專利名稱：一種鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物保護技術(shù)領(lǐng)域，涉及番茄黃化曲葉病毒接種鑒定的研究，更具體的說是一種快速、簡捷、高效的鑒定天津地區(qū)番茄黃化曲葉病毒抗性接種的方法。
背景技術(shù)：
番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)主要危害番茄、辣椒、茄子、甘藍和黃瓜等蔬菜以及煙草等經(jīng)濟作物，特別是在番茄上危害更重。針對于TYLCV 病毒的發(fā)生和危害，如何準確、快速、高效地檢測到該病毒的存在和發(fā)生，是蔬菜安全可持續(xù)生產(chǎn)的迫切需要。目前，鑒定番茄黃化曲葉病抗性的方法有煙粉虱傳毒、嫁接接種和機械傳毒等等。 其中，嫁接法以嫩病葉做接穗，采用腹接法接種到健康番茄上，它的優(yōu)點是能夠為待鑒定植株提供高含量的ITLCV病毒，但該方法耗時耗力，只適于少量鑒定。機械傳播是在人工環(huán)境下把感染TYLCV的曼陀羅、心葉煙或潘那利番茄作為毒源，通過機械傳播侵染健康番茄植株，成功率較低，且病毒從番茄傳到番茄上成功的例子只有很少的報道，因此，在接種中一般不用該TYLCV病毒。在育種進程中最常用的接種方法是煙粉虱接種鑒定法，包括溫室中煙粉虱接種、回型籠中煙粉虱接種、露地煙粉虱接種3種類型，但這個方法也有一些缺點1.蟲口密度不均一對抗性鑒定的影響。若蟲口密度過大，一些抗病品種也會表現(xiàn)出感病來；若蟲口密度太小，又區(qū)分不出抗感品種。目前對蟲口密度的要求還沒有一個標準。 2.蟲子逃逸引起病害的大面積發(fā)生。煙粉虱的體長一般為l_2mm，它可隨著調(diào)查人員的進出而逃逸出來，從而給周圍番茄產(chǎn)區(qū)帶來災(zāi)害。3.受季節(jié)限制。煙粉虱的最佳活動溫度是 ^_28°C，低于15°C蟲子基本不活動，也就不能傳毒，這就會延緩接種鑒定的進程。農(nóng)桿菌接種法是近年來發(fā)展起來的一種病毒抗性鑒定方法。利用TYLCV-DNA侵染性克隆，通過根癌農(nóng)桿菌侵染待鑒定植株，病毒DNA可在植物體內(nèi)形成、復制、運輸并誘發(fā)癥狀。侵染性克隆技術(shù)首先在噬菌體病毒Qβ、脊髓灰質(zhì)炎病毒b^iorir皿)中獲得成功，植物病毒侵染性克隆由Ahlquist等(1984)在雀麥花葉病毒virus, BMV)首次報道，至今國外已有大量的植物病毒被成功地構(gòu)建了全長cDNA侵染性克隆 (2008)。^iang等(2010，2009)分別構(gòu)建了番木瓜黃曲病毒的侵染性克隆和上海分離物 YLCV-[CN:SH2]的侵染性克隆，證明通過農(nóng)桿菌注射能誘導出病毒侵染癥狀。本發(fā)明的研究表明(2011)天津地區(qū)的分離物與上海和山東等省的分離物基因序列不同，編碼轉(zhuǎn)錄激活蛋白的序列有2處突變，導致天津地區(qū)分離物與其它地區(qū)分離物氨基酸的不同，分別是90位E到G和104位H到Y(jié)，推測這兩個突變可能增強了其致病力。目前，國內(nèi)還未見天津地區(qū)TYLCV的侵染性克隆工作的報道，因此，針對以天津為代表的華北地區(qū)抗番茄曲葉病毒栽培專用品種缺乏的現(xiàn)狀，開展侵染性克隆構(gòu)建工作，建立一套方便、可靠、安全的接種新方法，為抗病育種提供一種客觀的評價體系，從而篩選培育出具有自主知識產(chǎn)權(quán)的專用品種，對于提高番茄市場競爭力，推進蔬菜產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展
4具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對傳統(tǒng)技術(shù)不能準確地對TYLCV抗性進行鑒定的問題，本發(fā)明人進行了大量的研究工作，構(gòu)建了針對天津地區(qū)TYLCV的侵染性克隆(代號為TYLCV-TJ)，通過莖桿注射接種番茄黃化曲葉病毒，鑒定不同番茄材料對該病毒的抗性。此方法無需飼養(yǎng)煙粉虱、操作簡單、效率高、重復性好、可控性好，能提供相對一致的接種壓力，結(jié)果準確，是一種簡便有效的接種鑒定方法。本發(fā)明所公開的技術(shù)內(nèi)容如下
一種鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性的方法，其特征在于按如下的步驟進行
1)DNA提取從收集的發(fā)病植株的葉片中提取基因組總DNA ；
2)引物的設(shè)計以植物總DNA為模板，設(shè)計簡并引物-對病毒DNA-A進行PCR擴增，其中擴增所用PCR引物為
BamHI 上 ag tgggatccac ttctaaatg
BamHI Τ* aggatcc catattgcaagacagactac
2356Fbggatggaaatgtgctgacct
BamRbgtggatcccacatattgcaa
a:擴增全長的DNA-A序列；
b 擴增0. 4A的DNA-A序列；
3)擴增產(chǎn)物克隆到pMD-19T載體上，分別命名為1. OA-pMD和0. 4A_pMD并轉(zhuǎn)化到 DH5a菌液中；
4)串聯(lián)重復的克隆用BamHI酶切切下1.OA-pMD的病毒全長DNA ；用BamHI切開含有 0. 4A病毒基因組片段的0. 4A-pMD載體；利用試劑盒回收相應(yīng)大小的片段，利用T4連接酶將二者相連得到1. 4A-pMD重組載體，轉(zhuǎn)化至Dffia菌液中；
5)正向串聯(lián)重復序列的獲得
1. OA和0. 4A兩個片段，利用引物C擴增陽性克隆菌液，比較大小后選出正向串聯(lián)的菌落形成1. 4A串聯(lián)的克隆；所用引物為
PMD19F ccgcc aag ctt gca tgccg
BamR cgtggatcccacatattgcaa ；
6)表達載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化
利用KnpI和Mil對含有1. 4A TYLCV的1. 4A_pMD質(zhì)粒和植物表達載體pRI IOl-An 進行雙酶切，然后利用T4連接酶將目的片段與表達載體進行連接得到1.4A- pRI，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 α中；用凍融法將1. 4Α- pRI直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404的感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含利福平和卡那霉素平板，溫箱培養(yǎng)2 3d ；挑取單菌落接種于anl含利福平50ug / mL和卡那霉素50ug / mL的TCB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜后，取ImI 菌液置于1.5ml離心管，離心收集菌體，加50 L無菌水煮沸l(wèi)Omin，取上清作模板進行PCR 擴增，擴增產(chǎn)物用1. 0%瓊脂凝膠電泳驗證；
7)重組質(zhì)粒的提取與鑒定
用 TAKARAMiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 2. 0 (50 次量)試劑盒進行質(zhì)粒 DNA的微量提取，利用Mil和KnpI雙酶切1. 4A -pRI，37°C酶切消化Ih后瓊脂糖凝膠電泳8)序列測定與分析
數(shù)據(jù)處理借助 DNAMAN Version 6. 0 (Lynnon Biosoft, QuebeCanada)進行，利用 BLAST 程序在GeneBank數(shù)據(jù)庫中尋找與DNA-A序列最相近的基因組序列；
9)農(nóng)桿菌接種及病毒DNA的檢測和田間調(diào)查
將含有病毒DNA-A侵染性克隆的農(nóng)桿菌LBA4404分別接種在含卡那霉素(50 ug/mL) 和利福平(50 ug/mL)的YEB液體培養(yǎng)基中，28°C，200 rpm振蕩培養(yǎng)48 h，接種時，取一支 1 mL的一次性注射器，吸取培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液，在距離供試植株根部1-2 cm處取三點進行韌皮部注射，接種植株置于防蟲溫室中培養(yǎng)，在注射接種后30天，采集葉片約0. 5克，抽 DNA-A后進行PCR檢測，對植株高度和葉片進行癥狀的觀察。本發(fā)明通過該方法能科學高效準確地鑒定出番茄對ITLCV的抗性，其特點在于 (1)本發(fā)明公開的接種鑒定方法與其它的侵染性克隆不同的是本發(fā)明是利用雙子葉植
物表達載體pRI-101-AN。該載體能特異地在番茄體內(nèi)高效表達有利于病毒癥狀的誘導且具有自主知識產(chǎn)權(quán)。(2)本發(fā)明將含有雙向起動子的頂區(qū)序列串聯(lián)在了全長基因組編碼序列之后，而其它的如TYLCV的YlO分離物是將頂區(qū)串聯(lián)在了全長基因組之前，實驗證明這種策略同樣能有效起動病毒的編碼，為侵染性克隆的構(gòu)建提供了更多的途徑。(3)本發(fā)明是針對天津地區(qū)特有的番茄黃化曲葉病毒序列而構(gòu)建的表達載體，其所編碼的氨基酸與其它地區(qū)是不同的，見文獻《華北農(nóng)學報》2011年第1期“天津地區(qū)番茄黃化曲葉病毒DNA-A的克隆和序列分析”。本發(fā)明更加詳細的方法如下 1材料和方法
1.1材料
毒源TYLCV侵染植株所引起的典型癥狀為黃脈、曲葉、曲莖、葉片皺縮、葉脈增厚、葉色褪綠、植株矮化等癥狀。采集表現(xiàn)這些癥狀的栽培番茄，-70°C保存待用。菌株與載體大腸桿菌和農(nóng)桿菌L. BA4404DH5 α購均自北京博美科生物技術(shù)有限公司；分子量標準Taq酶和克隆載體pMD-19T植物表達載體pRI IOl-An均購自寶生物工程有限公司。限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶及DNA購自寶信購自New England Biolabs01. 2 方法
(1)取材料，加液氮研磨成粉末狀，迅速移入1.5ml Eppendorf管中；
(2)加入800μ 1的CTAB提取緩沖液，混勻(CTAB在65°C水浴預熱)，每5min輕輕震蕩幾次，20min 后 12000 r/min，離心 15 min ；
(3)小心吸取上清液，加入等體積的酚氯仿(各400μ 1)溶液，混勻，4°C，12000 r/min, 離心10 min ；
(4)小心吸取上清液，加入等體積的氯仿，混勻，4°C，12000r/min，離心10 min。(5)重復步驟(4) 1-2次，以蛋白層不出現(xiàn)為止；
(6)取上清，-20°C沉淀lh，4°C，12000 r/min，離心 10 min ；
(7)棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀2次；
(8)室溫下干燥后(一般干燥5-15min)，溶于30-50 μ 1 DEPC去離子水中，于_20°C或者-70°C下保存?zhèn)溆?。引物的設(shè)計
根據(jù)于力等人設(shè)計的1對簡并引物，用于擴增該保守區(qū)的的片段。引物序列分別為
CoPR,5，>GA(AGCT)G(GC)ATG(ACT)GT(AG)CA (AGT)GCCATATA<3，， AV494，5，>GCC (CT)AT (AG)TA (CT)AG (AG) AAGCC (AC)AG<3，。對該部分區(qū)域進行克隆及序列測序，BLAST比較確定其是否為TYLCV分離物。根據(jù)已知片段的序列擴增未知的全長序列。在設(shè)計引物時加入載體的酶切位點
表1克隆所用PCR引物
權(quán)利要求
1. 一種鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性的方法，其特征在于按如下的步驟進行1)DNA提取從收集的發(fā)病植株的葉片中提取基因組總DNA ；2)引物的設(shè)計以植物總DNA為模板，設(shè)計簡并引物-對病毒DNA-A進行PCR擴增，其中擴增所用PCR引物為BamHI _tag tgggatccac ttctaaatgBamHI Τ" aggatcc catattgcaagacagactac2356FbggatggaaatgtgctgacctBamRbgtggatcccacatattgcaaa 擴增全長的DNA-A序列；b 擴增0. 4A的DNA-A序列；3)擴增產(chǎn)物克隆到pMD-19T載體上，分別命名為1. OA-pMD和0. 4A_pMD并轉(zhuǎn)化到 DH5a菌液中；4)串聯(lián)重復的克隆用BamHI酶切切下1.OA-pMD的病毒全長DNA ；用BamHI切開含有 0. 4A病毒基因組片段的0. 4A-pMD載體；利用試劑盒回收相應(yīng)大小的片段，利用T4連接酶將二者相連得到1. 4A-pMD重組載體，轉(zhuǎn)化至Dffia菌液中；5)正向串聯(lián)重復序列的獲得1. OA和0. 4A兩個片段，利用引物C擴增陽性克隆菌液，比較大小后選出正向串聯(lián)的菌落形成1. 4A串聯(lián)的克??；所用引物為PMD19F ccgcc aag ctt gca tgccgBamR cgtggatcccacatattgcaa ；6)表達載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化利用KnpI和Mil對含有1. 4A TYLCV的1. 4A_pMD質(zhì)粒和植物表達載體pRI IOl-An進行雙酶切，然后利用T4連接酶將目的片段與表達載體進行連接得到1.4A- pRI，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 α中；用凍融法將1. 4Α- pRI直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404的感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含利福平和卡那霉素平板，溫箱培養(yǎng)2 3d ；挑取單菌落接種于anl含利福平50ug / mL和卡那霉素IOOug / mL的YEB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜后，取ImI 菌液置于1.5ml離心管，離心收集菌體，加50 L無菌水煮沸l(wèi)Omin，取上清作模板進行PCR 擴增，擴增產(chǎn)物用1. 0%瓊脂凝膠電泳驗證；7)重組質(zhì)粒的提取與鑒定用 TAKARAMiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 2. 0 (50 次量)試劑盒進行質(zhì)粒 DNA的微量提取，利用Mil和KnpI雙酶切1. 4A -pRI，37°C酶切消化Ih后瓊脂糖凝膠電泳檢查結(jié)果；8)序列測定與分析數(shù)據(jù)處理借助 DNAMAN Version 6. 0 (Lynnon Biosoft, QuebeCanada)進行，利用 BLAST 程序在GeneBank數(shù)據(jù)庫中尋找與DNA-A序列最相近的基因組序列；9)農(nóng)桿菌接種及病毒DNA的檢測和田間調(diào)查將含有病毒DNA-A侵染性克隆的農(nóng)桿菌LBA4404分別接種在含卡那霉素(50 ug/mL) 和利福平(50 ug/mL)的YEB液體培養(yǎng)基中，28°C，200 rpm振蕩培養(yǎng)48 h，接種時，取一支 1 mL的一次性注射器，吸取培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液，在距離供試植株根部1-2 cm處取三點進行韌皮部注射，接種植株置于防蟲溫室中培養(yǎng)，在注射接種后30天，采集葉片約0. 5克，抽DNA-A后進行PCR檢測，對植株高度和葉片進行癥狀的觀察。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性的方法，它是針對天津地區(qū)特有的番茄黃化曲葉病毒序列而構(gòu)建了針對天津地區(qū)TYLCV的侵染性克隆，通過莖桿注射接種番茄黃化曲葉病毒，鑒定不同番茄材料對該病毒的抗性。此方法無需飼養(yǎng)煙粉虱、操作簡單、效率高、重復性好、可控性好，能提供相對一致的接種壓力，結(jié)果準確，是一種簡便有效的接種鑒定方法。
文檔編號C12Q1/68GK102392080SQ20111036516
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月17日
發(fā)明者劉仲齊, 王建江, 薛俊, 金鳳媚 申請人:天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心