專利名稱：：肽的重組產(chǎn)生的制作方法肽的重組產(chǎn)生本發(fā)明涉及重復(fù)自組裝前體蛋白質(zhì)、編碼其的核酸序列及表達構(gòu)建體、及通過使用此類前體蛋白質(zhì)重組產(chǎn)生肽的方法。
背景技術(shù)：
：存在不同已知方法通過生物技術(shù)手段來產(chǎn)生肽。因為短的多肽鏈在微生物宿主細胞中之穩(wěn)定性通常較低，且因為此類游離肽可對宿主生物產(chǎn)生可能毒性作用(例如抗微生物肽)，所以大多數(shù)方法包含產(chǎn)生較大前體蛋白質(zhì)，在純化前體蛋白質(zhì)之后自該前體蛋白質(zhì)切除肽。獲得穩(wěn)定前體蛋白質(zhì)之一可能性包含借助于融合蛋白質(zhì)表達肽以及穩(wěn)定蛋白質(zhì)。該融合蛋白質(zhì)之性質(zhì)極大地影響后續(xù)處理步驟，其由基本上與肽序列無關(guān)之融合配偶體決定，且因此可易于控制且適于產(chǎn)生具有不同序列之肽。WO2008/085543描述一種借助于融合蛋白質(zhì)產(chǎn)生蛋白質(zhì)及肽之特殊方法。此融合蛋白質(zhì)除所需肽序列以外亦包含融合配偶體，該融合配偶體確保融合蛋白質(zhì)具有逆相變行為。此行為首先涉及以簡單且廉價之方式自細胞環(huán)境中純化融合蛋白質(zhì)。其次，在已通過蛋白質(zhì)裂解將肽移除之后，同樣可以簡單且廉價之方式移除該融合配偶體。雖然融合蛋白質(zhì)?？梢詢?yōu)良產(chǎn)率獲得，但前體蛋白質(zhì)之肽部分通常較小，且因此此過程之效率并非最佳。另一方法涉及重復(fù)前體蛋白質(zhì)，其包含重組產(chǎn)生之所需肽的多個拷貝。W003/089455描述多聚前體蛋白質(zhì)之產(chǎn)生，通過酸裂解自此類多聚前體蛋白質(zhì)中切除具有抗微生物性質(zhì)之所需肽序列。存在許多其他公開方法(實例Metlitskaya等人，BiotechnolAppl.Biochem39；339-345(2004);Wang及CaiAppl.BiochemandBiotechnol.141;203_213(2007))，其用于證明肽序列或肽序列家族可通過特定方法借助于重復(fù)前體蛋白質(zhì)來產(chǎn)生。在某種程度上，已描述位于所需肽序列之重復(fù)序列之間的特點輔助序列之用途。更具體地，已提出陰離子輔助序列，其明顯減少重復(fù)前體蛋白質(zhì)內(nèi)之陽離子抗微生物肽序列對宿主細胞之有害作用(參看例如WO00/31279及US2003/0219854)。雖然此重復(fù)方法中之前體蛋白質(zhì)的所需肽序列比例比融合蛋白質(zhì)之情況高，但所需陽離子肽序列極大地影響此類重復(fù)前體蛋白質(zhì)之性質(zhì)。本發(fā)明人并不了解涉及根據(jù)可以有效方式進行之簡單且低成本方案借助于重復(fù)前體蛋白質(zhì)產(chǎn)生任何肽序列之可能性的任何先前方法。各種抗微生物肽已描述于文獻中且概括于評述中(Hancock,R.E.W.及Lehrer,R.1998,TrendsinBiotechnology,16:82-88；Hancock,R.E.ff.及Sahl,H.G.2006,NatureBiotechnology,24:1551-1557)。文獻中亦描述組合兩種活性肽之融合肽。Wade等人報導(dǎo)刻克羅普斯蠶蛾(Hyalophoracecropia)殺菌肽(cecropin)A與毒性蜂毒肽之各種融合物的抗菌作用(Wade,D.等人·，1992,InternationalJournalofPeptideandProteinResearch,40:429-436)。Shin等人描述由20個氨基酸組成的刻克羅普斯蠶蛾殺菌肽A與光滑爪蟾(XenopusIaevis)爪蟾抗菌肽(magainin)2之融合肽的抗菌作用。殺菌肽A由37個氨基酸組成且顯示出其對抗革蘭氏陰性細菌(Gram-negativebacteria)之活性低于對抗革蘭氏陽性細菌之活性。爪蟾抗菌肽2由23個氨基酸組成且對細菌以及腫瘤細胞系具有活性。與天蠶抗菌肽A與蜂毒肽之融合物相比，此融合物顯示在可比抗菌作用下明顯較低之溶血活性(Shin,S.Y.Kang,J.H.,Lee,Μ.Κ.,Kim,S.Y.,Kim,Y.,Hahm,K.S.,1998,BiochemistryandMolecularBiologyInternational，44:1119-1126)。US2003/0096745Al及US6，800,727B2要求保護由20個氨基酸組成之此等融合肽，及因氨基酸取代、尤其帶正電荷氨基酸及疏水性氨基酸之取代而帶更多正電荷且疏水性更強的該融合物之變體。Shin等人,1999描述此天蠶抗菌肽A-爪蟾抗菌肽2融合肽之進一步發(fā)展。他們證明具有SEQIDNO:6之肽的溶血活性比起始融合物低，但其對大腸桿菌(Escherichiacoli)及枯草桿菌(Bacillussubtilis)之抗菌活性未受到不利影響(Shin等人，1999JournalofPeptideResearch,53:82_90)。發(fā)明簡述因此，本發(fā)明之一目標為提供一種借助于重復(fù)前體蛋白質(zhì)產(chǎn)生肽之廣泛適用方法。通過一種經(jīng)由生物技術(shù)手段產(chǎn)生肽之新穎方法來實現(xiàn)此目標，其中以可預(yù)期方式產(chǎn)生包含高比例所需肽序列且包含控制前體蛋白質(zhì)性質(zhì)之輔助序列的重復(fù)前體蛋白質(zhì)。該方法可用于產(chǎn)生不同肽序列而無需針對不同肽序列之每一者在根本上重建使前體分子表達之條件或后續(xù)處理程序。此外，可能產(chǎn)生出先前所用方法無效率產(chǎn)生之肽。附圖簡述圖I描繪借助于投影α螺旋結(jié)構(gòu)獲得之氨基酸序列之螺旋輪表示。重復(fù)前體蛋白質(zhì)中所包含之氨基酸序列Α1-Α7(A)描繪于環(huán)(B)上。此排列顯現(xiàn)出α-螺旋中氨基酸之位置圖2描繪在酸裂解之后肽“ΖηΟ”之逆相層析圖；圖3描繪在酸裂解及反相HPLC之后“ΖηΟ”肽之質(zhì)譜；所示數(shù)值表示特定單同位素峰之m/z值；圖4描繪在酸裂解及陽離子交換層析之后肽“P18”之反相層析圖；圖5描繪在酸裂解、陽離子交換層析及反相HPLC之后“P18”肽之質(zhì)譜；所示數(shù)值指示特定單同位素峰之m/z值；圖6描繪在酸裂解之后肽“Min”之反相層析圖；圖7描繪在酸裂解及反相HPLC之后“Min”肽之質(zhì)譜；所示數(shù)值指示特定單同位素峰之m/z值；圖8描繪在酸裂解及陽離子交換層析之后肽SEQIDNO6之反相層析圖；圖9描繪在酸裂解、陽離子交換層析及反相HPLC之后肽SEQIDNO6之質(zhì)譜；所示數(shù)值為具體單同位素峰之m/z值；圖10描繪在根據(jù)實施例6進行酰胺化之前及之后肽“P18”之HPLC陽離子交換層析圖；出于比較之目的，展示具有肽“P18”序列之以化學(xué)方式合成且酰胺化之參考肽的層析圖；圖11描繪在根據(jù)實施例7進行酰胺化之前及之后肽“P18”之HPLC陽離子交換層析圖；出于比較之目的，展示具有肽“P18”序列之以化學(xué)方式合成且酰胺化之參考肽的層析圖。優(yōu)選實施方案本發(fā)明尤其涉及以下實施方案I.一種合成、尤其重組產(chǎn)生之前體蛋白質(zhì)，其包含所需肽(Pep)組件與輔助肽(Aux)組件之重復(fù)單元的以酶促及/或化學(xué)方式可裂解之重復(fù)序列，通式如下(Pep-Aux)x或(Aux-Pep)X其中X>1，其中此類Aux組件為相同或不同的且包含賦予該前體蛋白質(zhì)自組裝性質(zhì)之氨基酸序列組件；且此類Pep組件為相同或不同的且包含相同或不同肽分子之氨基酸序列。2.如實施方案I之前體蛋白質(zhì)，其中此類組件Pep與Aux直接或經(jīng)由可裂解之肽序列以肽鍵連接彼此，且該肽鍵可以化學(xué)方式或酶促方式特異性裂解，亦即，僅僅或主要在確定氨基酸位置或確定氨基酸序列處裂解。3.如前述實施方案中任一實施方案之前體蛋白質(zhì)，其具有自組裝性質(zhì)以使自發(fā)(亦即自行)或經(jīng)誘導(dǎo)形成穩(wěn)定之非共價締合物，此類締合物在標準條件下，如尤其在室溫下，無法在一小時內(nèi)由O.2MNaOH溶解，或無法在10分鐘內(nèi)由2M尿素或Im鹽酸胍溶解。本發(fā)明之穩(wěn)定締合物由所提及之此三種標準中之至少一者被滿足而產(chǎn)生。4.如前述實施方案中任一實施方案之前體蛋白質(zhì)，其中至少一個Aux組件包含自組裝肽(SA)組件，其中該SA組件包含至少一個具有至少8個，諸如8-10、8-12、8-14、8-16、8-18或8-20個連續(xù)氨基酸之序列基序，該序列基序包含至少50%、例如50-10060-90%或70-80%之丙氨酸殘基，至少50%、例如50-100%、60-90%或70-80%之纈氨酸殘基，或至少50%、例如50-100%、60-90%或70-80%之谷氨酰胺殘基，或至少80%之序列基序由此等殘基中至少一個組成；該SA組件可尤其包含例如至少一種以下序列基序An(基序I)(GA)m(基序2)Vn(基序3)(VA)m(基序4)(WAA)。(基序5)其中A為丙氨酸，G為甘氨酸，V為纈氨酸，η為2至12之整數(shù)，m為2至10之整數(shù)，且ο為I至6之整數(shù),其中更具體地，n=5-10,m=4-8且ο=2-4,舉例而言,η=7-9,m=6-7且ο=2-3ο上述SA序列在各情況下可在C端及/或N端上延長另外I至3個隨機氨基酸殘基。適合N端延長之實例為序列基序“G-”，“GS-”，“GAG-”，“GPG-”，“GPS-”，“GAS-”，“GQQ_”和“GSS-”；適合C端延長的實例包含序列基序“-SGP”，“-GGA”，“-GPG”，“-SGA”，“-GGQ”，“-GGY”及“-GGL”。5.如實施方案4之前體蛋白質(zhì)，其中該SA組件包含選自氨基酸序列SEQIDNOI至SEQIDNO:5或SEQIDNO73之氨基酸序列。6.如前述實施方案中任一實施方案之前體蛋白質(zhì)，其中至少一個Aux肽另外包含保護性肽(SU)組件。7.如實施方案6之前體蛋白質(zhì)，其中該SU組件具有“比例增加”之帶電氨基酸殘基，亦即(例如在PH=7下)非O之總帶電量，例如+20至-20或+10至-10或+5至-5，尤其帶負電荷氨基酸殘基，例如在pH=7下，非O之總帶電量，例如-I至-20，尤其-4至-10。8.如實施方案7之前體蛋白質(zhì)，其中該前體蛋白質(zhì)中之SU組件能夠形成兩親性螺旋結(jié)構(gòu)。9.如實施方案8之前體蛋白質(zhì)，其中該SU組件為兩親性肽，其包含能夠形成兩親性α-螺旋之具有至少七個以肽鍵連接之氨基酸的序列區(qū)段，其中該螺旋之氨基酸殘基在垂直投影中分為該螺旋之疏水性半部及親水性半部，在該垂直投影中該螺旋之疏水性半部具有至少3個、例如3或4個相鄰的相同或不同疏水性氨基酸殘基，且在該垂直投影中該螺旋之親水性半部具有至少3個、例如3或4個相鄰的相同或不同親水性氨基酸殘基。10.如實施方案7、8或9之前體蛋白質(zhì)，其中選擇該SU組件之帶電氨基酸殘基之比例，使得在PH=7下該前體蛋白質(zhì)之總凈電荷大于-10且小于+10，例如大于-8且小于+8,大于-5,尤其小于+5,大于-2且小于+2。11.如實施方案7至10中任一實施方案之前體蛋白質(zhì)，其中該SU組件包含選自氨基酸序列SEQIDNO:16至SEQIDNO:19及SEQIDNO68之氨基酸序列。12.如前述實施方案中任一實施方案之前體蛋白質(zhì)，其中該Pep組件包含具有陽離子總正電荷之抗微生物肽序列。13.如實施方案12之前體蛋白質(zhì)，其中該P印組件包含選自陽離子氨基酸序列SEQIDNO6至SEQIDNO:15、SEQIDNO23,SEQIDNO26及SEQIDNO69至SEQIDNO72或任何以下所示其在C端及/或N端上經(jīng)修飾之形式的氨基酸序列。14.如實施方案I至5中任一實施方案之前體蛋白質(zhì)，其中該Pep肽包含選自氨基酸序列SEQIDNO:20或SEQIDNO:29至67或任何以下所示其在C端及/或N端經(jīng)修飾之形式的氨基酸序列。15.如前述實施方案中任一實施方案之前體蛋白質(zhì)，其中該Aux組件彼此獨立地具有任一以下含義SA,SA-SU，SU-SA，SA-SU-SA，SU-SA-SU,其中此類組件SA與SU以肽鍵連接彼此，且此類Aux組件在末端以肽鍵連接于至少一個Pep組件，亦即直接或經(jīng)由可裂解之肽序列連接，其中至少連接于此類Pep組件之該肽鍵可以化學(xué)方式或酶促方式特異性裂解。16.一種核酸序列,其編碼至少一種如前述實施方案中任一實施方案之前體蛋白質(zhì)。17.如實施方案16之核酸序列，其包含SEQIDNO:21、24、27、74及76中至少一種編碼序列。18.一種表達盒,其包含至少一種如實施方案16或17之核酸序列,該至少一種核酸序列可操作地連接于至少一種調(diào)節(jié)核酸序列。19.一種用于使真核或原核宿主轉(zhuǎn)化之重組載體，其包含如實施方案16及17中任一實施方案之核酸序列或如實施方案18之表達盒。20.一種產(chǎn)生所需肽(P印)之方法，其包含a)產(chǎn)生如實施方案I至15中任一實施方案之前體蛋白質(zhì)，及b)自該前體蛋白質(zhì)移除此類Pep肽，c)該肽可任選地以酶促方式或化學(xué)方式修飾，例如可經(jīng)酰胺化、酯化、氧化、烷基化或(例如經(jīng)由天然化學(xué)連接反應(yīng)或經(jīng)由邁克爾加成反應(yīng))可連接于另一分子；其中例如該肽可借助于增強該肽之疏水性的分子來修飾，例如經(jīng)含有烷基之分子修飾；其中該修飾可在該肽之任選純化步驟之前或之后進行，如以下實施例中所說明。適合燒基為例如C2-C16燒基，如乙基、異丙基或正丙基、正丁基、異丁基、伯丁基或·叔丁基、正戊基或異戊基；此外，為正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正i^一烷基、正十二烷基、正十三院基、正十四烷基、正十五烷基及正十六烷基以及其單一或多分支類似物；以及其未取代或經(jīng)取代之修飾物，該修飾物含有一或多個、例如1、2或3個鹵素(例如F、Cl、Br)、羥基、巰基、氨基或C1-C4-烷基氨基取代基或其可在該烷基鏈中被一或多個、例如1、2或3個如O或N之雜原子中斷。C1-C4烷基尤其表示甲基、乙基、異丙基或正丙基、正丁基、異丁基、伯丁基或叔丁基。21.如實施方案20之方法，其中在攜帶至少一個如實施方案19之載體的重組微生物中產(chǎn)生該前體蛋白質(zhì)。22.如實施方案21之方法，其中在重組大腸桿菌菌株中產(chǎn)生該前體蛋白質(zhì)。23.如實施方案20至22中任一實施方案之方法，其中任選在該表達之前體蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定締合形式之后，將其純化且以化學(xué)方式或酶促方式裂解以釋放該所需肽(Pep)。24.一種前體蛋白質(zhì)，其包含所需肽(P印)組件及輔助肽(Aux')組件之可裂解序列，通式如下(Pep-Aux')x或(Aux,-Pep)X其中X>1，其中此類Aux'組件為相同或不同的且包含形成兩親性α-螺旋之肽，該兩親性肽包含能夠形成兩親性α螺旋之具有至少七個以肽鍵連接之氨基酸的序列區(qū)段，其中該螺旋之氨基酸殘基在垂直投影中分為該螺旋之疏水性半部及親水性半部，在該垂直投影中該螺旋之疏水性半部具有至少3個、例如3或4個相鄰的相同或不同疏水性氨基酸殘基，且在該垂直投影中該螺旋之親水性半部具有至少3個、例如3或4個相鄰的相同或不同親水性氨基酸殘基；且此類Pep組件為相同或不同的且包含相同或不同肽分子之氨基酸序列。25.如實施方案24之前體蛋白質(zhì)，其中此類Aid^組件包含至少一個如實施方案4及5中之任一者中所定義之自組裝肽(SA)組件。26.如實施方案24或25之前體蛋白質(zhì)，其中該所需肽(P印)為陽離子抗微生物肽，且該Aux'組件為形成兩親性α-螺旋之陰離子肽。27.一種兩親性肽之用途，其作為保護性肽用于重組產(chǎn)生與其不同之所需抗微生物肽，其中該兩親性肽包含能夠形成兩親性α螺旋之具有至少七個以肽鍵連接之氨基酸的序列區(qū)段，其中該螺旋之氨基酸殘基在垂直投影中分為該螺旋之疏水性半部及親水性半部，該螺旋之疏水性半部具有至少3個相鄰(在該垂直投影中)的相同或不同之疏水性氨基酸殘基，且該螺旋之親水性半部具有至少3個相鄰(在該垂直投影中)的相同或不同之親水性氨基酸殘基。28.如實施方案27之用途，其中該所需肽(P印)為陽離子抗微生物肽，且該Aux'組件為形成兩親性α-螺旋之陰離子肽。29.如實施方案20至22中任一實施方案之方法，其中產(chǎn)生如實施方案12或13之前體蛋白質(zhì)，諸如包含根據(jù)SEQIDΝ0:23或SEQIDNO:6之Ρ18肽結(jié)構(gòu)單元的前體蛋白質(zhì)。30.如實施方案29之方法，其包括以下處理步驟-用溶解污染蛋白質(zhì)但不溶解或基本上不溶解此類前體蛋白質(zhì)締合物之溶劑，諸如O.IM至I.OMNaOH洗滌此類締合物；-若例如Ρ18之該所需肽經(jīng)由可以酸裂解之基團并入該前體蛋白質(zhì)中，則例如用酸裂解此類前體蛋白質(zhì)。31.如實施方案30之方法，其包括至少一個以下額外處理步驟-在細胞破裂之后，用諸如磷酸之輔助沉淀劑處理此類前體蛋白質(zhì)締合物；-使用層析法純化該肽裂解反應(yīng)混合物；-用酸性溶劑或溶劑混合物洗滌該經(jīng)純化及干燥之肽。32.如實施方案20至23及29至31中任一實施方案之方法，其用于產(chǎn)生SEQIDNO23之肽，該方法包括以下處理步驟-在細胞破裂之后，通過添加85%濃度之磷酸直至pH=3來處理此類前體蛋白質(zhì)締合物；-用氫氧化鈉溶液、例如O.4MNaOH洗滌此類前體蛋白質(zhì)締合物；-以磷酸或甲酸、例如2%磷酸裂解該前體蛋白質(zhì)；-任選以己酸或99份己烷與I份乙酸之混合物洗滌該經(jīng)干燥之肽。33.如實施方案20至23及29至31中任一實施方案之方法，其用于產(chǎn)生SEQIDNO6之肽，該方法包括以下處理步驟-例如用5%H3PO4水解或裂解沉淀物；-離心；-例如借助于25%NaOH將上清液之pH值調(diào)整為約4.O；-通過陽離子交換層析純化上清液；-例如通過添加NaOH至洗脫物中來沉淀該所要肽；-離心；-使沉淀物再懸浮于水中；-例如通過添加乙酸來溶解肽；-凍干。34.本發(fā)明此外涉及P18肽(SEQIDNO23)以及SEQIDNO:6之肽及根據(jù)本發(fā)明之其產(chǎn)生及其在美容或制藥手段中用于治療或預(yù)防鱗屑、尤其頭皮屑，或用于抑制親脂性真菌、尤其馬拉色氏霉菌屬(Malasseziassp.)、尤其糠批馬拉色霉菌(Malasseziafurfur)之生長及/或活性的用途。此亦描述于例如2008年12月19日申請之先前國際申請案PCT/EP2008/010912中，本文中明確地引用該案之揭示內(nèi)容。本發(fā)明之個別方面之詳細描述I.肽本發(fā)明之肽(P印)亦可稱為“所需肽”或“目標肽”，其為2至100個、例如5至70個且尤其7至50個、例如10至40個、12至35個或15至25個氨基酸經(jīng)由肽鍵連接之氨基酸鏈。肽可包含任何α-氨基酸，尤其為蛋白質(zhì)型氨基酸。此類肽可具有特定所需生物或化學(xué)性質(zhì)以及尤其藥理學(xué)上可用之性質(zhì)。此類性質(zhì)之實例為抗微生物活性、特異性結(jié)合至某些表面、結(jié)晶過程及粒子形成中之成核性質(zhì)、控制晶體結(jié)構(gòu)、金屬或金屬離子之結(jié)合、表面活性劑性質(zhì)、乳化性質(zhì)、穩(wěn)定泡沫之性質(zhì)、影響細胞吸附。此類肽可具有一或多個此等性質(zhì)。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生抗微生物肽之方法。此類“抗微生物肽”特點為，在濃度<100μM之抗微生物肽存在下，至少一種類型之革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌及/或至少一種類型之酵母及/或至少一種類型之絲狀真菌及/或至少一種類型之藻類的生長及/或增殖受到抑制及/或各個生物之細胞遭到破壞。在一實施方案中，本發(fā)明涉及提供陽離子抗微生物肽。陽離子抗微生物肽特點為，具有如上所定義之抗微生物作用及在PH7下大于O之凈電荷。此類陽離子肽包含例如以下序列X1X2KX3X4X5KIPX10KFX6X7X8AX9KF(SEQIDNO7)其中X10為肽鍵或任一或兩個堿性或疏水性氨基酸殘基或一或兩個脯氨酸殘基，且X1至X9為除脯氨酸以外之任何堿性或疏水性氨基酸殘基；及/或其突變體或衍生物；其中存在于前體蛋白質(zhì)中之重復(fù)序列基序可為相同或不同的。在另一特定實施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生包含以下序列之肽X1X2KX3X4X5KIPX11X12KFX6X7X8AX9KF(SEQIDNO8)其中X1為賴氨酸、精氨酸或苯丙氨酸，X2為賴氨酸或色氨酸，X3為亮氨酸或賴氨酸，X4S苯丙氨酸或亮氨酸，X5為亮氨酸或賴氨酸，X6為亮氨酸或賴氨酸，X7為組氨酸或賴氨酸，X8S丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸或絲氨酸，X9為亮氨酸或賴氨酸，X11為脯氨酸或化學(xué)鍵，且X12為脯氨酸或化學(xué)鍵，及/或其突變體及衍生物；其中存在于前體蛋白質(zhì)中之重復(fù)序列基序為相同或不同的。上述序列或重復(fù)序列基序之非限制性實例為SEQIDNO:6、SEQIDNO:9_SEQIDNO15,SEQIDNO23,SEQIDNO69,SEQIDNO:71及/或其突變體或衍生物。其它適合肽亦描述于例如2008年12月19日申請之本發(fā)明人之國際申請案PCT/EP2008/010912中，本文中明確地引用該案之揭示內(nèi)容。2.重復(fù)前體蛋白質(zhì)本發(fā)明之重復(fù)前體蛋白質(zhì)特點為，在各情況下以總序列長度計，至少60%，尤其至少80%，例如60-99%、70-95%、75-85%其氨基酸序列由肽重復(fù)單元(如下文中所定義)組成。剩余部分可包含例如非重復(fù)肽，諸如信號肽、標簽等等。3.重復(fù)單元肽重復(fù)單元包含至少一種根據(jù)本發(fā)明有利地產(chǎn)生之肽且原則上如下構(gòu)建(Pep-Aux)X或(Aux-Pep)X其中x>1，且Pep為上文所示之肽且Aux如本文中所定義。本發(fā)明之重復(fù)單元(P印-Aux或Aux-P印)為10-200個、例如20-130個及/或30-80個氨基酸長之氨基酸序列，其以相同序列形式或具有至少70%、例如至少80%且尤其至少約90%同一性(例如91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性)之特定序列之變異形式多次出現(xiàn)于前體蛋白質(zhì)中。本發(fā)明之重復(fù)前體蛋白質(zhì)因此可包含例如單一氨基酸序列或多個不同氨基酸序列(例如Pep及/或Aux結(jié)構(gòu)單元)之相同拷貝或變異形式。此外，任何數(shù)目之上述重復(fù)單元(例如1-100個、1-50個或2-32個且尤其4-16個)可在重復(fù)性前體蛋白質(zhì)中結(jié)合在一起。本發(fā)明肽在重復(fù)單元中之比例以摩爾質(zhì)量計為20%-80%，例如30%-70%。重復(fù)單元之剩余部分由Aux序列、尤其上文所定義之SA及SU序列、及任選存在之用于選擇性移除Pep結(jié)構(gòu)單元之特異性裂解序列構(gòu)成。4.輔助序列最廣泛意義上之輔助序列為本發(fā)明前體蛋白質(zhì)中影響該前體蛋白質(zhì)之性質(zhì)以便改良該前體蛋白質(zhì)之表達、穩(wěn)定性及/或處理的氨基酸序列。重復(fù)前體蛋白質(zhì)中之輔助序列可為重復(fù)單元(上文所示之Aux結(jié)構(gòu)單元)之一部分，或可附接至前體蛋白質(zhì)之氨基端或羧基端，諸如6xHis標簽(HHHHHH)、T7標簽(MASMTGGQQMG)、S標簽(KETAAAKFERQHMDS)、c-Myc標簽(EQKLISEEDL)、Strep標簽(WSHPQFEK)或HA標簽(YPYDVPDYA)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、麥芽糖結(jié)合蛋白、纖維素結(jié)合蛋白。此等及其它輔助序列描述于Terpe;ApplMicrobiolBiotechnol；60(5):523-33(2003)中。此外，輔助序列CanA(Mai,,InVitroUntersuchungenzumextrazelllllarenNetzwerkvonPyrodictiumabyssiTAGlI“[InVitroStudiesoftheExtracellularNetworkofPyrodictiumabyssiTAGlI],PhDTheses,RegensburgUniversity(1998))及yaaD(WohllebenEurBiophysJ,(2009)在線公開)適用于附接至前體蛋白質(zhì)之氨基端或羧基端。在一實施方案中，前體蛋白質(zhì)包含影響該前體蛋白質(zhì)之溶解度的輔助序列。在一優(yōu)選實施方案中，輔助序列賦予前體蛋白質(zhì)”自組裝”性質(zhì)。前體蛋白質(zhì)之該自組裝性質(zhì)特點為，該前體蛋白質(zhì)已在表達期間“自發(fā)”(亦即自行)形成穩(wěn)定締合物，無需其它手段，或可能以“誘導(dǎo)性”方式，亦即通過觸發(fā)物，開始可溶性前體蛋白質(zhì)之此類穩(wěn)定締合物之形成。具有自組裝性質(zhì)之前體蛋白質(zhì)優(yōu)于其它前體蛋白質(zhì)，因為其可以簡單且有效之方式純化。此類締合物通常僅僅或基本上包含諸如氫鍵、離子及/或疏水相互作用之非共價鍵之形成。自組裝序列長度可為例如至少8個鄰接氨基酸。適合序列可位于例如先前已檢測到組裝成更高分子量之締合物的本身已知之蛋白質(zhì)中。此類締合物之實例為類淀粉原纖維、肌動蛋白或肌球蛋白絲、蛋白纖維(諸如彈性蛋白纖維)、膠原纖維、胎貝足絲線(musselbyssusthread)、角蛋白纖維或絲線。包含自組裝序列之此等及其它蛋白質(zhì)描述于Scheibel,CurrentOpinioninBiotechnology16;1-7(2005)中，本文中明確地引用該文獻。促穩(wěn)性鹽溶液可用作“觸發(fā)物”?？捎诒疚闹信e例提及之促穩(wěn)性鹽為彼等根據(jù)”霍夫邁斯特系列(Hofmeisterseries)”,包含至少一種促穩(wěn)性高于鈉離子或氯離子之離子。此類鹽之實例為磷酸鉀及硫酸銨。此類鹽溶液之實例為O.5M磷酸鉀及O.SM硫酸銨。前體蛋白質(zhì)之本發(fā)明穩(wěn)定締合物特點為，能在采用通常能夠溶解多種聚集蛋白質(zhì)之溶液處理期間維持其締合形式一段時期，且由此能與蛋白質(zhì)污染物分離。此類溶液之實例為堿、酸、尿素、鹽及去污劑之溶液。更具體地，本發(fā)明之穩(wěn)定締合物在堿金屬氫氧化物、尿素、胍鹽或帶電去污劑(諸如烷基三甲基銨鹽或烷基硫酸鹽)之溶液中保持一段時期內(nèi)不溶解。更具體地，穩(wěn)定締合物在以下溶液中保持一段時期內(nèi)不溶30.2M氫氧化鈉、彡2M尿素、>IM鹽酸胍、>IM硫氰酸胍、或>0.I%十二烷基硫酸鈉、或>0.I%溴化十六烷基三甲基銨。更具體地，前體蛋白質(zhì)之穩(wěn)定締合物在上述溶液中穩(wěn)定持續(xù)>10分鐘，例如>30分鐘且尤其>60分鐘。特定言之，若在室溫(亦即約20°C)下，a)無法由0.2MNaOH在I小時內(nèi)溶解，及/或b)無法由2M尿素及/或c)無法由IM鹽酸胍在10分鐘內(nèi)溶解，則存在穩(wěn)定締合物。在另一特定實施方案中，前體蛋白質(zhì)包含輔助序列(SU)，其保護宿主細胞免受重復(fù)前體蛋白質(zhì)之破壞影響。在一特定實施方案中，前體蛋白質(zhì)包含輔助序列SU，其保護宿主細胞兔受存在于重復(fù)前體蛋白質(zhì)中之陽離子抗微生物肽序列之破壞影響。更具體地，此等保護性序列包含帶負電荷之氨基酸(Asp、Glu)。更具體地，輔助序列包含許多帶負電荷之谷氨酸及/或天冬氨酸氨基酸，導(dǎo)致在PH=7下重復(fù)前體蛋白質(zhì)內(nèi)之總凈電荷大于-10且小于+10，尤其大于-5且小于+5,例如大于-2且小于+2。在另一特定實施方案中，帶負電荷之保護性序列形成兩親性螺旋。若一級結(jié)構(gòu)中7個連續(xù)氨基酸序列(A1-A7)按順序Al-A5-A2-A6-A3-A7-A4(圖I)之環(huán)形排列(亦即，在軸向(沿螺旋軸線)投影或俯視圖中)中，該環(huán)上有至少3個相鄰氨基酸為疏水性氨基酸(Ala、Met、CyS、Phe、Leu、Val、Ile)或甘氨酸，且該環(huán)上有3個相鄰氨基酸為親水性氨基酸(Thr、Ser>Trp>Tyr>Pro、His、Glu、Gin、Asp、Asn、Lys、Arg)或甘氨酸,則形成本發(fā)明之兩親性螺旋。此環(huán)形排列亦稱為“螺旋輪投影”。在一優(yōu)選實施方案中，帶負電荷之保護性序列對應(yīng)于序列SEQIDN0:16_SEQIDNO:19之任一者。5.裂解序列裂解序列為排列于本發(fā)明所需肽序列(P印)之上游及下游的氨基酸序列。此等序列能夠使Pep結(jié)構(gòu)單元通過“特異性”裂解自重復(fù)前體蛋白質(zhì)中移除。在本文中，“特異性”意謂該裂解發(fā)生在前體蛋白質(zhì)中基本上、尤其僅僅在一或多個確定位置處，藉此移除所需肽或其前體?！扒绑w”例如可由在一端或兩端上包含不為天然原始肽序列之一部分但不干擾進一步使用及功能性，或必要時籍由使用習(xí)知化學(xué)或生物化學(xué)方法裂解可移除之氨基酸殘基的肽鏈組成。裂解序列可借助于蛋白水解活性酶之特異性識別序列發(fā)揮作用，此類活性酶結(jié)合至該序列且使兩個特定氨基酸之間的肽鍵裂解。實例為以下識別序列=Arg-C蛋白酶、Asp-N內(nèi)肽酶、胱天蛋白酶(caspase)、胰凝乳蛋白酶、梭菌蛋白酶、腸激酶、因子Xa、谷氨酰基內(nèi)肽酶、粒酶B、LysC賴氨?；鶅?nèi)肽酶(無色桿菌屬(Achromobacter)蛋白酶I)、LysN肽基-Lys金屬內(nèi)肽酶、胃蛋白酶、脯氨酸內(nèi)肽酶、蛋白酶K、葡萄球菌肽酶I、嗜熱菌蛋白酶、凝血酶、胰蛋白酶。相應(yīng)識別序列描述于文獻中，例如描述于Keil,“Specificityofproteolysis”第335頁，Springer-Verlag(1992)中?；蛘?，特定氨基股序列能夠使多肽主鏈通過如以下之特定化學(xué)物質(zhì)選擇性裂解BNPS糞臭素(2-(2'-硝基苯基亞磺酰)-3-甲基-3-溴假吲哚)、溴化氰(bromcyane)、酸、羥胺、氧碘基苯甲酸、NTCB(2-硝基-5-硫氰基苯甲酸)。更具體地，所用裂解序列能夠使重復(fù)前體蛋白質(zhì)通過化學(xué)物質(zhì)裂解。尤其適合之裂解序列包含允許以羥胺裂解之序列基序Asn-Gly，或允許以酸裂解之Asp-PiO或AspXxx，其中Xxx可為任何蛋白質(zhì)型氨基酸。6.本發(fā)明序列之其它發(fā)展6.I氨基酸序列除了本文中特別揭示之肽(Pep)序列、及輔助序列(Aux、SA、SU)、重復(fù)順序、裂解序列及重復(fù)前體蛋白質(zhì)之序列以外，本發(fā)明亦涉及該序列之功能等同物、功能衍生物及鹽。根據(jù)本發(fā)明，“功能等同物”亦尤其意謂在上述氨基酸序列之至少一個序列位置中，具有與特別提及之氨基酸不同之氨基酸，但性質(zhì)仍與最初未經(jīng)修飾之肽相同的突變體。“功能等同物”因此包含通過一或多個氨基酸添加、取代、缺失及/或倒位可獲得之突變體，此類修飾可能發(fā)生在任何序列位置處，只要其產(chǎn)生具有根據(jù)本發(fā)明之性質(zhì)概況之突變體即可。更具體地，即使突變體與未經(jīng)修飾之多肽之間的反應(yīng)模式在性質(zhì)上相對應(yīng)，仍存在功能等同物。在上述意義上之“功能等同物”亦為所述多肽之“前體”以及此類多肽之“功能衍生物”及“鹽”。本文中之“前體”為具有或不具有所需生物活性的此類多肽之天然或合成前體。適合氨基酸取代之實例可見于下表中、原始殘基取代實例AlaSerArgLysAsnGin;HisAspGluCysSerGlnAsnGluAspGlyProHisAsn;GlnHeLeu;ValLeuHe;ValLysArg;Gin;GluMetLeu;HePheMet;Leu;TyrSerThrThrSerTrpTyrTyrTrp;PheValHe;Leu表述“鹽”意謂本發(fā)明肽分子的羧基之鹽及氨基之酸加成鹽。羧基之鹽可以本身已知之方式制備且包含諸如鈉鹽、鈣鹽、銨鹽、鐵鹽及鋅鹽之無機鹽，以及與如下有機堿形成之鹽例如胺(諸如三乙醇胺)、精氨酸、賴氨酸、哌啶及其類似物。本發(fā)明同樣涉及酸加成鹽，諸如與諸如鹽酸或硫酸之無機酸形成之鹽，及與諸如乙酸及草酸之有機酸形成之鹽。本發(fā)明多肽之“功能衍生物”(或“衍生物”)可同樣借助于已知技術(shù)在功能性氨基酸側(cè)基上或在其N端或C端產(chǎn)生。此類衍生物之實例包含羧酸基圍之脂族酯；羧酸基團之酰胺，通過與伯胺或仲胺反應(yīng)可獲得；游離氨基之N?；苌?，通過與?；磻?yīng)來制備；或游離羥基之O-?；苌?，通過與?；磻?yīng)來制備。此外，I至5個、例如2、3或4個隨機D-或L-氨基酸殘基可另外共價(以肽鍵)結(jié)合至N端及/或C端。6.2核酸、表達構(gòu)建、載體及包含其之微生物核酸本發(fā)明此外包含編碼本發(fā)明所用之肽及蛋白質(zhì)序列的核酸分子。本文中所提及之所有核酸序列(單鏈及雙鏈DNA及RNA序列，例如cDNA及mRNA)可以本身已知之方式，通過自核苷酸結(jié)構(gòu)單元化學(xué)合成，例如通過對雙螺旋之個別重迭互補核酸結(jié)構(gòu)單元進行片段融合而制備。舉例而言，寡核苷酸可以已知方式，通過亞磷酰胺方法化學(xué)合成(Voet,Voet,第2版，WileyPressNewYork,第896-897頁)。借助于DNA聚合酶之克列諾片段(Klenowfragment)及連接反應(yīng),組裝合成寡核苦酸及填補缺口，以及一般克隆方法描述于Sambrook等人(1989),MolecularCloningAlaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratoryPress中。本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明多肽或蛋白質(zhì)或其生物活性區(qū)段之分離之核酸分子，與可例如用作供鑒別或擴增本發(fā)明之編碼核酸之雜交探針或引物的核酸片段。此外，本發(fā)明之核酸分子可包含來自編碼基因區(qū)域之3'端及/或5'端之未翻譯序列?！胺蛛x之”核酸分子自存在于該核酸之天然來源中之其它核酸分子中移除，且另外當通過重組技術(shù)制備時，其可基本上無其它細胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或當以化學(xué)方式合成時可無化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)。本發(fā)明之核酸分子可借助于標準分子生物學(xué)技術(shù)及本發(fā)明所提供之序列信息分離。舉例而言，可通過使用任何特別揭示之具體序列或其任何區(qū)段作為雜交探針及標準雜交技術(shù)自適合cDNA文庫中分離出cDNA(例如Sambrook,J.，F(xiàn)ritsch,E.F.及Maniatis,T.MolecularCloningALaboratoryManual.第2版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989中所述)。此外，可使用包含任何揭示之序列或其區(qū)段的核酸分子，其可通過聚合酶鏈反應(yīng)，使用基于此序列產(chǎn)生之寡核苷酸引物來分離。以此方式擴增之核酸可克隆至適合載體中且可通過DNA序列分析來表征。本發(fā)明之寡核苷酸亦可通過標準合成方法，例如使用DNA合成儀來制備。此外，本發(fā)明包含與特別描述之核苷酸序列或其區(qū)段互補之核酸分子。本發(fā)明之核苷酸序列能夠產(chǎn)生可用于鑒別及/或克隆其他細胞類型及生物中之同源序列的探針及引物。通常此類探針及引物之核苷酸序列區(qū)域在嚴格條件下與本發(fā)明核酸序列之有義鏈或相應(yīng)反義鏈之至少約12個，優(yōu)選至少約25個，例如約40、50或75個連續(xù)核苷酸雜交。本發(fā)明亦包含彼等包含“沉默突變”或已根據(jù)特定原始或宿主生物之密碼子選擇，與特別提及之序列相比經(jīng)修飾之核酸序列，以及其天然存在之變體，諸如剪接變體或等位基因變體。本發(fā)明亦涉及可通過保守核苷酸取代(亦即，相關(guān)氨基酸經(jīng)相同電荷、尺寸、極性及/或溶解度之氨基酸置換)獲得之序列。本發(fā)明亦涉及因序列多態(tài)性而衍生自特別揭示之核酸的分子。由于天然變異，故此等遺傳多態(tài)性可存在于單一群體內(nèi)之個體中。此等天然變異通常導(dǎo)致基因之核苷酸序列中I至5%之變異。此外，本發(fā)明亦包含與上述編碼序列雜交或與其互補之核酸序列。可通過篩選基因組或cDNA文庫，找到此等多核苷酸，且任選借助于PCR，使用適合引物，由此擴增，且隨后例如使用適合探針來分離。另一可能性為以本發(fā)明之多核苷酸或載體轉(zhuǎn)化適合微生物，增殖此類微生物及因此增殖此類多核苷酸，且隨后分離其。另外，亦可以化學(xué)方式合成本發(fā)明之多核苷酸。能夠與多核苷酸”雜交”之性質(zhì)意謂多核苷酸或寡核苷酸在嚴格條件下結(jié)合至基本上互補序列的能力，同時在此等條件下非互補配偶體之間未發(fā)生非特異性結(jié)合反應(yīng)。為達成此目的，序列應(yīng)為70-100%、優(yōu)選90-100%互補。舉例而言,在Northern或Southern印跡技術(shù)中或在PCR或RT-PCR中引物結(jié)合下，使用互補序列能特異性彼此結(jié)合之性質(zhì)。通常，出于此目的，采用至少30個堿基對長度之寡核苷酸。例如在Northern印跡技術(shù)中，嚴格條件意謂使用50-70°C，優(yōu)選60-65°C洗滌溶液，例如今有O.1%SDS之O.IxSSC緩沖液(20xSSC3MNaCUO.3M檸檬酸鈉，pH7.O)，以洗脫非特異性雜交之cDNA探針或寡核苷酸。如上所述，在此情況下僅高度互補之核酸保持彼此附接。嚴格條件之調(diào)節(jié)為技術(shù)人員所知且描述于例如Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中。兩個核酸之間的“同一性”意謂在各情況下核酸總長度上核苷酸之同一性，尤其為借助于來自Informax(USA)之VectorNTISuite7.I軟件且應(yīng)用Clustal方法(HigginsDG,SharpPM.Fastandsensitivemultiplesequencealignmentsonamicrocomputer.ComputAppl.Biosci.1989年4月；5(2):151-1)且設(shè)定下列參數(shù)進行比較所計算之同一性多個比對參數(shù)空位開放罰分10空位延伸罰分10空位分離罰分范園8空位分離罰分關(guān)閉比對延遲之同一性％40殘基特異性空位關(guān)閉親水性殘基空位關(guān)閉轉(zhuǎn)換權(quán)重O成對比對參數(shù)FAST算法開啟K-元組尺寸I空位罰分3窗口尺寸5最佳對角線數(shù)目5表達構(gòu)建體及載體本發(fā)明另外涉及包含在由調(diào)節(jié)核酸序列之遺傳控制下編碼本發(fā)明肽或前體蛋白質(zhì)之核酸序列的表達構(gòu)建體，及包含至少一個此類表達構(gòu)建體之載體。本發(fā)明之此類構(gòu)建體優(yōu)選包含特定編碼序列之5'-上游的啟動子及3’下游之終止子序列，以及任選還用之在各情況下可操作地連接于編碼序列的其它常見調(diào)節(jié)元件。“可操作地連接”意謂啟動子、編碼序列、終止子及任選其它調(diào)節(jié)元件以某一方式按序排列，使得此類調(diào)節(jié)元件之每一者可在編碼序列表達期間實現(xiàn)其預(yù)定功能?？刹僮鞯剡B接序列之實例為靶向序列以及增強子、多腺苷酸化信號等等。其它調(diào)節(jié)元件包含選擇標記、擴增信號、復(fù)制起點等等。適合調(diào)節(jié)序列描述于例如Goeddel,GeneExpressionTechnologyMethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA(1990)中。除人工調(diào)節(jié)序列之外，天然調(diào)節(jié)序列仍可存在于實際結(jié)構(gòu)基因之上游。此天然調(diào)節(jié)可任選通過遺傳修飾來關(guān)閉，藉此增加或減少基因之表達。然而，基因構(gòu)建體亦可具有更簡單之結(jié)構(gòu)，亦即無額外調(diào)節(jié)信號插入結(jié)構(gòu)基因之上游，且不移除具有調(diào)節(jié)作用之天然啟動子。反之，天然調(diào)節(jié)序列以一方式發(fā)生突變，使得不再進行調(diào)節(jié)且增加或減少基因表達?；驑?gòu)建體可包含核酸序列之一或多個拷貝?？捎脝幼又畬嵗秊?cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、laclq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PR或λ-PL啟動子，其宜用于革蘭氏陰性細菌中；以及革蘭氏陽性啟動子amy及SP02、酵母啟動子ADCl、MFa,AC、P_60、CYCl、GAPDH或植物啟動子CaMV/35S、SSU、0CS、Iib4、usp、STLSl、B33、not或泛素啟動子或菜豆球蛋白啟動子。尤其優(yōu)選使用誘導(dǎo)性啟動子，諸如光誘導(dǎo)性及尤其溫度誘導(dǎo)性啟動子，諸如Pf1啟動子。原則上，可使用具有調(diào)節(jié)序列之任何天然啟動子。另外，亦宜使用合成啟動子。此類調(diào)節(jié)序列意欲能夠使核酸序列及蛋白質(zhì)以特定方式表達。視宿主生物而定，例如此可意謂基因僅在誘導(dǎo)之后表達或過表達，或基因即刻表達及/或過表達。此處優(yōu)選為能積極地影響表達且藉此增加或減少表達之調(diào)節(jié)序列或因子。因此，有可能通過使用強轉(zhuǎn)錄信號(諸如啟動子及/或“增強子”)有利地在轉(zhuǎn)錄水平上強化調(diào)節(jié)元件。然而，此外，亦可能例如通過提高mRNA之穩(wěn)定性來增加翻譯。通過將適合啟動子融合至適合編碼核苷酸序列且融合至終止或多腺苷酸化信號來制備表達盒。出于此目的，使用熟悉之重組及克隆技術(shù)如例如以下文獻中所描述T.Maniatis，E.F.Fritsch及LSambrook，MolecularCloningALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor，NY(1989);及1\J.Silhavy，M.LBerman及LW.Enquist，ExperimentswithGeneFusions，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor，NY(1984);及Ausubel，F(xiàn).M.等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssoc,andWileyInterscience(1987)。為在適合宿主生物中表達重組核酸構(gòu)建體或基因構(gòu)建體，宜將其插入宿主特異性載體中，該載體能夠使基因在宿主中最佳表達。載體為技術(shù)人員所熟知且可見于例如“CloningVectors，，(PouwelsP.H.etal.,eds.,Elsevier，Amsterdam-NewYork-Oxford，1985)中。應(yīng)了解除質(zhì)體之外，載體亦包括技術(shù)人員已知之任何其它載體，諸如噬菌體、病毒(諸如SV40、CMV、桿狀病毒及腺病毒)、轉(zhuǎn)座子、IS元件、質(zhì)體、黏粒及線性或環(huán)狀DNA。此類載體可在宿主生物中自主復(fù)制或隨染色體復(fù)制?？商峒爸m合表達載體之實例為常見融合表達載體，諸如pGEX(PharmaciaBiotechInc；Smith,D.B.及Johnson，K.S.(1988)Gene67:31-40)、pMAL(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)及pRIT5(Pharmacia，Piscataway,NJ)，其中谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E-結(jié)合蛋白及蛋白質(zhì)A分別融合至重組靶蛋白質(zhì)。非融合蛋白表達載體，如pTrc(Amann等人，(1988)Gene69:301-315)及pET11d(Studieretal.GeneExpressionTechnology!MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,California(1990)60-89)。用于在釀酒酵母(S.cerevisiae)中表達之酵母表達載體，諸如pYepSecl(Baldarietal.,(1987)EmboJ.6229-234)，pMFa(KurjanandHerskowitz(1982)Cell30:933-943)，pJRY88(Schultzetal.，(1987)Gene54:113—123)和pYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego,CA)。適用于諸如絲狀真菌之其它真菌之載體及載體構(gòu)建方法包含彼等詳細描述于以下文獻中者vandenHondel，C.A.M.J.J.&Punt,P.J.(1991)“Genetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi，，，inAppliedMolecularGeneticsofFungi,J.F.Peberdyetal.,eds.,pp.1-28,CambridgeUniversityPress!Cambridge?？捎糜谠谂囵B(yǎng)的昆蟲細胞(例如Sf9細胞)中表達蛋白質(zhì)之桿狀病毒載體包含pAc系歹Ij(Smith等人，(1983)Mol.CellBiol.3:2156-2165)及pVL系歹Ij(Lucklow及Summers,(1989)Virology170:31-39)。植物表達載體，諸如彼等詳細描述于以下文獻中者Becker，D.，Kemper，E.，Schell,J.和Masterson，R.(1992)“Newplantbinaryvectorswithselectablemarkerslocatedproximaltotheleftborder”，PlantMol.Biol.20:1195-1197;和Bevan，M.W.(1984)“BinaryAgrobacteriumvectorsforplanttransformation”，Nucl.AcidsRes.12:8711-8721。哺乳動物表達載體，諸如pCDM8(Seed，B.(1987)Nature329:840)及pMT2PC(Kaufman等人(1987)EMBOI.6:187-195)。用于原核及真核細胞之其它適合表達系統(tǒng)描述于以下文獻之第16章及第17章中Sambrook,J.,Fritsch,E.F.及Maniatis，T.,Molecularcloning:ALaboratoryManu訓(xùn)，第2片反，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor,NY,19890重組微生物可借助于本發(fā)明載體，產(chǎn)生已例如經(jīng)至少一種本發(fā)明載體轉(zhuǎn)化且可用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽之重組微生物。宜將上述本發(fā)明之重組構(gòu)建體引入適合宿主系統(tǒng)中且表達。此處優(yōu)選使用技術(shù)人員所熟悉之克隆及轉(zhuǎn)染方法，諸如共沉淀、原生質(zhì)體融合、電穿孔、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染等等，例如以便實現(xiàn)此類核酸在各個表達系統(tǒng)中之表達。適合的系統(tǒng)描述于例如CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.Ausubeletal.,Hrsg.,WileyInterscience,NewYork1997，或Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual.2nded.，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989中。根據(jù)本發(fā)明，亦可產(chǎn)生同源重組之微生物。出于此目的，制備包含本發(fā)明基因或編碼序列之至少一個區(qū)段的載體，任選向載體中引入至少一個氨基酸缺失、添加或取代以修飾，例如在功能上破壞(“敲除”載體)本發(fā)明序列。所引入序列亦可為例如來自相關(guān)微生物或衍生自哺乳動物、酵母或昆蟲來源之同源物?；蛘撸糜谕粗亟M之載體可以一方式設(shè)計，使得在同源重組之后，內(nèi)源性基因以另一方式突變或修飾，但仍編碼功能性蛋白質(zhì)(舉例而言，上游調(diào)節(jié)區(qū)域可以改變內(nèi)源性蛋白質(zhì)表達之方式經(jīng)修飾)。本發(fā)明基因之經(jīng)修飾區(qū)段存在于同源重組載體中。用于同源重組之合適載體之構(gòu)建描述于例如Thomas，K.R.及Capecchi,M.R.(1987)Cell51:503中。適合的宿主生物原則上為能夠表達本發(fā)明核酸、其等位基因變體、其功能等同物或衍生物之任何生物。宿主生物意謂例如細菌、真菌、酵母、植物或動物細胞。原核表達生物之非限制性實例為大腸桿菌、枯草桿菌、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)及其它。真核表達生物之非限制性實例為酵母，諸如釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)及其它酵母；絲狀真菌，諸如黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、里氏木霉(Trichodermareesei)、產(chǎn)黃支頂抱(Acremoniumchrysogenum)及其它絲狀真菌；哺乳動物細胞，如Hela細胞、COS細胞、CHO細胞及其它哺乳動物細胞；昆蟲細胞，諸如Sf9細胞、MEL細胞及其它昆蟲細胞；植物或植物細胞，諸如馬鈴薯(Solanumtuberosum)、煙草(Nicotiana)及其它植物或植物細胞?？山柚谕瑯哟嬖谟谳d體或表達盒中之標記基因選擇經(jīng)成功轉(zhuǎn)化之生物。此類標記基因之實例為負責(zé)抗生素抗性之基因，及負責(zé)催化著色反應(yīng)而使轉(zhuǎn)化細胞染色之酶的基因。隨后可借助于自動細胞分選來選出此類轉(zhuǎn)化細胞。載有合適抗生素抗性基因(例如G418或潮霉素)之經(jīng)載體成功轉(zhuǎn)化之微生物可借助于包含相應(yīng)抗生素之液體或固體培養(yǎng)基來加以選擇。在細胞表面上呈遞之標記蛋白質(zhì)可用于借助于親和層析之選擇。7.重組產(chǎn)生前體蛋白質(zhì)及肽本發(fā)明所用肽及前體蛋白質(zhì)原則上可以本身已知之方式重組產(chǎn)生，該方式包含培養(yǎng)產(chǎn)生肽/前體蛋白質(zhì)之微生物，任選誘導(dǎo)此類多肽表達，且自培養(yǎng)物中分離出此類多肽。必要時亦可以此方式以工業(yè)規(guī)模產(chǎn)生肽及前體蛋白質(zhì)?？筛鶕?jù)已知方法培養(yǎng)及發(fā)酵重組微生物。舉例而言，可在TB或LB培養(yǎng)基中及在20°C至40°C及pH6至9下使細菌增殖。適合的培養(yǎng)條件詳細地描述于例如T.Maniatis,E.F.Fritsch及J.Sambrook,MolecularCloningALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)中。除非肽或前體蛋白質(zhì)分泌至培養(yǎng)基中，否則使細胞破裂且通過已知的蛋白質(zhì)分離法自裂解物中回收產(chǎn)物。任選可通過高頻超音波，通過高壓(例如在弗氏細胞壓碎器(Frenchpressurecell)中)，通過滲透,通過去污劑、裂解酶或有機溶劑作用，通過勻衆(zhòng)器，或通過組合多種所列方法，使細胞破裂?？墒褂靡阎畬游龇?，諸如分子篩層析(凝膠過濾)，諸如Q-S^harose層析、離子交換層析及疏水性層析，及通過其它常見方法，諸如超濾、結(jié)晶、鹽析、透析及非變性凝膠電泳，來純化肽或前體蛋白質(zhì)。適合方法描述于例如Cooper,F.G.,BiochemischeArbeitsmethoden[原始標題TheToolsofBiochemistry],VerlagWalterdeGruyter,Berlin,NewYorkorinScopes,R.,ProteinPurification,SpringerVerlag,NewYork,Heidelberg,Berlin中。此外，可通過使用載體系統(tǒng)或寡核苷酸分離重組肽或前體蛋白質(zhì)，此類載體系統(tǒng)或寡核苷酸使cDNA延長特定核苷酸序列且因此編碼用于例如更簡單純化之經(jīng)修飾之多肽或融合蛋白質(zhì)。此類適合修飾之實例為充當錨定物之“標簽”，例如稱為六組氨酸錨定物之修飾，或可由抗體識別為抗原之表位(描述于例如Harlow,E.及Lane,D.,1988,AntibodiesALaboratoryManual.ColdSpringHarbor(N.Y.)Press中)。此等錨定物可用于將蛋白質(zhì)固定至固相支持體(例如聚合物基質(zhì))上，該固相支持體可引入例如層析柱中或可用于微量滴定板或另一支持體上。同時，此等錨定物亦可用于識別蛋白質(zhì)。此外，可單獨使用或與此類錨定物組合使用諸如以下之常見標記物來識別此類蛋白質(zhì)以衍生蛋白質(zhì)熒光染料、在與底物反應(yīng)后形成可檢測反應(yīng)產(chǎn)物之酶標記物、或放射性標記物。更具體地，通過表達編碼本發(fā)明重復(fù)前體蛋白質(zhì)之經(jīng)合成制備之基因序列來產(chǎn)生重復(fù)前體蛋白質(zhì)。合成基因序列之一可能制備方法描述于Hummerich等人，Biochemistry43；13604-13612(2004)中。重復(fù)前體蛋白質(zhì)可以可溶或不溶形式存在于宿主細胞中。在兩種情況下，細胞均破裂。更具體地，借助于高壓勻漿機，在1000-1500巴下進行破裂。在可溶性重復(fù)前體蛋白質(zhì)之情況下，通過將裂解物加熱至60-100°C，諸如70-90°C或75_85°C，使大部分細胞蛋白質(zhì)沉淀，且通過適合分離方法(例如沉降或過濾)，自可溶性重復(fù)前體蛋白質(zhì)中移除。隨后通過添加促穩(wěn)性鹽(如上所述)使重復(fù)前體蛋白質(zhì)沉淀。重復(fù)前體蛋白質(zhì)在該過程中形成穩(wěn)定締合物。視締合物而定，所添加之促穩(wěn)性鹽之最終濃度可變化且約在約0.2-3M或例如0.8-2M之范圍內(nèi)?？梢缘鞍踪|(zhì)化學(xué)家所熟悉之簡單方式確定最佳濃度。亦可在無外部觸發(fā)物之情況下組裝重復(fù)前體蛋白質(zhì)。在此情況下，重復(fù)前體蛋白質(zhì)在宿主細胞中組裝，得到相應(yīng)穩(wěn)定締合物。在細胞破裂之后，籍由適合分離方法(例如沉降或過濾)，將此類締合物與可溶性組分分離?？稍诩毎屏阎?，通過添加輔助沉淀劑，來改良締合物之移除。此類輔助沉淀劑會引起締合物進一步凝結(jié)，因此，沉降需要較低加速度，例如以便將締合物與水性培養(yǎng)基分離?？墒褂弥o助沉淀劑為酸、堿液、聚合物溶液，尤其為帶電聚合物之水溶液。輔助沉淀劑之實例為磷酸或聚乙烯亞胺溶液?？蛇M一步純化重復(fù)前體蛋白質(zhì)之穩(wěn)定締合物。出于此目的，穩(wěn)定締合物不溶但其它污染物可溶之溶液可用于此純化。更具體地，使用堿、酸、尿素、鹽及去污劑之水溶液。尤其適合使用堿金屬羥化物、尿素、胍鹽或帶電去污劑(諸如烷基三甲基銨鹽或；烷基硫酸鹽)之溶液。更具體地，使用>0.2M氮氧化鈉、32M尿素、>IM鹽酸胍、>IM硫氰酸胍、或^0.I%十二烷基硫酸鈉、或>0.I%溴化十六烷基三甲銨之溶液。為進行純化，將穩(wěn)定締合物再懸浮于相應(yīng)溶液中，且隨后通過簡單分離方法(例如沉降或過濾)與溶液分離。隨后將重復(fù)前體蛋白質(zhì)以水洗滌且使用技術(shù)人員所熟悉之方法進行干燥。為了自重復(fù)前體蛋白質(zhì)中回收肽，必須將此等序列自此類前體蛋白質(zhì)中裂解且與輔助序列分離。在存在于重復(fù)前體蛋白質(zhì)中之裂解序列處進行裂解。用于特異性裂解氨基酸鏈之方法描述于文獻中?？梢烂复俜绞交蚧瘜W(xué)方式裂解重復(fù)前體蛋白質(zhì)。可用于特異性裂解氨基酸鏈之酶之實例為Arg-C蛋白酶、Asp-N內(nèi)肽酶、胱天蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、梭菌蛋白酶、腸激酶、因子Xa、谷氨?；鶅?nèi)肽酶、粒酶B、LysC賴氨?；鶅?nèi)肽酶(無色桿菌屬蛋白酶I)LysN肽基-Lys金屬內(nèi)肽酶、胃蛋白酶、脯氨酸內(nèi)肽酶、蛋白酶K、葡萄球菌肽酶I、嗜熱菌蛋白酶、凝血酶、胰蛋白酶。可用于特異性裂解氨基酸鏈之化學(xué)物質(zhì)之實例為BNPS糞臭素(2-(2'-硝基苯基亞磺酰)3-甲基-3-溴假吲哚)、溴化氰、酸、羥胺、氧碘代苯甲酸、NTCB(2-硝基-5-硫氰基苯甲酸)。更具體地，依化學(xué)方式，例如通過羥胺或酸裂解，使重復(fù)前體蛋白質(zhì)裂解。PKs小于5且大于0，優(yōu)選小于4且大于I之任何無機酸或有機酸均適用于酸裂解。更具體地，使用1-5%磷酸或1-5%甲酸進行該裂解。視酸裂解之條件而定，在氨基酸Asp與Ρι·ο之間或Asp與Xxx之間發(fā)生簡單裂解，其中Xxx為任何蛋白質(zhì)型氨基酸，或首先在氨基酸Asp與Pro之間或Asp與Xxx之間發(fā)生裂解，且隨后自肽氨基酸序列中之該天冬氨酸之N端上游的氨基酸完全裂解天冬氨酸?？墒褂媒?jīng)純化之重復(fù)前體蛋白質(zhì)，或使用包含重復(fù)前體蛋白質(zhì)之細胞級分(例如宿主細胞之可溶性組分或宿主細胞之不溶性組分)，或使用包含重復(fù)前體蛋白質(zhì)之完整宿主細胞進行裂解。在裂解之后必須使裂解劑失活。用于實現(xiàn)此目的之方法為技術(shù)人員所知。失活后，裂解反應(yīng)混合物尤其包含所需肽、裂解出來之輔助序列及失活裂解劑。在該溶液中，肽可能已具有其所需活性。若需要更大純度，則自重復(fù)前體蛋白質(zhì)中釋放之肽可在裂解之后自輔助序列移除。自組裝輔助序列之優(yōu)勢在于此類輔助序列在裂解期間或之后組裝。其可在裂解期間在所選裂解條件下自發(fā)組裝，或因添加支持此類輔助序列組裝之物質(zhì)而組裝。此類組裝促進物質(zhì)為例如促穩(wěn)性鹽，其包含至少一種類型之根據(jù)霍夫邁斯特系列，促穩(wěn)性比鈉離子或氯離子高之離子。其它組裝促進物質(zhì)為例如酸，或堿液，或可與水混溶之有機溶劑，諸如醇類。經(jīng)組裝之輔助序列可通過沉降或過濾自釋放之可溶性肽移除。可能需要其它純化步驟，以自所需肽移除剩余蛋白質(zhì)或肽污染物或在裂解期間或之后添加之鹽或其它物質(zhì)。出于此目的，可才采用例如層析法、沉淀、透析、兩相萃取及技術(shù)人員所熟悉之其它方法。含有肽之溶液隨后可直接用于所需應(yīng)用，或可使用技術(shù)人員所熟悉之方法(例如噴霧干燥或冷凍干燥)來干燥溶液，且使用相應(yīng)干燥產(chǎn)物。干燥后，只要將肽溶解于水中，通過以該肽不可溶之溶劑來洗滌，可移除不能自肽移除之污染物。適用溶劑為有機溶劑，諸如正己烷、N-甲基吡咯烷酮；或溶劑與酸之混合物，例如正己烷與乙酸之混合物；或有機酸，諸如乙酸或己酸。對于此純化步驟，將干燥肽再懸浮于適當溶劑/溶劑混合物中，且隨后通過沉降或過濾、再次移除?？赏ㄟ^干燥來移除剩余溶劑/溶劑混合物。通過裂解獲得之形式的所需肽可具有所需活性。然而，在裂解之后亦可能需要進一步修飾肽。舉例而言，肽可經(jīng)酰胺化、酯化、氧化、烷基化或以化學(xué)方式連接于任何分子。可應(yīng)用于此類修飾中之分子之實例為醇類，醇半胱氨酸酯、羧酸、硫酯或及馬來酰亞胺。更具體地，用于此類修飾的分子是增加肽的疏水性的分子。此類分子可含有經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾之如上所定義之烷基。此類分子優(yōu)選含有C2-C16-烷基，尤其SC6-C14-烷基。相應(yīng)方法為技術(shù)人員所知。可在以下任何時候進行修飾例如直接在細胞破裂之后，在前體蛋白質(zhì)純化之后，在前體蛋白質(zhì)裂解之后，或在肽純化之后?？芍苯邮褂镁哂兴杓兌戎娜芤?。或者，可應(yīng)用不同保存方法來長期儲存。保存方法之實例為冷卻、冷凍、添加防腐劑。或者，可干燥肽。干燥方法之實例為凍干或噴霧干燥?？呻S后儲存干燥之肽。為使用肽，將干燥之物質(zhì)溶解于適合溶劑、優(yōu)選水溶液中。該水溶液可包含鹽或緩沖物質(zhì)或無其它添加物。8.各種其它一般術(shù)語之定義除非另有說明，否則”衍生”自特別揭示之序列或與其”同源”之序列(例如衍生之氨基酸或核酸序列)意謂根據(jù)本發(fā)明，與起始序列有至少80%或至少90%，尤其91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%同一性之序列。實驗部分基于產(chǎn)生三種具有不同序列及氨基酸組成之肽(ΖηΟ、Ρ18、Min)來證明本發(fā)明中所述之產(chǎn)生任何肽序列(Pep)之方法的普遍適用性。除非另有說明，否則使用有機與生化分析及蛋白質(zhì)之重組產(chǎn)生及微生物培養(yǎng)之標準方法。實施例I:產(chǎn)生肽ZnO(SEQIDNO20)肽ZnO為衍生自公開序列之肽,其影響氧化鋅粒子之形成(Umetsuetal.Adv.Mat.17:2571-75(2005))ο使用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI及HindIII，將合成基因ZnO4(SEQIDNO21)克隆至Hummerich等人，Biochemistry43;13604-13612(2004)中所述的載體PAZL中，且根據(jù)其中所述之方案進行二聚化，且克隆至載體pET21(Novagen)中。隨后存在于該載體中之序列編碼重復(fù)前體蛋白質(zhì)ZnO8(SEQIDNO:22)。該重復(fù)前體蛋白質(zhì)包含8個重復(fù)單元，每一者均包含ZnO肽拷貝及一輔助序列。該輔助序列包含聚丙氨酸序列且賦予重復(fù)前體蛋白質(zhì)自組裝性質(zhì)。意欲使用的使ZnO肽能夠自前體蛋白質(zhì)中選擇性裂解出來之氨基酸Asp-Pro位于輔助序列與肽序列之間。在菌株大腸桿菌BL21[DE3](Novagen)中進行表達。在p02>20%及pH=6.8下，以補料分批方法進行培養(yǎng)及蛋白質(zhì)合成。培養(yǎng)基8升水25g一7JC合特檬酸40g甘油(99%)125g磷酸二氫鉀(KH2PO4)62.5g硫酸銨((NH4)2SO4)18.8g硫酸鎂七水合物(MgSO4*7H2O)1.3g氯化鈣二水合物(CaCl2*2H2O)155ml痕量鹽溶液添加水至9.8升用25%濃度之NaOH調(diào)整pH值至6.33mlTegoKS911(消泡劑；Goldschmidt3mlProdukte)Ig氣千青霉素(Ampicillin)190mg鹽酸疏胺素(thiaminehydrochloride)20mg維生素BI2痕量鹽溶液5升水200.00g一水合將檬酸55.00gZnSO4*7H2O42.50g(NH4)2Fe(SO4)2*6H2O15.00gMnSO4*H2O4.00gCuSO4*5H2O1.25gCoSO4*7H2O補料溶液1125g水41.3g一7_Κ合抒樣酸81.6g硫酸鈉(Na2SO4)6.3g(NH4)2Fe(SO4)2*6H2O4734g99.5%甘油在存在于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中之甘油耗盡之后，開始以100ml/h之速率恒定地補料。在細菌培養(yǎng)物達到0D_=60之光密度之后，通過添加ImM異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷誘導(dǎo)蛋白質(zhì)合成。此時，培養(yǎng)物之溫度自37°C降至30°C。在誘導(dǎo)之后5小時，收獲細胞。根據(jù)以下方案純化ZnO8-每克濕質(zhì)量細胞沉淀物重懸浮于5ml20mMMOPS(3_(N-嗎啉代)丙磺酸)(pH7.O)-在高壓勻漿機中在1400巴下使細胞破裂-在5000Xg下離心30分鐘-在80°C下培育上清液30分鐘-在5000Xg下離心30分鐘-通過在4°C下添加I.8M硫酸銨(最終濃度)隔夜，使ZnO8自上清液中沉淀出-以8M尿素洗滌沉淀物-以水洗滌沉淀物2次-凍干-使經(jīng)凍干之ZnO8達至-20V。自每一升培養(yǎng)基回收2.2g純Ζη08。為進行裂解，將250mg經(jīng)凍干之ZnO8前體蛋白質(zhì)重懸浮于5mlI%甲酸中且在90°C下溫育6小時。在此溫育期間，凍干產(chǎn)物發(fā)生溶解，得到凝膠狀物質(zhì)。冷卻至室溫之后，通過在ISOOOxg下沉降，自可溶性組分中移除凝膠狀物質(zhì)。以2MNaOH中和剩余溶液。隨后凍干溶液。凍干產(chǎn)物包含所需裂解產(chǎn)物及由甲酸中和得到之甲酸鈉。借助于HPLC分析經(jīng)凍干之產(chǎn)物為此，將產(chǎn)物以lmg/ml之濃度溶解于水中且使用反相層析柱(JupiterProteo4.6x250mm；Phenomenex)分析。所用洗脫劑為O.1%三氟乙酸水溶液，使用線性梯度，以O(shè).I%三氟乙酸之乙腈溶液替換。在206nm下進行檢測(圖2)。為進一步分析，收集主峰之級分且進一步研究其中存在之物質(zhì)。N端測序證實此組分為ZnO肽。借助于質(zhì)譜分析(MALDI-T0F)之研究確立2002之質(zhì)量，其與ZnO肽之理論質(zhì)量一致(圖3)。HPLC分析揭示基于UV活性組分，純度為62%。實施例2:產(chǎn)生肽P18(SEQIDNO:23)肽P18為衍生自Shin等人，J.PeptideRes.58:504-14(2001)所述之高活性抗微生物肽序列之肽。使用限制性內(nèi)切核酸酶BamHI及HindIII，將合成基因AHeAP182(SEQIDNO24)克隆至Hummerich等人,Biochemistry43；13604-13612(2004)中所述之載體pAZL中，且根據(jù)其中所述之方案進行二聚化，且克隆至載體PET21(Novagen)中。隨后存在于該載體中之序列編碼重復(fù)前體蛋白質(zhì)AHeAP184(SEQIDNO:25)。該重復(fù)前體蛋白質(zhì)包含4個重復(fù)單元，每一者包含一P18肽拷貝及一輔助序列。該輔助序列包含兩個聚丙氨酸序列且賦予重復(fù)前體蛋白質(zhì)自組裝性質(zhì)。此外，輔助序列包含帶負電荷之螺旋保護性序列。意欲通過酸使P18肽自前體蛋白質(zhì)中選擇性裂解出來之氨基酸Asp-Pro位于輔助序列與P18肽序列之間。在菌株大腸桿菌BL21[DE3](Novagen)中進行表達。在p02>20%及pH=6.8下，以補料分批方法進行培養(yǎng)及蛋白質(zhì)合成。培養(yǎng)基、痕量鹽溶液及補料溶液具有實施例I中所述之組成。在存在于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中之甘油耗盡之后，開始以100ml/h之速率恒定地補料。在細菌培養(yǎng)物達到0D_=60之光密度之后，通過添加ImM異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷誘導(dǎo)蛋白質(zhì)合成。在誘導(dǎo)之后10小時，通過在5000Xg下沉降30分鐘來收獲細胞。濕生物量為1932g。根據(jù)以下方案純化濕生物量-重懸浮細胞沉淀物每克生物量添加6g20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)且充分混合-在高壓勻漿機中，在1500巴下使細胞破裂-添加磷酸至pH=3±0·5-在攪拌下于23°C下培育10分鐘-離心20分鐘，至少5000xg-重懸浮此類沉淀物每克濕質(zhì)量添加25mlO.2MNaOH,勻漿且在攪拌下于23°C下培育4小時-中和以85%濃度之H3PO4調(diào)整pH值為8.5±0·5-離心20分鐘，至少5000xg-用2%濃度之H3PO4水解或裂解由經(jīng)洗滌之包含P18前體蛋白質(zhì)之包含體組成的沉淀物裂解條件i.每克沉淀物使用5mlH3PO4ii.勻漿iii.在搖動下于90°C下培育16小時。-使裂解反應(yīng)混合物冷卻。-離心20分鐘，至少5000xg-中和以IOMNaOH調(diào)整pH值為5.5±0·5-離心20分鐘，至少5000xg-以水稀釋上清液，直至電導(dǎo)率小于10mS/cm-經(jīng)由陽離子交換層析(FractogelCOO；Merck);&450mMNaCl洗脫，自上清液純化P18-匯集含有肽之級分，且以水稀釋，直至電導(dǎo)率小于lOmS/cm-經(jīng)由陽離子交換層析(FractogelC00；Merck),以5OmMHCl洗脫，自匯集級分純化Ρ18-以2ΜNaOH中和洗脫物-凍干中和溶液。借助于HPLC分析經(jīng)凍干之產(chǎn)物為此，將產(chǎn)物以lmg/ml之濃度溶解于水中且使用反相層析柱(JupiterProteo4.6x250mm；Phenomenex)分析。所用洗脫劑為O.1%三氟乙酸水溶液，使用線性梯度，以O(shè).1%三氟乙酸之乙腈溶液替換。在280nm下進行檢測(圖4)。為進一步分析，收集主峰之級分且進一步研究其中存在之物質(zhì)。N端測序證實此組分為P18肽。借助于質(zhì)譜分析(MALDI-T0F)之研究確立肽之質(zhì)量為2512，此與P18肽之理論質(zhì)量一致(圖5)。HPLC分析揭示基于UV活性組分，純度為85%。由30g濕生物量獲得52mgP18肽。因此，每升發(fā)酵培養(yǎng)物可回收約330mg純P18肽。為研究P18肽之活性，將LB培養(yǎng)基(5g/l酵母提取物；10g/l胰蛋白胨，5g/l氯化鈉)中之大腸桿菌B培養(yǎng)物在搖動下于37°C下與不同濃度之P18肽一起培育，此類培養(yǎng)物具有如在600nm下所測量O.I之光密度。24小時后，通過測量光密度監(jiān)控細菌生長。以31ppm之肽濃度實現(xiàn)生長之完全抑制(24小時后，600nm下之光密度<O.15)。通過使C端羧基酰胺化可進一步提高抗微生物活性。為此，以I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽及N-羥基-磺基琥珀酰亞胺活化此類羧基且通過隨后添加氨使其酰胺化。實施例3:產(chǎn)生肽Min(SEQIDNO26)使用限制性內(nèi)切核酸酶BamHI及HindIII，將合成基因AEMin4(SEQIDNO27)克隆至Hummerich等人Biochemistry43;13604-13612(2004)中所述之載體pAZL中，且根據(jù)其中所述方案進行二聚化，且克隆至載體PET21(Novagen)中。隨后存在于該載體中之序列編碼重復(fù)前體蛋白質(zhì)AEMin8(SEQIDNO:28)。該重復(fù)前體蛋白質(zhì)包含8個重復(fù)單元，每一者包含一Min肽拷貝及一輔助序列。輔助序列包含聚丙氨酸序列且賦予重復(fù)前體蛋白質(zhì)自組裝性質(zhì)。此外，輔助序列包含帶負電荷之保護性序列。意欲使用酸使P18肽自前體蛋白質(zhì)中選擇性裂解出來之氨基酸Asp-Ριχ)位于輔助序列與肽序列之間。在菌株大腸桿菌BL21[DE3](Novagen)中進行表達。在p02>20%及pH=6.8下，以補料分批方法進行培養(yǎng)及蛋白質(zhì)合成。培養(yǎng)基、痕量鹽溶液及補料溶液具有實施例I中所述之組成。在存在于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中之甘油耗盡之后，開始以100ml/h之速率恒定地補料。在細菌培養(yǎng)物達到OD_=60之光密度之后，通過添加ImM異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷誘導(dǎo)蛋白質(zhì)合成。此時，培養(yǎng)物之溫度自37°C降至30°C。在誘導(dǎo)之后5小時，收獲細胞。根據(jù)以下方案純化AEMin8-將每克濕質(zhì)量細胞沉淀物重懸浮于5ml20mMpH7.0MOPS(3_(N-嗎啉代)丙烷磺酸)中-在高壓勻漿機中，在1400巴下使細胞破裂-在5000xg下離心30分鐘-在80°C下培育上清液20分鐘-在5OOOxg下離心3O分鐘-通過在4°C下添加2M硫酸銨(最終濃度)隔夜，使AEMin8自上清液中沉淀出-以SM尿素洗滌沉淀物-以水洗滌沉淀物2次-凍干-使經(jīng)凍干之AEMin8達到_20°C。每升培養(yǎng)基回收O.4g純AEMin8。為裂解，將250mg經(jīng)凍干之AEMin8前體蛋白質(zhì)重懸浮于12.5ml1%磷酸中且在90°C下培育8小時。冷卻至室溫之后，通過在ISOOOxg下沉降，自可溶性組分中移除不溶性物質(zhì)。以2MNaOH中和剩余溶液。接著凍干溶液。凍干產(chǎn)物包含所需裂解產(chǎn)物及由磷酸中和得到之磷酸氫二鈉。借助于HPLC分析經(jīng)凍干之產(chǎn)物為此，將產(chǎn)物以lmg/ml之濃度溶解于水中，且使用反相層析柱(JupiterProteo4.6x250mm；Phenomenex)分析。所用洗脫劑為O.1%三氟乙酸水溶液，使用線性梯度，以O(shè).I%三氟乙酸之乙腈溶液替換。在206nm下進行檢測(圖6)。為進一步分析，收集主峰之級分且進一步研究其中存在之物質(zhì)。N端測序證實此組分為Min肽。借助于肽質(zhì)譜分析(MALDI-T0F)之研究確立1900之質(zhì)量，其與Min肽之理論質(zhì)量一致(圖7)。HPLC分析揭示基于UV活性組分，純度為68%。實施例4:優(yōu)化肽P18(SEQIDNO23)之制備為提高來自實施例2之肽P18的產(chǎn)率，研究不同Aux序列對肽產(chǎn)率之影響。在合成基因AHe2AP182(SEQIDNO:74)在根據(jù)實施例2克隆至載體pET21中之后編碼SEQIDNO75之前體蛋白質(zhì)的情況下，觀察到表達及總產(chǎn)率顯著提高。根據(jù)實施例2中所述條件進行發(fā)酵。根據(jù)以下方案純化濕生物量-重懸浮細胞沉淀物每克生物量添加6g水且充分混合-在高壓勻漿機中，在1500巴下使細胞破裂-添加磷酸至pH=3±0·5-在攪拌下于23°C下培育10分鐘-離心20min,至少5000xg-重懸浮此類沉淀物每克濕質(zhì)量添加20mlO.4MNaOH,勻漿且在攪拌下于23°C下培育I小時-中和以IMpH6.O磷酸鉀緩沖液調(diào)整pH值為8.5±0·5-離心20分鐘，至少5000xg-用2%H3PO4水解或裂解由經(jīng)洗滌之包含P18前體蛋白質(zhì)之包含體組成的沉淀物裂解條件i.每克沉淀物使用7mlH3PO4ii.勻漿iii.在搖動下于90°C下溫育16小時-冷卻裂解反應(yīng)混合物-離心20分鐘，至少5000xg-以25%NaOH調(diào)整pH值為4.O±O.5-離心20分鐘，至少5000xg-以水稀釋上清液，直至電導(dǎo)率小于30mS/cm-經(jīng)由陽離子交換層析(SP-SepharoseHighPerformance；GEHealthcare),自上清液純化P18;洗滌緩沖液10mMpH4乙酸鈉緩沖液+450mMNaCl;洗脫緩沖液10mMpH4乙酸鈉緩沖液+IlOOmMNaCl-通過添加25%NaOH至洗脫物中，直至pH=10.5±0.3，使肽沉淀-離心20分鐘，至少5000xg-每克濕質(zhì)量沉淀物重懸浮于5毫升水中-溶解肽添加乙酸，直至pH=6±0.5-凍干以上述方式，每升發(fā)酵培養(yǎng)液可獲得約Ig純P18肽。實施例5:制備肽SEQIDNO6經(jīng)由自各個前體蛋白質(zhì)進行酸裂解，獲得實施例I至4中所提及之肽。這涉及天冬氨酸與脯氨酸之間的肽鍵水解。因此，如實施例I中所示，肽序列在N端之脯氨酸殘基開始及在C端之天冬氨酸殘基結(jié)束。如實施例2及3中所示，可在某些條件下使C端天冬氨酸殘基裂解，因此，允許產(chǎn)生具有自由選擇C端序列之肽序列。為展示本發(fā)明之方法可制備N端不以脯氨酸殘基開始而以自由選擇的N端氨基酸開始的肽，制備具有SEQIDN0:6之肽。出于此目的且根據(jù)實施例4，利用合成基因AHe2AP182-P-G(SEQIDNO:76)制備具有SEQIDNO:77之前體蛋白質(zhì)。該前體蛋白質(zhì)與實施例4之前體蛋白質(zhì)SEQIDNO:75的不同之處在于P18肽之N端氨基酸為Pro-Gly，且此外C端Gly缺失。根據(jù)實施例4中所述條件進行克隆及發(fā)酵。根據(jù)以下方案純化濕生物量-重懸浮細胞沉淀物每克生物量添加6g水且充分混合-在高壓勻漿機中，在1500巴下使細胞裂解-離心20分鐘，至少5000xg-用5%H3PO4水解或裂解由含有P18前體蛋白質(zhì)之包含體組成之沉淀物裂解條件i.每克沉淀物使用5mlH3PO4ii.勻漿iii.在搖動下于90°C下溫育16小時-冷卻裂解反應(yīng)混合物-離心20分鐘，至少5000xg-以25%NaOH調(diào)整pH值為4.O±O.5-離心20分鐘，至少5000xg-以水稀釋上清液，直至電導(dǎo)率小于30mS/cm-經(jīng)由陽離子交換層析(SP-SepharoseHighPerformance；GEHeraltheare),自上清液純化肽；洗滌緩沖液10mMpH4乙酸鈉緩沖液+450mMNaCl;洗脫緩沖液10mMpH4乙酸鈉緩沖液+IlOOmMNaCl-通過添加25%NaOH至洗脫物中，直至pH=10.5±0.3，使肽沉淀-離心20分鐘，至少5000xg-每克濕質(zhì)量沉淀物重懸浮于5毫升水中-通過添加乙酸，直至pH=6.0±0.5，來溶解肽-凍干借助于HPLC分析經(jīng)凍干之產(chǎn)物。為此，將產(chǎn)物以lmg/ml之濃度溶解于水中，且借助于反相層析柱(JupiterProteo4.6x250mm;Phenomenex)分析。使用的洗脫劑為O.I%三氟乙酸水溶液，以線性梯度之O.I%三氟乙酸之乙腈溶液替換。在280nm下進行檢測(圖8)。為進一步分析，收集主峰之級分且進一步研究其中所含物質(zhì)。借助于質(zhì)譜分析(MALDI-T0F)之研究展示具有2300.6之質(zhì)量的肽，其與肽SEQIDNO:6之理論質(zhì)量一致(圖9)。實施例6:經(jīng)凍干之肽pl8(SEQIDNO:23)之酰胺化在一些情況下，若C端不含游離羧基而以酰胺化形式存在，則此對于肽活性而言可為有利的。為進一步證明此，根據(jù)以下方案使實施例4之經(jīng)凍干之肽P18酰胺化O10mg/mlP18肽O30%EtOHOIOmMpH5.O的2_(N_嗎啉代)乙磺酸O3M氯化銨O2.5mMN-羥基琥珀酰亞胺O50mMI-乙基-3-(3_二甲基氛基丙基)碳二亞胺〇在室溫下溫育2小時O以NaOH中和至pH7.O通過使用LunaSCX5μIOOA層析柱(Phenomenex,Torrance,CA,USA)進行HPLC來分析酰胺化樣品使用的洗脫劑是20mMKH2PO4(pH2.5)及25%乙腈，以線性梯度以20mMKH2PO4(pH2.5)、25%乙腈及IMKCl替換。在280nm下進行檢測(圖10)。為進行比較，圖10展示具有肽“P18”序列之以化學(xué)方式合成及酰胺化之參考肽(如由BachemAG7Bubendorf,Switzerland所制備)的層析圖。通過如實施例4中所述之陽離子交換層析進一步純化肽。實施例7以整合酰胺化來制備肽P18(SEQIDNO23)為提高制備酰胺化肽P18之經(jīng)濟效率，將酰胺化整合到處理過程中而不是如根據(jù)實施例6所述在肽純化后進行酰胺化。出于此目的，通過根據(jù)實施例4之發(fā)酵獲得前體蛋白質(zhì)SEQIDNO:75，且通過使前體蛋白質(zhì)進行酸裂解，釋放肽。隨后進行以下步驟-冷卻裂解反應(yīng)混合物-離心20分鐘，至少5000xg-以25%NaOH調(diào)整pH值為10.5±O.5-離心20分鐘，至少5000xg-每克濕質(zhì)量沉淀物溶解于3ml乙醇中-離心；確定上清液中之肽(稀釋)-混合以下組分a.12.5ml溶解于乙醇中之肽b.4.2ml水c.添加400μ1500mM2_(N_嗎啉代)乙磺酸d.以HCl調(diào)整pH值為5.Oe.添加2.14g氯化銨f.200μI500mMN-羥基琥珀酰亞胺g.ImlIMI-乙基-3-(3_二甲基氛基丙基)碳二亞胺-在室溫下溫育2小時-以水稀釋混合物，直至電導(dǎo)率小于30mS/cm-經(jīng)由陽離子交換層析(SP-SepharoseHighPerformance；GEHealthcare),純化經(jīng)修飾之P18;洗滌緩沖液10mMpH4乙酸鈉緩沖液+450mMNaCl;洗脫緩沖液10mMpH4乙酸鈉緩沖液+IlOOmMNaCl-通過添加25%NaOH至洗脫物中，直至pH=10.5±0·3，使肽沉淀-離心20分鐘，至少5000xg-每克濕質(zhì)量沉淀物重懸浮于5毫升水中-溶解肽添加乙酸至pH6+0.5-凍干通過使用LunaSCX5μ100A層析柱(Phenomenex,Torrance,CA,USA)進行HPLC來分析酰胺化樣品使用的洗脫劑是20mMKH2PO4(pH2.5)及25%乙腈，以線性梯度以20mMKH2PO4(pH2.5)、25%乙腈及IMKCl替換。在280nm下進行檢測(圖11)。為比較，圖11展示具有肽“P18”序列之以化學(xué)方式合成及酰胺化之參考肽(如由BachemAG，Bubendorf,Switzerland所制備)的層析圖。本發(fā)明之序列之總覽權(quán)利要求1.一種前體蛋白質(zhì)，其包含所需肽(Pep)組件及輔助肽(Aux)組件的可裂解重復(fù)序列，具有通式(Pep-Aux)x或(Aux-Pep)x其中X>1，其中此類Aux組件為相同或不同的且包含賦予所述前體蛋白質(zhì)自組裝性質(zhì)的氨基酸序列組件'及此類Pep組件為相同或不同的且包含相同或不同肽分子的氨基酸序列。2.根據(jù)權(quán)利要求I的前體蛋白質(zhì)，其中所述組件Pep與Aux以肽鍵連接彼此且該肽鍵可依化學(xué)方式或酶促方式特異性裂解。3.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的前體蛋白質(zhì)，其形成穩(wěn)定締合物，此類穩(wěn)定締合物在室溫下不能在I小時內(nèi)由O.2MNaOH溶解或在10分鐘內(nèi)由2M尿素或IM鹽酸胍溶解。4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的前體蛋白質(zhì)，其中至少一個Aux組件包含自組裝肽(SA)組件，該自組裝肽(SA)組件包含至少一個具有至少8個氨基酸的序列，該序列包含至少50%丙氨酸殘基、至少50%纈氨酸殘基或至少50%谷氨酰胺殘基，或至少80%的該序列由這些殘基中的至少一個組成。5.根據(jù)權(quán)利要求4的前體蛋白質(zhì)，其中所述SA組件包含至少一個以下序列基序K(基序1)(GA)m(基序2)Vn(基序3)(VA)m(基序4)(VVAA)0(基序5)其中A為丙氨酸,G為甘氨酸,V為繳氨酸,η為2至12的整數(shù),m為2至10的整數(shù),且ο為I至6的整數(shù)。6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的前體蛋白質(zhì)，其中所述SA組件包含選自氨基酸序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:5及SEQIDNO73的氨基酸序列。7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的前體蛋白質(zhì)，其中至少一個Aux肽另外包含保護性肽(SU)組件。8.根據(jù)權(quán)利要求7的前體蛋白質(zhì)，其中所述SU組件具有比例增加的帶負電荷的氨基酸殘基。9.根據(jù)權(quán)利要求8的前體蛋白質(zhì)，其中所述前體蛋白質(zhì)中的所述SU組件能夠形成兩親性螺旋結(jié)構(gòu)。10.根據(jù)權(quán)利要求9的前體蛋白質(zhì)，其中所述SU組件為兩親性肽，其包含能夠形成兩親性α-螺旋的至少七個以肽鍵連接的氨基酸的序列區(qū)段，其中所述螺旋的氨基酸殘基在垂直投影中分為該螺旋的疏水性半部及親水性半部，該螺旋的疏水性半部具有至少3個相鄰(在該垂直投影中)的相同或不同的疏水性氨基酸殘基，且該螺旋的親水性半部具有至少3個相鄰(在該垂直投影中)的相同或不同的親水性氨基酸殘基。11.根據(jù)權(quán)利要求8、9或10的前體蛋白質(zhì)，其中選擇所述SU組件的帶電氨基酸殘基的比例，使得在PH=7下該前體蛋白質(zhì)的總凈電荷大于-10且小于+10。12.根據(jù)權(quán)利要求8至11中任一項的前體蛋白質(zhì)，其中所述SU組件包含選自氨基酸序列SEQIDNO:16至SEQIDNO:19及SEQIDNO68的氨基酸序列。13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的前體蛋白質(zhì)，其中所述Pep組件包含陽離子抗微生物肽序列。14.根據(jù)權(quán)利要求13的前體蛋白質(zhì)，其中所述Pep組件包含選自陽離子氨基酸序列SEQIDNO6至SEQIDNO:15、SEQIDNO23,SEQIDNO26及SEQIDNO69至SEQIDNO72的氨基酸序列。15.根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項的前體蛋白質(zhì)，其中所述Pep組件包含選自氨基酸序列SEQIDNO:20或SEQIDNO:29至67的氨基酸序列。16.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的前體蛋白質(zhì)，其中所述Aux組件彼此獨立地具有任一以下含義SA,SA-SU，SU-SA,SA-SU-SA,SU-SA-SU，其中所述組件SA與SU以肽鍵連接彼此，且所述Aux組件在末端以肽鍵連接于至少一個Pep組件，且連接于所述Pep組件的此肽鍵可依化學(xué)方式或酶促方式特異性裂解。17.一種核酸序列，其編碼至少一種根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的前體蛋白質(zhì)。18.根據(jù)權(quán)利要求17的核酸序列，其包含序列SEQIDNO:21、24、27、74及76的至少一種編碼序列。19.一種表達盒，其包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求17或18的核酸序列，該至少一種核酸序列可操作性連接于至少一種調(diào)節(jié)核酸序列。20.一種用于轉(zhuǎn)化真核或原核宿主的重組載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求17及18中任一項的核酸序列，或根據(jù)權(quán)利要求19的表達盒。21.一種產(chǎn)生所需肽(P印)的方法，其包括a)產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求I至16中任一項的前體蛋白質(zhì)，及b)自該前體蛋白質(zhì)移除所述Pep肽。22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中在攜帶至少一種根據(jù)權(quán)利要求19的載體的重組微生物中產(chǎn)生所述前體蛋白質(zhì)。23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中在重組大腸桿菌菌株中產(chǎn)生所述前體蛋白質(zhì)。24.根據(jù)權(quán)利要求21至23中任一項的方法，其中任選在所述表達的前體蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定締合形式后，將其純化且依化學(xué)方式或酶促方式裂解，以釋放該所需肽(Pep)。25.一種前體蛋白質(zhì)，其包含所需肽(Pep)組件及輔助肽(Aux’)組件的可裂解序列，具有通式(Pep-Aux’)x或(Aux，-Pep)x其中x>1，其中所述Aux’組件為相同或不同的且包含形成兩親性α-螺旋的肽，所述兩親性肽包含能夠形成兩親性α-螺旋的至少七個以肽鍵連接的氨基酸的序列區(qū)段，其中所述螺旋的氨基酸殘基在垂直投影中分為該螺旋的疏水性半部及親水性半部，該螺旋的疏水性半部具有至少3個相鄰(在該垂直投影中)的相同或不同的疏水性氨基酸殘基，且該螺旋的親水性半部具有至少3個相鄰(在該垂直投影中)的相同或不同的親水性氨基酸殘基；且所述Pep組件為相同或不同的且包含相同或不同肽分子的氨基酸序列。26.根據(jù)權(quán)利要求25的前體蛋白質(zhì)，其中所述Aux’組件包含至少一個根據(jù)權(quán)利要求4至6中任一項中所定義的自組裝肽(SA)組件。27.根據(jù)權(quán)利要求25或26的前體蛋白質(zhì)，其中所述所需肽(Pep)為陽離子抗微生物肽，且所述Aux’組件為形成兩親性α-螺旋的陰離子肽。28.一種兩親性肽的用途，其作為保護性肽用于重組產(chǎn)生與其不同的所需抗微生物肽；其中所述兩親性肽包含能夠形成兩親性α螺旋的至少七個以肽鍵連接的氨基酸的序列區(qū)段，其中所述螺旋的氨基酸殘基在垂直投影中分為該螺旋的疏水性半部及親水性半部，該螺旋的疏水性半部具有至少3個相鄰(在該垂直投影中)的相同或不同的疏水性氨基酸殘基，且該螺旋的親水性半部具有至少3個相鄰(在該垂直投影中)的相同或不同的親水性氣基酸殘基。29.根據(jù)權(quán)利要求28的用途，其中所述所需肽(P印)為陽離子抗微生物肽，且所述Aux’組件為形成兩親性α-螺旋的陰離子肽。全文摘要本發(fā)明涉及重復(fù)自組裝前體蛋白質(zhì)、編碼其的核酸序列及表達構(gòu)建體、及使用此類前體蛋白質(zhì)重組產(chǎn)生肽的方法。文檔編號C12N15/62GK102724992SQ201080033646公開日2012年10月10日申請日期2010年6月2日優(yōu)先權(quán)日2009年6月3日發(fā)明者B·利布曼,C·施瓦爾布,D·許梅里希,H·布呂澤,M·費爾申請人:巴斯夫歐洲公司