一種酯酶WDEst9及其編碼基因和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種酯酶WDEst9及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明從囊孢菌NRRL18085中克隆到了一個酯酶基因WDEst9，全長為936bp，其編碼的酯酶WDEst9共包含311個氨基酸。酯酶WDEst9可用于拆分手性2?氯丙酸甲酯、2?氯丙酸乙酯和乳酸甲酯，利用酯酶WDEst9作為催化劑，分別制備得到了光學(xué)純度大于99％的(S)?2?氯丙酸甲酯(轉(zhuǎn)化率82.56％)、(S)?2?氯丙酸乙酯(轉(zhuǎn)化率87.48％)和(L)?乳酸甲酯(轉(zhuǎn)化率86.75％)。
【專利說明】
一種酯酶WDEst9及其編碼基因和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物化工和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種酯酶WDEst9及其編碼基因和 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 當(dāng)今世界上所使用的原料藥接近一半都是合成藥，而其中有四成是外消旋體。在 外消旋體中，不同對映體往往會表現(xiàn)出截然不同的生理活性和毒性。誤用這些藥會導(dǎo)致嚴(yán) 重的后果，如R型的"反應(yīng)停"是孕婦用鎮(zhèn)痛藥和止痛藥，而S型的"反應(yīng)停"對胎兒則有致畸 作用；巴比妥酸鹽S-(_)異構(gòu)體具有抑制神經(jīng)活動的作用，而R_( + )異構(gòu)體卻具有興奮作用。 為了減少有毒副作用的對映體，并降低其生物活性，光學(xué)純手性藥物的合成研究一直是制 藥研究領(lǐng)域的焦點。但是由于技術(shù)和成本等方面的原因，國內(nèi)還有很多藥物仍使用他們的 外消旋體。所以研究和開發(fā)具有我國自主產(chǎn)權(quán)的酯酶/脂肪酶具有十分重要的意義。
[0003] 光學(xué)純的2-氯丙酸及其酯是合成一些旋光性農(nóng)藥的重要原料，它可以替代一些農(nóng) 藥中間體，如2-對甲基苯磺酰丙酸酯、2-甲磺酰丙酸酯等。同時，它還可以用于合成醫(yī)藥中 間體2-氯丙酸、消炎止痛藥布洛芬等。其中，（S)-2_氯丙酸及其酯通常具有較高的生理活性 或藥理作用，而(R)-2_氯丙酸及其酯衍生的產(chǎn)物生理活性低或者無活性。因此對2-氯丙酸 及其酯光學(xué)異構(gòu)體的拆分分離研究具有重要的應(yīng)用價值。
[0004] 乳酸酯，特別是乳酸甲酯，是重要的香料及工業(yè)溶劑，在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、精細化 工等領(lǐng)域都得到廣泛的應(yīng)用。（L)-乳酸甲酯是合成一種重要的非留體鎮(zhèn)痛藥布洛芬的藥物 中間體，并且由（L)-乳酸甲酯合成的（S)-布洛芬的療效要比（D)-布洛芬高28倍。但由于生 產(chǎn)技術(shù)和生產(chǎn)成本方面的原因，目前我國市售的布洛芬大多數(shù)是外消旋體。隨著人們對手 性藥物不同對映體的生理和藥理性差異的了解，以及認(rèn)識到合成和使用單一對映體藥物的 重要性，由光學(xué)純?nèi)樗峒柞ブ苯雍铣上鄳?yīng)光學(xué)純藥物的研究將會受到越來越多的重視。
[0005] 當(dāng)今國內(nèi)外對于乳酸甲酯和2-氯丙酸及其酯光學(xué)異構(gòu)體的分離常用的方法主要 有:化學(xué)法、色譜法和酶法等。其中，化學(xué)拆分法拆分需要昂貴的手性試劑，且多數(shù)情況下較 難得到滿意的收率;色譜法拆分需要CSP、添加劑CMP或用手性試劑衍生化;而生物酶法拆分 具有立體選擇性強，反應(yīng)條件溫和，成本低等優(yōu)點，更重要的是屬于綠色化學(xué)范疇而備受青 睞?？梢灶A(yù)見，生物酶拆分將是手性藥物發(fā)展的一個朝陽方向，因此開發(fā)具有光學(xué)選擇性的 生物酶對于手性化合物的拆分具有非常大的推動作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中酯酶價格昂貴、生產(chǎn)技術(shù)受到制約的不足，提供一種新的 酯酶WDEst9及其編碼基因和應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明從一株囊抱菌（Dactylosporangium aurantiacum subsp.Hamdenensis) NRRL18085基因組中開發(fā)了一種新的酯酶WDEst9及其編碼基因 WDEst9,構(gòu)建了含有WDEst9 的重組表達載體和基因工程菌，培養(yǎng)基因工程菌后獲得酯酶WDEst9,其可應(yīng)用于拆分（±)_ 2-氯丙酸甲酯、（±)-2_氯丙酸乙酯、（±)_乳酸甲酯。
[0008] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種酯酶WDEst9,其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0009] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種編碼所述的酯酶WDEst9的酯酶基因 WDEst9。
[0010] 優(yōu)選，所述的酯酶基因 WDEst9的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0011] 本發(fā)明還提供一種含有所述的酯酶基因 WDEst9的重組表達載體。所述的表達載 體，優(yōu)選pET28a( + )載體。
[0012]本發(fā)明還提供一種含有所述的酯酶基因 TOEst9的基因工程菌。所述的基因工程 菌，優(yōu)選大腸桿菌BL21 (DE3)。
[0013]本發(fā)明的第三個目的是提供酯酶WDEst9在拆分（± )-2-氯丙酸甲酯制備得到（S)-2_氯丙酸甲酯中的應(yīng)用。
[0014] 進一步優(yōu)選，其步驟為:取酯酶WDEst9于pH為6.0-10.0的緩沖液中，再加入（±)_ 2_氯丙酸甲酯，進行反應(yīng)，得到(S) -2-氯丙酸甲酯。
[0015]進一步優(yōu)選，所述的緩沖液為檸檬酸-梓檬酸鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液、Tris/HCl 緩沖液和甘氨酸-NaOH緩沖液中的一種。
[0016] 本發(fā)明的第四個目的是提供酯酶WDEst9在拆分（± )-2-氯丙酸乙酯制備得到（S)-2-氯丙酸乙酯中的應(yīng)用。
[0017] 進一步優(yōu)選，其步驟為:取酯酶WDEst9于pH為6.0-10.0的緩沖液中，再加入（± )-2-氯丙酸乙酯，進行反應(yīng)，得到(S)-2-氯丙酸乙酯。
[0018] 本發(fā)明的第五個目的是提供酯酶WDEst9在拆分（±)_乳酸甲酯制備得到(L)-乳酸 甲酯中的應(yīng)用。
[0019] 進一步優(yōu)選，其步驟為:取酯酶WDEst9于pH為6.0-10.0的緩沖液中，再加入（±)_ 乳酸甲酯，進行反應(yīng)，得到(L)-乳酸甲酯。
[0020] 本發(fā)明還提供酯酶WDEst9在耐受他+、1(+、1^2+、環(huán)己烷、正辛烷、正癸烷、二甲基亞 砜或三聚磷酸鈉環(huán)境下進行催化的應(yīng)用。
[0021 ]本發(fā)明的酯酶基因 w D E s t 9來自深海樣品中篩選得到的一株囊孢菌 (Dactylosporangium aurantiacum subsp.Hamdenensis)NRRL18085，保存在中國科學(xué)院南 海海洋研究所實驗室。本發(fā)明用生物信息學(xué)分析的方法，從基因組測序的囊孢菌 (Dactylosporangium aurantiacum subsp·Hamdenensis)NRRL18085中篩選得到酯酶基因 WDEst9,全長為936bp(從起始密碼子到終止密碼子），編碼311個氨基酸。通過克隆編碼酯酶 WDEst9的酯酶基因 WDEst9并將其連接表達載體pET-28a( + )后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，培 養(yǎng)并誘導(dǎo)表達后，得到了重組表達的酯酶WDEst9。酯酶WDEst9作為催化劑拆分（±)-2_氯丙 酸甲酯，可制備得到99%光學(xué)純度的（S)-2-氯丙酸甲酯;酯酶WDEst9作為催化劑拆分（±)_ 2-氯丙酸乙酯，可得到99%光學(xué)純度的（S)-2-氯丙酸乙酯。酯酶WDEst9作為催化劑拆分 (±)_乳酸甲酯，可得到99%光學(xué)純度的（L)-乳酸甲酯。酯酶WDEst9具有穩(wěn)定性高、催化效 率高的優(yōu)點，在生物化工和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域具有非常大的應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0022]圖1是酯酶WDEst9對不同側(cè)鏈長度的對硝基苯酚酯酶活。
[0023]圖2是酯酶WDEst9的最適pH及pH穩(wěn)定性，A為最適反應(yīng)pH曲線圖，B為pH穩(wěn)定性曲線 圖。
[0024] 圖3是酯酶WDEst9的最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性，A為最適反應(yīng)溫度曲線圖，B為溫 度穩(wěn)定性曲線圖。
[0025] 圖4是不同濃度NaCl(KCl)對酯酶WDEst9酶活性影響。
[0026]圖5是酯酶WDEst9拆分（± )-2-氯丙酸甲酯反應(yīng)GC圖，A為樣品（± )-2-氯丙酸甲酯 氣相圖，B為酯酶WDESt9拆分（±)-2-氯丙酸甲酯反應(yīng)2.0h后的氣相圖，其中S代表(S)-2-氯 丙酸甲酯，R代表(R)-2_氯丙酸甲酯。
[0027]圖6是酯酶WDEst9拆分（± )-2-氯丙酸乙酯反應(yīng)GC圖，A為樣品（± )-2-氯丙酸乙酯 氣相圖，B為酯酶WDESt9拆分（±)-2-氯丙酸乙酯反應(yīng)2.0h后的氣相圖，其中S代表(S)-2-氯 丙酸乙酯，R代表(R)-2-氯丙酸乙酯。
[0028]圖7是酯酶WDEst9拆分（± )_乳酸甲酯反應(yīng)GC圖，A為樣品（± )_乳酸甲酯氣相圖，B 為酯酶WDEst9拆分（±)_乳酸甲酯反應(yīng)l.Oh后的氣相圖，其中L代表(L)-乳酸甲酯，D代表 (D)-乳酸甲酯。
[0029] 圖8是酯酶WDEst9的蛋白表達純化情況，其中，Μ為蛋白Marker，1為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo) 的含有pET-28a( + )-WDEst9的大腸桿菌BL21(DE3)，2為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的含有pET-28a( + )_ WDEst9的大腸桿菌BL21(DE3)，3為鎳柱穿透液，4為Ni柱純化后得到的酯酶WDEst9,5為經(jīng)過 脫鹽柱后的酯酶WDEst9。
【具體實施方式】
[0030] 以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0031] 下列實例中未具體注明的實驗方法，均可按照常規(guī)方法進行，或按照所用產(chǎn)品生 產(chǎn)廠商的使用說明。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可通過商業(yè)途徑 得到。
[0032 ]本發(fā)明的酯酶基因 w D E s t 9來自深海樣品中篩選得到的一株囊孢菌 (Dactylosporangium aurantiacum subsp .Hamdenensis)NRRL18085，該菌保存在中國科學(xué) 院南海海洋研究所實驗室。
[0033] 實施例1:酯酶基因 WDEst9引物設(shè)計及開放閱讀框邊界確定
[0034] 提取囊抱菌（Dactylosporangium aurantiacum subsp.Hamdenensis)NRRLl8〇85 的基因組DNA，經(jīng)測序驗證無誤后，利用生物信息學(xué)手段對基因組進行注釋，分析其中的酯 酶基因，確定了其中酯酶基因 WDEst9的開放閱讀框，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，全 長為936bp(從起始密碼子到終止密碼子），其編碼的酯酶WDEst9的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，共311個氨基酸，該基因是一個全新的酯酶基因。根據(jù)分析得到的酯酶基因 WDEst9序列，設(shè)計引物如下:正向引物W -CATGAATTCATGCCACTCGACCCGCAG-37，下劃線部分 為EcoR頂每切位點；反向引物:5 7 -CACAAGCTTTTAGGATCCGAACCACGC-37，下劃線部分為Hind m酶切位點。
[0035] 實施例2:酯酶基因 WDEst9的克隆及載體構(gòu)建
[0036] 2.1PCR 擴增
[0037] 將實施例1設(shè)計的引物(正向引物W -CATGAATTCATGCCACTCGACCCGCAG-37，反向引 物:5^ -CACAAGCTTTTAGGATCCGAACCACGC-37 )送至上海生物工程有限公司合成引物，合成的 引物使用TE稀釋到ΙΟμΜ，提取囊抱菌（Dactylosporangium auran tiacum subsp.Hamdenensis)NRRL18085的總DNA作為DNA模板，建立如表1所示反應(yīng)體系：
[0038] 表1 PCR反應(yīng)體系
[0039]
[0040] 使用以下PCR擴增程序擴增酯酶基因 WDEst9:a.94°C變性3min;b.94°C變性30s，55 ~65°C退火0.5-lmin，72°C延伸lmin，進行20個循環(huán);c.72°C延伸lOmin，冷卻到10°C。
[00411將PCR產(chǎn)物在1 %瓊脂糖凝膠中，120V電壓下電泳20min，置于凝膠成像系統(tǒng)中觀 察。回收936bp左右的條帶。PCR產(chǎn)物按照膠回收試劑盒的方法進行回收，使用20yL無菌水洗 脫，得到純化回收的PCR產(chǎn)物。
[0042] 2.2酶切
[0043]將純化回收的PCR產(chǎn)物使用以下體系進行雙酶切，酶切時間lh。酶切體系為:EcoRI 241^，!1;[11(11112以]^，0財〈0.3以8，滅菌的雙蒸水加至3(^匕酶切后純化回收得到經(jīng)過雙酶切的 PCR產(chǎn)物。
[0044]質(zhì)粒pET_28a( + )的雙酶切:挑取含有質(zhì)粒pET_28a( + )的大腸桿菌DH5a單菌落，過 夜培養(yǎng)。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，用EcoRI和Hindm按以下體系雙酶切，酶切時間1-2h。酶切體系為:EcoRI 2yL，HindIII2yL，質(zhì)粒DNA〈lyg，滅菌的雙蒸水加至20yL。酶切后純化 回收得到經(jīng)過雙酶切的pET-28a (+)載體。
[0045] 上述雙酶切使用的限制性內(nèi)切酶為Thermo公司生產(chǎn)的快速內(nèi)切酶，酶切后的純化 回收使用核酸純化回收試劑盒(Magen，Hipure Gel Pure DNA Micro Kit)，質(zhì)粒提取試劑 盒為上海捷瑞生物工程有限公司的質(zhì)粒小量制備試劑盒，操作方法按其使用說明書。
[0046] 2.3連接
[0047]將經(jīng)過雙酶切的PCR產(chǎn)物和pET_28a( + )載體按照3:1的摩爾比例進行連接。連接使 用的T4連接酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，連接使用的酶量為5U/5yL連接體系，連 接溫度為22°C，連接時間30min。
[0048] 2.4轉(zhuǎn)化及篩選
[0049] 取5yL連接產(chǎn)物于50yL大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞中，冰浴30min，后于42°C水浴鍋 熱激90s，冰浴2min后加入500yL LB液體培養(yǎng)基，37°C200rpm轉(zhuǎn)速下，孵育培養(yǎng)lh。取一定量 的菌液涂布于含100yL/mL卡那霉素的LB平板，培養(yǎng)20h后挑選單菌落。單菌落于5mL LB培養(yǎng) 基中過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進行雙酶切驗證，酶切片段與基因大小相同的即為陽性克隆。
[0050] 2.5基因核苷酸序列測定
[0051] 將篩選的正確陽性克隆送至上海美吉生物醫(yī)藥有限公司進行測序，測序結(jié)果與酯 酶基因 WDEst9核苷酸序列進行比對，確認(rèn)是將酯酶基因 WDEst9(其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示）插入到pET-28a( + )質(zhì)粒中，結(jié)果完全正確后確認(rèn)得到帶有酯酶基因 WDEst9的 pET-28a( + )質(zhì)粒(命名為pET-28a( + )-WDEst9)，可用于進行下一步試驗。
[0052] 實施例3:酯酶基因 WDEst9在大腸桿菌BL21 (DE3)中的高效表達 [0053] 3.1大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞制備
[0054] 1、將少量大腸桿菌BL21(DE3)菌種接入5mL LB試管液中，37°C過夜搖培，250rpm;
[0055] 2、按1 %體積比的接種量將過夜搖培后的大腸桿菌BL21(DE3)菌液接種到300ml LB搖瓶中，37°C搖培3-4h(彡300rpm)，得到原培養(yǎng)物；
[0056] 3、將培養(yǎng)好的搖瓶在冰水中迅速冷卻至0°C，將原培養(yǎng)物分裝至冰預(yù)冷的離心管 (50mL)，冰置數(shù)分鐘；
[0057] 4、4°C，4000rpm離心10min回收細胞，去上清；
[0058] 5、用冰預(yù)冷的10mL 0.1M的CaCl2重懸細胞，4°C、4000rpm離心10min回收細胞；
[0059] 6、重復(fù)5,用10mL 0.1M的CaCl2重懸細胞，冰浴lh以上；
[0060] 7、4°C，4000rpm 離心 lOmin回收細胞；
[0061 ] 8、每50mL原培養(yǎng)物得到的細胞用2mL含體積分?jǐn)?shù)15%DMS0的0.1M CaCl2來重懸， 分裝于1.5mL離心管，1 OOyL每管，-80 °C保藏。由此得到大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞。
[0062] 3.2轉(zhuǎn)化
[0063] 取實施例2中得到的pET-28a( + )-WDEst9質(zhì)粒0.5~lyL與50yL大腸桿菌BL21(DE3) 感受態(tài)細胞混合，冰浴30min，于42°C水浴鍋熱激45s，冰浴2min后加入500yL LB液體培養(yǎng) 基，37°C200rpm培養(yǎng)lh。培養(yǎng)物離心后涂布50yL/mL的卡那霉素 LB平板，培養(yǎng)過15h后挑選單 菌。由此得到含有pET-28a(+) -WDEst9的大腸桿菌BL21 (DE3)。
[0064] 實施例4:酯酶WDEst9的表達和純化
[0065] 4.1蛋白誘導(dǎo)
[0066] 含有pET-28a( + )-WDEst9的大腸桿菌BL21(DE3)在LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)至OD6〇〇為 0.5左右，加 IPTG至終濃度0.2mM，20 °C培養(yǎng)20個小時。300mL菌液4000rpm，4°C離心10min，收 集菌體，用PBS緩沖液洗滌菌體2次，4000rpm，lOmin收集菌體。用30mL(50mM，pH 7.5)PBS緩 沖液重懸菌體，超聲400w，超4s，停6s，破碎10min，4°C、10000rmp離心20min，收集上清。
[0067] 4·2酯酶WDEst9的純化
[0068] 用鎳離子親和層析柱對步驟4.1中收集的上清進行純化得純化的酯酶WDEst9(圖 8 )，純化的蛋白大小約33kD，符合理論預(yù)期。具體實施方案如下:使用1 OmM的咪唑洗脫5個柱 體積，30mM咪唑洗脫30個柱體積，最后使用100~lOOOmM咪唑洗脫5個柱體積，收集中間 3.5mL。用脫鹽柱S印hadexG25進行脫鹽，具體操作方法參照GE公司的操作手冊進行。
[0069] 4·3酯酶WDEst9酶活測定
[0070]酯酶WDEst9活力測定采用對硝基苯酚酯，具體方法如下：①配制10mM的對硝基苯 酚酯；②在lmL反應(yīng)體系中加入940yL Tris-HCl buffer(50mM，pH 8.0)，40yL乙醇，10yL濃 度為0.40~0.86mg/mL酯酶WDEst9純酶液;③于35°C下，3~5min后，410nm測定吸光度。
[0071 ]酶活單位定義：lmin內(nèi)水解對硝基苯酸酯，釋放Ιμπιο?對硝基苯酸所需的酶量定義 為一個酶活單位。
[0072] 實施例5:酯酶WDEst9的酶學(xué)性質(zhì)
[0073] 5.1水解不同長度的對硝基苯酚酯
[0074] 按照4.3的測定條件，比較酯酶WDEst9作用不同長度的對硝基苯酚酯，結(jié)果如圖1， 說明酯酶WDEst9對長鏈對硝基苯酚酯基本上沒有水解活性，而對于短鏈對硝基苯酚酯的作 用效果較好，最佳的底物是C4，即對硝基苯酚丁酸酯。
[0075] 5.2最適pH和pH穩(wěn)定性
[0076]配制不同的緩沖溶液，這些緩沖溶液具有不同的pH，如表2所示，其濃度均為50mM: [0077]表2不同緩沖體系的pH
[0078]
[0079]
[0080] 將4.3中測定條件所述的緩沖液(Tris-HCl buffer)按照表2中的緩沖溶液分別進 行替換，底物為對硝基苯酚丁酸酯，測定不同pH的緩沖溶液對酯酶WDEst9的酶活力的影響， 結(jié)果說明酯酶WDEst9酶活在Tris/HCl緩沖溶液pH為8.0時活性最高（圖2A)，PH高于8.0、小 于8.0活性都會急劇下降。
[0081 ] 酯酶WDEst9在不同pH的緩沖液中4 °C處理12h，然后按4.3中測定條件（以對硝基苯 酚丁酸酯作為底物)測定酯酶酶活，從圖中可以看出，酯酶WDEst9在4°C處理12h后，其酶活 性基本沒變，說明酯酶WDEst9可以長時間在不同的pH條件下保持較高酶活，其對pH的耐受 性較強（圖2B)。
[0082] 5.3最適溫度和溫度穩(wěn)定性
[0083]用pH 8.0、50mM Tris/HCl作為緩沖溶液，按4.3中的反應(yīng)混合液（以對硝基苯酚丁 酸酯作為底物)置于不同的溫度(20~50°C)下處理lh后，加入等量的酯酶WDEst9,在各自的 溫度下反應(yīng)1~5min，405nm測定酶活。結(jié)果說明，酯酶WDEst9最適反應(yīng)溫度在30°C(圖3A)。
[0084] 將酯酶WDEst9在20~50°C經(jīng)不同時間預(yù)處理，于30°C，pH 8.0、50mM Tris/HCl的 緩沖溶液中，按4.3測定方法（以對硝基苯酚丁酸酯作為底物)測定酯酶WDEst9酶活。結(jié)果說 明，酯酶WDEst9在20°C_30°C的穩(wěn)定性最好，隨著溫度升高，穩(wěn)定性逐漸降低，50°C處理 60min后酶活殘余約20% (圖3B)。
[0085] 5 · 4NaCl (KC1)濃度對WDEst9酶活性的影響
[0086] 將酯酶WDEst9分別加入到含有不同濃度NaCl和KCl，pH8.0、50mM Tris/HCl的緩沖 溶液中，按4.3測定方法（以對硝基苯酚丁酸酯作為底物）在各自的溫度下反應(yīng)1~5min， 405nm測定酶活。結(jié)果說明，0-1.5M的NaCl和0-2M的KC1都會促進酯酶WDEst9的酶活，當(dāng)NaCl 和KC1濃度為1M時，酯酶WDEst9酶活力殘余最高，分別為159.91 ±2.15 %和156.23 土 3.45%。當(dāng)NaCl和KCl濃度升到4M時，酯酶WDESt9酶活力殘余仍大于30%(圖4)。說明酯酶 WDEst9是耐鈉鹽和鉀鹽的酯酶。
[0087] 5.5金屬離子抑制
[0088]以50mM、pH8.0的Tris/HCl為溶劑配制不同金屬離子溶液，每種金屬離子濃度均為 ImM，將酯酶WDEst9酶液在各種金屬離子溶液中4°C下處理12h;以不加金屬離子的50mM、 pH8.0的Tris/HCl溶液為對照(Control)。再按照4.3中的測定方法（以對硝基苯酸丁酸酯作 為底物)測定酶活，結(jié)果見表3,大部分已測得金屬離子都能不同程度的促進酯酶WDEst9的 水解活性，尤其是 Na+、K+和 Mg2+，酶活分別為 159.91±2.15%、156.23±3.45%和121.44± 6.23%〇
[0089] 表3金屬離子對酯酶WDEst9酶活力的影響
[0090]
[0091]
[0092] 5.6有機溶劑、變性劑和抑制劑對酯酶WDEst9酶活性的影響
[0093] 將酯酶WDEst9加入到表4中的有機溶劑、變性劑和抑制劑中處理12h(對照為蒸餾 水，其他處理溶液的濃度為體積分?jǐn)?shù)5%或質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%)，然后按照4.3的測定方法（以對 硝基苯酚丁酸酯作為底物)測定酶活。結(jié)果表明有機溶劑環(huán)己烷、正辛烷、正癸烷和DMS0(二 甲基亞砜)能促進酯酶WDEst9酶活，最高達到145.27±8.8(%);表面活性劑三聚磷酸鈉對 酯酶WDEst9的酶活具有促進作用。
[0094] 表4有機溶劑、變性劑和抑制劑對酯酶WDEst9酶活性的影響
[0095]
[0096]實施例6:酯酶WDEst9在拆分（± )-2-氯丙酸甲酯、（± )-2-氯丙酸乙酯和（± )-乳 酸甲酯中的應(yīng)用
[0097]本法在水相中拆分（± )-2_氯丙酸甲酯、（± )-2_氯丙酸乙酯和（± )_乳酸甲酯。 [0098] 1)在優(yōu)化的條件下，即在0.5ml 50mM、pH7.5的PBS緩沖溶液中，加入5mg的酯酶 WDEst9粗酶粉，于30 °C，200rpm條件下，拆分30mM的（± )-2-氯丙酸甲酯，在2h內(nèi)可得到99 % 光學(xué)純度的（S)-2-氯丙酸甲酯，產(chǎn)物產(chǎn)率為82.56% (圖5)。
[0099] 2)在優(yōu)化的條件下，即在0.5ml 50mM、pH8.0的Tris/HCl緩沖溶液中，加入5mg的酯 酶WDEst9粗酶粉，于30°C，200rpm條件下，拆分20mM的（± )-2-氯丙酸乙酯，在2h內(nèi)可得到 99%光學(xué)純度的（S)-2-氯丙酸乙酯，產(chǎn)物產(chǎn)率為87.65% (圖6)。
[0100] 3)在優(yōu)化的條件下，即在0.5mL 50mM、pH8.5的Tris/HCl緩沖溶液中，加入5mg的酯 酶WDEst9粗酶粉，于30°C，200rpm條件下，拆分15mM的（± )-乳酸甲酯，在1. Oh內(nèi)可得到大于 99 %光學(xué)純度的(L)-乳酸甲酯，產(chǎn)物產(chǎn)率為86.75 % (圖7)。
[0101]具體分析條件為：采用福立氣相色譜儀，配有手性柱（30mX0.25mm Cyclosil B chir 1 column)和氫離子火焰檢測器。儀器分析條件設(shè)置為:注射器溫度220°C，檢測器溫度 250°C，載氣為N2，流速1.2mL/min，采用梯度升溫進行分析:80°C保持lmin，15°C/min，120°C 保持lmin，10°C/min到220°C，保持lmin。
【主權(quán)項】
1. 一種酯酶WDEst9，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDN0.2所示。2. -種編碼權(quán)利要求1所述的酯酶WDEst9的酯酶基因 WDEst9。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的酯酶基因 WDEst9,其特征在于，所述的酯酶基因 WDEst9的核苷 酸序列如SEQ ID N0.1所示。4. 權(quán)利要求1所述的酯酶WDEst9在拆分（±)-2_氯丙酸甲酯制備得到（S)-2-氯丙酸甲 酯中的應(yīng)用。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，取酯酶WDEst9于pH為6.0-10.0的緩沖液 中，再加入（±)-2_氯丙酸甲酯，進行反應(yīng)，得到(S)-2-氯丙酸甲酯。6. 權(quán)利要求1所述的酯酶WDEst9在拆分（±)-2_氯丙酸乙酯制備得到（S)-2-氯丙酸乙 酯中的應(yīng)用。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，取酯酶WDEst9于pH為6.0-10.0的緩沖液 中，再加入（±)-2_氯丙酸乙酯，進行反應(yīng)，得到(S)-2-氯丙酸乙酯。8. 權(quán)利要求1所述的酯酶WDEst9在拆分（±)_乳酸甲酯制備得到（L)-乳酸甲酯中的應(yīng) 用。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，取酯酶WDEst9于pH為6.0-10.0的緩沖液 中，再加入（± )-乳酸甲酯，進行反應(yīng)，得到(L)-乳酸甲酯。10. 權(quán)利要求1所述的酯酶WDEst9在耐受似+、1(+、1%2+、環(huán)己烷、正辛烷、正癸烷、二甲基亞 砜或三聚磷酸鈉環(huán)境下進行催化的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/70GK106085985SQ201610604881
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月27日 公開號201610604881.7, CN 106085985 A, CN 106085985A, CN 201610604881, CN-A-106085985, CN106085985 A, CN106085985A, CN201610604881, CN201610604881.7
【發(fā)明人】胡云峰, 王依龍, 徐珊, 李任強, 張云, 孫愛君
【申請人】中國科學(xué)院南海海洋研究所