專利名稱：重組人那希力肽的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物活性多肽的制備方法，特別涉及一種利用基因重組技術(shù)制備那希力肽的生物活性多肽的方法。
背景技術(shù)：
那希力肽(Nesiritide)又稱腦鈉素(Brain Natreuritic Peptide，BNP)，是由腦組織和心臟合成和分泌的生物活性物質(zhì)。Sudoh等首先從豬腦中分離出那希力肽，隨后發(fā)現(xiàn)其他動(dòng)物和人心臟中也有那希力肽的分布，腦細(xì)胞中合成的那希力肽作為神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮生理功能；心肌細(xì)胞合成并分泌至血液循環(huán)中的那希力肽則作為心臟的內(nèi)分泌物，對(duì)調(diào)節(jié)心血管功能和水鹽代謝起重要作用。心力衰竭時(shí)血漿BNP含量增加，靜脈滴注外源性BNP可以進(jìn)一步改善心力衰竭時(shí)的心腎功能。因此，重組人那希力肽在臨床上具有重要的使用價(jià)值。
根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，人那希力肽(hBNP)由32個(gè)氨基酸殘基所組成，其氨基酸序列如下Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-Cys-Phe-Gly-Arg-Lys-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His，其中第10位和第26位Cys殘基內(nèi)的巰基形成分子內(nèi)的二硫鍵。
中國(guó)專利99120613.4公布了一種制備人那希力肽的方法，該方法采用的是串聯(lián)表達(dá)技術(shù)，既將BNP串聯(lián)成十聚體直接克隆到表達(dá)載體pET22a上。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)柱層析純化后，串聯(lián)的BNP融合蛋白用色氨酸裂解試劑裂解為單個(gè)BNP，經(jīng)柱層析純化后，再將BNP單體中二硫鍵氧化生成二硫鍵，最后用梭肽酶Y去掉BNP C末端多余的色氨酸得到與天然人序列完全一致的BNP。該工藝步驟極其繁雜，且容易在BNP二硫鍵生成時(shí)形成分子間的聚合體或異構(gòu)體，得率極低。本發(fā)明大大簡(jiǎn)化了工藝，大大提高了那希利肽產(chǎn)量，從而可大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)人那希力肽。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種制備人那希力肽的方法，該方法包括以下步驟
a.人工合成人編碼那希力肽氨基酸序列的基因DNA片段；b.步驟a得到的基因片段與適宜的表達(dá)載體上的細(xì)菌硫氧還蛋白基因3′端融合，中間含腸激酶或者凝血酶識(shí)別位點(diǎn)；c.將含有步驟b.得到克隆的融合蛋白編碼基因的表達(dá)載體重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化適宜的大腸桿菌獲得基因工程菌；d.該基因工程菌經(jīng)發(fā)酵后，經(jīng)提取，層析，純化步驟，制備出人那希力肽-硫氧還蛋白融合蛋白；e.步驟d得到的融合蛋白經(jīng)腸激酶或者凝血酶切割后，分離，純化，獲得重組人那希力肽。
步驟d.中的融合蛋白中硫氧還蛋白和人那希力肽之間通過(guò)腸激酶酶切識(shí)別位點(diǎn)-(Asp)n-Lys-連接，結(jié)構(gòu)為X-(Asp)n-Lys-hBNP，其中X為硫氧還蛋白，Asp為天冬氨酸(簡(jiǎn)寫為D)，Lys為賴氨酸(簡(jiǎn)寫為K)，hBNP為人那希力肽，n為2、3或者4，即表示n個(gè)Asp串聯(lián)在一起Asp。
或融合蛋白中硫氧還蛋白和人那希力肽之間通過(guò)凝血酶酶切識(shí)別位點(diǎn)X-P2-P3-Pro-P1.連接，結(jié)構(gòu)為X-P2-P3-Pro-P1_hBNP，其中X為硫氧還蛋白，P1為Arg或Lys，P2、P3為疏水性氨基酸選自Leu、Val、ILe、Met、Ala、Cys或Trp，這里P2可以優(yōu)選但不限于Leu，P3可以優(yōu)選但不限于Val，X-P2-P3-Pro-P1_hBNP代表的優(yōu)選的氨基酸序列可以但不限于為X-Leu-Val-Pro-Arg-hBNP。
所述人那希力肽-硫氧還蛋白融合蛋白的編碼DNA和氨基酸序列見序列表序列表1為那希力肽-硫氧還蛋白融合蛋白(腸激酶識(shí)別序列為DDDDY)的編碼DNA序列。
序列表2為那希力肽-硫氧還蛋白融合蛋白(腸激酶識(shí)別序列為DDDDY)的氨基酸序列。
序列表3為那希力肽-硫氧還蛋白融合蛋白(腸激酶識(shí)別序列為DDDY)的編碼DNA序列。
序列表4為那希力肽-硫氧還蛋白融合蛋白(腸激酶識(shí)別序列為DDDY)的氨基酸序列。
序列表5為那希力肽-硫氧還蛋白融合蛋白(腸激酶識(shí)別序列為DDY)的編碼DNA序列。
序列表6為那希力肽-硫氧還蛋白融合蛋白(腸激酶識(shí)別序列為DDY)的氨基酸序列。
序列表7為那希力肽-硫氧還蛋白融合蛋白(凝血酶識(shí)別序列)的編碼DNA序列。
序列表8為那希力肽-硫氧還蛋白融合蛋白(凝血酶識(shí)別序列)的氨基酸序列。
本發(fā)明的制備方法，其特征在于，其中所述發(fā)酵是將合格的重組人那希力肽基因工程菌接種到發(fā)酵罐中培養(yǎng)，其中加入IPTG誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)。
本發(fā)明的制備方法，其中所述提取層析純化，對(duì)于腸激酶識(shí)別位點(diǎn)的融合蛋白包括的步驟為離心收集菌體，破菌、離心收集破菌液上清的步驟，將收集的上清上Zn2+-Sepharose F.F.金屬離子螯和柱，用平衡緩沖液洗去雜蛋白，然后用含適宜濃度的咪唑洗脫那希力肽-硫氧還蛋白融合蛋白，將洗脫的那希力肽-硫氧還蛋白融合蛋白用透析或超濾除去咪唑，用高純度的Enterkinase做酶切處理，將酶切的融合蛋白上Zn2+-Sepharose F.F.柱去掉硫氧還蛋白，將得到的那希力肽上反相柱層析，用含TFA的Acetonitrile梯度洗脫，得到純度95％以上的純那希力肽。
對(duì)于凝血酶識(shí)別位點(diǎn)的融合蛋白包括的步驟為離心收集菌體，破菌、離心收集破菌液沉淀(Thioredoxin-BNP融合蛋白主要在離心沉淀中)。將收集的沉淀清用8M的脲素溶解，然后用透析的方法去掉脲素，將透析液直接用凝血酶(Thrombin)酶切，將酶切的溶液直接上SP-Sepharose F.F.離子交換柱，rhBNP被吸附在柱上，其它大部分雜質(zhì)則直接穿透；將洗脫的含rhBNP的溶液上反相柱層析，用含TFA的Acetonitrile梯度洗脫，可得到純度95％以上的純品。用適宜的方法去掉乙氰和三氟乙酸，并換成適宜的緩沖液，如檸檬酸鹽緩或磷酸鹽緩沖液。
本發(fā)明還提供人那希力肽藥物組合物，其配方組成如下那希力肽 0.5mg甘露醇 5～20mg
檸檬酸(一水) 2.1mg檸檬鈉(二水) 2.94mg或那希力肽 0.5mg甘露醇 5～20mg磷酸二氫鈉 0.93mg磷酸氫二鈉 1.73mg氯化鈉 10mg本發(fā)明是根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的人那希力肽一級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸編碼序列(該序列可按照遺傳密碼的通用性、簡(jiǎn)并性和大腸桿菌對(duì)遺傳密碼使用的偏好性原則進(jìn)行改變)，人工合成該雙鏈DNA全序列。本發(fā)明的主要特點(diǎn)在于，分別將該編碼基因片段克隆入適宜表達(dá)載體，(優(yōu)選的如pET32a或pTDa，為常規(guī)的表達(dá)載體，均可在市場(chǎng)上買到，內(nèi)含硫氧還蛋白基因片段)中構(gòu)建形成重組質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化適宜的大腸桿菌，經(jīng)過(guò)篩選，優(yōu)選的為BL21(λDE3)或HB101菌株(為常規(guī)菌株，均可在市場(chǎng)上買到)。該基因工程菌以硫氧還蛋白(Thioredoxin)為融合伴侶，融合表達(dá)hBNP，即形成那希力肽-硫氧還蛋白融合蛋白，所表達(dá)的融合蛋白經(jīng)過(guò)適宜的步驟分離純化后，用適宜的具有特異序列識(shí)別能力的蛋白酶如用腸激酶(Enterkinase)或凝血酶(Thrombin)將hBNP從融合蛋白上切割下來(lái)，經(jīng)過(guò)高度分離純化，得到hBNP純品。經(jīng)過(guò)N-末端氨基酸序列測(cè)定、質(zhì)譜分子量測(cè)定、等電點(diǎn)測(cè)定、肽圖分析以及生物活性檢測(cè)等分析，結(jié)果表明我們所表達(dá)的人那希力肽與天然的那希力肽各指標(biāo)完全一致，而表達(dá)效率為全菌蛋白的30％以上，高于現(xiàn)有技術(shù)報(bào)道的串聯(lián)法生產(chǎn)那希力肽。
本發(fā)明使用的分子克隆方法的基本原理，以及操作步驟中所使用的原料，溶劑，工具屬于現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域，如DNA的合成方法，酶切位點(diǎn)的選擇等，本發(fā)明使用的基因表達(dá)載體，基因工程菌等都可以在市場(chǎng)上買到。
以上方法的具體操作步驟可以見本發(fā)明的實(shí)施例。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)主要表現(xiàn)在(1)、本發(fā)明中那希力肽-硫氧還蛋白融合蛋白以可溶的形式存在(以腸激酶Enterkinase識(shí)別序列連接)，或者以包涵體的形式存在(以凝血酶Thrombin識(shí)別序列連接)在8M脲素溶解后透析復(fù)性，其BNP10位和26位上的cys的形成完全正確的二硫鍵，避免融合蛋白酶切純化后必須進(jìn)行復(fù)性處理，從而大大簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝和大大提高生產(chǎn)效率；(2)、通過(guò)上述工藝得到的rhBNP，其結(jié)構(gòu)等理化特性和生物學(xué)活性與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)構(gòu)完全一致，無(wú)任何二聚體或者異構(gòu)體的存在，同時(shí)還避免通常重組蛋白質(zhì)藥物N端前面多出一個(gè)Met甚至多個(gè)氨基酸殘基，從而可降低其免疫原性；(3)、表達(dá)率高。
本發(fā)明組合物的優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在(1)穩(wěn)定性好，室溫下放置18個(gè)月，其各項(xiàng)指標(biāo)仍能達(dá)到注射用生物制品的各項(xiàng)要求。


圖1pET-32a質(zhì)粒圖譜圖2pET-32a多克隆位點(diǎn)及序列圖3pET32a-BNP重組質(zhì)粒的構(gòu)建示意4那希力肽-硫氧還蛋白融合蛋白(腸激酶識(shí)別序列)融合蛋白表達(dá)圖5腸激酶處理后純化的那希力肽電泳圖譜圖6pTDa表達(dá)載體圖7pTDa-BNP重組質(zhì)粒DNA的構(gòu)建示意8那希力肽-硫氧還蛋白融合蛋白(凝血酶識(shí)別序列)的表達(dá)(1、2為實(shí)例1所得到的rhBNP、3、4為實(shí)例2所得到的rhBNP)圖9兩種方式純化的那希力肽電泳圖譜
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例11.表達(dá)載體的選擇選用Novagen公司的pET系列表達(dá)載體pET32a作為表達(dá)載體，The pET-32a是用于高效融合表達(dá)蛋白和多肽的大腸桿菌表達(dá)載體系統(tǒng)，目的蛋白或多肽以109個(gè)氨基酸殘基的硫氧還蛋白(Trx·TagTM)作為融合伴侶。(圖譜見附圖1、圖2)。
2.基因的設(shè)計(jì)和合成根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的人那希力肽DNA編碼序列(序列可根據(jù)遺傳密碼的通用性、簡(jiǎn)并性原則改變，但不改變氨基酸組成和排列)設(shè)計(jì)編碼成熟人BNP序列，如5’_AGC CCT AAA ATG GTA CAG GGT TCT GGT TGC TTC GGT CGT AAA ATG GAC CGTATC AGC TCT TCC AGC GGT CTG GGT TGC AAA GTA CTG CGT CGT CAC TAA_3’。同時(shí)在該序列的5’-端加上Kpn識(shí)別序列GGTACC和腸激酶(Enterokinase)酶切位點(diǎn)編碼序列GACGACGACGACAAG(即編碼-DDDDK-)；在3’_端加上Xho I的識(shí)別序列CTCGAG從而形成如下的設(shè)計(jì)序列5’_GGT ACC GAC GAC GAC GAC AAG CCT AAAATG GTA CAG GGT TCT GGT TGC TTC GGT CGT AAA ATG GAC CGT ATC AGC TCT TCCAGC GGT CTG GGT TGC AAA GTA CTG CGT CGT CAC TAA CTC GAG_3’。
或在該序列的5’-端加上Kpn識(shí)別序列GGTACC和腸激酶(Enterokinase)酶切位點(diǎn)編碼序列GACGACGACAAG(即編碼-DDDK-)；在3’_端加上Xho I的識(shí)別序列CTCGAG從而形成如下的設(shè)計(jì)序列5’_GGT ACC GAC GAC GAC GAC AAG CCT AAAATG GTA CAG GGT TCT GGT TGC TTC GGT CGT AAA ATG GAC CGT ATC AGC TCT TCCAGC GGT CTG GGT TGC AAA GTA CTG CGT CGT CAC TAA CTC GAG_3’。
或在該序列的5’-端加上Kpn識(shí)別序列GGTACC和腸激酶(Enterokinase)酶切位點(diǎn)編碼序列GACGACAAG(即編碼-DDK-)；在3’_端加上Xho I的識(shí)別序列CTCGAG從而形成如下的設(shè)計(jì)序列5’_GGT ACC GAC GAC GAC GAC AAG CCT AAA ATG GTACAG GGT TCT GGT TGC TTC GGT CGT AAA ATG GAC CGT ATC AGC TCT TCC AGC GGTCTG GGT TGC AAA GTA CTG CGT CGT CAC TAA CTC GAG_3’。
合成方法參見《分子克隆手冊(cè)》冷泉港第二版3.將上述合成的核酸片段插入到PET32a的Kpn和Xho I位點(diǎn)形成重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)篩選即得高效表達(dá)基因工程菌。有關(guān)操作方法參見《分子克隆手冊(cè)》冷泉港第二版構(gòu)建圖譜見附圖34.將細(xì)菌接種到LB或其它適宜的培養(yǎng)基中，當(dāng)工程菌長(zhǎng)到適宜濃度時(shí)如對(duì)數(shù)中期，加入適宜濃度的IPTG(如0.1～0.5mM)，可見明顯的融合蛋白表達(dá)條帶，見附圖45.將培養(yǎng)過(guò)夜的種子液，接種到發(fā)酵罐適宜的培養(yǎng)基(如LB、TB或其它適宜培養(yǎng)基中)中培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)至適宜的程度時(shí)，加IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)一定時(shí)間(如3-4小時(shí))。離心收菌，將菌體懸浮在適宜的緩沖液中(如磷酸鹽緩沖液、Tris-HCL緩沖液等)，超生波或高壓勻漿破菌。將破碎的菌液離心，收集上清液，棄沉淀。
將收集的上清(或再經(jīng)過(guò)濾處理)上Zn2+-Sepharose F.F.金屬離子螯和柱(chelating-Sepharose F.F.經(jīng)適宜濃度如100mM的Zn2+SO4或者Zn2+Cl2處理)，用平衡緩沖液(如20-50mM磷酸鹽緩沖液、Tris-HCL緩沖液等)洗去雜蛋白，然后用含適宜濃度的100mM咪唑洗脫那希力肽-硫氧還蛋白融合蛋白。
將洗脫的那希力肽-硫氧還蛋白融合蛋白用透析或超濾除去咪唑，用高純度的Enterkinase(如Invitrogen公司的EKmax)處理，條件可參照文獻(xiàn)或Invitrogen公司的Enterkinase酶使用推薦條件。
將酶切的融合蛋白上Zn2+-Sepharose F.F.柱去掉硫氧還蛋白(條件同第一步純化)，將得到的rhBNP上反相柱層析(填料可選取C4、c8、Resource等反相填料)，用含一定濃度水的Acetonitrile(含一定濃度如0.1％的三氟乙酸)梯度洗脫，可得到純度95％以上的純品。用適宜的方法(如真空泵抽調(diào)或者用離子交換的方法)去掉乙氰和三氟乙酸，并換成適宜的緩沖液，如磷酸鹽緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液。
純化后得到的rhBNP電泳附圖5實(shí)施例21、表達(dá)載體的選擇選用本實(shí)驗(yàn)室的pTDa作為表達(dá)載體(見附圖6)2、基因的設(shè)計(jì)和合成根據(jù)大腸桿菌對(duì)遺傳密碼使用的偏好性原則設(shè)計(jì)了編碼成熟人那希力肽序列5’_AGC CCT AAA ATG GTA CAG GGT TCT GGT TGC TTC GGT CGT AAA ATG GACCGT ATC AGC TCT TCC AGC GGT CTG GGT TGC AAA GTA CTG CGT CGT CAC TAA(序列可根據(jù)遺傳密碼的通用性、簡(jiǎn)并性原則改變，但不改變氨基酸組成和排列)。同時(shí)在該序列的5’-端加上EcoRI識(shí)別序列GAA TTC和凝血酶(Thrombin)酶切位點(diǎn)(-LVPR-X)編碼序列CTG GTG CCT CGT；在3’_端加上Sal I的識(shí)別序列GTC GAC從而形成如下的最終設(shè)計(jì)序列5’_GAA TTC CTG GTG CCT CGT AGC CCTAAA ATG GTA CAG GGT TCT GGT TGC TTC GGT CGT AAA ATG GAC CGT ATC AGC TCTTCC AGC GGT CTG GGT TGC AAA GTA CTG CGT CGT CAC TAA GTC GAC_3’。合成方法參見《分子克隆手冊(cè)》冷泉港第二版2、上述合成的核酸片段插入到pTDa的EcoRI和Sal I位點(diǎn)形成重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101，經(jīng)篩選即得到高效表達(dá)基因工程菌。有關(guān)操作方法參見《分子克隆手冊(cè)》冷泉港第二版(重組質(zhì)粒DNA的構(gòu)建示意圖見附圖7)3、將細(xì)菌接種到LB或其它適宜的培養(yǎng)基中，當(dāng)工程菌長(zhǎng)到適宜濃度時(shí)如對(duì)數(shù)中期，加入適宜濃度的IPTG(如0.1～0.5mM)，可見明顯的融合蛋白表達(dá)條帶，見附圖84、過(guò)夜的種子液，接種到發(fā)酵罐適宜的培養(yǎng)基(如LB、TB或其它適宜培養(yǎng)基中)中培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)至適宜的程度時(shí)，加IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)一定時(shí)間(如3-4小時(shí))。離心收菌，將菌體懸浮在適宜的緩沖液中(如磷酸鹽緩沖液、Tris-HCL緩沖液等)，超生波或高壓勻漿破菌。將破碎的菌液離心，收集沉淀，棄上清液。
5、沉淀用8M脲溶解，稀釋復(fù)性，用Thrombin進(jìn)行酶切(參照酶的使用說(shuō)明)。
6、酶切后用SP-FF柱層析進(jìn)行純化。
將得到的rhBNP上反相柱層析(填料可選取C4、C8、Resource等反相填料)，用含一定濃度水的乙氰(含一定濃度如0.1％的三氟乙酸)梯度洗脫，可得到純度95％以上的純品。用適宜的方法(如真空泵抽調(diào)或者用離子交換的方法)去掉乙氰和三氟乙酸，并換成適宜的緩沖液，如磷酸鹽緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液。
6、純化后得到的rhBNP電泳附圖9實(shí)施例3根據(jù)實(shí)施例1或2所得的rhBNP的理化性質(zhì)測(cè)定1、N-末端15個(gè)氨基酸序列測(cè)定將上述兩種方法得到的重組人那希力肽，進(jìn)行N-末端測(cè)定，Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-Cys-Phe-Gly-Arg-Lys-Met2、分子量質(zhì)譜測(cè)定采用FAB方法測(cè)定，兩種方法得到的重組人那希力肽的分子量為3462，與理論預(yù)測(cè)一致。
3、生物學(xué)活性測(cè)定利用Phenylephrine與其在血管上的受體結(jié)合，產(chǎn)生縮血管效應(yīng)，將血管的靜止張力提高，并穩(wěn)定維持在一定水平，然后利用rhBNP與其在血管上的利鈉肽受體結(jié)合，產(chǎn)生對(duì)家兔胸主動(dòng)脈條的擴(kuò)血管效應(yīng)，通過(guò)血管張力的變化，測(cè)定rhBNP的生物活性。所得到的rhBNP表現(xiàn)出明顯的擴(kuò)血管效應(yīng)。
序列表<110>成都西瑪生物科技有限公司<120>重組人那希力肽的生產(chǎn)方法<160>8<210>1<211>579<212>DNA<213>人工序列<220>
<400>1atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg60gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc120ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac180atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg240ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg300aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat360catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa420ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caagagccct480aaaatggtac agggttctgg ttgcttcggt cgtaaaatgg accgtatcag ctcttccagc540ggtctgggtt gcaaagtact gcgtcgtcac taactcgag 579<210>2<211>190<212>PRT<213>人工序列<220>
<400>2Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr1 5 10 15Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala20 25 30Glu Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu35 40 45Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn50 55 60Ile Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly65 70 75Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr80 85 90Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp95 100 105Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly His Met His His His His110 115 120His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu125 130 135Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser Pro Asp140 145 150Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Set Pro Lys Met Val Gln Gly155 160 165Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser170 175 180Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His185 190
<210>3<211>576<212>DNA<213>人工序列<220>
<400>3atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg60gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc120ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac180atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg240ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg300aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat360catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa420ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacaa gagccctaaa480atggtacagg gttctggttg cttcggtcgt aaaatggacc gtatcagctc ttccagcggt540ctgggttgca aagtactgcg tcgtcactaa ctcgag 576<210>4<211>189<212>PRT<213>人工序列<220>
<400>4Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thrl 5 10 15Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala20 25 30Glu Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu35 40 45Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn50 55 60Ile Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly65 70 75Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr80 85 90Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp95 100 105Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly His Met His His His His110 115 120His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu125 130 135Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser Pro Asp140 145 150Leu Gly Thr Asp Asp Asp Lys Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser155 160 165Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly170 175 180Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His185 189<210>5<211>573<212>DNA<213>人工序列<220>
<400>5atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg60
gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc120ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac180atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg240ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg300aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat360catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa420ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacaagag ccctaaaatg480gtacagggtt ctggttgctt cggtcgtaaa atggaccgta tcagctcttc cagcggtctg540ggttgcaaag tactgcgtcg tcactaactc gag 573<210>6<211>188<212>PRT<213>人工序列<220>
<400>6Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr1 5 10 15Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala20 25 30Glu Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu35 40 45Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn50 55 60Ile Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly65 70 75Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr80 85 90Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp95 100 105Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly His Met His His His His110 115 120His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu125 130 135Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser Pro Asp140 145 150Leu Gly Thr Asp Asp Lys Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly155 160 165Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu170 175 180Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His185 188<210>7<211>507<212>DNA<213>人工序列<220>
<400>7atgtctgata aaattattca tctgactgat gattcttttg atactgatgt acttaaggca60gatggtgcaa tcctggttga tttctgggca cactggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgct120ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac180atcgatcaca acccgggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg240ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg300
aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggc tctggatccg gtgatgacga tgacaaggta360cctatgcatg agctcgagat cttcgaattc ctggtgcctc gtagccctaa aatggtacag420ggttctggtt gcttcggtcg taaaatggac cgtatcagct cttccagcgg tctgggttgc480aaagtactgc gtcgtcacta agtcgac 507<210>8<211>166<212>PRT<213>人工序列<220>
<400>8Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr1 5 10 15Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala20 25 30Glu Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu35 40 45Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn50 55 60Ile Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly65 70 75Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr80 85 90Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp95 100 105Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys Val110 115 120Pro Met His Glu Leu Glu Ile Phe Glu Phe Leu Val Pro Arg Ser125 130 135Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp140 145 150Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg155 160 165His16權(quán)利要求
1.一種人那希力肽的制備辦法，包括以下步驟a.人工合成人那希力肽氨基酸編碼區(qū)相對(duì)應(yīng)的基因；b.步驟a得到的基因與表達(dá)載體上的細(xì)菌硫氧還蛋白基因3′端融合，中間含腸激酶或者凝血酶識(shí)別位點(diǎn)；c.將含有步驟b的克隆有融合蛋白編碼基因的表達(dá)載體重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得基因工程菌；d.該基因工程菌發(fā)酵后，經(jīng)提取，層析，純化步驟，制備出那希力肽-硫氧還蛋白融合蛋白；e.步驟d的融合蛋白，經(jīng)腸激酶或者凝血酶切割后，經(jīng)分離，純化，得人那希力肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟d.中的融合蛋白中硫氧還蛋白和人那希力肽之間通過(guò)腸激酶酶切識(shí)別位點(diǎn)-(Asp)n-Lys-連接，結(jié)構(gòu)為X-(Asp)n-Lys-hBNP，其中X為硫氧還蛋白，Asp為天冬氨酸，Lys為賴氨酸，hBNP為人那希力肽，n為2、3或者4；或步驟d.中的融合蛋白中硫氧還蛋白和人那希力肽之間通過(guò)凝血酶酶切識(shí)別位點(diǎn)X-P2-P3-Pro-P1.連接，結(jié)構(gòu)為X-P2-P3-Pro-P1-hBNP，其中X為硫氧還蛋白，P1為Arg或Lys，P2、P3為疏水性氨基酸選自Leu、Val、ILe、Met、Ala、Cys或Trp。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，其中所述結(jié)構(gòu)為X-P2-P3-Pro-P1-hBNP的融合蛋白為X-Leu-Val-Pro-Arg-hBNP，其中X為硫氧還蛋白，其氨基酸序列見序列表8。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，其中所述結(jié)構(gòu)為X-(Asp)n-Lys-hBNP的融合蛋白為X-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-hBNP、氨基酸序列見序列表2X-Asp-Asp-Asp-Lys-hBNP、氨基酸序列見序列表4或X-Asp-Asp-Lys-hBNP，氨基酸序列見序列表6其中X為硫氧還蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述結(jié)構(gòu)為X-Leu-Val-Pro-Arg-hBNP的融合蛋白，其編碼DNA序列見序列表7。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述結(jié)構(gòu)為X-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-hBNP的氨基酸序列，其編碼DNA序列見序列表1，X-Asp-Asp-Asp-Lys-hBNP的氨基酸，其編碼DNA序列見序列表3，或X-Asp-Asp-Lys-hBNP的氨基酸序列，其編碼DNA序列見序列表5，其中X為硫氧還蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，其中所述表達(dá)載體為pET32a或pTDa。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，其中所述大腸桿菌為BL21或HB101菌株。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，其中所述發(fā)酵是將合格的重組人那希力肽基因工程菌接種到發(fā)酵罐中培養(yǎng)，采用IPTG誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)；其中所述提取，層析，純化步驟，對(duì)于腸激酶識(shí)別位點(diǎn)的融合蛋白包括的步驟為離心收集菌體，破菌、離心收集破菌液上清的步驟，將收集的上清上Zn2+-Sepharose F.F.金屬離子螯和柱，用平衡緩沖液洗去雜蛋白，然后用含適宜濃度的咪唑緩沖液洗脫那希力肽-硫氧還蛋白融合蛋白，將洗脫的那希力肽-硫氧還蛋白融合蛋白用透析或超濾除去咪唑，用高純度的Enterkinase做酶切處理，酶切完畢后溶液上Zn2+-Sepharose F.F.柱去掉硫氧還蛋白，將得到的含那希力肽溶液上反相柱層析，用含TFA的Acetonitrile梯度洗脫，得那希力肽；對(duì)于凝血酶識(shí)別位點(diǎn)的融合蛋白包括的步驟為離心收集菌體，破菌、離心收集破菌液沉淀，將收集的沉淀清用8M的脲素溶解，然后用透析的方法完全去掉脲素，將透析液直接用凝血酶酶切，將酶切后的溶液直接上SP-Sepharose F.F.離子交換柱，rhBNP被吸附在柱上，其它大部分雜質(zhì)則直接穿透；將洗脫的含rhBNP的溶液上反相柱層析，用含TFA的Acetonitrile梯度洗脫，得那希力肽。
10.一種那希力肽藥物組合物，其配方組成如下那希力肽0.5mg甘露醇 5～20mg檸檬酸(一水)2.1mg檸檬鈉(二水)2.94mg或那希力肽0.5mg甘露醇 5～20mg磷酸二氫鈉 0.93mg磷酸氫二鈉 1.73mg氯化鈉 10mg
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物活性多肽重組人那希力肽的生產(chǎn)方法，該方法包括以下步驟a.人工合成人那希力肽氨基酸編碼區(qū)相對(duì)應(yīng)的基因；b.步驟a得到的基因與適宜的表達(dá)載體上的細(xì)菌硫氧還蛋白基因3′端融合，中間含腸激酶或者凝血酶識(shí)別位點(diǎn)；c.將含有步驟b得到的融合蛋白編碼基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適宜的大腸桿菌獲得基因工程菌；d.該基因工程菌經(jīng)發(fā)酵后，經(jīng)提取，層析，純化步驟，制備出人那希力肽－硫氧還蛋白融合蛋白；e.步驟d得到的融合蛋白經(jīng)腸激酶或者凝血酶切割后，分離，純化，獲得重組人那希力肽。
文檔編號(hào)A61K38/16GK1769456SQ20051007112
公開日2006年5月10日 申請(qǐng)日期2005年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月20日
發(fā)明者周裕程, 趙斌, 彭宏衛(wèi), 楊偉, 彭輝 申請(qǐng)人:成都西瑪生物科技有限公司