專利名稱：煙草系統(tǒng)素原基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因植物領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種煙草系統(tǒng)素基因在轉(zhuǎn)基因煙草中提高煙草棉鈴蟲抗性的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1972年，Green和Ryan研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)被昆蟲傷害時(shí)，番茄和馬鈴薯的葉片系統(tǒng)性積累被稱為蛋白酶抑制劑I的絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白(Green T.R.，Ryan C.A.Wound-induced proteinase inhibitor in plant leavesa possible defense mechanismagainst insects.Science(1972)175776-77.)。這表明在植物的傷害部位和未傷害部位之間有一種移動(dòng)的因子作為信號(hào)誘導(dǎo)抗性蛋白的表達(dá)及系統(tǒng)性的抗性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)這種因子存在于番茄傷害葉片的粗體液中(Ryan C.A.Assay andbiochemical properties of the proteinase inhibitor inducing factor，a wound hormone.Plant Physiol.(1974)54328-32.)。當(dāng)體外施加這種初提物時(shí)能激活煙草蛋白酶抑制劑基因表達(dá)。依據(jù)這種因子的蛋白酶抑制劑誘導(dǎo)活性，通過生化手段，純化得到了18氨基酸的小分子多肽，因其與系統(tǒng)性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)所以命名為系統(tǒng)素(Pearce G.，Strydom D.，Johnson S.，Ryan C.A.A polypeptide from tomato leavesactivates the expression of proteinase inhibitor genes.Science(1991)253895-87.)。系統(tǒng)素在非常低的水平具有活性。番茄的系統(tǒng)素來自于一個(gè)200氨基酸的前體——系統(tǒng)素原(McGurl B.，Pearce G.，Orozco-Cardenas M.，Ryan C.A.Structure，expression，and antisense inhibition of the systemin precursor gene.Science(1992)2551570-73.)，編碼系統(tǒng)素原的基因由11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子組成(McGurl B.，Ryan C.A.The organization of the prosystemin gene.(1992)Plant Mol.Biol.20405-409.)。在未受傷的植物中，發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)素原的水平很低，但是受傷之后系統(tǒng)素原的水平上升了幾倍，在植物受到傷害的時(shí)候明顯的放大了傷害信號(hào)(McGurl B.，Pearce G.，Orozco-Cardenas M.，Ryan C.A.Structure，expression，andantisense inhibition of the systemin precursor gene.Science(1992)2551570-73.)。
過量表達(dá)反義系統(tǒng)素原基因的轉(zhuǎn)基因植物在傷害時(shí)降低了對(duì)蛋白酶抑制劑的系統(tǒng)性誘導(dǎo)并且也降低了對(duì)食草昆蟲的抗性(McGurl B.，Pearce G.，Orozco-Cardenas M.，Ryan C.A.Structure，expression，and antisense inhibition of thesystemin precursor gene.Science(1992)2551570-73.；Orozco-Cárdenas，M.McGurlB.，Ryan C.A.Expression of an antisense prosystemin gene in tomato plants reducesresistance toward Manduca Sexta larvae.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)908273-8276.)。過量表達(dá)系統(tǒng)素原的番茄植物，在整個(gè)植物的細(xì)胞中組成性合成和積累蛋白酶抑制劑，在沒有受傷的情況下，好像這些植物處于永久的受傷狀態(tài)(McGurl B.，Orozco-Cardenas M.，Pearce G.，Ryan C.A.Overexpression of theprosystemin gene in transgenic tomato plants generates a systemic signal that inducesproteinase inhibitor synthesis.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)919799-9802.)。這些實(shí)驗(yàn)表明在傷反應(yīng)中系統(tǒng)素是起始信號(hào)。
在其它茄科植物，如馬鈴薯，茄，和辣椒中也發(fā)現(xiàn)了系統(tǒng)素原的同源物(Constabel C.P.，Yip L.，Ryan C.A.Prosystemin from potato，black nightshade，andbell pepperprimary structures and biological acivities of the predicted systemins.Plant Mol.Biol.(1998)3455-62.)，但是在煙草中沒有發(fā)現(xiàn)番茄系統(tǒng)素原的同源物。雖然番茄的系統(tǒng)素不能誘導(dǎo)煙草植物葉片中防衛(wèi)基因的表達(dá)，然而煙草中確實(shí)存在系統(tǒng)性激活煙草胰蛋白酶抑制劑家族合成傷害反應(yīng)(Pearce G.，Johnson S.，Ryan C.A.Purification and characterization from tobacco(Nicotiana tabacum)leavesof six small，wound-inducible，proteinase isoinhibitors of the potato inhibitor II family.Plant Physiol.(1993)102639-644.)。后來發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)素引起懸浮培養(yǎng)番茄細(xì)胞的培養(yǎng)基堿化(Schaller，A.Oecking C.Modulation of Plasma Membrane H+-ATPaseActivity Differentially Activates Wound and Pathogen Defense Responses in TomatoPlants.Plant Cell(1999)11263-272.)。這種分析促使了兩個(gè)18個(gè)氨基酸多肽從煙草葉片的分離，并且這兩個(gè)多肽具有強(qiáng)烈的煙草胰蛋白酶抑制劑誘導(dǎo)活性。這兩個(gè)多肽被稱為煙草系統(tǒng)素I(Tob Sys I)和煙草系統(tǒng)素II(Tob Sys II)(Pearce G.，Moura D.S.，Stratmann J.，Ryan C.A.Production of multiple plant hormones from asingle polyprotein precursor.Nature(2001)411817-820.)。這兩個(gè)多肽相互之間的同源性很低，兩者與番茄系統(tǒng)素的同源性也很低。兩個(gè)系統(tǒng)素都具有番茄系統(tǒng)素類似的煙草胰蛋白酶抑制劑誘導(dǎo)活性。Pearce等人在2001年從煙草葉片的cDNA文庫中通過RT-PCR分離得到一個(gè)cDNA，其編碼一個(gè)165個(gè)氨基酸包含煙草Tob SysI和II兩個(gè)多肽的前體-系統(tǒng)素原，Tob Sys I位于系統(tǒng)素原的N端區(qū)域，Tob Sys II位于系統(tǒng)素原的C端區(qū)域(Pearce G.，Moura D.S.，Stratmann J.，Ryan C.A.Production of multiple plant hormones from a single polyprotein precursor.Nature(2001)411817-820.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供一種煙草系統(tǒng)素原基因(proTobsys)在轉(zhuǎn)基因煙草中的應(yīng)用。該轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)為對(duì)棉鈴蟲的抗性大大的提高，在轉(zhuǎn)基因植株上的棉鈴蟲生長和發(fā)育受到了明顯的抑制，生長緩慢，食欲下降，煙草的受損程度也降低。過量表達(dá)煙草系統(tǒng)素原基因的轉(zhuǎn)基因煙草誘導(dǎo)蛋白酶抑制劑表達(dá)和多酚氧化酶活性提高是抗性提高的主要原因。
在本發(fā)明中，為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案，該方法包括下列步驟A.依據(jù)煙草系統(tǒng)素原基因cDNA序列(Pearce G.，Moura D.S.，Stratmann J.，RyanC.A.Production of multiple plant hormones from a single polyprotein precursor.Nature(2001)411817-820.)設(shè)計(jì)引物Prosys5(5’-cgggatccatgagagttctgtttctcatctacc-3’)和Prosys3(5’cgggatccttaataggagtgaagaggacgctg-3’)，提取煙草的總RNA，通過RT-PCR得到煙草系統(tǒng)素原基因開放閱讀框序列。
B.通過T載體策略將系統(tǒng)素原基因片段連接到pBS上，形成pBS-proTobsys，重組pBS-proTobsys測(cè)序驗(yàn)證。
C.用BamHI酶切包含有煙草系統(tǒng)素原基因片段的pBS-proTobsys；D.將C步獲得的煙草系統(tǒng)素原基因片段連接到植物表達(dá)載體pBIm(W.Hua，L.Zhang，S.P.Liang，R.L.Jones，Y.T.Lu，A TobaccoCalcium/Calmodulin-binding Protein Kinase Functions as a NegativeRegulator of Flowering，J.Biol.Chem.279(2004)31483-31494.)上，形成pBIm-proTobsys(+)；使得煙草系統(tǒng)素元基因置于35S啟動(dòng)子和NOS尾巴之間，形成可轉(zhuǎn)化或表達(dá)的載體；E.將pBIm-proTobsys(+)通過制備的農(nóng)桿菌LBA4404(W.Hua，L.Zhang，S.P.Liang，R.L.Jones，Y.T.Lu，A Tobacco Calcium/Calmodulin-binding ProteinKinase Functions as a Negative Regulator of Flowering，J.Biol.Chem.279(2004)31483-31494.)感受態(tài)轉(zhuǎn)化進(jìn)入農(nóng)桿菌LBA4404，再通過葉盤法導(dǎo)入煙草葉片；F.篩選陽性植株.將煙草葉片在農(nóng)桿菌LBA4404中浸泡10min，葉片上表皮朝下置于共培養(yǎng)上，25℃光照培養(yǎng)2-3天，共培養(yǎng)結(jié)束后，用液體MS培養(yǎng)基洗葉片2次，再用加羧芐青霉素(500μg/ml)的液體MS培養(yǎng)基洗1次，葉片轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基上，每隔15天繼代一次選擇培養(yǎng)基，待再生芽長至1cm時(shí)切下小芽移至生根培養(yǎng)基上。苗生根后，移栽至土缽中形成完整的植株。
G.將通過Northern鑒定過量表達(dá)煙草系統(tǒng)素原基因的轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行棉鈴蟲取食煙草葉片實(shí)驗(yàn)。將人工孵化3天的棉鈴蟲幼蟲接到轉(zhuǎn)基因煙草葉片上，以野生型煙草作對(duì)照，每株煙草上接20條棉鈴蟲。棉鈴蟲取食煙草葉片10天后統(tǒng)計(jì)棉鈴蟲的體重和體長，轉(zhuǎn)基因煙草植株上棉鈴蟲的體重和體長分別是野生型煙草上棉鈴蟲的47％和73％，野生型煙草受到棉鈴蟲的傷害程度也遠(yuǎn)大于轉(zhuǎn)基因煙草。通過上述步驟煙草系統(tǒng)素基因(proTobsvs)在轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)棉鈴蟲抗性中得以應(yīng)用。
轉(zhuǎn)基因煙草抗性蛋白表達(dá)和活性分析。分析表明蛋白酶抑制劑的表達(dá)在轉(zhuǎn)基因煙草中顯著提高，轉(zhuǎn)基因煙草中多酚氧化酶的活性是野生型煙草多酚氧化酶活性的40倍左右。說明蛋白酶抑制劑和多酚氧化酶是受系統(tǒng)素調(diào)節(jié)的煙草傷害信號(hào)通路下游的抗性蛋白。蛋白酶抑制劑表達(dá)和多酚氧化酶活性在轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草中的差異是轉(zhuǎn)基因煙草抗性提高的主要原因之一。
本發(fā)明有以下優(yōu)點(diǎn)1.指出煙草系統(tǒng)素原基因在傷害反應(yīng)中的功能，即來源于系統(tǒng)素原的系統(tǒng)素是煙草傷害反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的起始信號(hào)以誘導(dǎo)下游一系列的反應(yīng)。
2.指出了過量表達(dá)系統(tǒng)素原基因能提高煙草對(duì)棉鈴蟲的抗性，減少了棉鈴蟲對(duì)煙草的傷害。
3.指出了過量表達(dá)系統(tǒng)素原基因能提高下游抗性基因蛋白酶抑制劑和多酚氧化酶的表達(dá)。


圖1植物表達(dá)載體pBIm示意圖其中Kanamycin為卡那霉素抗性，promoter為35S啟動(dòng)子，NOS尾巴為轉(zhuǎn)錄終止子。
圖2轉(zhuǎn)化植株的核酸分析-PCR鑒定結(jié)果W為對(duì)照野生植株，Transgenic lines為轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株成功導(dǎo)入外源基因。
圖3轉(zhuǎn)化植株的Northern結(jié)果W為對(duì)照野生植株；T2、T8、T10、T12為轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株系統(tǒng)素原基因過量表達(dá)。
圖4棉鈴蟲取食轉(zhuǎn)基因煙草與野生煙草對(duì)比。
a.取食煙草葉片10天后的棉鈴蟲，W為取食野生型煙草葉片棉鈴蟲，T為取食轉(zhuǎn)基因煙草葉片棉鈴蟲；b.棉鈴蟲取食煙草葉片3天后，煙草葉片傷害狀況，W為野生型煙草葉片，T為轉(zhuǎn)基因煙草葉片；c.棉鈴蟲取食煙草葉片10天后，煙草傷害狀況，W野生型煙草，T轉(zhuǎn)基因煙草。
圖5轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草蛋白酶抑制劑表達(dá)W為野生型煙草對(duì)照，T2、T8、T10、T12為4個(gè)不同的轉(zhuǎn)基因株系。
圖6轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草多酚氧化酶活性a.分廣光度法分析多酚氧化酶活性。W為野生型煙草，T2，T8，T10，T12為不同轉(zhuǎn)基因煙草株系。
具體實(shí)施例方式
下面具體闡述本發(fā)明。
實(shí)例1含有煙草系統(tǒng)素原基因的表達(dá)載體構(gòu)建根據(jù)煙草系統(tǒng)素原基因的cDNA序列(Pearce G.，Moura D.S.，Stratmann J.，Ryan C.A.Production of multiple plant hormones from a single polyprotein precursor.Nature(2001)411817-820.)，設(shè)計(jì)引物Prosys5(5’-cgggatccatgagagttctgtttctcatctacc-3’)和Prosys3(5’cgggatccttaataggagtgaagaggacgctg-3’)，RT-PCR克隆得到煙草系統(tǒng)素原基因。通過T載體策略將系統(tǒng)素原基因序列連接到pBS上，重組pBS-proTobsys測(cè)序驗(yàn)證。BamHI37℃消化pBS-Prosys獲得的系統(tǒng)素原基因片段克隆到植物表達(dá)載體質(zhì)粒pBIm(W.Hua，L.Zhang，S.P.Liang，R.L.Jones，Y.T.Lu，A Tobacco Calcium/Calmodulin-binding Protein KinaseFunctions as a Negative Regulator of Flowering，J.Biol.Chem.279(2004)31483-31494.)中，形成pBIm-proTobsys(+)。
實(shí)例2含有煙草系統(tǒng)素原基因的植株的轉(zhuǎn)化與篩選(1).農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備將農(nóng)桿菌LBA4404(W.Hua，L.Zhang，S.P.Liang，R.L.Jones，Y.T.Lu，ATobacco Calcium/Calmodulin-binding Protein Kinase Functions as a NegativeRegulator of Flowering，J.Biol.Chem.279(2004)31483-31494.)劃YM(W.Hua，L.Zhang，S.P.Liang，R.L.Jones，Y.T.Lu，A TobaccoCalcium/Calmodulin-binding Protein Kinase Functions as a NegativeRegulator of Flowering，J.Biol.Chem.279(2004)31483-31494.)平板，26-28℃培養(yǎng)48小時(shí)，挑取單菌落接種到40ml YM液體培養(yǎng)基中，250rpm懸浮培養(yǎng)約12-20小時(shí)，然后在超凈臺(tái)上將菌液轉(zhuǎn)入滅過菌的50ml離心管中，4℃，8000rpm，離心8分鐘，棄上清，用100mM氯化鈉(NaCl)(4℃預(yù)冷)重懸農(nóng)桿菌，4℃，8000rpm，離心8分鐘，棄上清，加入原始菌液1/50體積(800μl)的20mM氯化鈣(CaCl2)重懸菌體，并分裝成100μl/管。(此時(shí)的感受態(tài)農(nóng)桿菌可以直接用于轉(zhuǎn)化)，或置液氮中10秒鐘，放入-20℃或-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> YM培養(yǎng)基的配方酵母抽提液 0.4g/l甘露醇 10g/l氯化鈉(NaCl) 0.1g/l硫酸鎂(MgSO4) 0.1g/l
磷酸氫二鉀(K2HPO4) 0.5g/l瓊脂粉 15g/lpH7.2-7.4LB培養(yǎng)基(100ml)蛋白胨 1g酵母抽提物 0.5g氯化鈉 1g(2).重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌將感受態(tài)農(nóng)桿菌LBA4404置于冰上，加入1μg pBIm-proTobsys(+)質(zhì)粒DNA(體積不宜超過10μl)，充分混勻，置冰上30分鐘，置液氮中1分鐘(時(shí)間不能過長)，然后迅速轉(zhuǎn)入37℃水浴中，待其融化后加入1ml YM液體培養(yǎng)基于28℃，230rpm培養(yǎng)2-4小時(shí)，3000rpm離心2分鐘，將上清吸去500μl，留500μl于管中，振蕩重懸菌體，并涂布到含有卡那霉素(50μg/ml)和硫酸鏈霉素(25μg/ml)的YM平板上，吹干，28℃培養(yǎng)48小時(shí)，挑取單菌落接種到含有卡那霉素(50μg/ml)和硫酸鏈霉素(25μg/ml)的液體YM培養(yǎng)基中，28℃，250rpm培養(yǎng)48小時(shí)，菌液用于保存或轉(zhuǎn)化。
(3).煙草葉盤法轉(zhuǎn)化將成熟的煙草種子70％乙醇洗30s，無菌水洗5％的次氯酸鈉(NaClO)浸洗5-10min；無菌水洗4-5遍；將煙草種子平鋪在瓊脂濃度為0.8％的MS(pH5.8)培養(yǎng)基上，萌發(fā)的煙草無菌苗備用。
接種農(nóng)桿菌LBA4404(含質(zhì)粒DNA)于固體YM培養(yǎng)基上，兩天后挑取單菌落于50mlYM液體培養(yǎng)基中，200rpm，28℃培養(yǎng)42-48小時(shí)，待OD600為1.0左右時(shí)使用，將煙草葉片在農(nóng)桿菌中浸泡10min，葉片上表皮朝下置于共培養(yǎng)基上，25℃光照培養(yǎng)2-3天，共培養(yǎng)結(jié)束后，用液體MS培養(yǎng)基洗葉片2次，再用加羧芐青霉素(500μg/ml)的液體MS培養(yǎng)基洗1次，葉片轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基上，每隔15天繼代一次選擇培養(yǎng)基，待再生芽長至1cm時(shí)切下小芽移至生根培養(yǎng)基上。苗生根后，移栽至土缽中形成完整的植株。
MS培養(yǎng)基成分
大量元素

微量元素

鐵鹽

煙草轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基共培養(yǎng)基MS+2-嗎啉乙磺酸(MES)(0.59g/l)+萘乙酸(NAA)(0.1mg/l)+芐氨基嘌呤(BA)(1mg/l)+卡那霉素(Kan)(300mg/l)選擇培養(yǎng)基MS+MES(0.59g/l)+NAA(0.1mg/l)+BA(1mg/l)+Kan(300mg/l)+羧卞青霉素(Carb)(500mg/l)生根培養(yǎng)基1/2MS+Kan(100mg/l)+Carb(200mg/l)
實(shí)施例3含有煙草系統(tǒng)素原基因轉(zhuǎn)化植株的核酸分析-PCR1.用于PCR的轉(zhuǎn)化植株總DNA的提取70％乙醇擦洗葉片，稱取100mg，加入600μl抽提緩沖液(0.2M氯化鈉(NaCl)，25mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.5％十二烷基硫酸鈉(SDS)，pH7.5)，室溫快速研磨，在1.5ml Eppendorf管中渦旋混勻5-20秒于室溫，12000rpm，離心25分鐘。取上清加等體積異丙醇，上下顛倒混勻。-20℃沉淀過夜，室溫條件下，12000rpm，15分鐘。棄上清，倒置于吸水紙上待壁上液體流盡后加入200μl 70％的乙醇泡洗DNA沉淀，室溫(20-25℃)，12000rpm，10分鐘。棄乙醇，倒置于紙巾上待其干燥后加100μl TE緩沖液(pH 7.5)溶解沉淀。分光光度計(jì)測(cè)定或電泳估測(cè)DNA濃度，最后以總DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)和電泳檢測(cè)。
2.PCR程序PCR反應(yīng)混合液的配比同質(zhì)粒PCR鑒定，反應(yīng)的時(shí)間和溫度作如下94℃3min94℃1min，55℃1min，72℃1min30s，30cycles72℃10min實(shí)施例4含有煙草系統(tǒng)素原基因轉(zhuǎn)化植株的核酸分析Northern雜交1.RNA提取液氮研磨煙草組織，將研磨好的樣品加入1ml TRizol試劑，室溫(20-25℃)下放置5min。加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15sec。室溫22-25℃放置2-3min，12,000×g，4℃，離心15min。上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中，加入0.5ml異丙醇室溫沉淀RNA 10min。12,000×g，4℃，離心10min。用70％乙醇洗滌沉淀，室溫22-25℃干燥。沉淀溶于焦碳酸二乙酯處理的無菌水(DEPC-H2O)。
2.轉(zhuǎn)膜RNA電泳10×電泳上樣緩沖液50％(V/V)甘油(用DEPC處理的水稀釋)10mM EDTA(pH8.0)
100μg/ml EB(用DEPC處理的水稀釋)RNA樣品緩沖液甲酰胺 50μl10×MOPS10μl甲醛17.5μl①制備凝膠(1.2％)稱1.2克瓊脂糖，加72ml DEPC處理的水，加熱溶化。冷卻至60℃，在通風(fēng)廚內(nèi)加入10×凝膠緩沖液10ml，甲醛(37％)18ml，混均后倒入凝膠模具中。
②樣品制備在離心管里，將RNA樣品與RNA樣品緩沖液以1∶2比例混合。65℃溫浴5-10分鐘，迅速在冰上冷浴5分鐘，瞬時(shí)離心數(shù)秒。對(duì)于Northern雜交實(shí)驗(yàn)，總RNA上樣量可達(dá)到10-30μg。
③上樣前凝膠需預(yù)電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔。以5V/cm的電壓電泳1.5h-2.0h。
④待溴酚藍(lán)遷移至凝膠長度2/3-4/5處結(jié)束電泳。
⑤在紫外燈下觀察結(jié)果。
2)轉(zhuǎn)膜①用焦碳酸二乙酯處理的無菌水(DEPC-H2O)淋洗RNA膠，再用10×標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸緩沖液(SSC)洗兩次，每次30min。
②用吸印法或者轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)RNA到尼龍膜上(步驟同Southern Blot)。轉(zhuǎn)膜后在紫外交聯(lián)儀上交聯(lián)。立即使用或者4℃保存。
3)探針的制備①制備探針5×標(biāo)記緩沖液10μl(dATP、dTTP、dGTP各50μM)dNTP2μl(3’非翻譯區(qū))變性的DNA模板 25ngBSA(10mg/ml) 2μlα-32PdCTP 50μCiKlenow(5U/μl) 1μl②室溫22℃反應(yīng)1-2小時(shí)。
③加入2μl 0.5M EDTA終止反應(yīng)。
④加入35μl STE，過柱純化探針。
4)預(yù)雜交①雜交液0.5M Na2HPO4pH7.47％SDS②ssDNA(10mg/ml)70μl煮沸5min，放冰上10min。
③將交聯(lián)有RNA的膜至于雜交管中，帶有RNA的面朝內(nèi)。
④加入5-10ml預(yù)雜交液(即無探針的雜交液，含有100μg/ml的變性的ssDNA)，防止產(chǎn)生氣泡。
⑤65℃，2-3h。
5)雜交探針煮沸5min，放于冰上。倒掉預(yù)雜交液，加入雜交液后加入探針，65℃，10-16h。
6)洗膜①2×SSC/0.1％SDS，65℃洗兩次，每次15min；②0.2×SSC/o.1％SDS，65℃洗兩次，每次5min；7)放射自顯影，洗膠片洗膜、壓片雜交完成后，用含2×SSC，0.2％SDS的洗液在室溫下冷漂洗一次，再用預(yù)熱至65℃的洗液(1×SSC或0.5×SSC，0.1％SDS)于65℃熱洗兩次，各15分鐘。晾半干，迅速用保鮮膜包裹，放入暗夾。在暗室里裝入X-光片，把暗夾放在-80℃冰箱中放射自顯影4-7天，沖洗X-光片。
實(shí)例5.轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)棉鈴蟲抗性分析將人工孵化3天的棉鈴蟲幼蟲接到轉(zhuǎn)基因煙草葉片上，以野生型煙草作對(duì)照，每株煙草上接20條棉鈴蟲。棉鈴蟲取食煙草三天觀察煙草受棉鈴蟲的傷害程度，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草上的棉鈴蟲取食的葉片要明顯少于野生性煙草上的棉鈴蟲取食的葉片。棉鈴蟲取食煙草葉片10天后統(tǒng)計(jì)棉鈴蟲的體重和體長，轉(zhuǎn)基因煙草植株上棉鈴蟲的體重和體長分別是野生型煙草上棉鈴蟲的47％和73％，野生型煙草受到棉鈴蟲的傷害程度也遠(yuǎn)大于轉(zhuǎn)基因煙草。
實(shí)例6.轉(zhuǎn)基因煙草蛋白酶抑制劑表達(dá)和多酚氧化酶活性分析取野生型和轉(zhuǎn)基因煙草的葉片組織，液氮研磨后提取葉片組織的總RNA；在RNA變性膠上電泳；RNA轉(zhuǎn)到尼龍膜上；用煙草蛋白酶抑制劑I和II(Tob-PI I和Tob-PI II)cDNA兩端設(shè)計(jì)的引物(Heitz T.，Geoffroy P.，Stintzi A.，F(xiàn)ritig B.，Legrand M.cDNA cloning and gene expression analysis of the microbial proteinaseinhibitor of tobacco.J.Biol.Chem.268(1993)16987-16992；Balandin T.，van derDoes C.，Albert，J.M.Bol J.F.，Linthorst H.J.Structure and induction pattern of anovel proteinase inhibitor class II gene of tobacco.Plant Mol.Biol. 27(1995)1197-1204.)，通過PCR從已經(jīng)測(cè)序鑒定的重組質(zhì)粒pBS-Tob-PI I和pBS-Tob-PIII中擴(kuò)增煙草蛋白酶抑制劑I和II的基因片段作為Northern雜交探針制備的模板。用制備探針進(jìn)行雜交；放射自顯影顯示蛋白酶抑制劑的表達(dá)。
依據(jù)Laukkanena 1999年報(bào)到方法，分析煙草葉片組織中多酚氧化酶的活性(Laukkanena H.，Haggman H.，Kontunen-Soppela S.，Hohtola A.Tissue browningof in vitro cultures of Scots pineRole of peroxidase and polyphenol oxidase.Physiol.Plant.106(1999)337-343.)。取新鮮的煙草葉片100mg在液氮中研磨，然后將研磨的組織轉(zhuǎn)移到EP管中，向EP管中加入1ml 100mM預(yù)冷的磷酸鈉(pH7.0)搖勻放置于冰上5min；4℃，8,000rpm，離心5min，取上清。將100μl粗提物上清液加入到反應(yīng)混合液中。反應(yīng)混合液含有50mM磷酸鈉(pH8.7)和10mM對(duì)苯二酚，反應(yīng)混合液的總體積為1000μl。取100μl反應(yīng)混合液在25℃，410nm處測(cè)定其在5min內(nèi)吸收值的變化。測(cè)定的吸收值變化強(qiáng)弱表示煙草多酚氧化酶活性的強(qiáng)弱，變化越大說明多酚氧化酶的活性越強(qiáng)，請(qǐng)見表1。
表1棉鈴蟲取食煙草葉片10天后，棉鈴蟲的體重和體長

權(quán)利要求
1.一種煙草系統(tǒng)素原基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種煙草系統(tǒng)素原基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的應(yīng)用，其步驟是A.通過RT－PCR得到的cDNA序列；B.用T載體的策略將proTobsys克??；C.BamHI酶切包含有proTobsys的pBS－proTobsys；D.將獲得的片段連接到植物表達(dá)載體pBIm上，形成可轉(zhuǎn)化載體；E.將制備的載體通過制備的農(nóng)桿菌感受態(tài)轉(zhuǎn)化進(jìn)入農(nóng)桿菌，再通過葉盤法導(dǎo)入煙草葉片；F.對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行雜交鑒定，得到proTobsys過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草；G.轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行棉鈴蟲取食煙草葉片實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)基因植物對(duì)棉鈴蟲的抗性提高。分析轉(zhuǎn)基因煙草抗性基因的表達(dá)和活性，轉(zhuǎn)基因煙草蛋白酶抑制劑表達(dá)和多酚氧化酶活性都提高。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1884540SQ200610019360
公開日2006年12月27日 申請(qǐng)日期2006年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月15日
發(fā)明者呂應(yīng)堂, 任峰 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)