專(zhuān)利名稱(chēng)：一種豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒通用rt-pcr檢測(cè)用簡(jiǎn)并引物、檢測(cè)方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒通用RT-PCR檢測(cè)用簡(jiǎn)并引 物、檢測(cè)方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豇豆花葉病毒屬(Como virus )和蠶豆病毒屬、Faba virus )屬于類(lèi)小RNA病毒目 (.Picorna virales )、伴生豇豆病毒科(Seco viridae )、豇豆花葉病毒亞科(Como virinae )中 的2個(gè)病毒屬。豇豆花葉病毒屬含有15種病毒，單個(gè)病毒的寄主范圍窄，多數(shù)僅限于少數(shù) 豆科植物，豇豆花葉病毒(Cb『/7earir^s，CPMV)是其代表種。蠶豆病毒屬含有4種 病毒，具有較寬的寄主范圍，蠶豆萎蔫病毒1號(hào)、Broad bean wilt virus 1，BBWV-1)是其 代表種。這兩個(gè)病毒屬是一類(lèi)對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全造成重要威脅的病毒，多種病毒可對(duì)其寄主 植物造成嚴(yán)重?fù)p失。根據(jù)2007年公布的《中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》， 這兩個(gè)病毒屬中被列為檢疫性病毒的種類(lèi)有蠶豆染色病毒(^roai/ bean stain virus, BBSV)、菜豆莢斑駁病毒pod mottle virus, BPMV)、豇豆重花葉病毒(Cb啰ea severe mosaic virus, CPSMV)等3種病毒。2007年Ferrer等建立了蠶豆病毒屬0 力a口>狀)病 毒通用RT-PCR檢測(cè)鑒定方法，但還未建立豇豆花葉病毒屬(CbM^iry1S)的通用RT-PCR檢 測(cè)方法或可同時(shí)用于這兩個(gè)病毒屬的通用RT-PCR方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒通用RT-PCR檢 測(cè)用簡(jiǎn)并引物、檢測(cè)方法及其應(yīng)用。本發(fā)明檢測(cè)方法能夠快速準(zhǔn)確地判斷樣品是否有豇豆 花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒，根據(jù)序列進(jìn)行種類(lèi)鑒定，為進(jìn)出口安全提供了保證。為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明的解決方案是
一種豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒通用RT-PCR檢測(cè)用簡(jiǎn)并引物，由正向和反向 引物組成，其正向引物的核苷酸序列見(jiàn)SEQ ID No. 1 5' - TGYGAYTAYDVHWSffTTYGATGG -3'；反向引物的核苷酸序列見(jiàn) SEQ ID No. 2:5' - AKYARRTTRTCATCHCCATA -3'；其中 Y= C/T, D= G/A/T, V=G/A/C, H=A/T/C, ff=A/T, S=G/C，K= G/T, R= A/G。一種豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒通用RT-PCR檢測(cè)的檢測(cè)方法，包括如下 步驟以樣品總RNA為模板，利用上述引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增 產(chǎn)物，根據(jù)擴(kuò)增DNA片段的位置判定結(jié)果，病癥葉片中均能檢出3^T343 bp的DNA片段。所述的RT-PCR反應(yīng)包括反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增兩個(gè)過(guò)程。所述的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的溫度為42°C，PCR擴(kuò)增的先用退火溫度42°C進(jìn)行5個(gè)循環(huán)， 然后用退火溫度52°C進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，延伸溫度為72°C。一種豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒通用RT-PCR檢測(cè)用簡(jiǎn)并引物的應(yīng)用，所 述的引物對(duì)樣品總RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增后對(duì)所擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)一步序列測(cè)定后，能快速
3鑒定豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬的病毒種類(lèi)。一種豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒通用RT-PCR檢測(cè)用簡(jiǎn)并引物的應(yīng)用，所 述豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒通用RT-PCR檢測(cè)用簡(jiǎn)并引物能應(yīng)用于豇豆花葉病毒 屬和蠶豆病毒屬病毒通用RT-PCR檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明根據(jù)豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒RNAl基因 組上的RdRp基因序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，該引物可用于豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒的 通用RT-PCR檢測(cè)。而且本發(fā)明引物及相關(guān)試劑可組裝成試劑盒，以方便使用。本發(fā)明檢測(cè) 方法能夠快速準(zhǔn)確地判斷樣品是否有豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒，根據(jù)序列進(jìn)行種 類(lèi)鑒定，為進(jìn)出口安全提供了保證。


圖1是豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒通用RT-PCR方法對(duì)各種病毒的通用性 試驗(yàn)結(jié)果。1 一 8為豇豆花葉病毒屬病毒的檢測(cè)結(jié)果，9為蠶豆萎蔫病毒屬病毒的檢測(cè)結(jié) 果，10為健康蠶豆葉片的檢測(cè)結(jié)果。即，1為豇豆花葉病毒(CPMV)(分離物1)、2為豇豆花 葉病毒(CPMV)(分離物2)、3為豇豆重花葉病毒(CPSMV)(分離物1)、4為豇豆重花葉病毒 (CPSMV)(分離物2)、5為菜豆莢斑駁病毒(BPMV)、6為蘿卜花葉病毒(RaMV)、7為紅三葉草 斑駁病毒(RCMV)、8為南瓜花葉病毒(SqMV)、9為蠶豆萎蔫病毒1號(hào)(BBWV1 )、10為健康蠶豆 葉片。圖2是豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒通用RT-PCR方法特異性檢測(cè)結(jié)果。1-7 為線蟲(chóng)傳多面體病毒屬病毒(分別為ArMV、TRSV, ToRSV, TBRV, PRMV, CLRV, RpRSV)。
具體實(shí)施例方式下面實(shí)施例用于對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1
1、引物設(shè)計(jì)和合成
根據(jù)豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬中RaMV、SqMV、RCMV、CPMV、CPSMV、BPMV、BBWVl病毒 的RNAl基因組序列設(shè)計(jì)引物，引物序列為
SEQ ID No.1 5' - TGYGAYTAYDVHWSffTTYGATGG -3'； SEQ ID No. 2 5' - AKYARRTTRTCATCHCCATA -3'。2、總RNA的提取
1)取0.1g病葉，加入1 ml的TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，移入滅菌的1.5 m L離心管中，室溫下保持5 min；
2)加0.2mL氯仿，劇烈振蕩15 s，然后在室溫下保持2-15 min后，4°C，12000 g離心 15 min ；
3)將上層水相轉(zhuǎn)移到新的1.5m L離心管中，加0.5 m L異丙醇，顛倒混勻，室溫下保 持 15 min ；
4)4 °C, 12000 g離心10 min, RNA就會(huì)在管的側(cè)壁和底部形成沉淀；
5)倒掉上清液，加入75%的乙醇洗滌沉淀，然后4°C, 7500 g離心5 min (如沉淀懸浮 起來(lái)，則用12000 g離心)，棄去乙醇；6)沉淀于室溫下充分干燥后，溶于40 μ L無(wú)核酸酶的水中，_20°C保存?zhèn)溆谩?、RT-PCR擴(kuò)增方法的建立
以步驟2中備用的總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。20 μ L反應(yīng)體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反 應(yīng)，即在0. 2 mL的反應(yīng)管中加入8. 75 μ L無(wú)核酸酶的水，4 μ L總RNA，1 μ L Woligo ( d T)15引物(10 ymol/L)(寶生物工程(大連)有限公司)，1 μ L dNTP混合物(具體為dATP、 dGTP、dTTP和dCTP四種混合物)(10 mmol/L)(寶生物工程(大連)有限公司)，混勻后于65 V保持5 min，迅速轉(zhuǎn)移到冰上驟冷5min;然后向反應(yīng)管中加入，4 μ L 5X反轉(zhuǎn)錄緩沖液 (美國(guó)普洛麥格公司)，1 UL RNA酶抑制劑(40 U/μ L)(寶生物工程(大連)有限公司)，0. 25 μ L AMV反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/yL)(美國(guó)普洛麥格公司)，42°C反應(yīng)50 min ；72 °C 15 min滅 活反轉(zhuǎn)錄酶后獲得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA。PCR反應(yīng)體系為25 μ L，即在0.2 mL的PCR反應(yīng)管中加入13. 25 μ L無(wú)核酸酶的 水，3 μ L cDNA, 2 μ L 正向引物SEQ ID No. 1(10 ymol/L)、2 μ L 反向引物SEQ ID No. 2 (10 ymol/L)，10XPCR緩沖液2. 5 μ L (寶生物工程(大連)有限公司)，2 μ L dNTP (2. 5 mmol/L)(寶生物工程(大連)有限公司)，0. 25 μ L Taq DNA聚合酶(5 U/yL)(寶生物工 程(大連)有限公司)。反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性3 min;94°C變性50 s、42°C退火50 s、72°C 延伸50 s，5個(gè)循環(huán)；接著94°C變性50 s、52°C退火50 s、72°C延伸50 s，30個(gè)循環(huán)；最后 72°C延伸7 min。在PCR儀上完成。PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)是否擴(kuò)增到326 343 bp的DNA片 段判定樣品中是否含有豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒。本實(shí)施例檢測(cè)方法能夠快速準(zhǔn) 確地判斷樣品是否有豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒，根據(jù)序列進(jìn)行種類(lèi)鑒定，為進(jìn)出 口安全提供了保證。豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒RT-PCR檢測(cè)用簡(jiǎn)并引物進(jìn)一步可 做成豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒通用RT-PCR檢測(cè)試劑盒。實(shí)施例2
豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬通用RT-PCR方法的通用性檢測(cè) 取豇豆花葉病毒(CPMV)、豇豆重花葉病毒(CPSMV)、菜豆莢斑駁病毒(BPMV)、蘿卜花葉 病毒(RaMV)、紅三葉草斑駁病毒(RCMV)、南瓜花葉病毒(SqMV)、蠶豆萎蔫病毒1號(hào)(BBWVl) 等7種病毒9個(gè)分離物的病葉及健康蠶豆葉片，按實(shí)施例1方法分別提取總RNA，再進(jìn)行 RT-PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果病癥葉片中均檢出約350 bp的DNA片段。檢 測(cè)結(jié)果如圖1所示。表明建立的通用RT-PCR方法可用于這兩個(gè)病毒屬中不同病毒種類(lèi)的 檢測(cè)，具有良好的通用性，可用于豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒的通用檢測(cè)。實(shí)施例3
豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬通用RT-PCR方法的的特異性檢測(cè)取同屬于豇豆花葉病 毒亞科的線蟲(chóng)傳多面體病毒屬病毒(分別為ArMV、TRSV,ToRSV、TBRV、PRMV、CLRV,RpRSV)病 葉，按實(shí)施例1方法分別提取總RNA、進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，進(jìn)行特異性檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如圖2 所示。表明建立的通用RT-PCR方法并不會(huì)與同一個(gè)病毒屬的病毒產(chǎn)生交叉反應(yīng)，具有良好 的特異性，符合檢測(cè)的要求。序 列 表
<110>廈門(mén)出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
<120>豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒通用RT-PCR檢測(cè)用簡(jiǎn)并引物<130>
<160>2
<170>PatentIn version ？
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
TGYGAYTAYD VHffSffTTYGA TGG
<210>2
<211>20
<212>DNA <213>人工序列
<400>2
AKYARRTTRT CATCHCCATA20
權(quán)利要求
1.一種豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒通用RT-PCR檢測(cè)用簡(jiǎn)并引物，其 特征在于由正向和反向引物組成，其正向引物的核苷酸序列見(jiàn)SEQ ID No. 1 5'-TGYGAYTAYDVHWSffTTYGATGG -3 ‘；反向引物的核苷酸序列見(jiàn) SEQ ID No. 2 :5 ‘-AKYARRTTRTCATCHCCATA -3'；其中 Y= C/T，D= G/A/T, V=G/A/C, H=A/T/C, ff=A/T, S=G/C, K= G/T, R= A/G0
2.一種如權(quán)利要求1所述的豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒通用RT-PCR檢測(cè)的檢 測(cè)方法，其特征在于包括如下步驟以樣品總RNA為模板，利用上述引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增， 反應(yīng)結(jié)束后凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)擴(kuò)增DNA片段的位置判定結(jié)果，侵染這兩個(gè)病毒 屬病毒的病癥葉片中均能檢出326 343 bp的DNA片段。
3.如權(quán)利要求2所述的一種豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒通用RT-PCR檢測(cè)用簡(jiǎn) 并引物的檢測(cè)方法，其特征在于所述的RT-PCR反應(yīng)包括反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增兩個(gè)過(guò)程。
4.如權(quán)利要求3所述的一種豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒通用RT-PCR檢測(cè)的檢 測(cè)方法，其特征在于所述的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的溫度為42°C，PCR擴(kuò)增的先用退火溫度42°C進(jìn)行 5個(gè)循環(huán)，然后用退火溫度52°C進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，延伸溫度為72°C。
5.一種如權(quán)利要求1所述豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒通用RT-PCR檢測(cè)用簡(jiǎn)并 引物的應(yīng)用，其特征在于所述的引物對(duì)樣品總RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增后對(duì)所擴(kuò)增的DNA片 段進(jìn)一步序列測(cè)定后，能快速鑒定豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒的種類(lèi)。
6.一種如權(quán)利要求1所述豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒通用RT-PCR檢測(cè)用簡(jiǎn)并 引物的應(yīng)用，其特征在于所述豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒通用RT-PCR檢測(cè)用簡(jiǎn)并 引物能應(yīng)用于豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒通用RT-PCR檢測(cè)試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒通用RT-PCR檢測(cè)用簡(jiǎn)并引物、檢測(cè)方法及其應(yīng)用，由正向和反向引物組成，其正向引物的核苷酸序列見(jiàn)SEQIDNo.15′-TGYGAYTAYDVHWSWTTYGATGG-3′；反向引物的核苷酸序列見(jiàn)SEQIDNo.25′-AKYARRTTRTCATCHCCATA-3′；其中Y=C/T，D=G/A/T，V=G/A/C，H=A/T/C，W=A/T，S=G/C，K=G/T，R=A/G。本發(fā)明檢測(cè)方法能夠快速準(zhǔn)確地判斷樣品是否有豇豆花葉病毒屬和蠶豆病毒屬病毒，根據(jù)序列進(jìn)行種類(lèi)鑒定，為進(jìn)出口安全提供了保證。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102140555SQ20111009225
公開(kāi)日2011年8月3日 申請(qǐng)日期2011年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月7日
發(fā)明者吳媛, 廖富榮, 林石明, 黃蓬英 申請(qǐng)人:廈門(mén)出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心