專利名稱：細(xì)菌(柔膜細(xì)菌)污染的改良檢測(cè)的制作方法
細(xì)菌(柔膜細(xì)菌)污染的改良檢測(cè)本發(fā)明提供了通過(guò)抑制非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物改良的基于PCR的靶序列擴(kuò)增。改良涉及使用被最佳化以在第一種生物的基因組DNA的背景中擴(kuò)增污染物的核酸的引物對(duì)。當(dāng)對(duì)懷疑包含污染物的來(lái)自第二種生物的DNA實(shí)施相同的基于PCR的擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，當(dāng)?shù)谝环N生物的基因組DNA的量存在于擴(kuò)增反應(yīng)中時(shí)，污染物的檢測(cè)靈敏度和特異性增強(qiáng)。
背景技術(shù)：
支原體屬(Mycoplasma)是屬于缺乏細(xì)胞壁的柔膜體綱的細(xì)菌屬。沒有細(xì)胞壁， 支原體屬細(xì)菌不受靶向原核細(xì)胞壁合成的許多常見抗生素影響，所述抗生素例如青霉素或其他β-內(nèi)酰胺抗生素。存在超過(guò)100種公認(rèn)的支原體屬物種，柔膜體綱(Mollicutes) 中的幾個(gè)屬之一。柔膜細(xì)菌是人、其他動(dòng)物(包括昆蟲)和植物的寄生蟲或共生體；支原體屬通過(guò)定義被限定于脊椎動(dòng)物宿主。膽固醇是支原體屬以及柔膜細(xì)菌(mollicutes)的某些其他屬的物種生長(zhǎng)所需的。它們的最佳生長(zhǎng)溫度通常是其宿主的溫度，如果是溫血的 (warmbodied)(例如在人中37°C )，或環(huán)境溫度，如果宿主不能調(diào)節(jié)其自身內(nèi)部溫度。16S 核糖體RNA序列的分析以及基因含量強(qiáng)烈暗示柔膜細(xì)菌包括支原體與系統(tǒng)樹的乳桿菌屬 (Lactobacillus)或梭菌屬(Clostridium)分支(在嚴(yán)格意義上厚壁菌門(Firmicutes)) 緊密相關(guān)。支原體屬物種通常在研究實(shí)驗(yàn)室中作為細(xì)胞培養(yǎng)中的污染物發(fā)現(xiàn)。支原體細(xì)胞培養(yǎng)污染可以由于來(lái)自個(gè)體的污染或污染的細(xì)胞培養(yǎng)基成分而發(fā)生。支原體細(xì)胞物理上是很小的-小于ι μ m-并且它們因此難以用常規(guī)顯微鏡檢測(cè)。支原體可以誘導(dǎo)細(xì)胞改變，包括染色體畸變、代謝和細(xì)胞生長(zhǎng)中的改變。嚴(yán)重支原體感染具有破壞細(xì)胞系的潛力。支原體還涉及作為許多疾病中的病原體。肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae) 是社區(qū)獲得性肺炎的主要成因劑。螺原體屬(Spiroplasma)物種通過(guò)分子和血清學(xué)研究近期已與傳播性海綿狀腦病(TSEs)關(guān)聯(lián)(Bastian, F. 0. , J Neuropathol Exp Neurol 64(2005)833-838)。然而， 螺原體屬物種與TSh的關(guān)系仍是有爭(zhēng)議的，例如考慮到檢測(cè)受綿羊瘋癢病感染的倉(cāng)鼠腦中螺原體的任何足跡的rRNA種類的參與者不知情研究的失敗(Alexeeva，〗.，等人，J Clin Microbiol 44 0006)91-97)。然而，在考慮中的TSh包括綿羊中的綿羊瘋癢病、鹿中的慢性消耗性疾病(CWD)和人中的克雅氏病。顱內(nèi)接種到綿羊和山羊內(nèi)的從受綿羊瘋癢病侵襲的綿羊腦和受CWD侵襲的鹿腦中分離的螺旋體屬物種誘導(dǎo)非常類似這些動(dòng)物中的天然TSE 的海綿狀腦病。這些數(shù)據(jù)明確顯示螺原體與TSE相關(guān)。顯示螺原體屬細(xì)菌在含胚卵中生長(zhǎng)且可以在此類培養(yǎng)系統(tǒng)中傳代(Bastian， F. 0.，等人，Journal of Medical Microbiology 56(2007) 1235-1242) 含胚卵在疫苗生產(chǎn)中起主要作用。例如，針對(duì)流行性感冒的人疫苗已可用幾乎60 年，并且直到最近，幾乎完全由在9到11天齡的含胚雞卵的尿囊腔中生長(zhǎng)的病毒進(jìn)行制備。 因此，螺原體的致病性潛力使得柔膜體綱病原體的檢測(cè)成為用于確保由含胚卵制備的任何產(chǎn)物的安全的首要重要的工具。此外，在生物藥物生產(chǎn)、細(xì)胞療法和組織工程過(guò)程中支原體污染的可能性尤其是主要問(wèn)題。由全世界的藥典和藥物管理機(jī)構(gòu)要求的常規(guī)檢測(cè)法使用在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)，以鑒定污染生物。這些基于培養(yǎng)的技術(shù)要求長(zhǎng)時(shí)間以達(dá)到結(jié)果。此外，某些支原體屬物種的培養(yǎng)可能是不可能或不可靠的。因此，需要改良且特別是更快速和可靠的微生物測(cè)定。Eldering, J. A.，等人，Biologicals 32 (2004) 183-193 公開了用于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞培養(yǎng)的支原體測(cè)試的PCR法。測(cè)試的原理是首先分離來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)(細(xì)胞和上清液) 的基因組DNA，并且其次使用對(duì)于支原體屬物種的16S-rRNA基因中的區(qū)域特異的引物和分離的DNA作為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。在陽(yáng)性結(jié)果的情況下，形成且檢測(cè)到對(duì)應(yīng)于靶向區(qū)域的擴(kuò)增產(chǎn)物。當(dāng)未形成擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，獲得陰性結(jié)果。在該方法中使用的引物是先前公開的通用支原體引物(Wong-Lee，J.G.和 Lovett, Μ. , "Rapid and sensitive PCR method for identification of Mycoplasma species in tissue culture "in !Diagnostic molecular microbiology-principles and applications ；Persing, DH, Smith, TF, Tenover, FC, White, TJ(編輯),Washington, DC, American Society for Microbiology (1993) 257J60)。Eldering，J. A.，等人(同上)的方法是測(cè)定最佳化的結(jié)果且組合了改善支原體檢測(cè)的靈敏度和特異性的6個(gè)要素(1)用于與支原體基因組的擴(kuò)增物比較具有不同大小的PCR產(chǎn)物的陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒，(2)從懷疑被支原體細(xì)菌污染的細(xì)胞培養(yǎng)中分離的DNA的純化和濃縮，(3)熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶的使用，⑷其中應(yīng)用從70到60°C的退火溫度梯度的所謂降落PCR技術(shù)的使用，(5)PCR試劑的凈化，和(6)專用設(shè)備和材料的使用。值得注意的是，關(guān)于所述最佳化PCR法的要素2，作者選擇用于DNA純化和濃縮的方法，其包括步驟(a)裂解細(xì)胞培養(yǎng)(細(xì)胞和培養(yǎng)基)，和(b)用乙醇沉淀來(lái)自裂解物的DNA 且分離沉淀的DNA。進(jìn)一步公開的是此類沉淀法比使用旋轉(zhuǎn)柱的用于DNA純化的可替代方法具有優(yōu)勢(shì)。旋轉(zhuǎn)柱一般含有具有二氧化硅表面的過(guò)濾材料。例如通過(guò)離心，通過(guò)使緩沖液經(jīng)過(guò)旋轉(zhuǎn)柱，使溶解于任選還含有醇的高鹽和/或離液緩沖液中的DNA與過(guò)濾材料結(jié)合。在后續(xù)步驟中，DNA可以使用非離液低鹽緩沖液或純水從過(guò)濾材料中洗脫。在最佳化研究中，獲得與可能存在于旋轉(zhuǎn)柱中的痕量污染物一致的結(jié)果。當(dāng)柱與CHO基因組DNA接觸時(shí)，從旋轉(zhuǎn)柱中去除痕量污染物。CHO基因組DNA的可能作用描述為用于污染物的載體的那種作用?；贓ldering，J. Α.，等人(同上)的發(fā)現(xiàn)和其中公開的工作流程，Roche Applied Science (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)已進(jìn)一步最佳化且開發(fā)了 MYC0T00L測(cè)試試劑盒。使用測(cè)試試劑盒進(jìn)行的測(cè)定提供了用于細(xì)胞和無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)的高度靈敏的支原體測(cè)定。MYC0T00L特別涉及藥物質(zhì)量控制。先前研究涉及來(lái)自16S rRNA基因特異性引物的PCR生成的人工產(chǎn)物(Osborne， C. Α.，等人，F(xiàn)EMS Microbiology Letters 248(2005) 183-187) 得出結(jié)論使用特定引物對(duì)生成的人工產(chǎn)物可以通過(guò)使用用于擴(kuò)增反應(yīng)的不同引物來(lái)避免。本發(fā)明的發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)其中MYC0T00L測(cè)定的PCR產(chǎn)生可以是人工產(chǎn)物的片段的偶然情況(參見實(shí)施例)。注意到Eldering，J. Α.，等人(同上)的最佳化測(cè)定以及特別是其中使用的引物基本上構(gòu)成用于柔膜細(xì)菌的極佳檢測(cè)系統(tǒng)的事實(shí)，本發(fā)明的目的是改善 PCR方法，從而使得無(wú)關(guān)擴(kuò)增物的出現(xiàn)降到最低。特別地達(dá)到這種預(yù)期效應(yīng)而不改變引物的序列。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，一個(gè)或多個(gè)上述目的通過(guò)本發(fā)明的實(shí)施方案滿足。本發(fā)明的第一個(gè)方面是用于測(cè)定具有生物學(xué)材料的液體樣品中細(xì)菌污染物的存在或不存在的改良方法，所述方法包括以下步驟(a)處理樣品且純化來(lái)自經(jīng)處理的樣品的核酸，隨后為(b)形成用于基于PCR的擴(kuò)增反應(yīng)的組合物(反應(yīng)混合物)，該組合物包括-根據(jù)SEQ IDNO 1的第一種引物、-根據(jù)SEQ ID NO 2的第二種引物，和_步驟(a)的純化核酸或其測(cè)量的部分作為模板；隨后為(c)用步驟(b)的組合物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)；隨后為(d)檢測(cè)擴(kuò)增的靶序列的存在或不存在，由此其中所述擴(kuò)增的靶序列的存在指示樣品中細(xì)菌污染物的存在，并且所述擴(kuò)增的靶序列的不存在指示樣品中細(xì)菌污染物的不存在；改良的特征在于相對(duì)于樣品的體積，將來(lái)自CHO細(xì)胞的預(yù)定量的DNA加入(i)樣品、或(ii)步驟(a)的經(jīng)處理的樣品、或(iii)在步驟(a)中獲得的純化核酸、或(iv)步驟(b)的組合物中，由此所加入的來(lái)自CHO細(xì)胞的DNA減少步驟(d)中的非特異性擴(kuò)增。 本發(fā)明的第二個(gè)方面是包含來(lái)自含胚卵的羊膜液和來(lái)自CHO細(xì)胞的DNA的組合物。本發(fā)明的第三個(gè)方面是組合物，其包含(i)來(lái)自樣品的純化核酸，所述樣品選自羊膜液、真核細(xì)胞的懸液和來(lái)自真核細(xì)胞的懸液的上清液，和(ii)不含原核DNA的來(lái)自CHO細(xì)胞的DNA。本發(fā)明的第四個(gè)方面是根據(jù)本發(fā)明的組合物在用于擴(kuò)增來(lái)自從樣品中分離的DNA的原核污染物的DNA的方法中的用途，所述樣品選自羊膜液、真核細(xì)胞的懸液和來(lái)自真核細(xì)胞的懸液的上清液。本發(fā)明的第五個(gè)方面是試劑盒，其在分開的容器中包含(i)裂解試劑，(ii) 以預(yù)定濃度的來(lái)自CHO細(xì)胞的純化DNA，所述DNA不含原核DNA，和(iii)根據(jù)SEQ IDNO 1的第一種引物和根據(jù)SEQ ID NO :2的第二種引物。本發(fā)明的第六個(gè)方面是用于進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的改良方法，其中通過(guò)DNA聚合酶催化的一對(duì)寡核苷酸引物延伸形成具有范圍為約IOObp-約1500bp大小的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，所述引物各自與一種或多種原核生物的16S-rRNA的基因組互補(bǔ)體中包含的靶序列雜交，其中所述寡核苷酸引物對(duì)能夠在PCR 中形成來(lái)自第一種模板的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，所述PCR在預(yù)定條件(R)下在具有預(yù)定組合物的反應(yīng)混合物(Q)進(jìn)行，并且所述第一種模板包含第一種真核生物的基因組DNA和所述一種或多種原核生物的基因組DNA，并且其中在所述PCR中，所述寡核苷酸引物對(duì)在相同條件 (R)下在反應(yīng)混合物⑴)中不形成來(lái)自第二種模板的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中在所述第二種模板中， 不存在所述一種或多種原核生物的基因組DNA，但包含第一種真核生物的基因組DNA，該改良方法包括以下步驟(a)提供所述寡核苷酸引物對(duì)；(b)提供所述第一種真核生物的基因組DNA ； (c)提供包含第二種真核生物的基因組DNA的第三種模板，所述第二種真核生物被懷疑含有所述一種或多種原核生物的基因組DNA ； (d)在所述反應(yīng)混合物(Q)中混合(a)的所述引物對(duì)、(c)的所述第三種模板、和(b)的所述第一種真核生物的所述基因組DNA的測(cè)量的量，和在條件(R)下進(jìn)行PCR;其中非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的形成被抑制。發(fā)明詳述在本發(fā)明的說(shuō)明書中，某些術(shù)語(yǔ)以特定含義使用，或首次得到定義。為了本發(fā)明的目的，使用的術(shù)語(yǔ)通過(guò)其領(lǐng)域公認(rèn)的定義進(jìn)行定義，當(dāng)存在此類情況時(shí)，除這些定義與下文所述的定義沖突或部分沖突外。在定義中沖突的情況下，術(shù)語(yǔ)的含義首先通過(guò)下文所述的任何定義進(jìn)行定義。術(shù)語(yǔ)“包含”在本發(fā)明的說(shuō)明書和權(quán)利要求中用于意指“包括但不一定限于”。
冠詞“a”和“an”在本文中用于指冠詞的一個(gè)或超過(guò)一個(gè)(即至少一個(gè))語(yǔ)法目標(biāo)。例如，“微生物”意指一種微生物或超過(guò)一種微生物。當(dāng)指定數(shù)值范圍例如濃度范圍時(shí)，范圍可以通過(guò)單詞“在......之間”指示，隨后
為第一個(gè)值Ii1、單詞“和”和第二個(gè)值n2。此外，指定范圍可以通過(guò)表達(dá)“在Ii1-Ii2的范圍中” 指示。如果沒有另外說(shuō)明，那么當(dāng)指示指定范圍時(shí)，指定范圍的較低邊界應(yīng)理解為該值等于或高于第一個(gè)值。指定范圍的較高邊界應(yīng)理解為該值等于或小于第二個(gè)值”。因此，在指定范圍中的值χ通過(guò)Ii1彡χ彡n2給出。此外，應(yīng)當(dāng)理解與數(shù)值η組合的術(shù)語(yǔ)“約”指示在通過(guò)該值的數(shù)值士5%給出的間隔中的值X，即η-ο. 05*η彡χ彡η+0. 05*η。在與數(shù)值η組合的術(shù)語(yǔ)“約”描述本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案的情況下，如果沒有另外說(shuō)明，那么η的值是最優(yōu)選的。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“樣品”指復(fù)雜樣品，更優(yōu)選生物學(xué)樣品，即具有生物學(xué)材料的樣品。樣品可以含有希望與生物學(xué)材料中包含的核酸分離的多種有機(jī)和無(wú)機(jī)化合物。術(shù)語(yǔ) “樣品”還涵蓋含有衍生自其他來(lái)源的核酸的水溶液，例如來(lái)自化學(xué)或酶促反應(yīng)混合物，或來(lái)自生物學(xué)樣品材料的先前純化。從其中純化核酸的術(shù)語(yǔ)生物學(xué)樣品涵蓋包含病毒或細(xì)菌細(xì)胞的樣品，以及來(lái)自多細(xì)胞生物的分離細(xì)胞例如人和動(dòng)物細(xì)胞，以及組織的原始培養(yǎng)物和細(xì)胞系的培養(yǎng)物，以及其上清液和沖洗。本發(fā)明還涵蓋生物學(xué)樣品例如來(lái)自人或動(dòng)物體的流體。特別地，樣品可以是全血、血液血清、血液血漿、大腦流體、唾液、糞便、活組織檢查標(biāo)本、骨髓、經(jīng)口沖洗、組織、尿及其混合物。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選樣品是“液體樣品”，即樣品處于流動(dòng)狀態(tài)，并且樣品流體包含水和生物學(xué)材料。生物學(xué)材料優(yōu)選包含細(xì)胞或細(xì)胞組分。非常優(yōu)選的，根據(jù)本發(fā)明的液體樣品選自細(xì)胞培養(yǎng)上清液、培養(yǎng)細(xì)胞的懸液和羊膜液。更加優(yōu)選的，羊膜液來(lái)自含胚禽類卵。為了本發(fā)明的目的，與“液體樣品”組合的術(shù)語(yǔ)“處理”或“經(jīng)處理的”含義是通過(guò)加入一種或多種化合物，并且使一種或多種化合物與液體樣品混合來(lái)處理樣品，從而得到 “經(jīng)處理的樣品”?？梢杂糜诖祟愄幚淼膬?yōu)選化合物選自去垢劑、表面活性劑、有機(jī)溶劑、離液劑、蛋白酶和核酸酶抑制備物。根據(jù)本發(fā)明的“離液劑”是擾亂液態(tài)水的有序結(jié)構(gòu)的任何化學(xué)物質(zhì)。離液劑還促進(jìn)蛋白質(zhì)的解折疊、延伸和解離(Dandliker，W.，B.和de Saussure, V. , A. , In :The Chemistry of Biosurfaces, Hair, Μ. , L.,編輯，Marcel Dekker, Inc. New York (1971)第 18 頁(yè))。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選經(jīng)處理的樣品是裂解物?！傲呀馕铮?，或“裂解樣品”可以得自包含細(xì)胞(a comprising cells)，優(yōu)選微生物細(xì)胞，和非常優(yōu)選的細(xì)菌細(xì)胞，其中存在的細(xì)胞的大量部分的結(jié)構(gòu)完整性被破壞。為此，如果存在，那么細(xì)胞壁必須被破壞。為了釋放被破壞的細(xì)菌細(xì)胞的內(nèi)容物，用某些試劑處理材料，以崩解、使得多孔、溶解、降解或變性微生物細(xì)胞的細(xì)胞壁。此外，細(xì)胞膜必須被破壞。為了釋放細(xì)胞、組織或更一般地來(lái)自生物學(xué)樣品中包含的顆粒的內(nèi)容物，材料可以用酶或用化學(xué)制品進(jìn)行處理，溶解、降解或變性此類生物的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜。在任何此類情況下，裂解(“裂解的”)過(guò)程還將破壞細(xì)菌污染物的結(jié)構(gòu)完整性，從而釋放污染物的核酸。對(duì)于裂解過(guò)程，當(dāng)核酸在該過(guò)程中釋放時(shí)，通常使用離液劑例如胍鹽和/或陰離子、陽(yáng)離子、兩性離子或非離子型去污劑。使用快速降解具有溶核活性的酶和其他不需要的蛋白質(zhì)的蛋白酶也是有利的。在殘留微粒即在裂解過(guò)程后樣品材料的未溶解物質(zhì)的情況下，粒性物質(zhì)可以與裂解物分開，以導(dǎo)致澄清的裂解物。這可以例如通過(guò)過(guò)濾或離心完成。 因此，術(shù)語(yǔ)“裂解物”涵蓋澄清裂解液。來(lái)自經(jīng)處理的樣品的“核酸的純化”可以使用其為標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)的廣泛多樣的方法完成。這些可以包括例如使用醇從水溶液中沉淀核酸(用乙醇或異丙醇的沉淀是本領(lǐng)域眾所周知的)和沉淀物的分離。其他方法包括核酸吸附到固相(例如具有氧化表面例如二氧化硅)上，分離固相，隨后為從固相中洗脫核酸?！熬酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)”(“PCR”)是用于擴(kuò)增特定靶DNA序列的單個(gè)或少數(shù)拷貝跨越幾個(gè)數(shù)量級(jí)的技術(shù)，其中生成DNA序列的拷貝。PCR依賴于熱循環(huán)，由反應(yīng)混合物的反復(fù)加熱和冷卻循環(huán)組成，從而實(shí)現(xiàn)DNA解鏈和DNA的酶促?gòu)?fù)制。含有與靶DNA序列互補(bǔ)的序列的引物(DNA寡核苷酸)連同DNA聚合酶一起是致使選擇性和反復(fù)擴(kuò)增成為可能的關(guān)鍵組分。隨著PCR進(jìn)展，生成的DNA自身用作模板用于復(fù)制，啟動(dòng)其中DNA模板指數(shù)擴(kuò)增的鏈反應(yīng)。在這點(diǎn)上的“反應(yīng)混合物”包含DNA聚合酶、dNTP、離子、緩沖液和實(shí)現(xiàn)與靶DNA序列雜交(退火)的引物延伸所需的所有其他化合物。本發(fā)明人已得出結(jié)論在由ElderingJ. A·，等人(同上)公開的方法中，對(duì)于測(cè)定細(xì)菌污染物的存在或不存在關(guān)鍵的PCR條件是對(duì)于CHO (中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)細(xì)胞培養(yǎng)和/或培養(yǎng)上清液專一地最佳化的。此外，本發(fā)明人已觀察到根據(jù)SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的引物對(duì)偶然產(chǎn)生無(wú)關(guān)擴(kuò)增或人工產(chǎn)物(即對(duì)于大小不同于所需靶DNA片段的片段的非特異性擴(kuò)增)。這特別是當(dāng)從來(lái)自衍生自其他動(dòng)物物種或人的細(xì)胞培養(yǎng)的樣品材料制備的DNA 用作模板時(shí)的情況。在此類設(shè)置中，本發(fā)明基于其上的基礎(chǔ)觀察是當(dāng)PCR在CHO細(xì)胞DNA 的存在下進(jìn)行時(shí)，PCR人工產(chǎn)物的形成可以被抑制。然而，這種所需技術(shù)效應(yīng)要求CHO細(xì)胞 DNA不含由細(xì)菌DNA的污染，所述細(xì)菌DNA可以通過(guò)所述引物對(duì)擴(kuò)增。因此，以最廣泛的含義，本發(fā)明的第一個(gè)方面是用于進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的改良方法，其中通過(guò)DNA聚合酶催化的一對(duì)寡核苷酸引物延伸(PCR)形成具有范圍為約IOObp-約1500bp大小的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，所述引物各自與一種或多種原核生物的 16S-rRNA的基因組互補(bǔ)體中包含的靶序列雜交，其中所述寡核苷酸引物對(duì)能夠在PCR中形成來(lái)自第一種模板的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物， 所述PCR在預(yù)定條件(R)下在具有預(yù)定組合物的反應(yīng)混合物(Q)進(jìn)行，并且所述第一種模板包含第一種真核生物的基因組DNA和所述一種或多種原核生物的基因組DNA，并且其中在所述PCR中，所述寡核苷酸引物對(duì)在相同條件(R)下在反應(yīng)混合物⑴) 中不形成來(lái)自第二種模板的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中在所述第二種模板中，不存在所述一種或多種原核生物的基因組DNA，但包含第一種真核生物的基因組DNA，該改良方法包括以下步驟(a)提供所述寡核苷酸引物對(duì)；(b)提供所述第一種真核生物的基因組DNA ；(c)提供包含第二種真核生物的基因組DNA的第三種模板，所述第二種真核生物被懷疑含有所述一種或多種原核生物的基因組DNA ；(d)在反應(yīng)混合物(Q)中混合(a)的所述引物對(duì)、(C)的所述第三種模板、和(b) 的所述第一種真核生物的所述基因組DNA的測(cè)量的量，和在條件(R)下進(jìn)行PCR;
其中非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的形成被抑制。在本發(fā)明的背景中，PCR的條件(R)反映參數(shù)包括溫度方案、孵育時(shí)間、PCR循環(huán)數(shù)目和PCR領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他物理參數(shù)。反應(yīng)混合物(Q)包含PCR過(guò)程與之一起進(jìn)行的最終混合物的所有組分，包括引物延伸所需的所有化合物。反應(yīng)混合物(Q)還包括各自以其分別的預(yù)定濃度的引物對(duì)。為了明確起見，以這種意義的反應(yīng)混合物(Q)不包含分開添加的模板DNA。模板DNA這樣加入，使得在最終混合物(即在模板DNA的添加后)中，所有其他組分的濃度是等同的，不管使用何種模板。根據(jù)本發(fā)明，含有另一種生物而不是CHO細(xì)胞的基因組DNA的模板另外必須含有以測(cè)量的量即以預(yù)定濃度的CHO細(xì)胞DNA。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸對(duì)與多個(gè)原核物種雜交，并且0-3個(gè)錯(cuò)配可能在引物與其16S-rRNA基因的靶區(qū)域的雜交中發(fā)生。在任何此類情況下，任何錯(cuò)配 (如果存在的話)排除末端核苷酸，提供分別寡核苷酸的3’ -OH基團(tuán)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述一種或多種原核生物是選自柔膜體綱物種、芽孢桿菌屬(Bacillus)物種、梭菌屬物種、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)物種、微球菌屬(Micrococcus)物種、葡萄球菌屬Staphylococcus)物種和鏈球菌屬 Streptococcus)物種的物種。更加優(yōu)選的，物種是柔膜體綱物種。更加優(yōu)選的，物種是支原體屬物種，更加優(yōu)選的，物種選自豬鼻支原體(M. hyorhinis)、精氨酸支原體(M. arginini)、肺炎支原體、發(fā)酵支原體(M. fermentans)、口腔支原體(M. orale) 和梨形支原體(M.pirum)，或物種是無(wú)膽甾原體屬(Achol印lasma)物種，更加優(yōu)選萊氏無(wú)膽甾原體(Achol印lasma laidlawii)，或物種是螺原體屬物種，更加優(yōu)選非凡螺原體 (Spiroplasma mirium)。在本發(fā)明的一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一種真核生物是CHO細(xì)胞或包含多個(gè)CHO細(xì)胞的培養(yǎng)物。更加優(yōu)選的，所述引物對(duì)包含SEQ ID NO :1和SEQ ID N0:2之一，
或兩者。在本發(fā)明的一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，條件(R)和反應(yīng)混合物(Q)是在 MYC0T00L測(cè)試試劑盒的手冊(cè)中描述的通過(guò)Roche Diagnostics GmbH, Mannheim(德國(guó)) MYC0T00L 測(cè)定。本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案在下述項(xiàng)目列表中給出1.用于測(cè)定液體樣品中細(xì)菌污染物的存在或不存在的改良方法，所述方法包括以下步驟(a)處理樣品且純化來(lái)自經(jīng)處理的樣品的核酸，隨后為(b)形成用于基于PCR的擴(kuò)增反應(yīng)的組合物，該組合物包括-根據(jù)SEQID NO 1的第一種引物、-根據(jù)SEQID NO 2的第二種引物，和-步驟(a)的純化核酸或其測(cè)量的部分作為模板；隨后為(c)用步驟(b)的組合物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，由此擴(kuò)增原核16S-rRNA基因中包含的靶序列，如果存在于模板中的話；隨后為(d)檢測(cè)擴(kuò)增的靶序列的存在或不存在，由此所述擴(kuò)增的靶序列的存在指示樣品中細(xì)菌污染物的存在，并且所述擴(kuò)增的靶序列的不存在指示樣品中細(xì)菌污染物的不存在；
改良的特征在于相對(duì)于樣品的體積，將來(lái)自CHO細(xì)胞的預(yù)定量的DNA加入(i)樣品、或(ii)步驟(a)的經(jīng)處理的樣品、或(iii)在步驟(a)中獲得的純化核酸、或(iv)步驟(b)的組合物中，由此所加入的來(lái)自CHO細(xì)胞的DNA減少步驟(d)中的非特異性擴(kuò)增。2.項(xiàng)目1的方法，其特征在于每ml液體樣品的預(yù)定量DNA是來(lái)自約5xl06個(gè)CHO 細(xì)胞的DNA含量。3.根據(jù)項(xiàng)目1和2中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述液體樣品選自具有培養(yǎng)的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基、無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)上清液和羊膜液。4.根據(jù)項(xiàng)目3的方法，其特征在于所述液體樣品是羊膜液。5.根據(jù)項(xiàng)目4的方法，其特征在于所述羊膜液來(lái)自含胚卵。6.根據(jù)項(xiàng)目1-5中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述細(xì)菌污染物是選自無(wú)膽留原體屬、芽孢桿菌屬、梭菌屬、棒狀桿菌屬、微球菌屬、支原體屬、螺原體屬、葡萄球菌屬和鏈球菌屬的屬。7.根據(jù)項(xiàng)目6的方法，其特征在于所述細(xì)菌污染物是選自豬鼻支原體、精氨酸支原體、肺炎支原體、發(fā)酵支原體、口腔支原體和梨形支原體的支原體屬物種，或所述細(xì)菌污染物是萊氏無(wú)膽留原體，或所述細(xì)菌污染物是非凡螺原體。8.組合物，其包含來(lái)自含胚卵的羊膜液和來(lái)自CHO細(xì)胞的DNA。9.根據(jù)任何項(xiàng)目8的組合物，其進(jìn)一步包含選自離液劑和蛋白酶的裂解試劑。10.組合物，其包含(i)來(lái)自樣品的純化核酸，所述樣品選自羊膜液、真核細(xì)胞的懸液和來(lái)自真核細(xì)胞的懸液的上清液，和(ii)不含原核DNA的來(lái)自CHO細(xì)胞的DNA。11.根據(jù)項(xiàng)目10的組合物，其進(jìn)一步包含根據(jù)SEQ ID NO 1的第一種引物、根據(jù) SEQ ID NO :2的第二種引物、核苷酸三磷酸和耐熱的DNA聚合酶。12.根據(jù)項(xiàng)目11的組合物，其進(jìn)一步包含嵌入染料。13.試劑盒，其在分開的容器中包含⑴裂解試劑，(ii)以預(yù)定濃度的來(lái)自CHO細(xì)胞的純化DNA，所述DNA不含原核DNAJP (iii)根據(jù)SEQ ID NO 1的第一種引物和根據(jù)SEQ ID NO 2的第二種引物。14.根據(jù)項(xiàng)目10-12中任一項(xiàng)的組合物用于擴(kuò)增原核污染物的DNA的用途，所述原核污染物的DNA來(lái)自從樣品中分離的DNA，所述樣品選自羊膜液、真核細(xì)胞的懸液和來(lái)自真核細(xì)胞的懸液的上清液。15.用于進(jìn)行改良聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的改良方法，其中通過(guò)DNA聚合酶催化的一對(duì)寡核苷酸引物延伸形成具有范圍為約IOObp-約 1500bp大小的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，所述引物各自與一種或多種原核生物的16S-rRNA的基因組互補(bǔ)體中包含的靶序列雜交，其中所述寡核苷酸引物對(duì)能夠在PCR(P)中形成來(lái)自第一種模板的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，所述PCR(P)在預(yù)定條件(R)下在具有預(yù)定組合物的反應(yīng)混合物(Q)進(jìn)行，并且所述第一種模板包含第一種真核生物的基因組DNA和所述一種或多種原核生物的基因組DNA，并且其中在P中，所述寡核苷酸引物對(duì)在相同條件(R)下在反應(yīng)混合物⑴)中不形成來(lái)自第二種模板的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中在所述第二種模板中，不存在所述一種或多種原核生物的基因組DNA，但包含第一種真核生物的基因組DNA，所述改良方法包括以下步驟
(a)提供所述寡核苷酸引物對(duì)和所述第一種真核生物的基因組DNA ；(b)提供包含第二種真核生物的基因組DNA的第三種模板，所述第二種真核生物被懷疑含有所述一種或多種原核生物的基因組DNA ；(c)在所述反應(yīng)混合物(Q)中混合(a)的所述引物對(duì)、(d)的所述第三種模板、和所述第一種真核生物的所述基因組DNA的測(cè)量的量，和在條件(R)下進(jìn)行PCR;其中非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的形成被抑制。序列表描述SEQ ID NO 1用于檢測(cè)支原體屬和相關(guān)物種的通用引物(正向)；先前公開于 Wong-Lee, J. G.禾口 Lovett, Μ. , "Rapid and sensitive PCR method for identification of Mycoplasma species in tissue culture，，中Diagnostic molecular microbiology-principles and applications ；Persing, DH, Smith, TF, Tenover, FC, White, TJ (編輯)Washington，DC, American Society for Microbiology (1993) 257-260, 和 Eldering, J. A.，等人，Biologicals 32 (2004) 183-193。SEQ ID NO :2用于檢測(cè)支原體屬和相關(guān)物種的通用引物(反向)；先前公開于 Wong-Lee, J. G.，等人(同上)和 Eldering, J. A.，等人(同上)中。SEQ ID NO 3對(duì)于甘油醛3_磷酸脫氫酶基因中的靶序列(對(duì)照序列)特異的正向引物。SEQ ID NO 4對(duì)于甘油醛3_磷酸脫氫酶基因中的靶序列(對(duì)照序列)特異的反向引物。附圖描述

圖1泳道注釋/稀釋度1-5GAPDH對(duì)照PCR ；從MDCK細(xì)胞中分離的DNA，無(wú)CHO細(xì)胞DNA，用萊氏無(wú)膽甾原體DNA摻加1未稀釋的2 KT13 10 24 10 35 10 46大小標(biāo)記(50bp間隔(st印s))7-1IGAPDH對(duì)照PCR ；從MDCK細(xì)胞中分離的DNA，無(wú)CHO細(xì)胞DNA，未摻加7 KT18 10 29 IO 310 1(Γ411大小標(biāo)記(50bp間隔)圖2泳道注釋/稀釋度1-5GAPDH對(duì)照PCR ；從MDCK細(xì)胞中分離的DNA，加入CHO細(xì)胞DNA，用萊氏無(wú)膽甾原體DNA摻加1未稀釋的
2 KT13 IO 24 IO 35 IO 46大小標(biāo)記(50bp間隔)7-11 GAPDH對(duì)照PCR ；從MDCK細(xì)胞中分離的DNA，加入CHO細(xì)胞DNA，未摻加7 KT18 1(Γ29 IO 310 1(Γ411大小標(biāo)記(50bp間隔)圖3泳道注釋/稀釋度1-8如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2中的引物；從ASC分離的DNA，用口腔支原體 DNA摻加，無(wú)CHO細(xì)胞DNA1-8如SEQ ID N0:1和SEQ ID NO :2中的引物；用8個(gè)獨(dú)立抽取的等分試樣的PCR6條帶的大小與對(duì)于特定靶DNA擴(kuò)增產(chǎn)物觀察到的大小范圍一致圖4泳道注釋/稀釋度1-8如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2中的引物；從ASC中分離的DNA，用口腔支原體DNA摻加，含加入的CHO細(xì)胞DNA1-8如SEQ ID N0:1和SEQ ID NO :2中的引物；用8個(gè)獨(dú)立抽取的等分試樣的PCR9-12如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；用緩沖液的PCR( “無(wú)模板”對(duì)
昭)13大小標(biāo)記(50bp間隔)圖5泳道注釋/稀釋度1-8如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；用萊氏無(wú)膽甾原體DNA摻加的Tris 緩沖液，無(wú)CHO細(xì)胞DNAl_40cfu萊氏無(wú)膽甾原體DNA5_81cfu萊氏無(wú)膽甾原體DNA9-12如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；Tris緩沖液，未摻加，無(wú)CHO細(xì)胞DNA13，14如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；Tris緩沖液，陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒的約10個(gè)拷貝(MYC0T00L試劑盒的部分)/PCR反應(yīng)混合物，無(wú)CHO細(xì)胞DNA15大小標(biāo)記(50bp間隔)圖6泳道注釋/稀釋度1-8如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；用萊氏無(wú)膽甾原體DNA摻加的Tris 緩沖液，含加入的CHO細(xì)胞DNAl_410cfu萊氏無(wú)膽甾原體DNA5_81cfu萊氏無(wú)膽甾原體DNA9-12如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；Tris緩沖液，未摻加，含加入的CHO細(xì)胞DNA13，14如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；Tris緩沖液，陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒的約10個(gè)拷貝(MYC0T00L試劑盒的部分)/PCR反應(yīng)混合物，含加入的CHO細(xì)胞DNA15大小標(biāo)記(50bp間隔)圖7泳道注釋/稀釋度1-4如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；用萊氏無(wú)膽甾原體DNA摻加的Vero 細(xì)胞懸液，無(wú)CHO細(xì)胞DNAl_410cfu萊氏無(wú)膽甾原體DNA5-8如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；Vero細(xì)胞懸液，未摻加，無(wú)CHO細(xì)胞DNA9，10如SEQ ID NO :1禾口 SEQ ID NO 2中的引物；Tris緩沖液，陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒的約 10個(gè)拷貝(MYC0T00L試劑盒的部分)/PCR反應(yīng)混合物，無(wú)CHO細(xì)胞DNA11，12如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2中的引物；用緩沖液的PCR( “無(wú)模板”對(duì)
昭)13大小標(biāo)記(50bp間隔)圖8泳道注釋/稀釋度1-4如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；用萊氏無(wú)膽甾原體DNA摻加的Vero 細(xì)胞懸液，含加入的CHO細(xì)胞DNAl_43cfu萊氏無(wú)膽甾原體DNA5-8如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2中的引物；Vero細(xì)胞懸液，未摻加，含加入的 CHO細(xì)胞DNA9，10如SEQ ID NO :1禾口 SEQ ID NO 2中的引物；Tris緩沖液，陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒的約 10個(gè)拷貝(MYC0T00L試劑盒的部分)/PCR反應(yīng)混合物，含加入的CHO細(xì)胞DNA11，12如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2中的引物；用緩沖液的PCR( “無(wú)模板”對(duì)
昭)13大小標(biāo)記(50bp間隔)圖9泳道注釋/稀釋度1-4如SEQ ID NO=I和SEQ ID NO 2中的引物；用萊氏無(wú)膽甾原體“接種”的尿囊液，無(wú)CHO細(xì)胞DNAl_43cfu萊氏無(wú)膽甾原體DNA5-8如SEQ ID N0:1和SEQ ID NO :2中的引物；尿囊液，未接種的，無(wú)CHO細(xì)胞DNA9，10如SEQ ID NO :1禾口 SEQ ID NO 2中的引物；Tris緩沖液，陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒的約 10個(gè)拷貝(MYC0T00L試劑盒的部分)/PCR反應(yīng)混合物，無(wú)CHO細(xì)胞DNA11大小標(biāo)記(50bp間隔)箭頭指出其中非特異性擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物移動(dòng)的凝膠區(qū)域圖10泳道注釋/稀釋度1-4如SEQ ID NO=I和SEQ ID NO 2中的引物；用萊氏無(wú)膽甾原體“接種”的尿囊液，2. 5 μ g/50 μ 1 CHO 細(xì)胞 DNAl_43cfu萊氏無(wú)膽甾原體DNA
5-8 如 SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2 中的引物；尿囊液，未接種的，2. 5 μ g/50 μ 1 CHO細(xì)胞DNA9，10如SEQ ID NO :1禾口 SEQ ID NO 2中的引物；Tris緩沖液，陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒的約 10個(gè)拷貝(MYC0T00L試劑盒的部分)/PCR反應(yīng)混合物，無(wú)CHO細(xì)胞DNA11大小標(biāo)記(50bp間隔)箭頭指出其中非特異性擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物移動(dòng)的凝膠區(qū)域圖11泳道注釋/稀釋度1-4如SEQ ID NO=I和SEQ ID NO 2中的引物；用萊氏無(wú)膽甾原體“接種”的尿囊液，5 μ g/50 μ 1 CHO 細(xì)胞 DNAl_43cfu萊氏無(wú)膽甾原體DNA5-8如SEQ ID NO 1禾口 SEQ ID NO :2中的引物；尿囊液，未接種的， 5 μ μ g/50 μ ICHO 細(xì)胞 DNA9，10如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；用緩沖液的PCR( “無(wú)模板”對(duì)
昭)11大小標(biāo)記(50bp間隔)箭頭指出其中非特異性擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物移動(dòng)的凝膠區(qū)域圖12泳道注釋/稀釋度1-4如SEQ ID NO=I和SEQ ID NO 2中的引物；用萊氏無(wú)膽甾原體“接種”的尿囊液，10 μ g/50 μ 1 CHO 細(xì)胞 DNAl_43cfu萊氏無(wú)膽甾原體DNA5-8如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；尿囊液，未接種的，10 μ g/50 μ 1 CHO細(xì)胞DNA9，10如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；用緩沖液的PCR( “無(wú)模板”對(duì)
昭)11大小標(biāo)記(50bp間隔)箭頭指出其中非特異性擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物移動(dòng)的凝膠區(qū)域5圖13泳道注釋/稀釋度1-8如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；用萊氏無(wú)膽甾原體DNA摻加的Tris 緩沖液l-43cfu萊氏無(wú)膽甾原體DNA，無(wú)小牛胸腺DNA5-8Icfu萊氏無(wú)膽甾原體DNA，含加入的小牛胸腺DNA9-12如SEQ ID N0:1和SEQ ID NO :2中的引物；未摻加的Tris緩沖液，含加入的小牛胸腺DNA13，14如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；Tris緩沖液，陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒的約10個(gè)拷貝(MYC0T00L試劑盒的部分)/PCR反應(yīng)混合物，無(wú)小牛胸腺DNA15大小標(biāo)記(50bp間隔)圖14泳道注釋/稀釋度1-8如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2中的引物；用萊氏無(wú)膽甾原體“接種”的尿囊液，含加入的小牛胸腺DNA
l_43cfu萊氏無(wú)膽甾原體DNA5-8如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2中的引物；尿囊液，未接種的，含加入的小牛胸腺DNA9-12如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；Tris緩沖液，無(wú)接種物，含加入的小牛胸腺DNA13，14如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2中的引物；用緩沖液的PCR( “無(wú)模板”對(duì)
昭)15大小標(biāo)記(50bp間隔)實(shí)施例1MYC0T00L試劑盒和測(cè)定MYC0T00L PCR支原體檢測(cè)試劑盒是對(duì)于屬于柔膜體綱的細(xì)菌檢測(cè)最佳化的體外核酸擴(kuò)增測(cè)試。這些包括豬鼻支原體、精氨酸支原體、肺炎支原體、發(fā)酵支原體、口腔支原體、梨形支原體、唾液支原體(M. salivarum)、人型支原體(M. hominis)、滑液囊支原體 (M. synoviae)、非凡螺原體、檸檬螺原體(S. citri)和萊氏無(wú)膽甾原體。MycoTool試劑盒包含2個(gè)亞試劑盒(subkits)亞試劑盒1 ( "Detection Prep Kit" ；Roche Applied Science 目錄號(hào) 05184592001)和亞試劑盒 2 ( “Detection Amplification Kit" ；Roche Applied Science 目錄號(hào) 05184240001)。試劑盒確切地根據(jù)制造商的說(shuō)明書使用。如果沒有另外說(shuō)明，那么通過(guò)下述裂解選自(i)細(xì)胞培養(yǎng)上清液、(ii)培養(yǎng)細(xì)胞的懸液和(iii)羊膜液的液體樣品加入含有胍鹽和蛋白酶K的水性緩沖液，將緩沖液與樣品混合，且孵育混合物以實(shí)現(xiàn)裂解。在裂解后，一般將10-250 μ g/lml樣品CHO細(xì)胞DNA加入裂解物中且混合。CHO細(xì)胞DNA不含如分開測(cè)試的任何污染原核DNA。隨后，通過(guò)加入醇從混合物中沉淀核酸。通過(guò)離心回收沉淀物，用70%乙醇洗滌且干燥。將干燥的團(tuán)塊溶解于預(yù)先制備的緩沖液中且實(shí)施PCR分析。作為內(nèi)部對(duì)照，MYC0T00L試劑盒還包括用于GAPDH持家基因的引物對(duì)。在PCR擴(kuò)增前，通過(guò)應(yīng)用尿嘧啶-N-糖基化酶(試劑盒的組分)減少擴(kuò)增子污染的危險(xiǎn)。在下文每個(gè)實(shí)施例中，根據(jù)通過(guò)制造商的說(shuō)明書確切地進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠上在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行電泳。條帶用RES0LIGHT化合物和UV照明進(jìn)行顯現(xiàn)，條帶檢測(cè)在520nm。用于檢測(cè)柔膜體綱的MYC0T00L試劑盒的引物是SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的那些引物。還提供了對(duì)于GAPDH特異的對(duì)照引物(SEQID NO 3禾P SEQ ID NO :4)。每個(gè)MYC0T00L試劑盒進(jìn)一步包含含有支原體屬DNA的對(duì)照質(zhì)粒，然而，產(chǎn)生具有與由分離的細(xì)菌DNA(陽(yáng)性對(duì)照)擴(kuò)增的PCR片段相比較可區(qū)分的不同大小的PCR片段。為此,參考 Eldering, J. A.，等人，Biologicals 32 (2004) 183-193，其公開了質(zhì)粒。實(shí)施例2用于樣品摻加的來(lái)自柔膜體綱物種的DNA在本實(shí)施例中使用的所有樣品來(lái)自不含原核污染物的培養(yǎng)物。
代替由柔膜體綱物種感染的樣品材料，由萊氏無(wú)膽留原體或口腔支原體制備的 DNA在裂解前被摻加到樣品材料，或被摻加到由樣品材料制備的分離的DNA中(如果沒有另外說(shuō)明)。為了摻加的目的，由萊氏無(wú)膽甾原體(ATCC27556)和口腔支原體(ATCC23714)的參考培養(yǎng)物(標(biāo)準(zhǔn)條件)制備DNA。對(duì)于每種培養(yǎng)物，測(cè)定表示為菌落形成單位(cfu)的細(xì)胞滴度。應(yīng)用的摻加的DNA的數(shù)量反映對(duì)于由其制備DNA的各自培養(yǎng)物測(cè)定的cfu數(shù)目。如上所述的柔膜細(xì)菌DNA用于下文描述的摻加實(shí)驗(yàn)中。由柔膜體綱DNA擴(kuò)增的一般特定PCR片段(特異性擴(kuò)增產(chǎn)物)的大小在約430-470bp的范圍中。實(shí)施例3在來(lái)自MDCK細(xì)胞培養(yǎng)(懸浮細(xì)胞)的樣品中GAPDH基因組靶序列的檢測(cè)使用不含任何原核生物且具有0，79 · IO6細(xì)胞/ml的細(xì)胞滴度的MDCK細(xì)胞的培養(yǎng)物。將萊氏無(wú)膽甾原體DNA以3個(gè)菌落形成單位(cfu)/lml樣品的濃度加入樣品中。如 MYC0T00L試劑盒(還參見實(shí)施例1)的指導(dǎo)手冊(cè)中說(shuō)明的，從摻加的樣品材料中分離核酸。 制備2種不同核酸制備物，第一種不含CHO細(xì)胞DNA的添加，第二種含加入樣品材料中的 CHO 細(xì)胞 DNA (50mg/lml 樣品)。然而，進(jìn)行不摻加萊氏無(wú)膽留原體DNA的樣品的重復(fù)制備。再次，制備含或不含 CHO細(xì)胞DNA的核酸。在TE緩沖液中制備DNA制備物的幾個(gè)稀釋度。根據(jù)MYC0T00L指導(dǎo)手冊(cè)，對(duì)每個(gè)稀釋度的等分試樣實(shí)施GAPDH特異性PCR。圖1和2顯示具有指出獲得的PCR產(chǎn)物的條帶的凝膠。圖1描述了不含加入的 CHO細(xì)胞DNA而獲得的結(jié)果，圖2顯示了含加入的CHO細(xì)胞DNA的PCR產(chǎn)物?？梢悦鞔_觀察到含加入的CHO DNA,即使當(dāng)用10_4稀釋度進(jìn)行PCR時(shí)，GAPDH對(duì)照條帶也是可檢測(cè)的。實(shí)施例4在來(lái)自脂肪干細(xì)胞(ASC)的細(xì)胞上清液的摻加的樣品中原核DNA的16S_rRNA互補(bǔ)體中靶序列的檢測(cè)通過(guò)離心沉積不含任何原核生物的ASC。如MYC0T00L試劑盒的指導(dǎo)手冊(cè)中說(shuō)明的 (還參見實(shí)施例1)，澄清上清液(細(xì)胞培養(yǎng)基)用于DNA分離。在裂解步驟之前，將口腔支原體DNA以3個(gè)菌落形成單位(cfu)/lml樣品的濃度加入樣品中。隨后將樣品分成2個(gè)相等體積。向一個(gè)等分試樣中加入以100mg/lml上清液濃度的CHO細(xì)胞DNA。從2個(gè)等分試樣中分開地分離總DNA。用每種DNA制備物的等分試樣進(jìn)行幾次PCR反應(yīng)。圖3和4顯示通過(guò)PCR獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物和在電泳泳動(dòng)后的DNA片段的凝膠。明確地，CHO細(xì)胞DNA的添加使得MYC0T00L測(cè)試更有效(robust)，因?yàn)橹гw屬 DNA在測(cè)試的所有摻加的樣品中檢測(cè)到。另一方面，不含CHO細(xì)胞DNA，8次PCR反應(yīng)中僅1 次成功擴(kuò)增對(duì)于支原體屬靶DNA特異的片段。在其中不存在CHO細(xì)胞DNA的情況下，可以看出(圖3)非特異性PCR片段基本上不存在(圖3中的泳道1是可能的例外)。這強(qiáng)調(diào)本發(fā)明人的PCR人工產(chǎn)物通常不通過(guò) MYC0T00L測(cè)定產(chǎn)生的觀察。有趣的是，CHO細(xì)胞DNA的添加還不導(dǎo)致如在圖4中可以看出的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)施例5
在摻加的水性緩沖液中原核DNA的16S_rRNA互補(bǔ)體中靶序列的檢測(cè)不含任何污染物的IOmM TrisHCl緩沖液pH7. 5用萊氏無(wú)膽甾原體DNA以1或 10cfu/lml緩沖液的濃度進(jìn)行摻加。摻加和未摻加的緩沖液與CHO細(xì)胞DNA混合，以獲得 80 μ g/lml緩沖液的濃度。此外，制備不含CHO細(xì)胞DNA的摻加和未摻加的緩沖液。根據(jù) MYCOTOOL方案，從每種摻加和未摻加的制備物來(lái)制備DNA。用每種DNA制備物的等分試樣進(jìn)行幾次PCR反應(yīng)。此外，用含有其為MYCOTOOL試劑盒的一部分(陽(yáng)性對(duì)照)的對(duì)照質(zhì)粒的約10個(gè)拷貝的Tris緩沖液的等分試樣進(jìn)行PCR。圖5和6顯示具有通過(guò)PCR獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物和在電泳泳動(dòng)后的DNA片段的凝膠。雖然PCR檢測(cè)對(duì)應(yīng)于IOcfu的萊氏無(wú)膽甾原體DNA沒有問(wèn)題，但I(xiàn)cfu的檢測(cè)在 CHO細(xì)胞DNA的存在下得到顯著改善。具有陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒的泳道舉例說(shuō)明與萊氏無(wú)膽留原體靶序列的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物比較的可區(qū)分的大小差異。實(shí)施例6 在來(lái)自培養(yǎng)的Vero細(xì)胞培養(yǎng)(懸浮細(xì)胞)的摻加樣品中原核DNA的16S_rRNA互補(bǔ)體中靶序列的檢測(cè)向具有來(lái)自不含任何原核生物的培養(yǎng)物在IO5-IO6細(xì)胞/ml范圍中的細(xì)胞滴度的Vero細(xì)胞懸液中以3或lOcfu/lml細(xì)胞懸液的濃度摻加萊氏無(wú)膽留原體或口腔支原體DNA。向用3cfu/mlCH0細(xì)胞DNA摻加的培養(yǎng)物中，加入以10、30、50、70、85、100和 150 μ g/lml細(xì)胞懸液濃度的DNA。根據(jù)MYCOTOOL方案，由每種摻加的懸液以及僅Vero細(xì)胞的未摻加的懸液制備 DNA。用每種DNA制備物的等分試樣進(jìn)行幾次PCR反應(yīng)。此外，用含有其為MYCOTOOL試劑盒的一部分(陽(yáng)性對(duì)照)的對(duì)照質(zhì)粒的約10個(gè)拷貝的Tris緩沖液(IOmM TrisHCl緩沖液 PH7.5)的等分試樣進(jìn)行PCR。圖7和8顯示具有通過(guò)PCR獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物和在電泳泳動(dòng)后的DNA片段的凝膠。圖8中所示的樣品含有以150 μ g/lml細(xì)胞懸液的濃度的CHO細(xì)胞 DNA。當(dāng)使用10、30、50、70、85和100 μ gCHO細(xì)胞DNA/Iml細(xì)胞懸液的濃度時(shí)，獲得可比較的結(jié)果。值得注意的是，在不存在CHO細(xì)胞DNA的情況下獲得某些非特異性(人工產(chǎn)物) PCR產(chǎn)物(參見圖7)。注意到在某些情況下這些人工產(chǎn)物條帶的大小與特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的大小的相似性(圖7中的泳道1-4)。令人驚訝的是，在CHO細(xì)胞DNA的存在下沒有產(chǎn)生非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(圖8，泳道1-4)。實(shí)施例7在來(lái)自含胚雞卵的尿囊液的“接種”樣品中原核DNA的16S-rRNA互補(bǔ)體中靶序列的檢測(cè)不含支原體污染的尿囊液從用病毒疫苗株接種的含胚雞卵(9-11天)中收獲。用TE緩沖液1 1，000稀釋具有2.45xl03cfu滴度的萊氏無(wú)膽留原體的液體培養(yǎng)物。用尿囊液1 10稀釋這個(gè)稀釋度的等分試樣。加入這種1 10，000接種物的12. 2μ1 體積/Iml尿囊液，以獲得3cfu/lml接種的尿囊液的等價(jià)滴度。對(duì)接種的尿囊液實(shí)施DNA 分離而無(wú)進(jìn)一步孵育，即細(xì)菌不允許在尿囊液中生長(zhǎng)。提供了 4種不同樣品(i)不含CHO細(xì)胞DNA的接種的尿囊液，(ii)不含CHO細(xì)
17胞DNA的非接種的尿囊液，(iii)含加入的CHO細(xì)胞DNA的接種的尿囊液，和(iv)含加入的CHO細(xì)胞DNA的非接種的尿囊液。在(iii)和(iv)的樣品中，CHO細(xì)胞DNA的濃度是 208mg/lml 尿囊液。根據(jù)MYC0T00L方案，由每種接種和非接種的樣品(i_iv)制備DNA。用每種DNA制備物的等分試樣進(jìn)行幾次PCR反應(yīng)。此外，用含有其為MYC0T00L試劑盒的一部分(陽(yáng)性對(duì)照)的對(duì)照質(zhì)粒的約10個(gè)拷貝的Tris緩沖液(IOmM TrisHCl緩沖液pH7. 5)的等分試樣進(jìn)行PCR。再次，可以驗(yàn)證下述效應(yīng)CH0細(xì)胞DNA的存在(a)抑制非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和 (b)增加PCR檢測(cè)的靈敏度。實(shí)施例8在來(lái)自含胚雞卵的尿囊液的“接種”樣品中原核DNA的16S-rRNA互補(bǔ)體中靶序列的檢測(cè)，其中將不同濃度的CHO細(xì)胞DNA加入PCR反應(yīng)混合物中如實(shí)施例7中所述的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，除在DNA純化前不加入CHO細(xì)胞DNA。相反，在起始PCR之前，將CHO細(xì)胞DNA加入反應(yīng)混合物中。在反應(yīng)混合物中CHO細(xì)胞DNA的濃度是 0、2. 5、5和10 μ g/50 μ 1 (PCR反應(yīng)混合物的體積)。這對(duì)應(yīng)于最終反應(yīng)混合物中的Oyg/ μ 1、0. 05μ g/μ 1、0. 1 μ g/μ 1和0. 2μ g/μ 1，即僅在起始PCR反應(yīng)前的反應(yīng)混合物。圖 9-12顯示結(jié)果。實(shí)施例9在摻加的水性緩沖液中原核DNA的16S_rRNA互補(bǔ)體中靶序列的檢測(cè)如實(shí)施例5中所述的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，除萊氏無(wú)膽甾原體DNA的濃度是3cfu/lml緩沖液夕卜，并且代替CHO細(xì)胞DNA，在DNA純化前加入以200 μ g/lml緩沖液的濃度的小牛胸腺。圖 13顯示結(jié)果。值得注意的是，在小牛胸腺DNA的存在下生成的PCR片段顯示大小中的某些變動(dòng)， 不像在CHO細(xì)胞DNA的存在下產(chǎn)生的片段，例如圖6中所示的那些(具體地)。因此，小牛胸腺DNA不適合于抑制PCR人工產(chǎn)物的形成?？紤]到這些結(jié)果，得出結(jié)論CHO細(xì)胞DNA而不是小牛胸腺DNA(和其他真核基因組DNA)的能力可以提供所需效應(yīng)， 原因在于最初基于SEQ IDNO :1和SEQ ID NO 2的引物的MYC0T00L PCR適合于CHO細(xì)胞培養(yǎng)和培養(yǎng)上清液的事實(shí)。在做出最佳化時(shí)，CHO細(xì)胞的基因組DNA提供對(duì)于引物看起來(lái)是有利的“本底”并不顯而易見，因?yàn)椤氨镜住笨雌饋?lái)抑制人工產(chǎn)物的形成。來(lái)自其他物種的基因組DNA在組成中是不同的，并且看起來(lái)不能抑制非特異性人工產(chǎn)物的形成(或在實(shí)現(xiàn)這點(diǎn)時(shí)較不有效)。實(shí)施例10在來(lái)自含胚雞卵的尿囊液的“接種”樣品中原核DNA的16S-rRNA互補(bǔ)體中靶序列的檢測(cè)，其中添加小牛胸腺DNA如實(shí)施例7中所述的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，除代替CHO細(xì)胞DNA，在DNA純化前加入小牛胸腺外。提供了 4種不同樣品(i)不含小牛胸腺DNA的接種的尿囊液，(ii)不含小牛胸腺DNA的非接種的尿囊液，(iii)含加入的小牛胸腺DNA的接種的尿囊液，和(iv)含加入的小牛胸腺DNA的非接種的尿囊液。在(iii)和(iv)的樣品中，小牛胸腺DNA的濃度是200mg/lml 尿囊液。 圖14顯示結(jié)果?；旧?，結(jié)論與實(shí)施例9相似。再次，與在CHO細(xì)胞DNA的存在下的PCR形成對(duì)比，產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。
權(quán)利要求
1.一種用于測(cè)定具有生物學(xué)材料的樣品中細(xì)菌污染物的存在或不存在的改良方法，所述方法包括步驟(a)處理所述樣品且純化來(lái)自所述經(jīng)處理的樣品的核酸，隨后為(b)形成用于基于PCR的擴(kuò)增反應(yīng)的組合物(反應(yīng)混合物)，所述組合物包括-根據(jù)SEQ ID NO 1的第一種引物、-根據(jù)SEQ ID NO 2的第二種引物，和-步驟(a)的所述純化核酸或其測(cè)量的部分作為模板；隨后為(c)用步驟(b)的所述組合物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)；隨后為(d)檢測(cè)擴(kuò)增的靶序列的存在或不存在，其中所述擴(kuò)增的靶序列的存在指示所述樣品中所述細(xì)菌污染物的存在，并且所述擴(kuò)增的靶序列的不存在指示所述樣品中所述細(xì)菌污染物的不存在；所述改良的特征在于相對(duì)于所述樣品的體積，將來(lái)自CHO細(xì)胞的預(yù)定量的DNA加入(i) 所述樣品、或(ii)步驟(a)的所述經(jīng)處理的樣品、或(iii)在步驟(a)中獲得的所述純化核酸、或(iv)步驟(b)的所述組合物中，由此所加入的來(lái)自CHO細(xì)胞的DNA減少步驟(d) 中的非特異性擴(kuò)增。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于每ml液體樣品的DNA預(yù)定濃度在10yg/lml樣品-250 μ g/Iml樣品的范圍中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述液體樣品選自具有培養(yǎng)的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基、無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)上清液和羊膜液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于所述液體樣品是羊膜液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于所述羊膜液來(lái)自含胚卵。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述細(xì)菌污染物是選自無(wú)膽留原體屬、芽孢桿菌屬、梭菌屬、棒狀桿菌屬、微球菌屬、支原體屬、螺原體屬、葡萄球菌屬和鏈球菌屬的屬。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征在于所述細(xì)菌污染物是選自豬鼻支原體、精氨酸支原體、肺炎支原體、發(fā)酵支原體、口腔支原體和梨形支原體的支原體屬物種，或所述細(xì)菌污染物是萊氏無(wú)膽留原體，或所述細(xì)菌污染物是非凡螺原體。
8.一種組合物，其包含來(lái)自含胚卵的羊膜液和來(lái)自CHO細(xì)胞的DNA。
9.根據(jù)任何權(quán)利要求8的組合物，其進(jìn)一步包含選自離液劑和蛋白酶的裂解試劑。
10.一種組合物，其包含(i)來(lái)自樣品的純化核酸，所述樣品選自羊膜液、真核細(xì)胞的懸液和來(lái)自真核細(xì)胞的懸液的上清液，和(ii)不含原核DNA的來(lái)自CHO細(xì)胞的DNA。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的組合物，其進(jìn)一步包含根據(jù)SEQID NO :1的第一種引物、根據(jù) SEQ ID NO 2的第二種引物、核苷酸三磷酸和耐熱的DNA聚合酶。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的組合物，其進(jìn)一步包含嵌入染料。
13.—種試劑盒，其在分開的容器中包含(i)裂解試劑，(ii)以預(yù)定濃度的來(lái)自CHO細(xì)胞的純化DNA，所述DNA不含原核DNAJP (iii)根據(jù)SEQ ID NO 1的第一種引物和根據(jù)SEQ ID NO 2的第二種引物。
14.根據(jù)權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)的組合物用于擴(kuò)增原核污染物的DNA的用途，所述原核污染物的DNA來(lái)自從樣品中分離的DNA，所述樣品選自羊膜液、真核細(xì)胞的懸液和來(lái)自真核細(xì)胞的懸液的上清液。
15. 一種用于進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的改良方法，其中通過(guò)DNA聚合酶催化的一對(duì)寡核苷酸引物延伸形成具有范圍為約IOObp-約 1500bp大小的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，所述引物各自與一種或多種原核生物的16S-rRNA的基因組互補(bǔ)體中包含的靶序列雜交，其中所述寡核苷酸引物對(duì)能夠在PCR中形成來(lái)自第一種模板的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，所述 PCR在預(yù)定條件(R)下在具有預(yù)定組合物的反應(yīng)混合物(Q)中進(jìn)行，并且所述第一種模板包含第一種真核生物的基因組DNA和所述一種或多種原核生物的基因組DNA，并且其中在所述PCR中，所述寡核苷酸引物對(duì)在相同條件(R)下在反應(yīng)混合物(Q)中不形成來(lái)自第二種模板的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中在所述第二種模板中，不存在所述一種或多種原核生物的基因組DNA，但包含第一種真核生物的基因組DNA， 所述改良方法包括以下步驟(a)提供所述寡核苷酸引物對(duì)；(b)提供所述第一種真核生物的基因組DNA；(c)提供包含第二種真核生物的基因組DNA的第三種模板，所述第二種真核生物被懷疑含有所述一種或多種原核生物的基因組DNA ；(d)在所述反應(yīng)混合物(Q)中混合(a)的所述引物對(duì)、(c)的所述第三種模板、和(b) 的所述第一種真核生物的所述基因組DNA的測(cè)量的量，和在條件(R)下進(jìn)行PCR;其中非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的形成被抑制。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過(guò)抑制非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物改良的基于PCR的靶序列擴(kuò)增。改良涉及使用被最佳化以在第一種生物的基因組DNA的背景中擴(kuò)增污染物的核酸的引物對(duì)。當(dāng)對(duì)懷疑包含污染物的來(lái)自第二種生物的DNA實(shí)施相同的基于PCR的擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，當(dāng)?shù)谝环N生物的基因組DNA的量存在于擴(kuò)增反應(yīng)中時(shí)，污染物的檢測(cè)靈敏度和特異性增強(qiáng)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102471804SQ201080033520
公開日2012年5月23日 申請(qǐng)日期2010年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月1日
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