡稱PLRV)、馬鈴薯A病毒(簡稱PVA)、馬鈴薯S病毒(簡稱PVS)，其中危害最嚴重的病毒是PLRV、PVY。馬鈴薯生產中，在不同地區(qū)幾種不同的馬鈴薯病毒病往往混合發(fā)生。馬鈴薯病毒病在早期常常沒有癥狀或癥狀混雜，只有當病毒病發(fā)生嚴重時才表現(xiàn)一定癥狀，各種病毒表現(xiàn)的癥狀又很難區(qū)分，要準確鑒定馬鈴薯感染的病毒種類，光憑癥狀觀察容易引起誤判。目前我國馬鈴薯生產上普遍采用種薯脫毒技術來預防病毒病的危害，為了確保馬鈴薯原原種、原種的脫毒質量，準確鑒定種薯病毒病種類，馬鈴薯種薯生產上急需一種更為靈敏和準確的檢驗方法。傳統(tǒng)的生物學檢測方法對專業(yè)技術要求高，且費時費力；一般的免疫學方法難以檢測含量極少的韌皮部病毒如PLRV及休眠種薯中的病毒?；诤怂岱肿訖z測的聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，以下簡稱PCR)具有靈敏度高、特異性強、準確性好等優(yōu)點，在病毒的檢測上日益顯示出強大的優(yōu)勢。由于常見馬鈴薯病毒大都是單鏈正義RNA(ssRNA)病毒，因此實際檢測中需先將病毒RNA反轉錄后再進行PCR擴增。傳統(tǒng)的生物學檢測方法對專業(yè)技術要求高，且費時費力；一般的免疫學方法難以檢測含量極少的韌皮部病毒如PLRV及休眠種薯中的病毒。基于核酸分子檢測PCR技術具有靈敏度高、特異性強、準確性好等優(yōu)點，在病毒的檢測上日益顯示出強大的優(yōu)勢。
本發(fā)明針對田間經常是2～3種馬鈴薯病毒引起復合侵染，以常規(guī)反轉錄聚合酶鏈式反應(以下簡稱RT-PCR)檢測需要多次操作，檢測成本高；而一步法RT-PCR法檢測多種馬鈴薯病毒，加入的多種引物之間的相互競爭性抑制作用導致檢測靈敏度降低的弊病，采用兩步法雙重RT-PCR同步檢測馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯卷葉病毒；三重RT-PCR同步檢測馬鈴薯X病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯S病毒，可以確保微量馬鈴薯病毒核酸的同步快速靈敏地檢出。適用于早期鑒定馬鈴薯種薯原原種及原種脫毒效果，馬鈴薯種苗攜帶病毒類型的快速鑒定。利用固相化核酸兩步法RT-PCR試劑盒及配套的制樣、檢測技術，適合田間復合侵染的馬鈴薯多種病毒和傳毒蚜蟲帶毒狀態(tài)的鑒定和監(jiān)測，省時省力，可以降低檢測成本。
通過兩年田間調查及分子檢測發(fā)現(xiàn)在重慶、四川等馬鈴薯種植地區(qū)，馬鈴薯病毒病常常2-3種病毒復合侵染，迫切需要經濟方便的多重檢測方法，但沒有檢測到PSTVd類病毒。馬鈴薯病毒是單鏈正義RNA病毒(ssRNA)，利用核酸分子檢測需要首先將病毒RNA反轉錄為cDNA，再進行PCR擴增(RT-PCR)。已經報道的常規(guī)馬鈴薯病毒核酸分子檢測技術在制樣技術、檢測對象、檢測特異性以及檢測體系優(yōu)化等方面還存在一定的局限。目前僅國外的Rudra討論了二重RT-PCR反轉錄反應中試劑濃度對PCR的影響。針對目前馬鈴薯病毒分子診斷試劑盒國內尚無生產、而進口的少量血清學試劑盒存在特異性差，缺少陽性對照、不能確定病毒種類等問題，合格種苗的質量檢測技術難以保證，嚴重制約馬鈴薯脫毒種薯的應用和發(fā)揮其增產潛力。本研究擬通過特異性引物篩選、樣品快速制備方法優(yōu)化，多重RT-PCR反轉錄及PCR反應中的引物濃度比例、試劑濃度、反應條件優(yōu)化等步驟，建立一種快速準確的多重RT-PCR分子檢測技術平臺，以期同時檢測多種病毒，簡化操作程序，降低檢測成本，并為開發(fā)馬鈴薯快速、簡便、靈敏、特異性強的檢測試劑盒奠定基礎。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的旨在克服上述現(xiàn)有技術的不足，提供一種馬鈴薯病毒病兩步法多重RT-PCR固相化檢測試劑盒及其檢測方法。
為達到上述目的，本發(fā)明的技術方案是1.引用現(xiàn)有技術中馬鈴薯病毒檢測的寡核苷酸引物，包括寡核苷酸引物對5’-TAGCACAACACAGGCCACAG-3’5’-GGCAGCATTTCAGCTTC-3’(序號NO.1)；寡核苷酸引物對5’-ACGTCCAAAATGAGAATGCC-3’5’-TGGTGTTCGGTGATGTGACCT-3’(序號NO.2)；寡核苷酸引物對5’-CGCGCTAACAGAGTTCAGCC-3’5’-GCAATGGGGGTCCAACTCAT-3(序號NO.3)；
寡核苷酸引物對5′-GTTGGAGAATTCAAGATCCTGG 3′5′-TTTCTCTGCCACCTCATCG 3′(序號NO.4)寡核苷酸引物對5’-TGGCGAACACCGAGCAAATG-3’5’-ATGATCGAGTCCAAGGGCACTG-3’(序號NO.5)。
其中NO.1用于擴增馬鈴薯X病毒，擴增產物大小為562bp；NO.2用于擴增馬鈴薯Y病毒，擴增產物大小為480bp；NO.3用于擴增馬鈴薯卷葉病毒，擴增產物大小為336bp；NO.4用于擴增馬鈴薯A病毒，擴增產物大小為255bp，NO.5用于擴增馬鈴薯S病毒，擴增產物大小為187bp。
2.制備用于田間復合侵染的馬鈴薯Y病毒(簡稱PVY)和馬鈴薯卷葉病毒(簡稱PLRV)的同步反轉錄兩步法雙重RT-PCR固相化試劑盒，由以下各種檢測試劑組成樣品病毒RNA提取試劑，病毒RNA反轉錄固相化試劑，cDNA擴增固相化試劑，無害化PVY和PLRV陽性對照品，健康馬鈴薯植株陰性對照品；其關鍵是，所述樣品病毒RNA提取試劑是0.4～0.5％曲拉通X-100與0.35～0.45％NaSO3在常溫下的混合物；所述無害化PVY和PLRV陽性對照品由如下步驟制得(1)種馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯卷葉病毒于健康馬鈴薯植株上，(2)提取馬鈴薯Y病毒和馬鈴薯卷葉病毒復合侵染后的病毒RNA，(3)設計擴增5種馬鈴薯病毒的上下游引物，上游引物的特征是5’端帶有T7啟動子序列，(4)行雙重RT-PCR擴增得PVY、PLRV DNA片段混合物，(5)PVY、PLRV DNA片段混合物為模板轉錄得PVY、PLRV RNA片段混合物；所述病毒RNA反轉錄固相化試劑、cDNA擴增固相化試劑分別是固相化混合物凍干膠珠；其中，病毒RNA反轉錄固相化試劑由雙重RT-PCR同步反轉錄馬鈴薯Y病毒和馬鈴薯卷葉病毒組成，該試劑中含有如下組分組分終濃度5x反轉錄緩沖液 1X，25mM MgCl23mmol/L，25mM dNTPs 1.0～1.5mmol/L，40U/μL RNA酶抑制劑 5～10Unit/10uL，200U/μL MMLV反轉錄酶 50～100Unit/10uL，25μM PVY∶PLRV反義引物 0.30～0.50∶0.70～0.90，25ng/μL待測樣品或RNA模板 1.0～2.5μL，
生物大分子穩(wěn)定劑 加至10μL，所使用的反義引物為寡核苷酸引物對5’-ACGTCCAAAATGAGAATGCC-3’5’-TGGTGTTCGGTGATGTGACCT-3’(序號No.2)，和寡核苷酸引物對5’-CGCGCTAACAGAGTTCAGCC-3’5’-GCAATGGGGGTCCAACTCAT-3；(序號No.3)；cDNA擴增固相化試劑由同步擴增馬鈴薯Y病毒和馬鈴薯卷葉病毒cDNA的二重PCR反應組成，該試劑中含有如下組分組分終濃度10x PCR緩沖液 1X，25mM MgCl22.0～2.5mmol/L，25mM dNTPs 0.4～0.5mmol/L，5U/μL Taq熱啟動聚合酶 1.5～2.5Unit/25uL，25ng/μl PVY∶PLRV(上下游引物對)0.30～0.40∶0.15～0.30，生物大分子穩(wěn)定劑加至21μL，所使用的引物為寡核苷酸引物對5’-ACGTCCAAAATGAGAATGCC-3’5’-TGGTGTTCGGTGATGTGACCT-3’(序號NO.2)，和寡核苷酸引物對5’-CGCGCTAACAGAGTTCAGCC-3’5’-GCAATGGGGGTCCAACTCAT-3(序號NO.3)，反轉錄合成的cDNA 4μL作為PCR反應的模板。
3、制備用于田間復合侵染的馬鈴薯病毒X病毒(簡稱PVX)、馬鈴薯A病毒(簡稱PVA)、馬鈴薯S病毒(簡稱PVS)的同步反轉錄兩步法三重固相化RT-PCR試劑盒，由以下各種檢測試劑組成樣品病毒RNA提取試劑，病毒RNA反轉錄固相化試劑，cDNA擴增固相化試劑，無害化PVX、PVA和PVS陽性對照品，健康馬鈴薯植株陰性對照品；其關鍵是，所述樣品病毒RNA提取試劑是0.4～0.5％曲拉通X-100與0.35～0.45％NaSO3在常溫下的混合物；所述無害化PVX、PVA和PVS陽性對照品由如下步驟制得(1)接種馬鈴薯X病毒，馬鈴薯A病毒，馬鈴薯S病毒于健康馬鈴薯植株上，
(2)提取馬鈴薯病毒X病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯S病毒復合侵染后的病毒RNA，(3)設計擴增5種馬鈴薯病毒的上下游引物，上游引物的特征是5’端帶有T7啟動子序列，(4)進行三重RT-PCR擴增得PVX、PVA、PVS DNA片段混合物，(5)以PVX、PVA、PVS DNA片段混合物為模板轉錄得PVX、PVA、PVS RNA片段混合物，用作三重RT-PCR的無害化陽性對照；所述病毒RNA反轉錄固相化試劑、cDNA擴增固相化試劑分別是固相化混合物凍干膠珠；其中，病毒RNA反轉錄固相化試劑由同步反轉錄三重RT-PCR馬鈴薯Y病毒和馬鈴薯卷葉病毒組成，該試劑中含有如下各種組分組分 終濃度5X反轉錄緩沖液1X，25mM MgCl23mmol/L，25mM dNTPs1.5～2.0mmol/L，40U/μL RNA酶抑制劑 5.0～10.0Unit/10uL，200U/μL MMLV反轉錄酶 50～100Unit/10uL，25μM PVX∶PVA∶PVS引物 0.30～0.40∶0.80～1.00∶0.80～1.00，25ng/μL無害化陽性對照品 1.0～2.5μL，25ng/μL待測樣品或RNA模板 1.0～2.5μL，生物大分子穩(wěn)定劑 加至10μL，所使用的引物為寡核苷酸引物對5’-TAGCACAACACAGGCCACAG-3’5’-GGCAGCATTTCAGCTTC-3’(序號NO.1)，和寡核苷酸引物對5′-GTTGGAGAATTCAAGATCCTGG 3′5′-TTTCTCTGCCACCTCATCG 3′(序號NO.4)，和寡核苷酸引物對5’-TGGCGAACACCGAGCAAATG-3’5’-ATGATCGAGTCCAAGGGCACTG-3’(序號NO.5)；cDNA擴增固相化試劑由同步擴增馬鈴薯X病毒、馬鈴薯A病毒和馬鈴薯S病毒cDNA三重PCR反應組成，該試劑中含有如下組分組分 終濃度10x PCR緩沖液 1X，25mM MgCl22.5～3.0mmol/L，
25mM dNTPs0.4～0.5mmol/L，5U/μL Taq熱啟動聚合酶1.5～2.5Unit/25μL，25ng/μL PVX∶PVA∶PVS0.35～045∶0.15～0.25∶0.10～0.20，生物大分子穩(wěn)定劑 加至21μL，所使用的引物為寡核苷酸引物對5’-TAGCACAACACAGGCCACAG-3’5’-GGCAGCATTTCAGCTTC-3’(序號NO.1)，和寡核苷酸引物對5′-GTTGGAGAATTCAAGATCCTGG 3′5′-TTTCTCTGCCACCTCATCG 3′(序號NO.4)，和寡核苷酸引物對5’-TGGCGAACACCGAGCAAATG-3’5’-ATGATCGAGTCCAAGGGCACTG-3’(序號NO.5)，反轉錄合成的cDNA 4μL作為PCR反應的模板。
本發(fā)明所述病毒RNA反轉錄固相化試劑、cDNA擴增固相化試劑的固相化混合物凍干膠珠是利用生物大分子穩(wěn)定劑經真空冷凍干燥制備而成的可以常溫貯運的PCR擴增固相化混合物凍干膠珠。而生物大分子穩(wěn)定劑由重量體積比為0.05-0.1％明膠、0.1～0.2％多糖、0.02～0.05％BAS，其余為純凈水混合而成。
4、提供用于馬鈴薯多種病毒RNA提取方法，按以下步驟進行(1)配制馬鈴薯病毒RNA專用浸提液，即試劑盒中的樣品病毒RNA提取試劑，它由0.4～0.5％曲拉通X-100與0.35～0.45％ NaSO3在常溫下與無RNA酶的滅菌純化水混合溶液；(2)在100μL馬鈴薯病毒RNA浸提液中分別加入樣品馬鈴薯植株的葉片5～10mg、葉梗20～30mg、莖干30～40mg或塊莖50～60mg于37℃下進行浸提30min；(3)10000r/min離心10min，取上清直接用于RT-PCR。
5、在具備上述1、2、3、4、條件的情況下，提供一種同步檢測多種馬鈴薯病毒的多重RT-PCR檢測方法，其步驟如下(1)根據(jù)馬鈴薯病毒的特異序列設計設計馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯卷葉病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯S病毒特異性引物對，該引物分別是第1點所述引物；(2)采用簡易浸提法快速提取馬鈴薯多種病毒RNA(即第4點所述方法)，同時加入PCR反應抑制因子解除劑；該解除劑以重量份數(shù)0.3-0.5％NaSo3，0.01-0.1％Triton X-100，與適量無RNA酶的滅菌純水，在常溫下混合攪拌所得溶液；
(3)對于雙重RT-PCR，加入馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯卷葉病毒特異性下游引物及反轉錄反應組分進行反轉錄合成cDNA；(4)對于三重RT-PCR，加入馬鈴薯X病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯S病毒特異性下游引物及反轉錄組分進行反轉錄合成cDNA；同時做好陽性對照和陰性對照；病毒RNA反轉錄固相化試劑；(5)將反轉錄合成的cDNA作為模板，雙重RT-PCR分別加入馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯卷葉病毒特異性引物對及PCR反應組分進行PCR擴增；三重RT-PCR分別加入馬鈴薯X病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯S病毒特異性引物對及PCR反應組分進行PCR擴增；同時做好陽性對照和陰性對照定量品；即試劑盒中cDNA擴增固相化試劑。
(6)將擴增產物進行凝膠電泳，GV熒光染料顯色后，在凝膠成像儀上照相。
本發(fā)明經實驗獲得顯著成功，其部分實驗及檢測數(shù)據(jù)請見圖1、圖2和表1。
由圖1可知，應用雙重RT-PCR檢測帶有馬鈴薯病毒PVX和PVY或PVA和PLRV；表明檢測體系特異、靈敏。
由圖2可知應用三重RT-PCR檢測帶有馬鈴薯病毒PVX，PVS和PVA；表明三重檢測體系準確和特異。
表1是馬鈴薯病毒RT-PCR實際檢測結果。
由表1可看出，采用RT-PCR技術對不同來源的部分馬鈴薯樣品進行實際檢測，結果表明本發(fā)明所提出的方法具有特異性強，靈敏度高，準確性好的特點。
表1 馬鈴薯病毒RT-PCR實際檢測

采用上述技術方案，本發(fā)明突出的技術進步在于1、可以同步檢測馬鈴薯Y病毒和馬鈴薯卷葉病毒的固相化試劑盒和兩步法三重RT-PCR同步檢測馬鈴薯X病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯S病毒的試劑盒；2、本發(fā)明以分子檢測為基礎，利用RNA簡易快速浸提技術和多重RT-PCR技術，只需微量材料即可對多種馬鈴薯病毒直接進行RT-PCR檢測，突出的優(yōu)點就在于快速、靈敏度高、特異性強、所需檢測材料少，克服了現(xiàn)有的對馬鈴薯病毒病依據(jù)癥狀學的常規(guī)診斷方法誤判率高、傳統(tǒng)的生物學檢測方法費時費力、一般的免疫學方法難以檢測含量極少的韌皮部病毒如PLRV及休眠種薯中的病毒等缺陷，以及一步法多重RT-PCR靈敏度低、不穩(wěn)定的缺點。
3、由于本發(fā)明在靈敏度和特異性方面的特長及同時可檢測2-3種馬鈴薯病毒，因此特別適合于早期快速鑒定馬鈴薯種薯原原種及原種帶毒情況以及馬鈴薯葉片、葉梗、莖干和塊莖樣品中病毒類型的快速鑒定。
4、兩步法多重RT-PCR檢測技術及固相化試劑盒尤其適合田間復合侵染的馬鈴薯多種病毒和傳毒蚜蟲帶毒狀態(tài)的鑒定和監(jiān)測，并省時省力，可以降低檢測成本。
5、由于本發(fā)明RNA提取時間短，縮短了病毒的檢測時間，現(xiàn)在利用原始材料進行RT-PCR檢測只需要4-6小時，特別適合于馬鈴薯原原種、原種種苗進行脫毒檢驗，以確保組培馬鈴薯種苗的質量。
綜上所述，采用本發(fā)明，能對馬鈴薯種薯種苗和田間調查過程中所獲得的各種材料進行馬鈴薯病毒病分子生物學鑒定或檢測，對馬鈴薯脫毒種苗的生產和質量監(jiān)督具有重要作用。


圖1是應用雙重RT-PCR擴增馬鈴薯病毒PVX和PVY；PVA和PLRV對照圖，其中1列100bp DNA片斷大小標準；2列空白對照；3-4列PVX和PVA；5列空白對照；6-7列PVY and PLRV；8列陰性對照。
圖2是三重RT-PCR擴增馬鈴薯病毒檢測圖，其中1列100bp DNA片斷大小標準；2-5列RT-PCR檢測PVX，PVA和PVS；6列陰性對照。
具體實施例方式
實施例一、兩步法二重RT-PCR同步檢測馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯卷葉病毒固相化檢測試劑盒及檢測方法。
一、固相化檢測試劑盒的組分樣品病毒RNA提取試劑，PVY、PLRV病毒RNA反轉錄固相化試劑，cDNA擴增固相化試劑，無害化PVY、PLRV陽性對照，健康植株陰性對照。
二、固相化試劑盒的制備1、檢測方法包括如下步驟1)提取病毒RNA配制馬鈴薯病毒RNA專用浸提液(是0.5％曲拉通X-100與含終濃度0.4％ NaSO3在常溫下與適量無RAN酶的純凈水的混合液)；取出待檢馬鈴薯樣品，在100μL馬鈴薯病毒RNA浸提液中分別加入樣品馬鈴薯植株的葉片10mg、葉梗30mg、莖干40mg或塊莖60mg于37℃下進行浸提30min；10000r/min離心10min，取上清液直接用于反轉錄聚合酶鏈式反應。在加溫37℃時混合，攪拌5分鐘所得溶液；2)設計兩對引物一對寡核苷酸引物用于擴增馬鈴薯Y病毒5’-ACGTCCAAAATGAGAATGCC-3’，5’-TGGTGTTCGGTGATGTGACCT-3’(序號NO.2)；另一對寡核苷酸引物用于擴增馬鈴薯卷葉病毒5’-CGCGCTAACAGAGTTCAGCC-3’，5’-GCAATGGGGGTCCAACTCAT-3(序號NO.3)；3)加入NO.2和NO.3中的下游引物于反轉錄反應體系中，反轉錄反應體系為1×反轉錄反轉錄反應緩沖液是3mmol/L MgCl2，1.5mmol/L dNTPs，10U RNA酶抑制劑，100U MMLV反轉錄酶，反義引物PVY∶PLRV為0.50∶0.90，提取的病毒RNA2.5μL，生物大分子穩(wěn)定劑0.4％明膠、0.2％多糖、0.05％BAS、無RNA酶的超純水補足至10uL。將反應體系混合離心后再置于PCR擴增儀(Bio-Rad，USA)進行PCR反應，反應用水作空白對照，用無害化PVY和PLRV病毒RNA作陽性對照，用健康馬鈴薯植株作陰性對照。反應程序為反轉錄反應25℃ 10min，42℃ 1h，95℃ 5min。
4)加入NO.2和NO.3引物對于PCR反應體系中，PCR擴增反應體系為4μL反錄錄合成的cDNA作為PCR反應模板，1×PCR緩沖液，2.5mM/L MgCl2，0.5mM/L dNTPs，Taq DNA聚合酶2.5U，正義反義引物對PVY∶PLRV為0.40∶0.30；生物大分子穩(wěn)定劑0.05％明膠、0.1％多糖、0.03％BAS、去離子水補足至25uL。將反應體系混合離心后再置于定量PCR擴增儀(Bio-Rad，USA)進行PCR反應，PCR擴增程序為94℃變性1min，60℃復性1min，72℃延伸1min；共30個循環(huán)，最后72℃ 10min。
5)擴增產物檢測擴增反應結束后，取10μl擴增產物加1μl含溴酚藍的上樣緩沖液，用2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，緩沖液為1×TAE，100V電泳30min，GV熒光染色，DNA片段大小標準采用100bp DNA ladder。凝膠成像系統(tǒng)觀測電泳結果并照相記錄。
2、檢測結果若檢測到以馬鈴薯病毒病RNA為模板的陽性對照有靶帶產生，陰性對照和空白對照沒有靶帶產生，而樣品的檢測結果與陽性對照的靶帶大小一致，即產生480bp大小的帶則是PVY病毒，產生336bp大小的帶為PVY，若同時產生480bp、336bp的帶，則為PVY，PLRV復合侵染。如圖1，圖2所示。
實施例二、兩步法三重RT-PCR同步檢測馬鈴薯X病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯S病毒固相化檢測試劑盒及檢測方法。
一、固相化檢測試劑盒的組分樣品病毒RNA提取試劑，PVX、PVA、PVS病毒RNA反轉錄固相化試劑，cDNA擴增固相化試劑，無害化PVX、PVA、PVS陽性對照，健康植株陰性對照。
二、固相化試劑盒的制備1、檢測方法包括如下步驟1)提取病毒RNA配制馬鈴薯病毒RNA專用浸提液(是0.5％ Triton X-100與含終濃度0.4％ NaSO3在常溫下與適量無RAN酶的純凈水的混合液)；取出待檢馬鈴薯樣品，在100μL馬鈴薯病毒RNA浸提液中分別加入樣品馬鈴薯植株的葉片5mg、葉梗20mg、莖干30mg或塊莖50mg于37℃下進行浸提30min；10000r/min離心10min，取上清液直接用于反轉錄聚合酶鏈式反應。
2)設計兩對引物一對寡核苷酸引物用于擴增馬鈴薯X病毒5’-TAGCACAACACAGGCCACAG-3’，5’-GGCAGCATTTCAGCTTC-3’(序號NO.1)；一對寡核苷酸引物用于擴增馬鈴薯A病毒5′-GTTGGAGAATTCAAGATCCTGG 3′，5′-TTTCTCTGCCACCTCATCG 3′(序號NO.4)；另一對寡核苷酸引物用于擴增馬鈴薯S病毒5’-TGGCGAACACCGAGCAAATG-3’，5’-ATGATCGAGTCCAAGGGCACTG-3’(序號NO.5)。
3)加入NO.1、NO.4和NO.5中的下游引物于反轉錄反應體系中，反轉錄反應體系為1×反轉錄反應緩沖液即3mmol/L MgCl2，1.5mmol/L dNTPs，5U RNA酶抑制劑，50～100U MMLV反轉錄酶，反義引物PVX∶PVA∶PVS為0.40∶0.80～1.00∶0.80，提取的病毒RNA 1μL，生物大分子穩(wěn)定劑0.08％明膠、0.2％多糖、0.02％BAS、無RNA酶的超純水補足至10uL。將反應體系混合離心后再置于PCR擴增儀(Bio-Rad，USA)進行PCR反應，反應用水作空白對照，用無害化PVX、PVA和PVS病毒RNA作陽性對照，用健康馬鈴薯植株作陰性對照。反應程序為反轉錄反應25℃ 10min，42℃ 1h，95℃ 5min。
4)加入NO.1、NO.4和NO.5引物于PCR反應體系中，PCR擴增反應體系為4μL反轉錄合成的cDNA作為PCR反應模板，1×PCR緩沖液，2.5mmol/L MgCl2，0.4mmol/L dNTPs，Taq DNA聚合酶1.5U，正義反義引物對PVX∶PVA∶PVS為0.35∶0.15∶0.10；生物大分子穩(wěn)定劑0.1％明膠、0.2％多糖、0.04％BAS、去離子水補足至25uL。將反應體系混合離心后再置于PCR擴增儀(Bio-Rad，USA)進行PCR反應，PCR擴增程序為94℃變性1min，60℃復性1min，72℃延伸1min；共30個循環(huán)，最后72℃ 10min。
5)擴增產物檢測擴增反應結束后，取10μl擴增產物加1μl含溴酚藍的上樣緩沖液，用2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，緩沖液為1×TAE，100V電泳30min，GV熒光染色，采用100bp DNA ladder作為DNA片段大小標準。凝膠成像系統(tǒng)觀測電泳結果并照相記錄。
檢測結果判定若檢測到以馬鈴薯病毒病RNA為模板的陽性對照有靶帶產生，陰性對照和空白對照沒有靶帶產生，而樣品的檢測結果與陽性對照的靶帶大小一致，即產生562bp大小的帶則是PVX病毒，產生255bp大小的帶為PVA，產生187bp大小的帶為PVS，若同時產生562bp、255bp和187bp大小的帶，則為PVX、PVA和PVS復合侵染。
權利要求
1.一種用于田間復合侵染的馬鈴薯Y病毒(簡稱PVY)和馬鈴薯卷葉病毒(簡稱PLRV)的同步反轉錄兩步法雙重RT-PCR固相化試劑盒，由以下各種檢測試劑組成樣品病毒RNA提取試劑，病毒RNA反轉錄固相化試劑，cDNA擴增固相化試劑，無害化PVY和PLRV陽性對照品，健康馬鈴薯植株陰性對照品；其特征是，所述樣品病毒RNA提取試劑是0.4～0.5％曲拉通X-100與0.35～0.45％NaSO3在常溫下的混合物；所述無害化PVY和PLRV陽性對照品由如下步驟制得(1)接種馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯卷葉病毒于健康馬鈴薯植株上，(2)提取馬鈴薯Y病毒和馬鈴薯卷葉病毒復合侵染后的病毒RNA，(3)設計擴增5種馬鈴薯病毒的上下游引物，上游引物的特征是5’端帶有T7啟動子序列，(4)進行雙重RT-PCR擴增得PVY、PLRV DNA片段混合物，(5)以PVY、PLRV DNA片段混合物為模板轉錄得PVY、PLRV RNA片段混合物；所述病毒RNA反轉錄固相化試劑、cDNA擴增固相化試劑分別是固相化混合物凍干膠珠；其中，病毒RNA反轉錄固相化試劑由雙重RT-PCR同步反轉錄馬鈴薯Y病毒和馬鈴薯卷葉病毒組成，該試劑中含有如下組分組分終濃度5x反轉錄緩沖液 1X，25mM MgCl23～5mmol/L，25mM dNTPs 1.0～1.5mmol/L，40U/μL RNA酶抑制劑 5～10Unit/10uL，200U/μL MMLV反轉錄酶 50～100Unit/10uL，25μM PVY∶PLRV反義引物 0.30～0.50∶0.70～0.90，25ng/μL待測樣品或RNA模板 1.0～2.5μL，生物大分子穩(wěn)定劑加至10μL，所使用的反義引物為寡核苷酸引物對5’-ACGTCCAAAATGAGAATGCC-3’5’-TGGTGTTCGGTGATGTGACCT-3’(序號No.2)，和寡核苷酸引物對5’-CGCGCTAACAGAGTTCAGCC-3’5’-GCAATGGGGGTCCAACTCAT-3；(序號No.3)；cDNA擴增固相化試劑由同步擴增馬鈴薯Y病毒和馬鈴薯卷葉病毒cDNA的二重PCR反應組成，該試劑中含有如下組分組分終濃度10x PCR緩沖液 1X，25mM MgCl22.0～2.5mmol/L，25mM dNTPs 0.4～0.5mmol/L，5U/μL Taq熱啟動聚合酶 1.5～2.5Unit/25uL，25ng/μl PVY∶PLR即上下游引物對 0.30～0.40∶0.15～0.30，生物大分子穩(wěn)定劑加至21μL，所使用的引物為寡核苷酸引物對5’-ACGTCCAAAATGAGAATGCC-3’5’-TGGTGTTCGGTGATGTGACCT-3’(序號NO.2)，和寡核苷酸引物對5’-CGCGCTAACAGAGTTCAGCC-3’5’-GCAATGGGGGTCCAACTCAT-3(序號NO.3)，反轉錄合成的cDNA 4μL作為PCR反應的模板。
2.根據(jù)權利要求1所述的馬鈴薯Y病毒(簡稱PVY)和馬鈴薯卷葉病毒(簡稱PLRV)的同步反轉錄兩步法雙重RT-PCR固相化試劑盒，其特征在于，所述生物大分子穩(wěn)定劑由重量體積比為0.05-0.1％明膠、0.1～0.2％多糖、0.02～0.05％BAS，其余為純凈水混合而成。
3.一種用于田間復合侵染的馬鈴薯病毒X病毒(簡稱PVX)、馬鈴薯A病毒(簡稱PVA)、馬鈴薯S病毒(簡稱PVS)的同步反轉錄兩步法三重固相化RT-PCR試劑盒，由以下各種檢測試劑組成樣品病毒RNA提取試劑，病毒RNA反轉錄固相化試劑，cDNA擴增固相化試劑，無害化PVX、PVA和PVS陽性對照品，健康馬鈴薯植株陰性對照品；其特征是，所述樣品病毒RNA提取試劑是0.4～0.5％曲拉通X-100與0.35～0.45％NaSO3在常溫下的混合物；所述無害化PVX、PVA和PVS陽性對照品由如下步驟制得(1)接種馬鈴薯X病毒，馬鈴薯A病毒，馬鈴薯S病毒于健康馬鈴薯植株上，(2)提取馬鈴薯病毒X病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯S病毒復合侵染后的病毒RNA，(3)設計擴增5種馬鈴薯病毒的上下游引物，上游引物的特征是5’端帶有T7啟動子序列，(4)進行三重RT-PCR擴增得PVX、PVA、PVS DNA片段混合物，(5)以PVX、PVA、PVS DNA片段混合物為模板轉錄得PVX、PVA、PVS RNA片段混合物，用作三重RT-PCR的無害化陽性對照；所述病毒RNA反轉錄固相化試劑、cDNA擴增固相化試劑分別是固相化混合物凍干膠珠；其中，病毒RNA反轉錄固相化試劑由同步反轉錄三重RT-PCR馬鈴薯Y病毒和馬鈴薯卷葉病毒組成，該試劑中含有如下各種組分組分終濃度5X反轉錄緩沖液 1X，25mM MgCl23～5mmol/L，25mM dNTPs 1.5～2.0mmol/L，40U/μL RNA酶抑制劑 5.0～10.0Unit/10uL，200U/μL MMLV反轉錄酶 50～100Unit/10uL，25μM PVX∶PVA∶PVS引物 0.30～0.40∶0.80～1.00∶0.80～1.00，25ng/μL無害化陽性對照品1.0～2.5μL，25ng/μL待測樣品或RNA模板 1.0～2.5μL，生物大分子穩(wěn)定劑加至10μL，所使用的引物為寡核苷酸引物對5’-TAGCACAACACAGGCCACAG-3’5’-GGCAGCATTTCAGCTTC-3’(序號NO.1)，和寡核苷酸引物對5′-GTTGGAGAATTCAAGATCCTGG 3′5′-TTTCTCTGCCACCTCATCG 3′(序號NO.4)，和寡核苷酸引物對5’-TGGCGAACACCGAGCAAATG-3’5’-ATGATCGAGTCCAAGGGCACTG-3’(序號NO.5)；cDNA擴增固相化試劑由同步擴增馬鈴薯X病毒、馬鈴薯A病毒和馬鈴薯S病毒cDNA三重PCR反應組成，該試劑中含有如下組分組分終濃度10x PCR緩沖液 1X，25mM MgCl22.5～3.0mmol/L，25mM dNTPs 0.4～0.5mmol/L，5U/μL Taq熱啟動聚合酶 1.5～2.5Unit/25μL，25ng/μLPVX∶PVA∶PVS 0.35～045∶0.15～0.25∶0.10～0.20，生物大分子穩(wěn)定劑加至21μL所使用的引物為寡核苷酸引物對5’-TAGCACAACACAGGCCACAG-3’5’-GGCAGCATTTCAGCTTC-3’(序號NO.1)，和寡核苷酸引物對5′-GTTGGAGAATTCAAGATCCTGG 3′5′-TTTCTCTGCCACCTCATCG 3′(序號NO.4)，和寡核苷酸引物對5’-TGGCGAACACCGAGCAAATG-3’5’-ATGATCGAGTCCAAGGGCACTG-3’(序號NO.5)，反轉錄合成的cDNA 4μL作為PCR反應的模板。
4.根據(jù)權利要求3所述的馬鈴薯病毒X病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯S病毒的同步反轉錄兩步法雙重RT-PCR固相化試劑盒，其特征在于，所述生物大分子穩(wěn)定劑由重量體積比為0.05-0.1％明膠、0.1～0.2％多糖、0.02～0.05％BAS，其余為純凈水混合而成。
5.一種用于馬鈴薯多種病毒RNA提取方法，其特征是按以下步驟進行[1]配制馬鈴薯病毒RNA專用浸提液，由0.4～0.5％曲拉通X-100與0.35～0.45％NaSO3與適量無RAN酶的純凈水混合而成；[2]在100μL馬鈴薯病毒RNA浸提液中分別加入樣品馬鈴薯植株的葉片5～10mg、葉梗20～30mg、莖干30～40mg或塊莖50～60mg于37℃下進行浸提30min；[3]10000r/min離心10min，取上清直接用于反轉錄聚合酶鏈式反應。
全文摘要
本發(fā)明涉及兩步法雙重RT－PCR同步檢測馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯卷葉病毒，三重RT－PCR同步檢測馬鈴薯X病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯S病毒的方法及檢測試劑盒，是專門針對馬鈴薯產業(yè)影響較大的5種馬鈴薯病毒而建立的一種同步檢測2或3種病毒的快速方法，檢測時間僅用4h，且靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定可靠。該方法克服了現(xiàn)有對馬鈴薯病毒病依據(jù)癥狀學的常規(guī)診斷方法誤判率較高、血清學方法難以檢測休眠馬鈴薯中的病毒及病毒含量較少的韌皮部病毒—馬鈴薯卷葉病毒等缺點；該方法適用于馬鈴薯種苗、種薯多種病毒病的早期診斷，對馬鈴薯種薯質量監(jiān)測和病毒病預防有著重要的作用。
文檔編號C12Q1/68GK1858255SQ200610054159
公開日2006年11月8日 申請日期2006年3月24日 優(yōu)先權日2006年3月24日
發(fā)明者王中康, 殷幼平, 袁青, 夏玉先, 彭國雄, 曾德玉, 曹月青, 劉紅光 申請人:重慶大學, 重慶重大生物技術發(fā)展有限公司, 四川渝高科技有限責任公司