專利名稱：一種豇豆花葉病毒亞科病毒通用rt-pcr檢測用簡并引物、檢測方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR檢測用簡并引物、檢測方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豇豆花葉病毒亞科(Cbffloririaae)屬于類小RNA病毒目QPicornavirales)、\牲豇豆病毒科中的一個亞科，包含豇豆花葉病毒屬(Cbfflorirm)、蠶豆病毒屬 (.Fabavirus)和線蟲傳多面體病毒屬U^povirus)等3個病毒屬，共有53種病毒。豇豆花葉病毒亞科病毒是一類對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全造成重要威脅的病毒，多種病毒具有十分廣泛的寄主范圍，并可造成多種作物嚴(yán)重?fù)p失。根據(jù)2007年公布的《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》，該病毒亞科中被列為檢疫性病毒的種類有南芥菜花葉病毒UraZ^s mosaic virus, ArMV)、蠶豆染色病毒(^roat/ bean stain virus, BBSV)、菜豆莢斑駁病毒、Bean pod mottle virus, BPMV)、豆工豆重花口十病毒(CbfFpea severe mosaic virus, CPSMV)、桃叢簇花葉病毒{Peach rosette mosaic virus, PRMV)、煙草環(huán)斑病毒、Tobacco ringspot 口>狀，TRSV)、番茄黑環(huán)病毒(Jomato black ring virus, TBRV)、番茄環(huán)斑病毒 {Tomato ringspot virus, iToRSV),共 8 種。2004 年 Maliogka 等建立了豇豆花葉病毒科 iComoviridae)(即現(xiàn)在的豇豆花葉病毒亞科)病毒通用檢測的巢式RT-PCR，但還未見常規(guī)的通用RT-PCR檢測方法。本申請發(fā)明人重新尋找豇豆花葉病毒亞科的RNAl基因組上的保守區(qū)域，根據(jù)保守區(qū)域序列重新設(shè)計一對簡并引物，通過反轉(zhuǎn)錄(reverse transcription, RT)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(polymerase chain reaction, PCR)建立了豇豆花葉病毒亞科的通用RT-PCR檢測方法，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)特異性擴(kuò)增DNA片段的位置判定結(jié)果，并根據(jù)序列測定結(jié)果進(jìn)行病毒種類鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR檢測用簡并引物、檢測方法及其應(yīng)用。本發(fā)明引物通用性好，檢測方法快速準(zhǔn)確，為進(jìn)出口安全提供了保證。為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明的解決方案是
一種豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR檢測用簡并引物，由正向和反向引物組成，其正向引物的核苷酸序列見SEQ IDNo. 1:5' -TGTGAYTAYWVNVVNTTYGATGG-3‘；反向引物的核苷酸序列見 SEQ ID No. 2 5' -YTTRTCHBTVCCATCVGTAAT-3‘；其中，Y=C/T，ff=A/T, V=G/ A/C, N=A/G/C/T, R=A/G, B=G/T/C, H=A/T/C。一種豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR檢測的檢測方法，包括如下步驟以樣品總RNA為模板，利用上述的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)擴(kuò)增DNA片段的位置判定結(jié)果，病癥葉片中均能檢出407 451 bp的DNA片段。
所述的RT-PCR反應(yīng)包括反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增兩個過程。所述的RT-PCR的反應(yīng)過程中反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的溫度為42°C，PCR擴(kuò)增的先用退火溫度 42°C進(jìn)行5個循環(huán)，然后用退火溫度50°C進(jìn)行30個循環(huán)，延伸溫度為72°C。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明根據(jù)豇豆花葉病毒亞科病毒RNAl基因組序列設(shè)計引物，該引物可用于豇豆花葉病毒亞科病毒的通用RT-PCR檢測。本發(fā)明檢測方法能夠快速準(zhǔn)確地判斷樣品是否有豇豆花葉病毒亞科病毒，引物通用性好，檢測方法快速準(zhǔn)確，為進(jìn)出口安全提供了保證。


圖1是豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR方法對各種亞科病毒的特異性試驗結(jié)果，包括9種線蟲傳多面體病毒屬Q(mào)N印ovirus)病毒、7種豇豆花葉病毒屬、Comovirus、病毒、和1種蠶豆萎蔫病毒屬0 如)病毒。S卩，1為南芥菜花葉病毒(ArMV)分離物1病葉、2為煙草環(huán)斑病毒(TRSV)病葉、3為番茄環(huán)斑病毒(ToRSV)分離物1病葉、4為櫻桃卷葉病毒(CLRV)病葉、5為煙草黑環(huán)病毒(TBRV)病葉、6為桃叢簇花葉病毒(PRMV)病葉、7為葡萄扇葉病毒(GFLV)病葉、8為烏飯樹葉斑駁病毒(BLMoV)病葉、9為懸鉤子環(huán)斑病毒(RpRSV) 病葉、10為菜豆莢斑駁病毒(BPMV)病葉、11為豇豆花葉病毒(CPMV)分離物1病葉、12為豇豆重花葉病毒(CPSMV)分離物1病葉、13為蠶豆染色病毒(BBSV)病葉、14為南瓜花葉病毒 (SqMV)病葉、15為紅三葉草斑駁病毒(RCMV)病葉、16為蠶豆萎蔫病毒1號(BBWVl)病葉、 17為蘿卜花葉病毒(RaMV)病葉、18為番茄環(huán)斑病毒(ToRSV)分離物2病葉、19為番茄環(huán)斑病毒(ToRSV)分離物3病葉、20為豇豆花葉病毒(CPMV)分離物2病葉、21為豇豆重花葉病毒(CPSMV)分離物2病葉、22為南芥菜花葉病毒(ArMV)分離物2病葉、23為南芥菜花葉病毒(ArMV)分離物3病葉，M為100 bp的DNA Mark。圖2是應(yīng)用豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR方法檢測健康寄主植物的結(jié)果。 1-10分別為蒲瓜、普通煙、番茄、黃瓜、南瓜、鵲豆、蠶豆、豇豆、西瓜、百合的健康葉片。圖3是應(yīng)用豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR方法檢測百合病葉的結(jié)果。1為健康百合葉片的檢測結(jié)果，2 - 6為發(fā)病百合葉片的檢測結(jié)果，7為空白對照，M為100 bp的 DNA Mark。
具體實施例方式下面實施例用于對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例1
1.引物設(shè)計與合成
根據(jù)豇豆花葉病毒亞科中蘇鐵壞死矮化病毒(CNSV)、葡萄鉻黃花葉病毒(GCMV)、 GFLV、黑醋栗退化病毒(BRV)、RaMV, SqMV, BPMV, RCMV, CPMV, CPSMV, BBWVl、蠶豆萎蔫病毒 2 號(BBWV2)、ArMV、TRSV、GFLV、RpRSV、TBRV、甜菜環(huán)斑病毒(BRSV)、PRMVjoRSV 病毒的 RNAl 基因組序列設(shè)計引物，引物序列為
SEQ ID No. 1 (上游)5' -TGTGAYTAYWVNVVNTTYGATGG-3‘； SEQ ID No. 2 (下游)5' -YTTRTCHBTVCCATCVGTAAT-3‘。
為便于測序，在引物中分別引入通用測序引物BCABESTTM Sequencing Primer RV-M和M13-47 (下劃線)，引物序列為:
SEQ ID No. 1 (Comov-sf-F2) 5 ‘ -GAGCGGATAACAATTTCACACAGG TGTGAYTAYWVNVVNTTYGATGG-3‘
SEQ ID No. 2 (Comov-sf-R2) 5 ‘ -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC YTTRTCHBTVCCATCVGTAAT-3‘ 2.總RNA的提取
1)取0.1 g植物發(fā)病葉片，加入1 ml的TRIzol (美國hvitrogen公司)試劑，移入滅菌的1. 5 ml離心管中，室溫下保持5 min ；
2)加0.2ml氯仿，劇烈振蕩15 s，然后在室溫下保持2_15 min后，4°C，12000 g離心 15 min ；
3)將上層水相轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中，加0.5 ml異丙醇，顛倒混勻，室溫下保持 15 min ；
4)4 °C, 12000 g離心10 min, RNA就會在管的側(cè)壁和底部形成沉淀；
5)倒掉上清液，加入75%的乙醇洗滌沉淀，然后4°C, 7500 g離心5 min (如沉淀懸浮起來，則用12000 g離心)，棄去乙醇；
6)沉淀于室溫下充分干燥后，溶于40μ 1 dH20 (DEPC處理)中，_20°C保存?zhèn)溆谩?. RT-PCR擴(kuò)增方法的建立
以總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。20 μ L反應(yīng)體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，即在0. 2 mL 的反應(yīng)管中加入6. 75 μ L DEPC處理水，4 μ L總RNA，1 μ L Woligo (d T)15引物(10 ymol/L)(寶生物工程(大連)有限公司)，1 μ L dNTP混合物(10 mmol/L)(具體為dATP、 dGTP、dTTP和dCTP四種混合物，寶生物工程(大連)有限公司)，混勻后于65 V保持5 min, 迅速轉(zhuǎn)移到冰上驟冷5min ；然后向反應(yīng)管中加入2 μ L DTT (二硫蘇糖醇，美國普洛麥格公司)(0. 1 mmol/L)，4 μ L 5X反轉(zhuǎn)錄緩沖液(美國普洛麥格公司)，1 μ L RNA酶抑制劑(40 U/UL)(寶生物工程(大連)有限公司)，0. 25 μ L反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/yL)(美國普洛麥格公司)，42°C反應(yīng)50 min ；72 V 15 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶后獲得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA。PCR反應(yīng)體系為25 μ L，即在0.2 mL的PCR反應(yīng)管中加入13. 25 μ L DEPC處理水，3 μ L cDNA, 2 μ L 正向引物SEQ ID No. 1(10 ymol/L)、2 μ L 反向引物SEQ ID No. 2 (10 ymol/DaOXPCR緩沖液2. 5 μ L (寶生物工程(大連)有限公司)，2 μ L dNTP混合物 (2.5 mmol/L), 0. 25 μ L Taq DNA聚合酶(5 U/μ L)寶生物工程(大連)有限公司)。反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性3 min ；94°C變性50 s、42°C退火50 s、72°C延伸50 s，5個循環(huán)；接著 94°C變性50 s、50°C退火50 s、72°C延伸50 s，30個循環(huán)；最后72°C延伸7 min。在PCR儀上完成。PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)是否擴(kuò)增到407 451 bp的DNA片段判定樣品中是否含有豇豆花葉病毒亞科病毒。本實施例檢測方法能夠快速準(zhǔn)確地判斷樣品是否有豇豆花葉病毒亞科病毒，根據(jù)序列進(jìn)行種類鑒定，為進(jìn)出口安全提供了保證。豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR檢測用簡并引物進(jìn)一步可做成豇豆花葉病毒亞科病毒通用 RT-PCR檢測試劑盒。實施例2
5豇豆花葉病毒亞科通用RT-PCR方法的通用性檢測
取南芥菜花葉病毒(ArMV)、煙草環(huán)斑病毒(TRSV)、番茄環(huán)斑病毒(ToRSV)、櫻桃卷葉病毒(CLRV)、煙草黑環(huán)病毒(TBRV)、桃叢簇花葉病毒(PRMV)、葡萄扇葉病毒(GFLV)、懸鉤子環(huán)斑病毒(RpRSV)、烏飯樹葉斑駁病毒(BLMoV)、菜豆莢斑駁病毒(BPMV)、豇豆花葉病毒 (CPMV)、豇豆重花葉病毒(CPSMV)、蠶豆染色病毒(BBSV)、南瓜花葉病毒(SqMV)、紅三葉草斑駁病毒(RCMV)、蘿卜花葉病毒(RaMV)、蠶豆萎蔫病毒1 (BBWV1)等17種病毒、M個分離物病葉，按實施例1方法分別提取總RNA，再按實施例1的方法進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。結(jié)果感染病毒的葉片中均檢出407 451 bp的DNA片段。檢測結(jié)果如圖1 所示。表明建立的RT-PCR方法可用于該亞科中不同病毒種類的檢測，具有良好的通用性， 可用于豇豆花葉病毒亞科病毒的通用檢測。實施例3
豇豆花葉病毒亞科通用RT-PCR方法的的特異性檢測
取蒲瓜、普通煙葉、番茄、黃瓜、南瓜、鵲豆、蠶豆、豇豆、西瓜、百合等植物的健康葉片， 按實施例1方法分別提取總RNA，再按實施例1的方法進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，進(jìn)行特異性檢測。 檢測結(jié)果如圖2所示。表明建立的通用RT-PCR方法并不會與病毒的寄主植物產(chǎn)生交叉反應(yīng)，具有良好的特異性，符合檢測的要求。實施例4
豇豆花葉病毒亞科通用RT-PCR方法的的在百合病毒檢測中的應(yīng)用取具有類似病毒癥狀的百合葉片，按實施例1方法分別提取總RNA，使用引物 Comov-sf-F2和ComoV-Sf-R2，按實施例1的方法進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，進(jìn)行檢測應(yīng)用。檢測結(jié)果如圖3所示。對擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行直接測序，序列分析表明為南芥菜花葉病毒(ArMV)。 表明建立的通用RT-PCR方法可用于百合等樣品中豇豆花葉病毒亞科病毒的快速檢測鑒定。
權(quán)利要求
1.一種豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR檢測用簡并引物，其特征在于由正向和反向引物組成，其正向引物的核苷酸序列見SEQ ID No. 1 5 ‘ -TGTGAYTAYWVNVVNTTYGATGG-3 ‘；反向引物的核苷酸序列見 SEQ ID No. 2 5 ‘ -YTTRTCHBTVCCATCVGTAAT-3 ‘；其中，Y=C/T，ff=A/T，V=G/A/C，N=A/G/C/T，R=A/G，B=G/ T/C, H=A/T/C。
2.一種如權(quán)利要求1所述的豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR檢測的檢測方法，其特征在于包括如下步驟以樣品總RNA為模板，利用上述的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)擴(kuò)增DNA片段的位置判定結(jié)果，病癥葉片中均能檢出407、51 bp的DNA片段。
3.如權(quán)利要求2所述的一種豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR檢測的檢測方法，其特征在于所述的RT-PCR反應(yīng)包括反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增兩個過程。
4.如權(quán)利要求3所述的一種豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR檢測的檢測方法，其特征在于所述的RT-PCR的反應(yīng)過程中反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的溫度為42°C，PCR擴(kuò)增時先用退火溫度 42°C進(jìn)行5個循環(huán)，然后用退火溫度50°C進(jìn)行30個循環(huán)，延伸溫度為72°C。
5.一種如權(quán)利要求1所述豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR檢測用簡并引物的應(yīng)用， 其特征在于所述的弓I物對樣品總RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增后對所擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)一步序列測定后，能快速鑒定豇豆花葉病毒亞科病毒的種類。
6.一種如權(quán)利要求1所述豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR檢測用簡并引物的應(yīng)用， 其特征在于所述豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR檢測用簡并引物能應(yīng)用于豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR檢測試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR檢測用簡并引物、檢測方法及其應(yīng)用，由正向和反向引物組成，其正向引物的核苷酸序列見SEQIDNo.15′-TGTGAYTAYWVNVVNTTYGATGG-3′；反向引物的核苷酸序列見SEQIDNo.25′-YTTRTCHBTVCCATCVGTAAT-3′；其中，Y=C/T，W=A/T，V=G/A/C，N=A/G/C/T，R=A/G，B=G/T/C，H=A/T/C。本發(fā)明引物通用性好，檢測方法快速準(zhǔn)確，為進(jìn)出口安全提供了保證。
文檔編號C12Q1/70GK102206714SQ20111008790
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月8日
發(fā)明者廖富榮, 林石明, 黃蓬英 申請人:廈門出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心