專利名稱：一種表達(dá)重組對蝦肽Pen24的基因工程菌株及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，更屬于一種表達(dá)重組對蝦肽Pen24的基因工程菌株，更具體涉及含有對蝦肽基因的基因工程菌株E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)，對蝦肽相關(guān)的重組對蝦肽Pen24，重組對蝦肽Pen24對革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、真菌、病毒均具有明顯的抗生物活性。還涉及基因工程菌株的制備方法，同時，還涉及重組基因工程蛋白質(zhì)Pen24在預(yù)防和治療動物和植物的細(xì)菌、真菌和病毒病中的應(yīng)用，以及作為防腐劑在化妝品、食品和飼料等領(lǐng)域中的用途。
背景技術(shù)：
抗菌肽是宿主免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，也是機(jī)體理想的第一道防線。Boman G等最先通過注射陰溝桿菌及大腸桿菌誘導(dǎo)惜古比天蠶蛹產(chǎn)生具有抗菌活性的多肽，即cecropins[Boman H G et al.，1987]。此后科學(xué)家們在哺乳動物、被囊動物(tunicate)、兩棲動物、昆蟲、魚類、鳥類和植物等多種生物體中發(fā)現(xiàn)并分離獲得了約300種內(nèi)源性抗菌肽。
抗菌肽是生物體抵御外源性病原微生物的入侵而產(chǎn)生的一類小分子多肽，能對抗外界病原體的感染?？咕氖怯杉?xì)菌特定基因編碼產(chǎn)生的一類小分子多肽，具有廣譜抗菌性，尤其對耐藥菌株有明顯的殺滅作用，且不破壞生物體細(xì)胞，無免疫原性[Michael C et al.，2003]。如果蠅中的andropin、drosocin，蜜蜂中的apidaecin、abaecin，狼蛛的acanthoscurrin等。兩棲動物它們的皮膚能夠分泌大量的抗菌肽類物質(zhì)，其含量非常高。如研究最廣泛的magaininsm、源于南美蛙的dermasep tin、來自樹蛙的bombininh以及日本蛙的melittin相關(guān)肽等。在海洋生物中發(fā)現(xiàn)與抗菌肽相關(guān)的肽類物質(zhì)，海兔的dolabellanin。哺乳動物中，抗菌肽在吞噬細(xì)胞和粘膜上皮細(xì)胞表達(dá)，目前已發(fā)現(xiàn)防御素和cathelicidins家族為代表的大量的抗菌活性肽。
抗菌肽除了抗菌活性外，同時還具有多種其他的調(diào)控功能。哺乳動物防御素主要有α-防御素和β-防御素兩種，具有廣泛的抗革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽性細(xì)菌、真菌和一些具包膜病毒的活性。從大鼠附睪頭部上皮細(xì)胞中成功地克隆到一個特異表達(dá)的新基因，并觀察到這個基因所編碼的多肽具有抗菌功能，并可能與生育有關(guān)[張永蓮等，2002]。
抗菌肽抗菌廣譜，對病毒、寄生蟲、癌細(xì)胞均有抑制作用。哺乳動物抗菌肽具有保守的多個半胱氨酸，能形成幾個穩(wěn)定的二硫鍵，具有十分廣泛的抗菌譜，除抗細(xì)菌、真菌、病毒外，還對支原體、衣原體、螺旋體及一些活性細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)有殺滅作用。cecropin P1是一種哺乳動物抗菌肽，對G-菌及一些G+菌有抑制殺滅作用?？咕母叨缺Ｊ氐陌被釟埢且恍┛咕姆肿泳哂锌咕钚运豢扇鄙俚模硗庖恍┨烊豢咕牡腃端往往是酰胺化的，這與抗菌肽的廣譜抗菌活性有關(guān)。
一般地，大多數(shù)抗菌肽由30多個氨基酸殘基組成，C端富含丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸等非極性氨基酸，N端富含精氨酸和賴氨酸等陽離子型氨基酸，中間部分富含脯氨酸[Daniel M L et al.，2003；Harder J et al.，2001]。在許多特定位置都有一些較保守的氨基酸殘基。大多數(shù)抗菌肽具有α-螺旋或者β-折疊結(jié)構(gòu)，有些同時包含這兩種結(jié)構(gòu)。ceceopin P1是由31個氨基酸組成的多肽，分子量約為3ku，不含半胱氨酸，不能形成分子內(nèi)二硫鍵，其分子內(nèi)含有兩親性α-螺旋，中間是形成柔性彎曲的谷氨酸-甘氨酸(Glu-Gly)卷曲序列，與昆蟲cecropin IA有64％相似性，與cecropin B有75％的相似性。
抗菌肽被認(rèn)為是魚、蝦、貝等防御系統(tǒng)的主要成分之一。Chisholm等研究證明甲殼動物的血細(xì)胞溶胞上清液含有能殺滅細(xì)菌的因子[Chisholm J R S etal.，1995]；Pierce等從鱟血細(xì)胞中分離到的抗菌肽[Pierce J C et al.，1997]；Schnapp等從青蟹的血細(xì)胞中分離到3種具有殺菌作用的肽[Schnapp D et al.，1996]。至今，已在南美白對蝦、南美藍(lán)對蝦、印度對蝦、中國對蝦和斑節(jié)對蝦等體內(nèi)發(fā)現(xiàn)多種抗菌肽。
Penaeidin家族是陽離子抗菌肽，COOH-端含有6個半胱氨酸，形成3個二硫鍵，NH2-端富含脯氨酸。Penaeidin前體N端具有保守性很強(qiáng)的信號肽，經(jīng)加工獲得成熟肽。Penaeidin成熟肽有翻譯后修飾的特性，或者C端酰氨化，或者N端通過焦谷氨酸環(huán)化。
抗菌肽的天然產(chǎn)量有限，國內(nèi)外學(xué)者通過化學(xué)合成獲得抗菌肽。但是，化學(xué)合成法步驟復(fù)雜、產(chǎn)量低、成本較高。目前國內(nèi)外學(xué)者在研究抗菌肽一級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，采用分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)方法在原核細(xì)胞、真核細(xì)胞或某些藻類中表達(dá)抗菌肽，并且獲得了抗菌肽轉(zhuǎn)基因的動植物。大腸桿菌為革蘭氏陰性細(xì)菌，遺傳背景清楚，有大量可用于克隆和表達(dá)外源性基因的菌株，并且易被大規(guī)模培養(yǎng)。但是，由于抗菌肽對大腸桿菌的毒性或殺菌作用，所以大腸桿菌不適宜用于表達(dá)抗菌肽，但也有少數(shù)成功的例子。邱定紅選擇自然界活性最強(qiáng)的天蠶素類抗菌肽B(CB)cDNA與人干擾素A1(h IFN A1)cDNA融合，構(gòu)建原核表達(dá)載體pBV-20的融合表達(dá)質(zhì)粒pBV-20-hIFN A1-CB(pHC)，轉(zhuǎn)導(dǎo)入大腸桿菌E.coli JMB菌株，溫控誘導(dǎo)后表達(dá)純化了的融合蛋白hIFN A1-CB[邱定紅等，2002]。通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)抗菌肽，實現(xiàn)抗菌肽批量生產(chǎn)具有重要的意義，將有希望使抗菌肽成為抑制和殺滅主要病原體、特別是耐藥菌的新型藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供一種表達(dá)重組對蝦肽Pen24的基因工程菌株。重組對蝦肽Pen24對蝦肽具有廣譜抗菌作用，對革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌均具有明顯的抑菌活性；對氨芐青霉素不敏感的強(qiáng)致病性細(xì)菌，如枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和綠膿桿菌等有很好的抗菌活性。同時，重組對蝦肽Pen24對抗氨芐青霉素的大腸桿菌具有抑菌活性。重組對蝦肽Pen24對昆蟲核型多角體病毒(包括家蠶核型多角體病毒、苜宿銀紋夜蛾核型多角體病毒、棉鈴蟲核型多角體病毒、甜菜夜蛾核型多角體病毒等)、對蝦白斑綜合癥病毒(簡稱WSSV)的感染均具有明顯的抗病毒活性?；蚬こ讨亟M對蝦肽Pen24可廣泛應(yīng)用于動物和植物的細(xì)菌、真菌和病毒病的預(yù)防和治療，以及作為防腐劑應(yīng)用于化妝品、食品和飼料等領(lǐng)域。
由于傳統(tǒng)抗生素的應(yīng)用帶來的耐藥性、藥物殘留等問題，對抗生素肽的研究開發(fā)已成為世界上研究抗生素新產(chǎn)品的前沿性課題?？咕呐c傳統(tǒng)的抗生素相比具有分子量小、抗菌譜廣、熱穩(wěn)定性好、抗菌機(jī)理獨特等優(yōu)點，具有抗細(xì)菌、霉菌、病毒、原蟲、癌細(xì)胞、螺旋體等多種活性，且不易產(chǎn)生耐藥性。利用抗菌肽替代傳統(tǒng)抗生素，作為新一代的抗菌藥來源，對提高畜產(chǎn)品品質(zhì)，推動綠色生物科技的發(fā)展具有非常重要的意義和廣闊的應(yīng)用前景。
本發(fā)明的目的是在于提供一種含有南美白對蝦Penaeidin-2基因的重組基因工程大腸桿菌菌株，其特征在于該菌株是一種高效表達(dá)重組對蝦肽Pen24的基因工程菌株E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)，該菌株株于2006年1月15日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NoM206003，含有插入了南美白對蝦Penaeidin-2表達(dá)盒的重組表達(dá)質(zhì)粒，或者包含編碼本發(fā)明所述的基因工程重組對蝦肽Pen24的DNA片斷。利用該基因工程菌株E.coliOrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)，可表達(dá)基因工程重組對蝦肽Pen24。
本發(fā)明的目的是在于提供一種大腸桿菌宿主細(xì)胞的構(gòu)建方法，方法簡便，操作方便，該宿主細(xì)胞包含重組對蝦肽Pen24的核苷酸序列。表達(dá)量高，基因工程蛋白的表達(dá)量最高可以達(dá)到菌體蛋白總量的20％，融合表達(dá)，安全性高，利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的目的之一是在于提供一種表達(dá)重組對蝦肽Pen24的基因工程菌株在預(yù)防或治療動物和植物的細(xì)菌、真菌和病毒病中的應(yīng)用，還可作為防腐劑在化妝品、食品和動物飼料中應(yīng)用。
本發(fā)明提供一種基因工程重組對蝦肽Pen24，其分子量為約24kDa。所述的基因工程重組對蝦肽Pen24具有抗細(xì)菌、真菌和病毒感染的生物活性。
本發(fā)明的目的之一是提供一種編碼基因工程重組對蝦肽Pen24的氨基酸序列，其氨基酸序列與序列表2的氨基酸序列至少有70％的同源性。
本發(fā)明的目的之一是提供一種編碼基因工程重組對蝦肽Pen24的氨基酸序列，其氨基酸序列與序列表2的氨基酸序列至少有80％的同源性。
本發(fā)明的目的之一是提供一種編碼基因工程重組對蝦肽Pen24的氨基酸序列，其氨基酸序列與序列表2的氨基酸序列至少有90％的同源性。
本發(fā)明的目的之一是提供一種編碼基因工程重組對蝦肽Pen24對應(yīng)的核苷酸序列，其核苷酸序列與序列表1的核苷酸序列至少有50％的同源性。
本發(fā)明的目的之一是提供一種編碼基因工程重組對蝦肽Pen24對應(yīng)的核苷酸序列，，其核苷酸序列與序列表1的核苷酸序列至少有80％的同源性。
本發(fā)明的目的之一是提供一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包含編碼本發(fā)明所述的基因工程重組對蝦肽Pen24的核苷酸序列，或者包含編碼本發(fā)明所述的基因工程重組對蝦肽Pen24的DNA片斷。
本發(fā)明的目的之一是提供一種大腸桿菌宿主細(xì)胞的構(gòu)建方法，該宿主細(xì)胞包含本發(fā)明所述的基因工程重組對蝦肽Pen24的核苷酸片斷。
本發(fā)明還涉及重組對蝦肽Pen24在抗細(xì)菌感染中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及重組對蝦肽Pen24在抗真菌感染中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及重組對蝦肽Pen24在抗病毒感染中的應(yīng)用。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施
本發(fā)明提供一種DNA片斷的制備方法，該片段包含所述的編碼基因工程重組對蝦肽Pen24的核苷酸序列。
在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明所提供的一種基因工程重組對蝦肽Pen24，其具有與序列表2所示氨基酸至少70％同源性的序列，其分子量為約24kDa，該基因工程重組對蝦肽Pen24具有抗細(xì)菌、真菌和病毒感染的生物活性。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種基因工程重組對蝦肽Pen24，一種分離的蛋白質(zhì)，其具有與序列表2所示氨基酸至少80％同源性的序列。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種基因工程重組對蝦肽Pen24，一種分離的蛋白質(zhì)，其具有與序列表2所示氨基酸至少90％同源性的序列。
在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明所述的基因工程重組對蝦肽Pen24具有的氨基酸序列為序列表2。
本發(fā)明所述的基因工程重組對蝦肽Pen24的氨基酸序列可以在一定范圍內(nèi)進(jìn)行修飾、改變，所獲得的修飾后的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的片段與基因工程重組對蝦肽Pen24有相同的生物學(xué)功能。重組對蝦肽Pen24具有廣譜抗菌作用，對革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌均具有明顯的抑菌活性；對氨芐青霉素不敏感的強(qiáng)致病性細(xì)菌，如枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和綠膿桿菌等有很好的抗菌活性。同時，重組對蝦肽Pen24對抗氨芐青霉素的大腸桿菌具有抑菌活性。重組對蝦肽Pen24對昆蟲核型多角體病毒(包括家蠶核型多角體病毒、苜宿銀紋夜蛾核型多角體病毒、棉鈴蟲核型多角體病毒、甜菜夜蛾核型多角體病毒等)、對蝦白斑綜合癥病毒(簡稱WSSV)的感染均具有明顯的抗病毒活性。
對蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾和改變的方法為常規(guī)的方法[Joe Sambrook，DavidRussell et al.，Molecular CloningA Laboratry Manual，Cold Spring Harbor Lab(CSHL)Press，2001]，為本專業(yè)技術(shù)人員所熟悉。按照現(xiàn)代生命科學(xué)的理論，氨基酸序列同源性70％以上的蛋白質(zhì)在生物學(xué)中常被詮釋為是具有相同生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)。在此范圍內(nèi)對蛋白質(zhì)氨基酸序列進(jìn)行的修飾和突變均被認(rèn)為并未改變蛋白質(zhì)的生物學(xué)特性，這些改變和修飾包括(1)對個別氨基酸進(jìn)行突變，特別是非功能決定位點的氨基酸。
(2)缺失或插入個別氨基酸，特別是非功能決定位點的氨基酸。這樣的改變?nèi)绻麤]有改變蛋白的空間構(gòu)象，就不會影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，也不會改變蛋白質(zhì)的免疫原性。
(3)插入特殊的氨基酸殘基。為了增加或改變蛋白質(zhì)的可溶性，增加穩(wěn)定性，在基因工程生產(chǎn)過程中，往往會在蛋白質(zhì)的N、C端加入一些氨基酸殘基，以避免形成包涵體，減少宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)內(nèi)切酶的降解；或者在N、C端加入一些特殊的氨基酸功能位點以利于蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化。
以上對蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾和改變的方法為常規(guī)的方法(常規(guī)方法同上)，為本專業(yè)技術(shù)人員所熟悉。通過上述方法獲得的與本發(fā)明所述的基因工程重組對蝦肽Pen24有70％同源性的蛋白質(zhì)或片段都具有與本發(fā)明所述基因工程重組對蝦肽Pen24相同的生物學(xué)功能，即它們具有抗細(xì)菌、真菌和病毒感染的生物活性，能夠用于實現(xiàn)本發(fā)明的一個或多個目的。
根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸組成，結(jié)合SDS-PAGE的分析結(jié)果，本發(fā)明所涉及的基因工程重組對蝦肽Pen24的分子量為約24kDa。如果蛋白質(zhì)的氨基酸序列發(fā)生部分或局部的改變，蛋白質(zhì)的分子量會發(fā)生變化。選用不同的宿主菌株和表達(dá)載體，由于翻譯后修飾的原因，蛋白質(zhì)的分子量也會發(fā)生變化。選用不同的檢測方法，蛋白質(zhì)的分子量也會有一些差異，但這些變化和差異在原則上不會超過蛋白質(zhì)分子量的10％。
本發(fā)明以南美白對蝦為材料，提取總RNA，設(shè)計Penaeidin-2特異引物，通過RT-PCR、PCR擴(kuò)增，得到其成熟肽編碼區(qū)序列，核苷酸序列為tacaggggcggttacacaggcccgatacccaggccaccacccattggaagaccaccgttcagacctgtttgcaatgcatgctacagactttccgtctcagatgctcgcaattgctgcatcaagttcggaagctgttgtcacttagtaaaaggataa在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種編碼基因工程重組對蝦肽Pen24的核苷酸序列為序列表1。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種基因工程重組對蝦肽Pen24，該蛋白為基因工程融合蛋白，其N的氨基酸是載體所編碼的，N端氨基酸是MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMADIGSEF本發(fā)明提供一種編碼基因工程重組對蝦肽Pen24的核苷酸序列，其具有與序列表1所示核苷酸至少有50％同源性的序列。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種編碼基因工程重組對蝦肽Pen24的核苷酸序列，其核苷酸序列與序列表1的核苷酸序列至少有80％的同源性。
基因工程蛋白質(zhì)氨基酸序列的任何改變可能改變其編碼的氨基酸，進(jìn)而改變其編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，但生物的氨基酸密碼子存在兼并性。本發(fā)明所述的基因工程重組對蝦肽Pen24的核苷酸序列可以進(jìn)行突變，但其編碼的蛋白質(zhì)有相同的生物學(xué)功能。這些突變包括錯義突變、同義突變和移碼突變。這些方法為常規(guī)的方法，可以通過點突變等方法實現(xiàn)。這些方法為本專業(yè)技術(shù)人員所熟悉，不需進(jìn)行創(chuàng)造性勞動即可獲得。通過該方法獲得的與本發(fā)明所述的核苷酸序列有50％同源性的核苷酸序列都具有與本發(fā)明所述核苷酸序列相同的生物學(xué)功能，能夠用于實現(xiàn)本發(fā)明的一個或多個目的。按照現(xiàn)代生物學(xué)的概念，尤其是生物信息學(xué)的理論，同源性在70％以上的核苷酸序列可以判定為具有顯著的相似性，同源性在80％以上的核苷酸序列可以判定為具有相同的生物學(xué)功能。
本發(fā)明所述的編碼基因工程重組對蝦肽Pen24的核苷酸序列可以在一定范圍內(nèi)進(jìn)行改變，所獲得的核苷酸序列與編碼基因工程重組對蝦肽Pen24的核苷酸序列具有相同的生物學(xué)功能。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所用pET-32a(+)質(zhì)粒為Novagen公司產(chǎn)品，在pET-32a(+)質(zhì)粒多克隆位點上游還帶有His.Tag、S.Tag及腸激酶和凝血酶酶切位點，表達(dá)的重組對蝦肽Pen24為融合蛋白，其分子質(zhì)量約24kDa。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種Penaeidin-2DNA片斷及其制備方法。該片段包含本發(fā)明所述的編碼基因工程重組對蝦肽Pen24的核苷酸序列。
發(fā)明所涉及的DNA片斷可以通過以下方式獲得(1)人工合成，可直接用DNA合成儀人工合成本發(fā)明所述的DNA片斷，或者分段合成本發(fā)明所述的DNA片斷，這些合成產(chǎn)物具有與本發(fā)明所述的DNA片斷相同的生物學(xué)功能，可以實現(xiàn)本發(fā)明所述的一個或多個目的。
(2)PCR擴(kuò)增，以本發(fā)明所述的DNA片斷為模板，或者以含有本發(fā)明所述的DNA片斷的質(zhì)粒、載體、宿主細(xì)胞為模板，通過PCR擴(kuò)增得到DNA片斷，這些PCR產(chǎn)物具有與本發(fā)明所述的DNA片斷相同的生物學(xué)功能，可以實現(xiàn)本發(fā)明所述的一個或多個目的。
以上方法為分子生物學(xué)中常用的方法，為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉，不需通過創(chuàng)造性勞動即可獲得，所獲得的DNA片斷被視為與本發(fā)明所涉及的核苷酸序列有相同的生物學(xué)功能，能夠進(jìn)一步通過基因工程的方法實現(xiàn)本發(fā)明的一個或多個發(fā)明目的。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種宿主細(xì)胞——大腸桿菌E.coli，該宿主細(xì)胞包含編碼本發(fā)明所述的基因工程重組對蝦肽Pen24的核苷酸序列，或者包含編碼本發(fā)明所述的基因工程重組對蝦肽Pen24的DNA片斷。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種大腸桿菌重組基因工程菌株，該菌株分類命名為E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏日期2006年1月10日，保藏編號CCTCC NoM206003，該宿主細(xì)胞包含本發(fā)明所述的基因工程重組對蝦肽Pen24的核苷酸序列。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種大腸桿菌重組基因工程菌株E.coliOrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)的構(gòu)建方法。
(1)南美白對蝦總RNA的提取及cDNA第一條鏈的合成采集健康南美白對蝦血淋巴，獲得血細(xì)胞，按Qiagen公司RNeasy Mini Kit說明書提取總RNA，并按Promega公司Universal Riboclone cDNA SynthesisSystem試劑盒操作手冊進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。
(2)PCR擴(kuò)增Penaeidin-2基因以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一條鏈為模板，上游引物P15＇GAATTCTACAGGGGCGGTTACACA 3＇(下劃線處為EcoR I位點)，下游引物P23′GTGAATCATTTTCCTATTTTCGAA5＇(下劃線處為Hind III位點)。利用PCR儀擴(kuò)增，獲得168bp目的基因。
(3)重組質(zhì)粒pGEM-T/Pen的構(gòu)建和鑒定回收PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T載體上，轉(zhuǎn)化E.coli JM109(購于美國Promega公司)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含X-gal、IPTG和Amp抗性的LB平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，用PCR和限制性內(nèi)切酶酶切鑒定、DNA測序分析鑒定重組質(zhì)粒pGEM-T/Pen。
(4)重組表達(dá)質(zhì)粒pET-pen的構(gòu)建和鑒定用EcoR I、Hind III分別雙酶切表達(dá)載體pET-32a(+)和重組子pGEM-T/Pen質(zhì)粒DNA，將Penaeidin-2基因定向插入表達(dá)載體pET-32a(+)，獲得重組質(zhì)粒pET-pen。轉(zhuǎn)化E.coli Origami B(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞。用PCR、限制性內(nèi)切酶酶切鑒定和DNA測序分析鑒定重組質(zhì)粒pET-pen。該菌株命名為大腸桿菌重組基因工程菌株E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種利用大腸桿菌重組基因工程菌株E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)表達(dá)基因工程重組對蝦肽Pen24的方法。
(1)挑取單菌落接種于含200μg/mL氨芐青霉素(Amp)，34μg/mL氯霉素和15μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，250r/min下振蕩培養(yǎng)8-12h。4℃放置過夜。
(2)次日按4％接種量接入新鮮2YT液體培養(yǎng)基中，在37℃下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至菌液OD600值為0.6-0.8時，加入誘導(dǎo)物IPTG至終濃度為0.4mmoI/L，在37℃下誘導(dǎo)表達(dá)3-5h，4℃離心收集菌體。
(3)15％SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達(dá)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種純化基因工程重組對蝦肽Pen24的方法。
(1)超聲波破碎離心收集上清；(2)采用His·Bind resin柱，按照操作手冊純化基因工程重組對蝦肽Pen24；(3)PBS緩沖液(pH7.3)透析處理純化的基因工程重組對蝦肽Pen24；(4)15％ SDS-PAGE電泳，激光掃描檢測重組對蝦肽蛋白Pen24純度。
(5)采用Bradford assay法，測定純化的重組對蝦肽蛋白Pen24濃度。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果在本發(fā)明的一個實施方案中，檢測了基因工程重組對蝦肽Pen24抗細(xì)菌的生物活性。
(1)采用紙片擴(kuò)散法，檢測重組對蝦肽Pen24對大腸桿菌的活力單位和抑菌效價。
(2)采用紙片擴(kuò)散法，檢測重組對蝦肽Pen24對革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌和抗氨芐青霉素的大腸桿菌菌株E.coli BL21(pET-32a)的活性。
(3)采用液體生長抑制法，測定重組對蝦肽Pen24對MIC。
將過夜培養(yǎng)的不同菌種進(jìn)行倍比稀釋，取10-3稀釋度進(jìn)行MIC測定，最后通過計算菌落形成單位(CFU)判斷最小抑菌濃度。
重組對蝦肽Pen24對蝦肽具有廣譜抗菌作用，對革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌均具有明顯的抑菌活性；對氨芐青霉素不敏感的強(qiáng)致病性細(xì)菌，如枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和綠膿桿菌等有很好的抗菌活性。同時，重組對蝦肽Pen24對抗氨芐青霉素的大腸桿菌具有抑菌活性。
在本發(fā)明的一個實施方案中，檢測了基因工程重組對蝦肽Pen24抗家蠶核型多角體病毒(BmNPV)的生物活性。
采用舔食法，檢測該重組對蝦肽Pen24對家蠶核型多角體病毒(BmNPV)感染家蠶幼蟲的影響。重組對蝦肽Pen24具有明顯的抗家蠶核型多角體病毒(BmNPV)感染的活性。
在本發(fā)明的一個實施方案中，檢測了基因工程重組對蝦肽Pen24抗苜宿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)的生物活性。
采用舔食法，檢測該重組對蝦肽Pen24對苜宿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)感染銀紋夜蛾幼蟲的影響。重組對蝦肽Pen24具有明顯的抗苜宿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)感染的活性。
在本發(fā)明的一個實施方案中，檢測了基因工程重組對蝦肽Pen24抗棉鈴蟲核型多角體病毒(HaNPV)的生物活性。
采用舔食法，檢測該重組對蝦肽Pen24對棉鈴蟲核型多角體病毒(HaNPV)感染棉鈴蟲幼蟲的影響。重組對蝦肽Pen24具有明顯的抗棉鈴蟲核型多角體病毒(HaNPV)感染的活性。
在本發(fā)明的一個實施方案中，檢測了基因工程重組對蝦肽Pen24抗甜菜夜蛾核型多角體病毒(SeNPV)的生物活性。
采用舔食法，檢測該重組對蝦肽Pen24對甜菜夜蛾核型多角體病毒(SeNPV)感染甜菜夜蛾幼蟲的影響。重組對蝦肽Pen24具有明顯的抗甜菜夜蛾核型多角體病毒(SeNPV)感染的活性。
在本發(fā)明的一個實施方案中，檢測了基因工程重組對蝦肽Pen24抗對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)的生物活性。
采用注射法，檢測該重組對蝦肽Pen24對對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)感染克氏原螯蝦的影響。重組對蝦肽Pen24具有明顯的抗對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)感染的活性。


本發(fā)明的上述和其它目的，特點和優(yōu)勢可顯而易見地從下面對本發(fā)明優(yōu)選實施例的詳細(xì)描述和附圖示出的內(nèi)容得到，不同視圖中相同的參考符號代表相同的部分。附圖并不一定是按比例示出，其重點在于說明本發(fā)明的實施和效果。
圖1基因penaedin-2 RT-PCR鑒定圖。
Lane 1.DL2000 Markers；Lane 2.PCR product圖2重組質(zhì)粒pGEM-T/Pen-2的PCR和酶切鑒定圖Lane 1 DL2000；Lane 2 PCR product；Lane 3 pGEM-T/Pen/EcoRI+HindIII；Lane 4pGEM-T/Pen/EcoRI；Lane 5 pGEM-T/Pen plasmid；lane6 marker III圖3重組表達(dá)質(zhì)粒pET-pen的PCR和酶切鑒定圖Lane 1 DL2000 Markers；Lane 2.PCR product；Lane 3.pET-pen/EcoR I+Hind III；Lane 4.pET-pen/EcoRI；Lane 5.pET-32a(+)/EcoRI；Lane 6.Marker III.
圖4重組表達(dá)質(zhì)粒pET-pen的構(gòu)建過程5 15％SDS-PAGE檢測Pen24的表達(dá)Lane 1.純化的Pen24融合蛋白；Lane 2.分子量標(biāo)準(zhǔn)；Lane 3.E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)未誘導(dǎo)；Lane 4.E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-pen)誘導(dǎo)前；Lane 5.E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-pen)誘導(dǎo)4h；Lane 6.E.coliOrigami B(DE3)pLysS(pET-pen)誘導(dǎo)3h；Lane 7.E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-32)誘導(dǎo)4h；Lane 8.E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-32)誘導(dǎo)前；Lane 9.E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-32)未誘導(dǎo)圖6重組對蝦肽Pen24抑菌效價測定圖7重組對蝦肽Pen24抑制BmNPV感染家蠶的活性測定注TN+BmNPVBmNPV陽性對照組；E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)破碎上清液+BmNPVE.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)破碎上清液+BmNPV組；A組，B組E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+BmNPV組；TNTN Buffer對照組圖8重組對蝦肽Pen24抑制AcNPV感染銀紋夜蛾的活性測定注AcNPVAcNPV陽性對照組；AcNPV+E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)破碎上清液+AcNPV組；AcNPV+Pen-24E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+AcNPV組；PBSPBS Buffer對照組圖9重組對蝦肽Pen24抑制HaNPV感染銀紋夜蛾的活性測定注HaNPVHaNPV陽性對照組；HaNPV+Pen-24E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+HaNPV組；HaNPV+E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)破碎上清液+HaNPV組；PBSPBS Buffer對照組圖10重組對蝦肽Pen24抑制SeMNPV感染銀紋夜蛾的活性測定注SeMNPV+E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)破碎上清液+SeMNPV組；SeMNPV+Pen-24E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+SeMNPV組；SeMNPVSeMNPV陽性對照組；PBSPBS Buffer對照組圖11重組對蝦肽Pen-24抑制WSSV感染克氏原螯蝦的活性測定注WSSV+E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)破碎上清液+WSSV組；WSSV+PBSWSSV陽性對照組；WSSV+Pen-24重組對蝦肽Pen24+WSSV組；PBSPBS Buffer對照組具體實施方式
實施例1 南美白對蝦總RNA的提取將南美白對蝦飼養(yǎng)于通氧22℃的水箱中待用。選取蛻皮間期健康蝦，用DEPC處理過的滅菌水漂洗后，用2.5mL一次性注射器從蝦的腹竇處收集血淋巴750μL，加入等體積的抗凝劑(PH7.0)，鏡檢記數(shù)，取細(xì)胞含量為1×107的血淋巴于4℃、、800g離心15min，移去上清，收集血細(xì)胞。按照Qiagen公司RNeasyMini Kit的產(chǎn)品說明書提取總RNA。將提取到的RNA溶液貯存于-80℃，以備用。
對提取的南美白對蝦總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示28S和18S兩條帶清晰可見，并且兩條帶的顯色強(qiáng)度近似為2∶1，說明所提取的總RNA基本上沒有降解，完整性較好。
實施例2 南美白對蝦反轉(zhuǎn)錄cDNA第一條鏈的合成以O(shè)ligo(dT)15為引物，按照Promega公司的Reverse Transcription Reaction試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。具體操作步驟如下將以下試劑加入到經(jīng)DEPC浸泡并滅菌處理過的PCR反應(yīng)管中25mM MgCl2，4μL；10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液，2μL；10mM dNTP混合物，2μL；重組的RNasin核糖核酸酶抑制劑，0.5μL；24U/μLAMV反轉(zhuǎn)錄酶，0.8μL；0.5μg/μL Oligo(dT)15引物1μL；總RNA，3μL；無核酸酶的水，2.7μL。反應(yīng)條件為42℃，1小時；95℃，5分鐘；3℃，5分鐘。
將合成的cDNA第一鏈存放于-80℃?zhèn)溆谩?br> 實施例3 南美白對蝦Penaeidin-2基因的擴(kuò)增1.擴(kuò)增引物的合成設(shè)計引物，上游引物P15＇GAATTCTACAGGGGCGGTTACACA 3＇(下劃線處為EcoR I位點)，下游引物P23＇GTGAATCATTTTCCTATTTTCGAA5＇(下劃線處為Hind III位點)。引物由上海生工生物工程有限公司合成，經(jīng)PAGE純化。
2.目的基因的PCR擴(kuò)增按照Reverse Transcription Reaction試劑盒操作手冊，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一條鏈為模板，PCR擴(kuò)增目的基因Penaeidin-2。PCR反應(yīng)體系10×reactionbuffer，5μL；1.5mM MgCl2，3μL；0.2mM dNTP，1μL；20pmol上游引物P1，1μL；20pmol下游引物P2，1μL；5U/μL Taq DNA聚合酶1μL；模板6μL；加無菌水至終體積為50μL。PCR反應(yīng)條件95℃，5min；94℃，30s；53℃，45s；72℃30s(35個循環(huán))；72℃，5min。
瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如附圖1所示。PCR擴(kuò)增目的基因Penaeidin-2產(chǎn)物經(jīng)1.2％的瓊脂糖凝膠電泳，有一約為168bp DNA帶，與預(yù)測目的基因Penaeidin-2結(jié)果相符。
實施例4 南美白對蝦Penaeidin-2基因的克隆1.目的基因penaedin-2片段的回收采用DNA膠回收試劑盒(Omega公司產(chǎn)品)，按照Omega公司DNA膠回收試劑盒說明書回收目的基因片段。具體操作步驟如下(1)PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳(1×TAE)，用紫外燈觀察電泳情況，當(dāng)要回收的DNA帶與其他帶完全分離時，停止電泳，在紫外燈下用刀片切下欲回收帶，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化。
(2)在Eppendorf管中將膠搗碎，加入等體積的溶膠液Binding Buffer，65℃水浴7min，其間每2min輕搖Eppendorf管一次直至膠完全融解。
(3)將融解的樣品加入層析柱中，12000rpm離心1min，棄去液體。
(4)加300μL Binding Buffer，離心棄去液體。
(5)加750μL Washing Buffer，離心棄去液體。
(6)重復(fù)步驟(5)。
(7)空柱子12000rpm離心1min以甩干液體。
(8)將柱子放于1.5mL Eppendorf管，加入30μL Elution buffer，37℃保溫2min，12000rpm離心1min，收集離心液，貯存于-20℃。
2.目的基因penaedin-2片段克隆入pGEM-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-T/Pen將以上純化的PCR產(chǎn)物克隆于pGEM-T載體，pGEM-T載體購自Promega公司。反應(yīng)體系為2×Ligation buffer，5.0μL；pGEM-T載體，0.5μL；PCR產(chǎn)物，4.0μL；T4DNA ligase，0.5μL；無加菌ddH2O至10μL。在冰上混合上述液體，16℃連接15h。
3.質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
(1)感受態(tài)細(xì)胞的制備采用冷氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。挑取單個E.coli JM109菌落，接種于5mL LB培養(yǎng)基中，37℃、220rpm培養(yǎng)過夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接種于50mL LB培養(yǎng)液中，37℃，220rpm振蕩，待菌液OD值為0.6時，取1.5mL菌液加入無菌的Eppendorf離心管中，4,000rpm離心10min，棄上清。加入800μL冰預(yù)冷的0.1M氯化鈣，輕輕振蕩重懸菌體沉淀，冰浴30min。4,000rpm離心10min，棄上清。加入100μL冰預(yù)冷的0.1M氯化鈣重懸沉淀，4℃保存，7～10天內(nèi)使用。
(2)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞取上述連接產(chǎn)物10μL加入100μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴60分鐘，42℃熱休克90秒，再置冰浴2分鐘，加入390μL新鮮LB液體培養(yǎng)基，37℃，150rpm輕搖，50min。取100μL菌液涂布于含5-溴-4氯-3吲哚-D-半乳糖苷(X-gal)、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)和Amp抗性的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜，觀察結(jié)果，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取白色菌落快速提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切鑒定。
4.重組質(zhì)粒pGEM-T/Pen的鑒定隨機(jī)挑取10個單克隆白斑，擴(kuò)大培養(yǎng)后用質(zhì)粒提取試劑盒(Qiagen公司產(chǎn)品)抽提質(zhì)粒。以質(zhì)粒pGEM-T/Pen為模板，用引物P1、P2擴(kuò)增出與預(yù)測結(jié)果相符的片斷，表明目的基因已克隆入pGEM-T載體中。PCR與酶切鑒定結(jié)果見附圖2。重組質(zhì)粒pGEM-T/Pen經(jīng)EcoRI+HindIII雙酶切，得到約3000bp和168bp的預(yù)期DNA片斷，pGEM-T/Pen經(jīng)EcoRI單酶切，得到單一約3168bp的預(yù)期DNA片斷。
5.Penaeidin-2核苷酸序列測定質(zhì)粒pGEM-T/Pen DNA經(jīng)PCR和酶切鑒定后，隨機(jī)選取陽性克隆送北京華大基因公司進(jìn)行DNA測序分析。pGEM-T/Pen質(zhì)粒經(jīng)全自動測序分析，Penaeidin-2基因核苷酸序列為tacaggggcggttacacaggcccgatacccaggccaccacccattggaagaccaccgttcagacctgtttgcaatgcatgctacagactttccgtctcagatgctcgcaattgctgcatcaagttcggaagctgttgtcacttagtaaaaggataa實施例5 基因工程菌株E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)的構(gòu)建和鑒定1.重組表達(dá)質(zhì)粒pET-pen的構(gòu)建用EcoR I、Hind III分別雙酶切表達(dá)載體pET-32a(+)和重組子pGEM-T/Pen質(zhì)粒DNA，分別用膠回收試劑盒回收、純化目的DNA片斷，再將Penaeidin-2DNA片斷與pET-32a(+)DNA片斷連接，16℃連接15h后，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli OrigamiB(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含12.5μg/ml Tetracycline、15μg/mlKanamycin、34μg/ml Chloramphenicol的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。
2.重組表達(dá)質(zhì)粒pET-pen的鑒定隨機(jī)挑取10個陽性克隆，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，用質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒，PCR和EcoR I、Hind III酶切鑒定pET-pen重組表達(dá)質(zhì)粒。以質(zhì)粒pET-pen為模板，用引物P1、P2擴(kuò)增出與預(yù)測結(jié)果相符的片斷，表明目的基因已克隆入pET-32a(+)載體中。PCR與酶切鑒定結(jié)果如附圖3。重組質(zhì)粒pET-pen DNA經(jīng)EcoRI+HindIII雙酶切，得到約5875bp和168bp的二個DNA片斷，pET-pen DNA經(jīng)EcoRI單酶切，得到單一約6043bp的DNA片斷。
重組表達(dá)質(zhì)粒pET-pen的構(gòu)建過程如附圖4。
3.核苷酸序列測定質(zhì)粒pET-pen DNA經(jīng)PCR和酶切鑒定后，隨機(jī)選取陽性克隆送北京華大基因公司進(jìn)行DNA測序分析。pET-pen質(zhì)粒經(jīng)全自動測序分析，結(jié)果表明6個His序列成功的融合到Penaeidin-2基因成熟肽起始密碼子tac前，序列閱讀框沒有移碼。
上述所構(gòu)建的菌株為E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)。
實施例6 基因工程重組對蝦肽Pen24的表達(dá)挑取用甘油保存的菌種E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)，接種于含100μg/mL Ampicillin，34μg/mL chloramphenicol和15μg/mL kanamycin(sulfate)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，250r/min下振蕩培養(yǎng)8-12h。次日按4％接種量接入新鮮含100μg/mL Ampicillin，34μg/mL chloramphenicol和15μg/mL kanamycin(sulfate)的2YT液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至菌液OD600值為0.6-0.8時，加入誘導(dǎo)物IPTG(終濃度為0.4mM)，37℃下誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)后2h，3h，4h分別取樣，離心沉淀，去上清，加入300μLPBS(PH6.9)緩沖液，超聲波破碎，12,000g離心10min，上清加入5×SDS-PAGE樣品緩沖液，參照《分子克隆》進(jìn)行SDS-PAGE，用考馬斯亮藍(lán)R250染色檢測分析表達(dá)結(jié)果。結(jié)果如附圖5所示。15％SDS-PAGE電泳結(jié)果表明在IPTG誘導(dǎo)后基因工程菌株能夠表達(dá)重組對蝦肽Pen24，表達(dá)產(chǎn)物分子量與預(yù)期相符，為24kDa。
實施例7 基因工程重組對蝦肽Pen24的純化(1)挑取用甘油保存的菌種E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)，接種于含100μg/mL Ampicillin，34μg/mL chloramphenicol和15μg/mL kanamycin(sulfate)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，250r/min下振蕩培養(yǎng)8-12h。次日按4％接種量接入新鮮含100μg/mL Ampicillin，34μg/mL chloramphenicol和15μg/mL kanamycin(sulfate)的2YT液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至菌液OD600值為0.6-0.8時，加入誘導(dǎo)物IPTG(終濃度為0.4mM)，37℃下誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)4h后，5000g離心收集菌體。
(2)重懸于Binding Buffer pH7.920mmol/L Tris-HCl，5mmol/L NaCl中，4℃，進(jìn)行超聲波破碎菌處理(處理30min，每次10s，間隔30s)。12,000g離心20min兩次，收集上清，上清即為基因工程重組對蝦肽Pen24的提取液。
(3)Ni++柱層析樣品處理基因工程重組對蝦肽Pen24的提取液經(jīng)0.45μm的濾膜過濾，用1×Binding Buffer定容至100ml Ni++柱層析樣品。用10床1×Binding Buffer，20床無菌水清洗柱床；用10床1×Charge Buffer(5mM NiSO4)，結(jié)合Ni++；再用10床1×Binding Buffer平衡柱床后，備用(1床即是柱內(nèi)介質(zhì)的體積)。樣品經(jīng)蠕動泵以循環(huán)方式通過Ni++柱，使帶有6×His的蛋白樣品流動相充分與Ni++柱中的Ni++相結(jié)合，過夜后從Ni++柱出口收集未與Ni++結(jié)合的樣品(穿漏液)。分別采用50床1×Binding Buffer；75床60mM咪唑；75床100mM咪唑；30床150mM咪唑梯度洗滌留在柱內(nèi)的少量樣品和與Ni++柱結(jié)合的非目的蛋白。用1×Elute Buffer(1M咪唑+0.5M NaCl+20mM Tris·HCl pH7.9)洗脫與Ni++柱結(jié)合的目的蛋白，分部收集，1mL/管。Ni++柱用1×Elute Buffer繼續(xù)洗脫，洗樣柱中全部蛋白；再用1×Strip Buffer(100mM EDTA+0.5M NaCl+20mMTris·HCl pH7.9)洗柱子。通過SDS-PAGE檢驗?zāi)康牡鞍自谙疵撘褐械姆植?，參照《分子克隆》進(jìn)行SDS-PAGE，用考馬斯亮藍(lán)R250染色檢測分析表達(dá)結(jié)果。結(jié)果如附圖5所示。純化樣品經(jīng)15％SDS-PAGE檢測，有大小為24.1kDa的單一條帶。
實施例8 基因工程重組對蝦肽Pen24純化樣品中蛋白質(zhì)含量的確定將15mL經(jīng)Ni++柱洗脫、收集的基因工程重組對蝦肽Pen24純化樣品裝入經(jīng)處理的透析袋中，放入盛有1000mL PBS緩沖液(PH6.9)燒杯中透析、過夜。以上操作均在4℃進(jìn)行。用Bradford法確定重組對蝦肽Pen24含量，用mg/mL標(biāo)定。
Bradford法具體操作如下(1)將0、1、2、3、4、5、6μL 1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)溶液依次加入酶標(biāo)微孔板中，用PBS補(bǔ)足50μL。
(2)向每孔中加入200μL Bradford試劑工作液(0.1％考馬斯亮藍(lán)G250，5％乙醇，8.5％磷酸)。振蕩、混勻后，室溫放置2分鐘。
(3)用酶標(biāo)儀測BSA蛋白各濃度的OD570值(λ＝570nm)。以BSA蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，以BSA蛋白各濃度的OD570值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(4)用同樣方法測定樣品的OD570值，用標(biāo)準(zhǔn)曲線中確定樣品的濃度。
實施例9 基因工程重組對蝦肽Pen24抗細(xì)菌的生物活性(1)重組對蝦肽Pen24抑菌效價和活力單位測定采用紙片擴(kuò)散法，檢測重組對蝦肽Pen24對大腸桿菌的活力單位和抑菌效價。濾紙片直徑為0.6cm。實驗菌種大腸桿菌(Escherichia coli)，將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的大腸桿菌(CFU＝1.5×106個/mL)以1∶200比例均勻涂布于LB瓊脂平板上，待干燥后貼上無菌紙片，將待測重組抗菌肽Pen24溶液20μL加到紙片上，以E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-32a)20μL作陰性對照，同時以含氨芐青霉素的藥敏紙片作陽性對照，37℃孵育12h后，測量抑菌圈直徑大小。
結(jié)果如附圖6所示。當(dāng)對蝦肽Pen24為2.80μg時，抑菌圈直徑為17.44mm，2.80μg Pen24和10μg(含15IU)的氨芐青霉素藥敏紙片產(chǎn)生的抑菌圈大小相等，表明重組對蝦肽Pen24的殺菌活力為1μg抗菌肽與5IU的氨芐青霉素殺菌活力相當(dāng)。試驗中，每片藥敏紙片中重組對蝦肽Pen24含量增加，抑菌圈直徑逐漸增大。
(2)采用紙片擴(kuò)散法，檢測重組對蝦肽Pen24對革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌和抗氨芐青霉素的大腸桿菌菌株E.coli BL21(pET-32a)的活性。實驗菌種包括抗氨芐青霉素大腸桿菌Escherichia coliBL21(pET-32a)、大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)(中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供)。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的不同細(xì)菌(CFU＝1.5×106個/mL)以1∶200比例均勻涂布于LB瓊脂平板上，待干燥后貼上無菌紙片，將待測重組抗菌肽Pen24溶液20μL加到紙片上，以E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-32a)20μL作陰性對照，同時以含氨芐青霉素的藥敏紙片作陽性對照，37℃孵育12h后，測量抑菌圈直徑大小。
重組對蝦肽Pen24對革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌和抗氨芐青霉素的大腸桿菌菌株E.coli BL21(pET-32a)的活性結(jié)果見表1。抑菌圈大小又表明重組對蝦肽Pen24對革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌均有不同程度的抗菌活性，并且對包括氨芐青霉素抗性菌在內(nèi)的多種細(xì)菌都有抑制作用，且隨著抗菌肽含量的提高，抑菌圈逐漸加大，效果不斷加強(qiáng)。
表1 重組對蝦肽Pen24活力測定

(3)重組對蝦肽Penaeidin-2最小抑菌濃度(MIC)值測定最小抑菌濃度(MIC)值的測定參照液體生長抑制法，將過夜培養(yǎng)的不同菌種進(jìn)行10倍稀釋，取10-3稀釋度進(jìn)行MIC測定，分別各取5μL(CFU＝1.5×107個/mL)加入1.5mL EP管中，向各管中依次加入0μL、10μL、20μL、30μL、35μL、36μL、38μL、40μL等經(jīng)過透析處理的并已經(jīng)定量的純化重組對蝦肽，37℃靜止培養(yǎng)24小時，均勻涂布于瓊脂平板，37℃過夜培養(yǎng)后計算菌落形成單位(CFU)。結(jié)果見表2。表明重組對蝦肽Pen-24對多種強(qiáng)致病性細(xì)菌均有很好的抑菌作用，Pen-24對革蘭氏陽性細(xì)菌抑菌效果較革蘭氏陰性細(xì)菌顯著。
表2 重組對蝦肽Pen24最小抑菌濃度(MIC)的測定

實施例10 基因工程重組對蝦肽Pen24抗家蠶核形多角體病毒感染的生物活性1.樣品的制備(1)家蠶核形多角體病毒(BmNPV)樣品的制備家蠶核形多角體病毒(BmNPV)粗提液經(jīng)蔗糖梯度純化，于顯微鏡下計數(shù)，BmNPV含量為1.6×109PIB/mL。
(2)E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液樣品制備菌種E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)經(jīng)發(fā)酵，收集菌體。100克濕菌體用500mL NT Buffer重懸，超聲波破碎，離心，取上清。
(3)E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液樣品制備菌種E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))經(jīng)發(fā)酵，收集菌體。100克濕菌體用500mL NT Buffer重懸，超聲波破碎，離心，取上清。
2.Pen24抗家蠶核形多角體病毒(BmNPV)感染生物活性測定家蠶購于武漢從蠶業(yè)研究所，于室溫飼養(yǎng)。將五齡家蠶幼蟲分成5組，選擇8×108PIB/mL BmNPV作為病毒感染劑量。分別用下述4種樣品添食感染①E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+BmNPV組E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液樣品與BmNPV懸液混合，26℃下作用1h后，涂于4片中等大小、新鮮干凈桑葉上，每片300μL，等其干燥后喂養(yǎng)家蠶。
②E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+BmNPV組E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液樣品與BmNPV懸液混合，26℃下作用1h后，涂于4片中等大小、新鮮干凈桑葉上，每片300μL，等其干燥后喂養(yǎng)家蠶。
③BmNPV陽性對照組BmNPV懸液涂于4片中等大小、新鮮干凈桑葉上，每片300μL，等其干燥后喂養(yǎng)家蠶。
④TN Buffer對照組TN Buffer涂于4片中等大小、新鮮干凈桑葉上，每片300μL，等其干燥后喂養(yǎng)家蠶。
家蠶幼蟲于20-25℃條件下飼養(yǎng)，感染BmNPV病毒3天后，每天喂食新鮮干凈桑葉兩次，一天兩次記錄家蠶幼蟲死亡的情況。
結(jié)果見附圖7。結(jié)果表明，第6天，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液)+BmNPV組死亡率分別為10％，20％；BmNPV陽性對照組死亡率為40％；E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+BmNPV對照組死亡率為40％。第7天，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液)+BmNPV組死亡率分別為60％，70％；BmNPV陽性對照組死亡率100％；E.coliOrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+BmNPV對照組死亡率為100％?？咕腜en24能有效地抑制BmNPV對五齡家蠶幼蟲感染，具有抗BmNPV病毒感染的生物活性。
實施例11 基因工程重組對蝦肽Pen24抗苜宿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)感染的生物活性采用舔食法，檢測基因工程重組對蝦肽Pen24抗苜宿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)感染銀紋夜蛾幼蟲的影響。
1.樣品的制備(1)苜宿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)樣品的制備苜宿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)粗提液經(jīng)蔗糖梯度純化，于顯微鏡下計數(shù)，AcNPV含量為1.1×109PIB/mL。
(2)E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液樣品制備菌種E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)經(jīng)發(fā)酵，收集菌體。100克濕菌體用500mL PBS Buffer重懸，超聲波破碎，離心，取上清。
(3)E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液樣品制備菌種E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))經(jīng)發(fā)酵，收集菌體。100克濕菌體用500mL PBS Buffer重懸，超聲波破碎，離心，取上清。
2.Pen24抗苜宿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)感染生物活性測定選擇1.1×104PIB/mL AcNPV作為病毒感染劑量。將銀紋夜蛾飼養(yǎng)于26℃，用人工飼料飼養(yǎng)。將三齡銀紋夜蛾幼蟲分成4組，分別用下述4種樣品添食感染①E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+AcNPV組E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液樣品與AcNPV懸液混合，26℃下作用1h后，按300μL涂于1cm3人工飼料表面，喂養(yǎng)銀紋夜蛾幼蟲。
②E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+AcNPV組E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液樣品與AcNPV懸液混合，26℃下作用1h后，按300μL涂于1cm3人工飼料表面，喂養(yǎng)銀紋夜蛾幼蟲。
③AcNPV陽性對照組AcNPV懸液按300μL涂于1cm3人工飼料表面，喂養(yǎng)銀紋夜蛾幼蟲。
④PBS Buffer對照組PBS Buffer懸液按300μL涂于1cm3人工飼料表面，喂養(yǎng)銀紋夜蛾幼蟲。
銀紋夜蛾幼蟲于20-25℃條件下飼養(yǎng)，感染AcNPV病毒三天后，每天喂食新鮮人工飼料，一天兩次記錄銀紋夜蛾幼蟲死亡情況。
結(jié)果見附圖8。結(jié)果表明，第5天，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+AcNPV組死亡率為58％；AcNPV陽性對照組死亡率為84％；E.coliOrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+AcNPV對照組死亡率為92％。第7天，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+AcNPV組死亡率為75％；AcNPV陽性對照組死亡率100％；E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+AcNPV對照組死亡率為100％。抗菌肽Pen24能有效地抑制AcNPV對三齡銀紋夜蛾幼蟲的感染，具有抗AcNPV病毒感染的生物活性。
實施例12 基因工程重組對蝦肽Pen24抗棉鈴蟲核形多角體病毒(HaNPV)感染的生物活性采用舔食法，檢測基因工程重組對蝦肽Pen24抗棉鈴蟲核形多角體病毒(HaNPV)感染棉鈴蟲幼蟲的影響。
1.樣品的制備
(1)棉鈴蟲核形多角體病毒(HaNPV)樣品的制備棉鈴蟲核形多角體病毒(HaNPV)粗提液經(jīng)蔗糖梯度純化，于顯微鏡下計數(shù)，HaNPV含量為1.5×109PIB/mL。
(2)E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液樣品制備菌種E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)經(jīng)發(fā)酵，收集菌體。100克濕菌體用500mL PBS Buffer重懸，超聲波破碎，離心，取上清。
(3)E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液樣品制備菌種E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))經(jīng)發(fā)酵，收集菌體。100克濕菌體用500mL PBS Buffer重懸，超聲波破碎，離心，取上清。
2.Pen24抗棉鈴蟲核形多角體病毒(HaNPV)感染生物活性測定選擇1.5×104PIB/mL HaNPV作為病毒感染劑量。將棉鈴蟲飼養(yǎng)于26℃，用人工飼料飼養(yǎng)。將三齡棉鈴蟲幼蟲分成4組，分別用下述4種樣品添食感染①E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+HaNPV組E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液樣品與HaNPV懸液混合，26℃下作用1h后，按300μL涂于1cm3人工飼料表面，喂養(yǎng)棉鈴蟲幼蟲。
②E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+HaNPV組E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液樣品與HaNPV懸液混合，26℃下作用1h后，按300μL涂于1cm3人工飼料表面，喂養(yǎng)棉鈴蟲幼蟲。
③HaNPV陽性對照組HaNPV懸液按300μL涂于1cm3人工飼料表面，喂養(yǎng)棉鈴蟲幼蟲。
④PBS Buffer對照組PBS Buffer懸液按300μL涂于1cm3人工飼料表面，喂養(yǎng)棉鈴蟲幼蟲。
棉鈴蟲幼蟲于20-25℃條件下飼養(yǎng)，感染HaNPV病毒三天后，每天喂食新鮮人工飼料，一天兩次記錄棉鈴蟲幼蟲死亡情況。
結(jié)果見附圖9。結(jié)果表明，第4天，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+HaNPV組死亡率為33％；HaNPV陽性對照組死亡率為75％；E.coliOrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+HaNPV對照組死亡率為75％。第5天，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+HaNPV組死亡率為67％；HaNPV陽性對照組死亡率為92％；E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+HaNPV對照組死亡率為92％。第6天，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+HaNPV組死亡率為83％；HaNPV陽性對照組死亡率100％；E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+HaNPV對照組死亡率為100％?？咕腜en24能有效地抑制HaNPV對三齡棉鈴蟲幼蟲的感染，具有抗HaNPV病毒感染的生物活性。
實施例13 基因工程重組對蝦肽Pen24抗甜菜夜蛾核形多角體病毒(SeMNPV)感染的生物活性采用舔食法，檢測基因工程重組對蝦肽Pen24抗甜菜夜蛾核形多角體病毒(SeMNPV)感染甜菜夜蛾幼蟲的影響。
1.樣品的制備(1)甜菜夜蛾核形多角體病毒(SeMNPV)樣品的制備甜菜夜蛾核形多角體病毒(SeMNPV)粗提液經(jīng)蔗糖梯度純化，于顯微鏡下計數(shù)，SeMNPV含量為7.8×109PIB/mL。
(2)E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液樣品制備菌種E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)經(jīng)發(fā)酵，收集菌體。100克濕菌體用500mL PBS Buffer重懸，超聲波破碎，離心，取上清。
(3)E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液樣品制備菌種E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))經(jīng)發(fā)酵，收集菌體。100克濕菌體用500mL PBS Buffer重懸，超聲波破碎，離心，取上清。
2.Pen24抗甜菜夜蛾核形多角體病毒(SeMNPV)感染生物活性測定選擇7.8×104PIB/mL SeMNPV作為病毒感染劑量。將甜菜夜蛾飼養(yǎng)于26℃，用人工飼料飼養(yǎng)。將三齡甜菜夜蛾幼蟲分成4組，分別用下述4種樣品添食感染①E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+SeMNPV組E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液樣品與SeMNPV懸液混合，26℃下作用1h后，按300μL涂于1cm3人工飼料表面，喂養(yǎng)甜菜夜蛾幼蟲。
②E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+SeMNPV組E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液樣品與SeMNPV懸液混合，26℃下作用1h后，按300μL涂于1cm3人工飼料表面，喂養(yǎng)甜菜夜蛾幼蟲。
③SeMNPV陽性對照組SeMNPV懸液按300μL涂于1cm3人工飼料表面，喂養(yǎng)甜菜夜蛾幼蟲。
④PBS Buffer對照組PBS Buffer懸液按300μL涂于1cm3人工飼料表面，喂養(yǎng)甜菜夜蛾幼蟲。
甜菜夜蛾幼蟲于20-25℃條件下飼養(yǎng)，感染SeMNPV病毒三天后，每天喂食新鮮人工飼料，一天兩次記錄甜菜夜蛾幼蟲死亡情況。
結(jié)果見附圖10。結(jié)果表明，第4天，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+SeMNPV組死亡率為58％；SeMNPV陽性對照組死亡率為75％；E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+SeMNPV對照組死亡率為75％。第5天，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+SeMNPV組死亡率為58％；SeMNPV陽性對照組死亡率為100％；E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+SeMNPV對照組死亡率為100％。第7天，E.coliOrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+SeMNPV組死亡率為75％；SeMNPV陽性對照組死亡率100％；E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+SeMNPV對照組死亡率為100％?？咕腜en24能有效地抑制SeMNPV對三齡甜菜夜蛾幼蟲的感染，具有抗SeMNPV病毒感染的生物活性。
實施例14 基因工程重組對蝦肽Pen24抗對蝦白斑綜合癥病毒感染的生物活性1.樣品的制備和處理(1)對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)樣品的制備將-20℃凍存的經(jīng)對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)感染的克氏原螯蝦置冰上，取頭胸部(腮、肝、心臟等器官)，用手術(shù)剪刀剪成小塊，放入玻璃勻漿器內(nèi)，冰浴勻漿。勻漿液12000r/min 4℃離心20min，上清液用0.45μm濾膜過濾除菌，分裝1.5ml EP管-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 用上述WSSV病毒懸液，用150μl/頭WSSV懸液注射克氏原螯蝦，22-24℃感染，結(jié)果6.5天內(nèi)全部死亡。用100μl/頭WSSV懸液注射克氏原螯蝦，22-24℃感染，結(jié)果9天內(nèi)全部死亡。我們選擇0.1mL WSSV病毒懸液為基因工程重組對蝦肽Pen24抗對蝦白斑綜合癥病毒感染體實驗的WSSV病毒感染劑量。
(2)四種試驗樣品的處理①基因工程重組對蝦肽Pen24純化樣品試驗組樣品將定量的1mg/mL重組對蝦肽Pen24純化樣品與WSSV病毒懸液等體積混勻，26℃下作用1h。
②E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液樣品制備和處理菌種E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))經(jīng)發(fā)酵，收集菌體。100克濕菌體用500mL PBS Buffer重懸，超聲波破碎，離心，取上清。將破碎上清液與WSSV病毒懸液等體積混勻，26℃下作用1h。
③WSSV陽性對照組樣品WSSV病毒懸液用PBS稀釋1倍，26℃下作用1h。
④健康對照組樣品PBS Buffer。
2.Pen24抗對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)感染生物活性測定克氏原螯蝦于22-24℃于室溫飼養(yǎng)，對蝦餌料(0號)購于湛江粵華水產(chǎn)飼料有限公司。將克氏原螯蝦分成4組，分別用上述4種試驗樣品注射克氏原螯蝦。劑量0.15mL/尾，每組25尾，兩個重復(fù)。在自然氣溫(15～22℃)的條件下養(yǎng)殖，每天換水并投喂人工蝦飼料一次，一天兩次記錄螯蝦死亡的情況。
結(jié)果見表3和附圖11。室溫(20-25℃)飼養(yǎng)的結(jié)果顯示，克氏原螯蝦于22-24℃養(yǎng)殖，在第4天，基因工程重組對蝦肽Pen24樣品試驗組無死亡；WSSV陽性對照組組死亡率為15％；E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液組死亡率為20％。第9天，WSSV陽性對照組和E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液組死亡率均為100％，基因工程重組對蝦肽Pen24純化樣品試驗組死亡率為85％，有15％的存活率。表明基因工程重組對蝦肽Pen24在克氏原螯蝦體內(nèi)能較有效地抵抗WSSV的感染，具有抗WSSV病毒感染的生物活性。
表3重組對蝦肽Pen24抗WSSV感染的測定

序列表1SEQUENCE LISTING<110>武漢大學(xué)<120>一種表達(dá)重組對蝦肽Pen24的基因工程菌株及應(yīng)用<130>一種重組對蝦肽Pen24核苷酸序列<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>657<212>DNA<213>重組DNA<220>
<221>CDS<222>(1)..(657)<223>
<400>1atg agc gat aaa att att cac ctg act gac gac agt ttt gac acg gat 48Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp1 5 10 15gta ctc aaa gcg gac ggg gcg atc ctc gtc gat ttc tgg gca gag tgg 96Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp20 25 30tgc ggt ccg tgc aaa atg atc gcc ccg att ctg gat gaa atc gct gac144Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp35 40 45gaa tat cag ggc aaa ctg acc gtt gca aaa ctg aac atc gat caa aac192Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn50 55 60cct ggc act gcg ccg aaa tat ggc atc cgt ggt atc ccg act ctg ctg240Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu65 70 75 80ctg ttc aaa aac ggt gaa gtg gcg gca acc aaa gtg ggt gca ctg tct288Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser85 90 95aaa ggt cag ttg aaa gag ttc ctc gac gct aac ctg gcc ggt tct ggt336Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly100 105 110tct ggc cat atg cac cat cat cat cat cat tct tct ggt ctg gtg cca384Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
115 120 125cgc ggt tct ggt atg aaa gaa acc gct gct gct aaa ttc gaa cgc cag432Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln130 135 140cac atg gac agc cca gat ctg ggt acc gac gac gac gac aag gcc atg480His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met145 150 155 160gct gat atc gga tcc gaa ttc tac agg ggc ggt tac aca ggc ccg ata528Ala Asp Ile Gly Ser Glu Phe Tyr Arg Gly Gly Tyr Thr Gly Pro Ile165 170 175ccc agg cca cca ccc att gga aga cca ccg ttc aga cct gtt tgc aat576Pro Arg Pro Pro Pro Ile Gly Arg Pro Pro Phe Arg Pro Val Cys Asn180 185 190gca tgc tac aga ctt tcc gtc tca gat gct cgc aat tgc tgc atc aag624Ala Cys Tyr Arg Leu Ser Val Ser Asp Ala Arg Asn Cys Cys Ile Lys195 200 205ttc gga agc tgt tgt cac tta gta aaa gga taa657Phe Gly Ser Cys Cys His Leu Val Lys Gly210 215<210>2<211>218<212>PRT<213>重組DNA<400>2Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp1 5 10 15Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp20 25 30Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp35 40 45Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn50 55 60Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu65 70 75 80Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser85 90 95Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly100 105 110Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro115 120 125
Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln130 135 140His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met145 150 155 160Ala Asp Ile Gly Ser Glu Phe Tyr Arg Gly Gly Tyr Thr Gly Pro Ile165 170 175Pro Arg Pro Pro Pro Ile Gly Arg Pro Pro Phe Arg Pro Val Cys Asn180 185 190Ala Cys Tyr Arg Leu Ser Val Ser Asp Ala Arg Asn Cys Cys Ile Lys195 200 205Phe Gly Ser Cys Cys His Leu Val Lys Gly210 215
序列表2SEQUENCE LISTING<110>武漢大學(xué)<120>一種表達(dá)重組對蝦肽Pen24的基因工程菌株及應(yīng)用<130>一種重組對蝦肽Pen24氨基酸序列<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>218<212>PRT<213>重組蛋白質(zhì)<400>1Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp1 5 10 15Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp20 25 30Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp35 40 45Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn50 55 60Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu65 70 75 80Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser85 90 95Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly100 105 110Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro115 120 125Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln130 135 140His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met145 150 155 160Ala Asp Ile Gly Ser Glu Phe Tyr Arg Gly Gly Tyr Thr Gly Pro Ile165 170 175Pro Arg Pro Pro Pro Ile Gly Arg Pro Pro Phe Arg Pro Val Cys Asn180 185 190Ala Cys Tyr Arg Leu Ser Val Ser Asp Ala Arg Asn Cys Cys Ile Lys195 200 205Phe Gly Ser Cys Cys His Leu Val Lys Gly210 21權(quán)利要求
1.一種基因工程表達(dá)、分離和純化的重組對蝦肽Pen24，其具有與序列表2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列。
2.一種基因工程表達(dá)、分離和純化的重組對蝦肽Pen24，其具有與序列表2所示氨基酸序列至少80％同源性的序列。
3.一種基因工程表達(dá)、分離和純化的重組對蝦肽Pen24，其具有與序列表2所示氨基酸序列至少90％同源性的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述的蛋白質(zhì)的分子量為24千道爾頓。
5.一種基因工程表達(dá)、分離和純化的重組對蝦肽Pen24，其具有與序列表1所示核苷酸序列至少50％同源性的序列。
6.一種基因工程表達(dá)、分離和純化的重組對蝦肽Pen24，其具有與序列表1所示核苷酸序列至少80％同源性的序列。
7.一種DNA片斷，其特征在于包括如權(quán)利要求5或6所述的核苷酸序列。
8.一種基因工程菌株，其特征在于包含如權(quán)利要求5或6所述的核苷酸序列。
9.一種表達(dá)重組對蝦肽Pen24基因工程菌株，其特征在于所述的菌株是基因工程菌株E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)，CCTCC NoM206003。
10.一種表達(dá)重組對蝦肽Pen24的基因工程菌株的構(gòu)建方法，它包括下列步驟A、美白對蝦總RNA的提取及cDNA第一條鏈的合成采集南美白對蝦血淋巴，獲得血細(xì)胞，提取總RNA，并按Promega公司Universal Riboclone cDNASynthesis System試劑盒操作手冊進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈；B、PCR擴(kuò)增Penaeidin-2基因以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一條鏈為模板，上游引物P15′GAATTCTACAGGGGCGGTTACACA 3′；下游引物P23′GTGAATCATTTTCCTATTTTCGAA 5′，利用PCR儀擴(kuò)增，獲得168bp目的基因；C、重組質(zhì)粒pGEM-T/Pen的構(gòu)建和鑒定回收PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T載體上，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含X-gal、IPTG和Amp抗性的LB平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，用PCR和限制性內(nèi)切酶酶切鑒定、DNA測序分析鑒定重組質(zhì)粒pGEM-T/Pen；D、重組表達(dá)質(zhì)粒pET-pen的構(gòu)建和鑒定用EcoR I、Hind III分別雙酶切表達(dá)載體pET-32a(+)和重組子pGEM-T/Pen質(zhì)粒DNA，將Penaeidin-2基因定向插入表達(dá)載體pET-32a(+)，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET-pen，轉(zhuǎn)化E.coli Origami B(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞獲得大腸桿菌重組基因工程菌株E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)，用PCR和限制性內(nèi)切酶酶切鑒定、DNA測序分析鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒pET-pen。
11.重組對蝦肽Pen24在抗細(xì)菌感染中的應(yīng)用。
12.重組對蝦肽Pen24在抗真菌感染中的應(yīng)用。
13.重組對蝦肽Pen24在抗病毒感染中的應(yīng)用。
14.重組對蝦肽Pen24作為防腐劑在化妝品中的應(yīng)用。
15.重組對蝦肽Pen24作為防腐劑在食品中的應(yīng)用。
16.重組對蝦肽Pen24作為防腐劑在動物飼料中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種表達(dá)重組對蝦肽Pen24基因工程菌株及應(yīng)用，編碼該Pen24的核苷酸和氨基酸序列，表達(dá)重組對蝦肽Pen24的基因工程菌株E.coliOrigamiB(DE3) pLysS(pET－pen)，CCTCC NoM206003，利用工程菌株表達(dá)重組對蝦肽Pen24。Pen24對革蘭氏陽性細(xì)菌、陰性細(xì)菌；抗氨芐青霉素的大腸桿菌和強(qiáng)致病性細(xì)菌，如枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和綠膿桿菌等均有很好的抗菌活性。Pen24對病毒感染具有明顯的抗病毒活性。Pen24在治療或預(yù)防動物和植物的細(xì)菌、真菌和病毒病中的應(yīng)用，作為防腐劑在化妝品、食品和動物飼料中應(yīng)用。
文檔編號C12N1/21GK1896238SQ20061001936
公開日2007年1月17日 申請日期2006年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月15日
發(fā)明者徐進(jìn)平, 孟小林, 王健, 魯偉, 付百玲 申請人:武漢大學(xué)