專利名稱：一種中國番茄黃曲葉病毒衛(wèi)星的組成型表達啟動子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種中國番茄黃曲葉病毒衛(wèi)星的組成型表達啟動子。具體地說，本發(fā)明涉及中國番茄黃曲葉病毒beta衛(wèi)星分子的PClORF缺失啟動子、全長啟動子和串聯(lián)啟動子序列的分離。本發(fā)明也涉及含有連接異源基因的中國番茄黃曲葉病毒beta衛(wèi)星的β ClORF缺失啟動子、全長啟動子和串聯(lián)啟動子的載體盒的構(gòu)建。另外，本發(fā)明也涉及利用含有中國番茄黃曲葉病毒beta衛(wèi)星的β ClORF各種 啟動子的表達載體進行瞬間表達和穩(wěn)定表達的方法。
背景技術(shù)：
植物基因工程的目的是將外源基因?qū)胧荏w植物后使其正確而有效地表達，而啟動子對外源基因的表達水平影響很大，是基因工程表達載體的重要元件。人們可根據(jù)需要選擇或人工構(gòu)建合適的啟動子來研究新基因的功能，闡明生物體的生長發(fā)育及其他生命周期的過程與機理，目前已有許多不同來源的啟動子被用于植物品質(zhì)改良基因工程、抗病育種基因工程以及植物生物反應器等基因工程領(lǐng)域。這些啟動子中一大類是從根瘤農(nóng)桿菌中分離出來，另一大類為植物本身來源的啟動子。相比上述啟動子控制的目標基因表達量往往較低，或者與受體植物細胞基因組序列具有一定的同源性的劣勢，植物病毒啟動子在植物遺傳轉(zhuǎn)化中有著不可或缺的優(yōu)勢。已經(jīng)鑒定的植物病毒啟動子，主要包括組成型表達啟動子和組織特異性表達啟動子。組成型啟動子能夠驅(qū)動外源基因在植物不同組織或器官以及不同的發(fā)育階段持續(xù)和穩(wěn)定的表達，不表現(xiàn)時空特異性，也不受外界因素的誘導。其中花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子在雙子葉植物基因表達中被廣泛應用，它具有多種順式作用元件，利用CaMV 35S核心啟動子與CaMV 35S啟動子的5’端不同區(qū)段和煙草花葉病毒(TMV)的5’非轉(zhuǎn)錄區(qū)(omega序列)相連，發(fā)現(xiàn)該啟動子可驅(qū)動報告基因在雙子葉植物煙草和單子葉植物水稻中均高效表達。有研究表明利用CaMV 35S啟動子的串聯(lián)重復序列作為啟動子元件能較大幅度地提高啟動子活性，而進ー步的研究表明啟動子元件或片段的重復雖然能夠提高其表達活性，但啟動子的表達模式不會改變。因此，通過對啟動子進行改造有可能提聞啟動子驅(qū)動外源基因表達的能力，從而為外源基因聞效表達載體的構(gòu)建及應用打下良好基礎。雙生病毒是世界范圍內(nèi)廣泛存在的ー類具有孿生顆粒形態(tài)的植物單鏈DNA病毒。beta衛(wèi)星是與某些單組份雙生病毒相伴隨的ー類分子，該分子大小約1.3 kb,是其輔助病毒基因組的一半左右。beta衛(wèi)星分子依賴于其輔助病毒進行DNA復制、移動和包裏。其基因組中除了存在一個富含腺嘌呤的區(qū)域(A-rich region)和一個衛(wèi)星保守區(qū)(SCR)タト,還存在ー個大小、位置和氨基酸序列上高度保守的β C10RF，現(xiàn)已證實其與致病性緊密相關(guān)，它的缺失并不影響beta衛(wèi)星的復制，并且已有實驗表明beta衛(wèi)星可以作為病毒誘導的基因沉默載體進行遺傳操作。已鑒定來源于中國番茄黃曲葉病毒YlO分離物相伴隨的beta衛(wèi)星分子的啟動子為韌皮部特異性表達的啟動子，而本研究中來源于中國番茄黃曲葉病毒Y25分離物相伴隨的beta衛(wèi)星分子和上述beta衛(wèi)星分子同源性達78. 7%，屬于同一衛(wèi)星分子的不同分離物，但是兩者在致病表型上卻有比較大的差異，推測該beta衛(wèi)星的啟動子在表達類型上也有別于上述beta衛(wèi)星的啟動子，有可能為植物基因表達提供ー些有價值的表達元件，并為兩類beta衛(wèi)星分子不同致病性機理的研究打下良好的分子生物學方面的基礎。因此，本發(fā)明的開展既可以通過了解決定致病相關(guān)蛋白PCl的啟動子的活性，有助于了解雙生病毒致病性和侵染的機理，并且可以為不同目的的植物基因工程提供合適類型的啟動子，為植物基因工程的迅速做出一定貢獻。已知PClORF啟動子是影響病毒衛(wèi)星載體表達效率的重要因素，而該啟動子的表達類型也決定了其在植物遺傳轉(zhuǎn)化中的應用價值，本發(fā)明分析了中國番茄黃曲葉病毒Υ25分離物相伴隨的beta衛(wèi)星分子中β ClORF的缺失啟動子、全長啟動子和串聯(lián)啟動子的表達活性以及全長啟動子的表達類型。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供ー種中國番茄黃曲葉病毒衛(wèi)星的組成型表達啟動子。
中國番爺黃曲葉病毒衛(wèi)星的組成型表達啟動子所述啟動子DNA序列為中國番爺黃曲葉病毒beta衛(wèi)星分子的PClORF的缺失啟動子SEQ ID NO: I、全長啟動子SEQ ID NO:2或串聯(lián)啟動子SEQ ID NO:3所示DNA序列。DNA構(gòu)建體包括權(quán)利要求I所示的中國番茄黃曲葉病毒beta衛(wèi)星分子的β ClORF的缺失啟動子SEQ ID NO: I、全長啟動子SEQ ID NO:2或串聯(lián)啟動子SEQ ID NO:3，以及與之進行可操作連接的有效基因，其中所述有效基因包括殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗細菌基因或抗病毒基因。利用植物細胞表達殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗細菌基因或抗病毒基因的方法包括如下步驟(a)以可表達的方式將殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗細菌基因或抗病毒基因連接到中國番茄黃曲葉病毒beta衛(wèi)星分子的PClORF的缺失啟動子SEQ IDNO: I、全長啟動子SEQ ID NO:2或串聯(lián)啟動子SEQ ID NO:3所述的啟動子DNA序列下游以獲得重組DNA片段；(b)將該重組DNA片段插入植物表達載體中；(c)用上述重組表達載體轉(zhuǎn)化植物細胞；(d)培養(yǎng)該植物細胞表達殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗細菌基因或抗病毒基因。利用植物細胞制備蛋白質(zhì)的方法包括如下步驟(a)以可表達的方式將編碼所需蛋白質(zhì)的DNA連接到中國番茄黃曲葉病毒beta衛(wèi)星分子的PClORF的缺失啟動子SEQ ID NO: I、全長啟動子SEQ ID NO:2或串聯(lián)啟動子SEQID NO: 3所述的啟動子DNA序列下游，獲得重組DNA片段；(b)將重組DNA片段插入表達載體中，獲得重組表達載體；(C)重組表達載體經(jīng)農(nóng)桿菌或基因槍法轉(zhuǎn)化植物細胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的植物細胞以表達所需的蛋白質(zhì)；(d)從培養(yǎng)物中回收所需的蛋白質(zhì)。表達載體含有中國番茄黃曲葉病毒beta衛(wèi)星分子的β ClORF的缺失啟動子SEQID NO: I、全長啟動子SEQ ID NO: 2或串聯(lián)啟動子SEQ ID NO: 3所述的啟動子DNA序列，其中所述載體是適用于植物細胞的質(zhì)粒載體、噬菌體或病毒，所述載體能夠插入殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗細菌基因或抗病毒基因。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果I)應用本發(fā)明中的啟動子，在植物抗病基因工程中可以實現(xiàn)有效的抗病目的。組成型啟動子與組織特異性啟動子相比，它能持續(xù)高效地表達目的基因，能有效控制病蟲害在整個植株中蔓延，使植物各類組織細胞都得到保護。組織化學染色法結(jié)果表明，本發(fā)明中的全長啟動子在轉(zhuǎn)基因植株根、莖、葉的皮層細胞、葉肉細胞以及維管組織的韌皮部、木質(zhì)部中都能夠表達(如圖5)。組成型表達的強啟動子，通常會導致外源基因在植株體內(nèi)的過量表達，從而對植株生長發(fā)育產(chǎn)生負面影響。盡管本發(fā)明中中國番茄黃曲葉病毒beta衛(wèi)星分子的串聯(lián)啟動子活性明顯強于全長啟動子以及缺失啟動子的活性，但與強組成型表達啟動子CaMV 35S啟動子相比，串聯(lián)啟動子的活性僅是它的58. 62%，所以該啟動子驅(qū)動的外源 基因的表達量對植株生長發(fā)育產(chǎn)生的影響較小。鑒于文獻報道已掲示啟動子的串聯(lián)重復不會改變其表達模式，綜合本發(fā)明中啟動子的組成型表達和非過量表達外源基因的優(yōu)點，應用于植物抗病基因工程中能夠達到經(jīng)濟有效的抗病目的。2)應用本發(fā)明中的組成型表達啟動子，可以高效表達外源基因，増加外源蛋白的產(chǎn)量。組成型表達的啟動子在植物的所有組織中以及生長發(fā)育的所有階段都能啟動基因表達，不表現(xiàn)時空特異性；RNA和蛋白質(zhì)表達量也是相對恒定的。如果要生產(chǎn)某種目的蛋白，應用組成型表達的啟動子其蛋白表達量明顯高于組織特異性啟動子。3)應用本發(fā)明中的啟動子，可以有效進行植物轉(zhuǎn)基因工程。植物基因工程中使用的植物來源的啟動子由于與受體植物基因組具有一定的同源性，往往會在寄主植物體內(nèi)引起基因沉默現(xiàn)象而造成外源基因失活。這種現(xiàn)象在多基因轉(zhuǎn)化時更為普遍。而本發(fā)明中的啟動子，由干與植物基因組序列沒有同源性，所以能夠避免基因沉默現(xiàn)象的發(fā)生。此外，大量研究表明，侵染雙子葉植物的病毒來源的啟動子可有效地應用于單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化。本發(fā)明中的啟動子來源于侵染雙子葉植物的病毒衛(wèi)星分子，開發(fā)該啟動子應用于多種作物(包括禾谷類)的基因轉(zhuǎn)化，應用前景將會十分廣闊。


圖I是中國番茄黃曲葉病毒beta衛(wèi)星分子的PClORF啟動子的結(jié)構(gòu)圖。以β ClORF的翻譯起始位點(ATG)為+1位；其中SCR代表衛(wèi)星保守區(qū)，A-rich代表富含腺嘌呤的區(qū)域；圖2是啟動子表達載體構(gòu)建圖?？寺『蟮膯幼悠畏謩e經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindIII/BamH I雙酶切后插入表達載體pINT121同酶切位點，構(gòu)建成啟動子表達載體；圖3是對照表達載體構(gòu)建圖。表達載體PINT121經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI/EcoR I雙酶切后產(chǎn)生的⑶S-NOS片段與BamH I/EcoR I雙酶切后的pBINPLUS載體片段連接，構(gòu)建成表達載體pBINGUS，其中pINT121用于陽性對照，pBINGUS用于陰性對照；圖4是各啟動子的瞬時表達⑶S活性分析。A，各啟動子的多次重復⑶S活性；B，各啟動子的相對平均GUS活性。A，B中pBINGUS為陰性對照，pINT121為陽性對照，η代表每個啟動子的獨立實驗重復次數(shù)。通過統(tǒng)計軟件SAS 8. O中的多重比較方法ANOVA中的LSD檢驗對實驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析(p〈0. 05or P<0. 01)，誤差線代表標準差；圖5是全長啟動子982 (a-g)及陽性對照pINT121 (h)的轉(zhuǎn)基因染色圖片。(a)根部橫切面；(b)莖橫切面；(c和e)根部；(d)葉橫切面；(f)葉片背面；(g)整株植物小苗；(h)陽性對照植物小苗。c,皮質(zhì)；x,木質(zhì)部；pm,柵欄組織；sm,海綿組織；vb,維管束；svb,次級維管束。
具體實施例方式中國番爺黃曲葉病韋衛(wèi)星的組成型表達啟動子DNA序列為中國番爺黃曲葉病韋beta衛(wèi)星分子的PClORF的缺失啟動子SEQ ID NO: I、全長啟動子SEQ IDNO: 2或串聯(lián)啟動子SEQ ID NO:3所示DNA序列。DNA構(gòu)建體包括權(quán)利要求I所示的中國番茄黃曲葉病毒beta衛(wèi)星分子的β ClORF的缺失啟動子SEQ ID NO: I、全長啟動子SEQ ID NO:2或串聯(lián)啟動子SEQ ID NO:3，以及與之進行可操作連接的有效基因，其中所述有效基因包括殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真 菌基因、抗細菌基因或抗病毒基因。利用植物細胞表達殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗細菌基因或抗病毒基因的方法包括如下步驟(a)以可表達的方式將殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗細菌基因或抗病毒基因連接到中國番茄黃曲葉病毒beta衛(wèi)星分子的PClORF的缺失啟動子SEQ IDNO: I、全長啟動子SEQ ID NO: 2或串聯(lián)啟動子SEQ ID NO: 3所述的啟動子DNA序列下游以獲得重組DNA片段；(b)將該重組DNA片段插入植物表達載體中；(c)用上述重組表達載體轉(zhuǎn)化植物細胞；(d)培養(yǎng)該植物細胞表達殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗細菌基因或抗病毒基因。利用植物細胞制備蛋白質(zhì)的方法包括如下步驟(a)以可表達的方式將編碼所需蛋白質(zhì)的DNA連接到中國番茄黃曲葉病毒beta衛(wèi)星分子的PClORF的缺失啟動子SEQ ID NO: I、全長啟動子SEQ ID NO:2或串聯(lián)啟動子SEQID NO: 3所述的啟動子DNA序列下游，獲得重組DNA片段；(b)將重組DNA片段插入表達載體中，獲得重組表達載體；(c)重組表達載體經(jīng)農(nóng)桿菌或基因槍法轉(zhuǎn)化植物細胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的植物細胞以表達所需的蛋白質(zhì)；(d)從培養(yǎng)物中回收所需的蛋白質(zhì)。表達載體含有中國番茄黃曲葉病毒beta衛(wèi)星分子的β ClORF的缺失啟動子SEQID NO: I、全長啟動子SEQ ID NO: 2或串聯(lián)啟動子SEQ ID NO: 3所述的啟動子DNA序列，其中所述載體是適用于植物細胞的質(zhì)粒載體、噬菌體或病毒，所述載體能夠插入殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗細菌基因或抗病毒基因。本發(fā)明提出的對轉(zhuǎn)化煙草植株的基因表達產(chǎn)物進行檢測，以評價啟動子的表達強度，并且分析啟動子在植物體內(nèi)表達的組織化學定位，使用了許多對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說非常熟知的技術(shù)，其中包括用于GUS酶活性分析的熒光分光光度法，用于組織化學分析的半薄切片法等技木。本發(fā)明描述了能組成型表達的病毒衛(wèi)星啟動子，它是與中國番茄黃曲葉病毒Y25分離物相伴隨的beta衛(wèi)星分子(GenBank登錄號AJ421619. 2)的PClORF啟動子。本發(fā)明中以感染有中國番茄黃曲葉病毒Y25分離物的番茄植物總DNA為模板，克隆并鑒定了中國番茄黃曲葉病毒相伴隨的beta衛(wèi)星分子的PClORF缺失啟動子、全長啟動子以及串聯(lián)啟動子，序列表顯示了各啟動子的序列。中 國番茄黃曲葉病毒相伴隨的beta衛(wèi)星的i3C10RF全長啟動子的全部天然序列有982個堿基對(啟動子的序列為SEQ ID NO: 2)，根據(jù)beta衛(wèi)星分子基因組的結(jié)構(gòu)特征，對全長啟動子進行缺失。缺失啟動子982 Λ 776的特征是缺失全長啟動子中-207至-982的片段(啟動子的序列為SEQ ID NO: I)，串聯(lián)啟動子982 X 2的特征是全長啟動子串聯(lián)重復片段(啟動子的序列為SEQ ID NO:3)，在啟動子的活性分析中發(fā)現(xiàn)，這兩個突變啟動子仍保留了啟動子活性(圖4)。本發(fā)明描述了植物細胞中基因產(chǎn)物表達的方法。將已克隆的啟動子與葡萄糖醛酸酶基因(GUS)融合構(gòu)建植物表達載體，通過農(nóng)桿菌浸潤法使GUS基因在煙草植物細胞中進行瞬間表達；將構(gòu)建后的植物表達載體通過葉盤法轉(zhuǎn)入煙草細胞中，使GUS基因在煙草細胞中進行穩(wěn)定表達。本發(fā)明還描述了植物細胞中GUS活性的鑒定和檢測方法。在植物細胞的瞬間表達體系中，通過熒光光度分析來檢測其表達活性。本發(fā)明中將全長啟動子的表達載體982通過葉盤法轉(zhuǎn)入煙草植株中，GUS組織化學染色后通過藍色位點的表達部位進ー步鑒定其上游啟動子的表達類型。結(jié)果表明，PClORF全長啟動子982能夠驅(qū)動⑶S基因在轉(zhuǎn)基因植株根、莖、葉等器官中組成型表達。本發(fā)明中的中國番茄黃曲葉病毒beta衛(wèi)星的β ClORF全長啟動子可組成型表達所需要的任何異源基因。異源基因的例子包括殺蟲毒素基因，除草劑抗性基因，抗真菌基因，抗細菌基因或抗病毒基因。本發(fā)明中將含有中國番茄黃曲葉病毒beta衛(wèi)星的i3C10RF啟動子和異源基因的構(gòu)建體插入到ー種載體中，用該載體轉(zhuǎn)化植物細胞，優(yōu)選的載體對于植物而言可以是ー種農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒衍生物，該質(zhì)粒衍生物通過農(nóng)桿菌介導的雙元載體技術(shù)導入植物細胞，這種技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的。將已轉(zhuǎn)化植物細胞培養(yǎng)于ー種合適培養(yǎng)基中，并再生出植株。本發(fā)明包括來自于中國番茄黃曲葉病毒beta衛(wèi)星的β ClORF缺失啟動子、全長啟動子和串聯(lián)啟動子DNA序列以及含有以上序列的DNA構(gòu)建體。同時，本發(fā)明還包括是中國番茄黃曲葉病毒beta衛(wèi)星的β ClORF啟動子的“功能等同物”的DNA序列，以及含有有效連接到異源基因上的這樣的DNA序列的構(gòu)建體。本發(fā)明還包括使用如本文所述的PClORF啟動子的“功能等同物”賦予處于它們控制下的任何基因的組成型表達。本發(fā)明中使用的術(shù)語“啟動子活性”是指當以該基因的可表達方式將有效基因連接到啟動子的下游，并導入到宿主(植物細胞)中，該宿主顯示具有在宿主內(nèi)或宿主外生產(chǎn)該有效基因產(chǎn)物的功能。通常是將容易定性、定量檢測的蛋白質(zhì)編碼基因(報告基因)連接至啟動子的下游，然后將構(gòu)建后的基因?qū)胨拗鲀?nèi)，檢測表達蛋白情況，以此來確定是否存在特定啟動子的活性以及其效カ如何?！叭笔幼印笔侵溉魏斡腥笔Ф跃哂袉幼踊钚缘闹袊腰S曲葉病毒beta衛(wèi)星的PClORF啟動子?！按?lián)啟動子”是指兩個全長啟動子串聯(lián)并具有啟動子活性的中國番茄黃曲葉病毒beta衛(wèi)星的PClORF啟動子?！肮δ艿韧铩笔侵冈趪栏耠s交條件下與ー個DNA序列互補的任何DNA序列，該序列與該參照物雜交并且有類似于中國番茄黃曲葉病毒beta衛(wèi)星的β ClORF啟動子的活性。采用下面的非限制性實施例對本發(fā)明作進ー步描述。實施例I中國番茄黃曲葉病毒beta衛(wèi)星的β ClORF啟動子片段的克隆以及序列測定
基本上按照Sambrook 等所述方法(Molecular Cloning: A LaboratoryManual,しold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Laboratory, NY,1989)實施分子技術(shù)。以感染中國番茄黃曲葉病毒的番茄植株為材料，用CTAB法提取植物總 DNA[Stewart et al.，BioTechniques, 1993，14:748-749]。預擴增的各啟動子片段見圖I。以植物總DNA為模板，通過特異性引物擴增中國番茄黃曲葉病毒beta衛(wèi)星的β C10RF 的各啟動子片段。引物 Fl (5’AAGCTTACACCTCTATTAGCCATAATAATC 3’，相應于 SEQID NO: I 中的 1-24 位，引入了 Hind III 位點)和 RL (5，GGATCCGTTTTATGCTGTGGATTATAC3’，相應于SEQ ID NO: I中的206-186位，引入了 BamH I位點)擴增缺失啟動子(SEQ IDNO: I) ο 引物 FL (5，AAGCTTATACGTATGCATACGTATTC 3’，相應于 SEQ ID N0:2 中的 1-20位，引入了 Hind III 位點)和 RL (5，GGATCCGTTTTATGCTGTGGATTATAC 3’，相應于 SEQ IDN0:2中的962-982位，引入了 BamH I位點)擴增全長啟動子(SEQID N0:2)。引物F2(5，GGATCCATACGTATGCATACGTATTC 3’，相應于 SEQID NO: 3 中的 983-1008 位，引入了 BamHI 位點)和 RL (5，GGATCCGTTTTATGCTGTGGATTATAC 3’，相應于 SEQ ID NO:3 中的 1950-1970位，引入了 BamH I位點)擴增串聯(lián)啟動子(SEQ ID NO:3)中的后半部分序列。擴增后的PCR 產(chǎn)物經(jīng) Hind III/BamH I (對于 SEQ ID NO: I 和 SEQ ID N0:2)或 BamH I (對于 SEQIDNO: 3)直接酶切后經(jīng)QIAGEN凝膠純化試劑盒回收目的片段，用Sanger雙脫氧鏈終止法測序驗證后用于載體構(gòu)建。實施例2啟動子表達載體及⑶S融合表達載體的構(gòu)建用限制性酶Hind III/BamH I酶切消化雙元表達載體pINT121 (該載體的構(gòu)建見Liu等發(fā)表的論文，即Planta，2003，216:824-833)。將酶切后的缺失啟動子、全長啟動子片段插入對應的同酶切位點，構(gòu)建為啟動子表達載體(圖2):缺失啟動子為ρβα-982Λ776，全長啟動子為pPCl-982。將BamH I酶切SEQ ID NO: 3部分序列插入相應酶切消化過的P β Cト982，即為串聯(lián)啟動子P β Cト982X2。用BamH I和EcoR I雙酶切表達載體ρΙΝΤ121，切割下的⑶S-N0S片段插入到表達載體pBINPLUS (該載體的構(gòu)建見van Engelen等發(fā)表的論文，即TransgenicResearch, 1995，4:288-290)的 BamH I/EcoR I 位點中，構(gòu)建后的載體為 pBINGUS (圖 3)，該載體作為陰性對照，載體PINT121作為陽性對照。實施例3農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化將各啟動子構(gòu)建物通過電擊法導入農(nóng)桿菌宿主細胞參照文獻[Mattanovichetal. , Nucleic Acids Research, 1989，17:6747],具體方法如下:28°C, 200rpm條件下培養(yǎng)根癌土壤桿菌16h左右，用I. 5mL離心管取I. 5mL菌液，8000rpm離心30s后去殘液，將沉淀用ImL ddH20充分懸浮，再8000rpm離心30s，重復以上步驟3次。去掉殘液后將沉淀用200 μ LddH20懸浮，即為電擊用農(nóng)桿菌感受態(tài)。取200ng重組質(zhì)粒至200 μ L感受態(tài)，輕打混勻，然后轉(zhuǎn)移至電擊杯中，置冰上。裝好電擊裝置，電壓為2500V，按住電擊按鈕，直到啪的一聲即電擊完畢。室溫靜止2min后加入800 μ LYEP培養(yǎng)基(10g/L酵母膏，10g/L蛋白胨，5g/L氯化鈉)，28°C靜置lh，然后28°C 200rpm振蕩培養(yǎng)2h。取200 μ L菌液，分別涂布于含有卡那霉素(50 μ g/mL)和利福平(50 μ g/mL)抗生素的固體YEP培養(yǎng)基平板。28°C培養(yǎng)2天后，用特異性引物對其進行PCR鑒定，篩選陽性克隆。實施例4啟動子的瞬間表達I)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)及誘導參照文獻[Kapila et al. , PlantScience, 1997，122:101-108]將含有各啟動子表達載體的農(nóng)桿菌菌液接種于含相應抗生素的液體YEP培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心收集菌體，重懸于MMA溶液(IOmmol/L2-(N-嗎啉)-こ基磺酸(MES，pH 5. 6)、100 μ mol/Lこ酰丁香酮、10mmol/L氯化鎂)，并調(diào)整菌液濃度使其0D_=1. 5，室溫靜置放置3h。 2)瞬間表達參照文獻[劉兆明等，生物工程學報，2002，18卷4期411-414; Yanget al. , The Plant Journal, 2000，22:543-551]對植株葉片采取農(nóng)桿菌浸潤法。具體方法選取6-7周齡本氏煙植株中部未完全展開的葉片,取一支ImL的一次性注射器,摘掉針頭，用針管靠壓カ將500 μ L重懸菌液完全注入每片葉片的脈間細胞中。將農(nóng)桿菌浸潤和農(nóng)桿菌注射后的植株于25°C恒溫室中培養(yǎng)，光照周期為16/8h。60-72h后取樣進行⑶S熒光活性分析。實施例5⑶S檢測熒光光度測定法參照文獻[Jefferson et al. , The EMBOJournal, 1987，6:3901-3907]將采樣后的植株葉片經(jīng)液氮研磨，加入3倍體積的⑶S提取液(50mmol/L 憐酸緩沖液 pH 7. 0,10mmol/I,こニ胺四こ酸ニ鈉，0. l%(w/v)TritonX-100,
0.l%(w/v)十二烷基肌氨酸鈉，10mmol/L β -巰基こ醇)，離心后取上清10 μ L與4-MUG(4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸)反應，熒光光度儀測定GUS活性。如圖4，A為各個啟動子構(gòu)建物多次重復后(重復次數(shù)不小于6)測得的GUS活性，B為各啟動子構(gòu)建物的平均表達活性。實驗數(shù)據(jù)通過SAS8. O軟件的多次重復比較ANOVA的LSD方法進行分析，以陽性對照ΡΙΝΤ121的35S啟動子活性為參照，結(jié)果表明缺失啟動子982 Δ 776的活性是35S啟動子活性的18. 76%，全長啟動子982的活性是35S啟動子活性的44. 01%,串聯(lián)啟動子982X2的活性是35S啟動子活性的58. 62%。而且缺失啟動子982 Λ 776，全長啟動子982及串聯(lián)啟動子982 X 2與陽性對照PINT121的啟動子活性之間均存在極顯著性差異(Ρ〈0. OI)，具體數(shù)據(jù)見表I。表I
權(quán)利要求
1.ー種中國番茄黃曲葉病毒衛(wèi)星的組成型表達啟動子，其特征在于所述啟動子DNA序列為中國番茄黃曲葉病毒beta衛(wèi)星分子的PCI ORF的缺失啟動子SEQ ID NO: I、全長啟動子SEQ ID NO: 2或串聯(lián)啟動子SEQ ID NO: 3所示DNA序列。
2.—種DNA構(gòu)建體，其特征在于包括權(quán)利要求I所示的中國番茄黃曲葉病毒beta衛(wèi)星分子的PCI ORF的缺失啟動子SEQ ID NO: I、全長啟動子SEQ ID NO: 2或串聯(lián)啟動子SEQ ID NO: 3，以及與之進行可操作連接的有效基因，其中所述有效基因包括殺蟲劑基因、除
3.ー種利用植物細胞表達殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗細菌基因或抗病毒基因的方法，其特征在于包括如下步驟 (a)以可表達的方式將殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗細菌基因或抗病毒基因連接到中國番茄黃曲葉病毒beta衛(wèi)星分子的PCI ORF的缺失啟動子SEQ ID NO:I、全長啟動子SEQ ID NO: 2或串聯(lián)啟動子SEQ ID NO: 3所述的啟動子DNA序列下游以獲 得重組DNA片段； (b)將該重組DNA片段插入植物表達載體中； (c)用上述重組表達載體轉(zhuǎn)化植物細胞； (d)培養(yǎng)該植物細胞表達殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗細菌基因或抗病毒基因。
4.ー種利用植物細胞制備蛋白質(zhì)的方法，其特征在于包括如下步驟 (a)以可表達的方式將編碼所需蛋白質(zhì)的DNA連接到中國番茄黃曲葉病毒beta衛(wèi)星分子的PCI ORF的缺失啟動子SEQ ID NO: I、全長啟動子SEQ ID NO: 2或串聯(lián)啟動子SEQID NO: 3所述的啟動子DNA序列下游，獲得重組DNA片段； (b)將重組DNA片段插入表達載體中，獲得重組表達載體； (C)重組表達載體經(jīng)農(nóng)桿菌或基因槍法轉(zhuǎn)化植物細胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的植物細胞以表達所需的蛋白質(zhì)； (d)從培養(yǎng)物中回收所需的蛋白質(zhì)。
5.—種表達載體,其特征在于含有中國番爺黃曲葉病毒beta衛(wèi)星分子的PCI ORF的缺失啟動子SEQ ID NO: I、全長啟動子SEQ ID NO: 2或串聯(lián)啟動子SEQ ID NO: 3所述的啟動子DNA序列，其中所述載體是適用于植物細胞的質(zhì)粒載體、噬菌體或病毒，所述載體能夠插入殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗細菌基因或抗病毒基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種中國番茄黃曲葉病毒衛(wèi)星的組成型表達啟動子。該啟動子來自于中國番茄黃曲葉病毒相伴隨的beta衛(wèi)星分子。分離的啟動子是該beta衛(wèi)星分子的βC1ORF的部分缺失啟動子、全長啟動子及串聯(lián)啟動子序列。實驗表明來自于中國番茄黃曲葉病毒beta衛(wèi)星分子的βC1ORF的啟動子為組成型表達的啟動子。本發(fā)明涉及了中國番茄黃曲葉病毒beta衛(wèi)星分子的βC1ORF的缺失啟動子、全長啟動子和串聯(lián)啟動子序列以及含有該βC1ORF缺失啟動子、全長啟動子和串聯(lián)啟動子序列的表達盒。本發(fā)明中的啟動子可應用于植物抗病毒基因工程及植物轉(zhuǎn)基因工程。
文檔編號C12N15/82GK102732521SQ20121019784
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月13日
發(fā)明者吳建祥, 周雪平, 張潔, 錢亞娟 申請人:浙江大學