青霉素結(jié)合蛋白Bt?pbp2X及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種新型的青霉素結(jié)合蛋白Bt?pbp2X及其編碼基因，所述蛋白具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸且具有同等活性的蛋白。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以用于制備青霉素類抗生素檢測(cè)試劑，應(yīng)用于青霉素類抗生素殘留的快速檢測(cè)，其不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，樣品前處理過(guò)程非常的簡(jiǎn)單，并且對(duì)于檢測(cè)人員技術(shù)及知識(shí)水平有特定要求，非常適于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】
青霉素結(jié)合蛋白Bt-pbp2X及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種青霉素結(jié)合蛋白及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著我國(guó)大眾生活水平的不斷提高，人們對(duì)食品安全的關(guān)注度越來(lái)越高，食品中 抗生素過(guò)量殘留的問(wèn)題已經(jīng)引起人們的強(qiáng)烈反響。內(nèi)酰胺類抗生素指其分子結(jié)構(gòu)中含有 內(nèi)酰胺環(huán)的一大類抗生素，包括青霉素及其衍生物、頭孢菌素、單酰胺環(huán)類、碳青霉烯和 青霉烯類酶抑制劑等，以及新發(fā)展的頭霉素類、硫霉素類、單環(huán)內(nèi)酰胺類等其他非典型β_ 內(nèi)酰胺類抗生素。它是現(xiàn)有在食品中添加的抗生素中使用最普及的一類。長(zhǎng)期攝入內(nèi)酰 胺類抗生素過(guò)量殘留的食品將嚴(yán)重導(dǎo)致人們身體健康，抗生素過(guò)量殘留能破壞胃腸道等菌 群的平衡，引起長(zhǎng)期的腹瀉、維生素缺乏及影響其他治療藥物的療效;攝入內(nèi)酰胺類抗生 素過(guò)量殘留的食品會(huì)導(dǎo)致一部分人群的過(guò)敏反應(yīng)，較輕者表現(xiàn)為蕁麻疹、發(fā)熱、關(guān)節(jié)腫痛及 蜂窩組織炎等病癥，嚴(yán)重時(shí)可引起喉頭水腫、呼吸困難、過(guò)敏性休克，甚至危及生命的危害； 長(zhǎng)期攝入抗生素過(guò)量殘留的食品會(huì)增強(qiáng)體內(nèi)細(xì)菌對(duì)人體的耐藥性，以至于出現(xiàn)預(yù)想的超級(jí) 細(xì)菌，當(dāng)人體出現(xiàn)疾病時(shí)，可增加治療難度甚至導(dǎo)致治療失效。
[0003] 隨著乳品中抗生素殘留問(wèn)題的日益嚴(yán)峻，我國(guó)對(duì)乳品質(zhì)量的監(jiān)管也日趨嚴(yán)格， 2007年我國(guó)通過(guò)了《生鮮乳品收購(gòu)標(biāo)準(zhǔn)修正案》，其中明確將抗生素殘留檢驗(yàn)列為強(qiáng)制檢測(cè) 項(xiàng)目并明確制定了各類抗生素在牛乳中的最高殘留限量。
[0004] 目前，國(guó)內(nèi)乳品行業(yè)廣泛應(yīng)用的牛乳中青霉素殘留的檢測(cè)方法主要依據(jù)國(guó)標(biāo) GB4789.27-94《鮮乳中抗生素殘留量檢測(cè)方法》進(jìn)行，包括試管法和平板法。商檢系統(tǒng)的行 業(yè)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法為杯碟法。盡管微生物法在基層單位使用廣泛，但該法的精確度、準(zhǔn)確度都 不夠高，且檢測(cè)過(guò)程煩瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，不易篩選到敏感菌株，易受其它抗菌藥物的影響，根本 無(wú)法適應(yīng)牛乳抗生素殘留檢測(cè)需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種青霉素類抗生素結(jié)合蛋白。
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供編碼所述青霉素類抗生素結(jié)合蛋白的基因。
[0007] 本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供所述蛋白在檢測(cè)青霉素類抗生素中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明從蘇云金芽孢桿菌中得到了一種新型的與青霉素具有高親和力的蛋白質(zhì) Bt-pbp2X，該蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，序列全長(zhǎng)699個(gè)氨基酸，表觀分子量為 76101.4Da，等電點(diǎn)約為8.80,該蛋白質(zhì)是一種細(xì)菌細(xì)胞壁合成過(guò)程中具有轉(zhuǎn)肽和轉(zhuǎn)糖催化 作用的雙功能，該酶參與細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的生物合成，并在合成過(guò)程中發(fā)揮糖基轉(zhuǎn)移酶 活性，該酶第30到582氨基酸類似于細(xì)胞分裂蛋白FtsI，第60到212氨基酸為二聚體結(jié)構(gòu)域 pfam03717,第262到565氨基酸轉(zhuǎn)肽酶結(jié)構(gòu)域pfam00905。
[0009] 應(yīng)當(dāng)理解，此領(lǐng)域相關(guān)技術(shù)人員可以根據(jù)此發(fā)明公開(kāi)的蛋白Bt-pbp2X的氨基酸序 列（SEQ ID No.2)，在不影響其生物活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基 酸，得到所述蛋白的突變序列。例如在非活性區(qū)段，將第80位的Asn替換為Asp，將第190位的 Glu替換為Gly或Ala，將第240位的Gin替換為T(mén)hr，將第320位的Lys替換為His，將第56~105 位氨基酸缺失，將第1位Met增加6個(gè)His組氨酸純化標(biāo)簽或增加 GST標(biāo)簽。因此，本發(fā)明的Bt-pbp2X蛋白還包括SEQ ID No.2所示氨基酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸， 具有與Bt-pbp2X同等活性的由Bt-pbp2X衍生得到的蛋白質(zhì)。
[0010]進(jìn)一步本發(fā)明提供編碼上述青霉素結(jié)合蛋白Bt-pbp2X的基因。
[0011]優(yōu)選地，所述核苷酸序列為：（1)序列表SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，或（2)SEQ ID No. 1所示核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸，編碼Bt-pbp2X的核苷 酸序列。
[0012] 此外，應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性以及不同物種密碼子的偏愛(ài)性，本領(lǐng)域相關(guān) 技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子。
[0013] 本發(fā)明的基因和蛋白質(zhì)可以從蘇云金芽孢桿菌中克隆或分離得到，或者通過(guò)DNA 或肽合成的方法得到。
[0014] 可將本發(fā)明基因與表達(dá)載體可操作地連接，得到能夠表達(dá)本發(fā)明蛋白的重組表達(dá) 載體，進(jìn)而可以通過(guò)本領(lǐng)域所熟知的轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)入到其他菌種中，使其具有表達(dá)所述蛋 白的能力。
[0015] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，將PCR擴(kuò)增得到的Bt-pbp2X基因插入到表達(dá)載體 pET28a( + )上構(gòu)建得到重組表達(dá)載體pET28a( + )-pbp2X，并最終轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主 E.coli BL21(DE3)，使其能誘導(dǎo)表達(dá)獲得Bt-pbp2X蛋白。
[0016] 進(jìn)一步，此發(fā)明提供了一種專門(mén)用于檢測(cè)食品中青霉素類抗生素殘留的檢測(cè)試 劑，其包括所述的Bt_pbp2X蛋白。所述的用于檢測(cè)的食品可以是固態(tài)、半固態(tài)、液態(tài)等。固態(tài) 食品可以通過(guò)簡(jiǎn)單的研磨、粉碎等方式處理后溶于相應(yīng)溶劑，使食品中青霉素得以釋放，并 用于青霉素的檢測(cè)。半固態(tài)食品直接向其中加入相應(yīng)的溶劑使青霉素釋放，并進(jìn)行檢測(cè)。液 態(tài)食品可以是飲料、牛奶等，一般可以直接進(jìn)行檢測(cè)。
[0017] 本發(fā)明提供的Bt-pbp2X蛋白質(zhì)具有與β-內(nèi)酰胺環(huán)類抗生素進(jìn)行特異性結(jié)合的能 力，可將其應(yīng)用用于食品中β-內(nèi)酰胺環(huán)類抗生素殘留的檢測(cè)，用此技術(shù)研發(fā)的產(chǎn)品不需要 特殊的儀器設(shè)備，樣品前處理過(guò)程簡(jiǎn)單方便，并且對(duì)檢測(cè)人員的技術(shù)以及知識(shí)水平要求低， 方便用于食品以及家庭進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1是PCR擴(kuò)增Bt-pbp2X基因的凝膠電泳圖，其中Μ是DNAMaker，l、2為以蘇云金芽 孢桿菌BMB171為模板PCR擴(kuò)增得到的Bt-pbp2X基因。
[0019] 圖2是重組質(zhì)粒pET28a( + )-pbp2X圖譜。
[0020]圖3是pET28a( + )-Bt-pbp2X的驗(yàn)證，Μ為DNA Maker，l、2為pET28a( + )-Bt-pbp2X，經(jīng) EcoRV，Xhc^酶切結(jié)果，片段大小分別為3.9kb，3.4kb。
[0021 ]圖4是Bt-pbp2X蛋白質(zhì)的純化結(jié)果，其中，Μ是蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，1是誘導(dǎo)上清，2是 純化蛋白。
[0022]圖5是不同青霉素濃度與Bt_pbp2X蛋白質(zhì)發(fā)生特異性相互作用后微熱泳變化。 [0023]圖6是使用Bt_pbp2X蛋白質(zhì)測(cè)定青霉素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0024]實(shí)施例1 Bt_pbp2X蛋白的制備 [0025] 1、蘇云金芽孢桿菌總DNA提取
[0026] (1)將蘇云金芽孢桿菌菌株BMB171接種于5ml PA瓶中28°C過(guò)夜活化，次日按1%接 種量轉(zhuǎn)接至50ml液體培養(yǎng)基中LB培養(yǎng)基中，28°C，200r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心收集菌 體，STE洗一次。
[0027] (2)加5.75ml Solution I(25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA，50mM葡萄糖）和 250yL溶菌酶(200mg/mL)冰浴過(guò)夜，
[0028] (3)加 3ml 10%SDS 于 50-60°C 水浴 30min;隨后加入 3.6ml5MNaCl，冰上 lOmin 后直 接加入苯酸:氯仿:異戊醇（25:24:1)去除蛋白質(zhì)；1200〇1'/111；[11，離心15111；[11后取上清，加2倍 體積無(wú)水乙醇沉淀。70 %乙醇洗滌一次。
[0029] (4)干燥沉淀，用200yL ddH20或TE溶30min。并用瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢 測(cè)總DNA的濃度和質(zhì)量。
[0030] 2、引物設(shè)計(jì)與合成
[0031]根據(jù)蘇云金芽孢桿菌BMB171中預(yù)測(cè)的基因序列，設(shè)計(jì)上下游引物，并在上游引物 引入酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基，下游引物引入酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基，引物由北京奧科生物 科技有限公司合成。
[0032] 上游引物CCGCATATGATGAAGTGGACAAAAAG (下劃線為Ndel酶切位點(diǎn)，灰色背景為保 護(hù)堿基）
[0033] 下游引物CCGCTCGAGTTAGTCTCCTAAAGTTAA (下劃線為Xhol酶切位點(diǎn)，灰色背景為保 護(hù)堿基）
[0034] 3、PCR擴(kuò)增Bt-pbp2X基因，具體反應(yīng)體系如下：
[0035] DNA 模板，0.5yL
[0036] 上游引物，1此
[0037] 下游引物，1此
[0038] 10倍Buffer，2.5yL
[0039] dNTP 混合物（2.5mmol/L)，2yL
[0040] pfu Tap酶，lyL
[0041] ddH20，17yL
[0042] 反應(yīng)條件如下：95°C預(yù)變性5min; 95°C0.5min，55 °C0.5min，72°C2min，30個(gè)循環(huán)； 72°C延伸lOmin，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，回收目的片段(圖1)。
[0043] 4、Bt_pbp2X蛋白表達(dá)菌株的構(gòu)建
[0044] 回收的PCR產(chǎn)物37°CNdeI和Xhol雙酶切4小時(shí)，載體pET-28a也經(jīng)過(guò)Ndel和Xhol雙 酶切4小時(shí)，T4連接酶將外源基因與pET-28a連接成pET28a( + )-pbp2X重組載體（圖2)，經(jīng) EcoRV，XhoI酶切驗(yàn)證為3.9kb，3.4kb符合預(yù)期（圖3)，轉(zhuǎn)入E. coli DH5a菌株;提取含有Bt-pbp2X基因的重組載體pET28a (+) -pbp2X轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主E · co 1 i BL21 (DE3)。
[0045] 5、Bt_pbp2X 蛋白的誘導(dǎo)
[0046] 將含有重組質(zhì)粒pET28a( + )-pbp2X的E.coli BL21(DE3)在平板上挑取單菌落，接 種含有卡拉霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C過(guò)夜活化培養(yǎng)，約14小時(shí)后，將菌液按1 /100比例 加入新鮮的卡拉霉素 LB液體培養(yǎng)基，200r/min培養(yǎng)至0D6q() = 0.8~1.0，加入IPTG誘導(dǎo)（IPTG 終濃度為〇. lmM)200r/min，16°C培養(yǎng)12小時(shí)，將培養(yǎng)瓶置于冰上5分鐘；4°C，12000r/min離 心收集菌體，預(yù)冷的ddH 20重懸菌體沉淀，再次離心收集菌體，備用。
[0047] 6、Bt_pbp2X 蛋白的純化
[0048] 用4°C的Soluble Binding BufTer(10mM咪挫，NaCl 0.5M，20mM Tris_HCl，pH = 7.9)重懸菌體，置于冰上超聲波破碎至懸液變澄清;4°C，12000r/min離心60分鐘，收集上清 液，經(jīng)〇.45μπι微孔濾膜過(guò)濾后緩緩加入到Ni瓊脂糖凝膠柱中，隨后使用15倍柱體積的 Soluble Binding Buffer沖洗柱子，洗脫雜蛋；然后用Elution Buffer(500mM咪唑，0.5M NaCl，20mMTris-HCl，pH = 7.9)洗脫柱子，收集洗脫液。隨后15KDa截流管去除咪唑，得到純 化蛋白質(zhì)Bt-pbp2X，SDS-PAGE鑒定提取蛋白為單一條帶無(wú)明顯雜蛋白（圖4)。經(jīng)測(cè)序鑒定為 本發(fā)明Bt_pbp2X。
[0049] 實(shí)施例2微量熱泳動(dòng)儀(MST，NanoTemper Technologies)測(cè)定Bt_pbp2X測(cè)定青霉 素相互作用
[0050] 微量熱泳動(dòng)儀(MST)是基于下述原理:將蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記，采用紅外激光光源產(chǎn) 生一個(gè)溫度場(chǎng)，小分子化合物與熒光標(biāo)記的蛋白結(jié)合后導(dǎo)致蛋白電荷、構(gòu)象等發(fā)生改變，則 熒光標(biāo)記的蛋白在溫度場(chǎng)中的熱泳動(dòng)快慢發(fā)生變化，這種變化反應(yīng)在熒光值的變化上。將 小分子稀釋為一定的梯度濃度，若小分子與焚光標(biāo)記的蛋白有結(jié)合，貝U焚光標(biāo)記蛋白的熱 泳動(dòng)變化也呈一定的規(guī)律性，由此可以擬合出二者的結(jié)合曲線，求得小分子和蛋白的解離 常數(shù)(Kd值)。
[0051 ] l、Bt-pbp2X蛋白的熒光標(biāo)記
[0052] 依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，將純化后的Bt-pbp2X蛋白濃度稀釋16μΜ，使A柱進(jìn)行buffer exchange，取100yL蛋白樣品加入94yL Labe 1 ing buffer和6yLRED_NHS染料混勾，于室溫黑 暗中孵育30min。孵育結(jié)束后，用B柱(分子篩)將游離的未結(jié)合染料和已經(jīng)標(biāo)記的蛋白樣品 分離，最終獲得約500yL標(biāo)記的Η亞基蛋白樣品用于相互作用分析。
[0053] 2、Bt_pbp2X蛋白與青霉素相互作用測(cè)定
[0054]測(cè)定已經(jīng)標(biāo)記的Bt_pbp2X蛋白樣品熒光值，篩選不同的稀釋濃度調(diào)節(jié)熒光值在 200-1500范圍之間。經(jīng)篩選確定，將蛋白樣品用roS稀釋20倍并加入終濃度為0.1 %的吐溫-20以減小蛋白在毛細(xì)管內(nèi)壁的附著。將青霉素溶于PBS緩沖溶液中配制成將小分子配體，即 青霉素溶解于PBS中配制成母液，再用PBS稀釋不同的濃度梯度。濃度梯度為0.00375、 0·0075、0·015、0·03、0·0625、0·125、0·25、0·5、1·0、2·0、4·0、8·0、16·0、32·0、64·0、128·0μ Μ的標(biāo)準(zhǔn)溶液。稀釋后的蛋白樣品和小分子配體化合物于12000rpm，4°C下離心5min，隨后分 別取上清，然后用PBS將小分子配體化合物進(jìn)行梯度稀釋，共16個(gè)濃度梯度。將蛋白樣品上 清與16個(gè)不同濃度的小分子配體化合物1:1混合，填充16根毛細(xì)管，進(jìn)行微量熱泳動(dòng)分析。
[0055] 3、相關(guān)性分析
[0056] 相關(guān)性分析使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS進(jìn)行，采用雙變量皮爾遜相關(guān)性分析，雙尾（two-tailed)檢驗(yàn)，在0.05水平上檢驗(yàn)其顯著性。經(jīng)測(cè)定Bt-pbp2X蛋白與青霉素親和常數(shù)Kd = 10.36nmol/L(圖 5)。
[0057] 實(shí)施例3 Bt_pbp2X蛋白檢測(cè)青霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
[0058] 1、青霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備
[0059]青霉素溶于PBS緩沖溶液配置成濃度為lyg/m L的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，向已知無(wú)抗牛奶 中加入此溶液調(diào)配含青霉素濃度一定的標(biāo)準(zhǔn)樣品。隨后，標(biāo)準(zhǔn)樣品置于搖床15min充分混 勻。
[0060] 2、Bt-pbp2X 包被酶標(biāo)板
[00611向酶標(biāo)板微孔中加入l00yL青霉素結(jié)合蛋白Bt-pbp2X溶液(4yg/mL)，4°C放置過(guò) 夜，以使Bt-pbp2X蛋白固定于微孔表面。傾去孔內(nèi)液體，每孔加入PBS緩沖溶液(300yL，洗滌 3遍，濾紙上拍干。
[0062] 3、酶標(biāo)板的封閉
[0063] 每空加入150yL 2%BSA封閉液，37°C孵育3小時(shí)，使用roS緩沖溶液洗滌3次后，濾 紙上拍干。
[0064] 4、加入標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品
[0065] 將青霉素溶于roS緩沖溶液中配制成質(zhì)量梯度為0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、 16.0、32.0、64.0、128.0、256. Oyg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。每孔中加入50yL不同梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再 加入50yL辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的青霉素(HRP-Amp)，37°C孵育30min，傾去孔內(nèi)液體，用TOST 溶液洗滌4次后，濾紙上拍干。
[0066] 5、加入酶解底物顯色
[0067] 加入100此新配置的四甲基聯(lián)苯胺溶液(TMB)，避光37°C孵育lOmin。立即向每孔中 加入50yL 2M H2SO4終止液，藍(lán)色變黃色。
[0068] 6、測(cè)定吸光值
[0069] 使用酶標(biāo)儀lOmin內(nèi)測(cè)測(cè)定微孔在450nm處的吸光A450。反應(yīng)過(guò)程中，青霉素和 HRP-Amp競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Bt-pbp2X，若樣品中含有青霉素越多，HRP-Amp結(jié)合在受體上的量越少， 最終導(dǎo)致酶解液的吸光度變小，即樣品中的青霉素濃度與微孔中酶解液的吸光度值成反 比。
[0070] 7、標(biāo)準(zhǔn)曲線建立
[0071] 以標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)樣品的％吸光度值為縱坐標(biāo)，用SPSS軟件，繪制標(biāo) 準(zhǔn)曲線。當(dāng)青霉素濃度在0到256yg/的時(shí)候，吸光度與青霉素濃度有線性關(guān)系44 5〇 =-0·12781η(〇ΜΡ)+1·1067，Κ2 = 0·9757(圖 6)。
[0072]實(shí)施例4利用Bt_pbp2X蛋白測(cè)定與牛奶中青霉素殘留 [0073] 1、檢測(cè)樣品的前處理
[0074]脫脂奶樣本直接上樣檢測(cè)，純牛奶樣本5000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘，脫脂后直接檢測(cè)。 [0075] 2、牛奶中青霉素殘留含量的測(cè)定
[0076]按照實(shí)施例2方法依次配置不同濃度的青霉素標(biāo)準(zhǔn)脫脂牛奶樣品，酶標(biāo)儀測(cè)定微 孔在450nm處的吸光度A45Q，以標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)樣品的％吸光度值為縱坐標(biāo)，用 Origin 8軟件，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取不同濃度下牛奶樣品，使用酶標(biāo)儀測(cè)定微孔在450nm處的 吸光A45Q。重復(fù)3次，每次6個(gè)平行，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算出牛奶中青霉素的含量。
[0077] 3、準(zhǔn)確性(添加回收率)的測(cè)定
[0078]在不含有青霉素的脫脂牛奶中添加一定量的青霉素，添加終濃度為5、10、20ng/ mL，然后用實(shí)施例3方法檢測(cè)樣品中青霉素的含量，每個(gè)樣品做6個(gè)平行樣(n = 6)。測(cè)定結(jié)果 表明，此方法具有很好的精密度及回收率，牛奶中添加濃度為5ng/mL時(shí)，回收率平均達(dá)到 94.4%±6.32%;添加濃度為10ng/mL時(shí)，回收率平均達(dá)到93.8 % ± 5.72 % ;添加濃度為 20ng/mL時(shí)，回收率平均達(dá)到93.4 % ± 5.24 % ;在添加濃度為Ong/m L中，沒(méi)有出現(xiàn)假陽(yáng)性， 也沒(méi)有假陰性(表1)。
[0079]表1:準(zhǔn)確性(添加回收率)的測(cè)定 [0080]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種與青霉素類抗生素結(jié)合的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列是： 1. SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或 2. SEQ ID No.2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸且具有同 等活性的蛋白。2. 編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。3. 如權(quán)利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。4. 含有權(quán)利要求2或3所述基因的表達(dá)載體。5. 由權(quán)利要求4所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。6. 如權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其為大腸桿菌。7. 含有權(quán)利要求所述蛋白的檢測(cè)試劑。8. 權(quán)利要求1所述蛋白在檢測(cè)青霉素殘留中的應(yīng)用。9. 一種檢測(cè)青霉素類抗生素殘留的方法，其是用權(quán)利要求1所述蛋白與樣品中的青霉 素相結(jié)合，并檢測(cè)結(jié)合的結(jié)果。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，將所述蛋白與標(biāo)準(zhǔn)品中的青霉素結(jié)合，并 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣品中青霉素的含量。
【文檔編號(hào)】C12N9/10GK106085982SQ201610697616
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年8月18日 公開(kāi)號(hào)201610697616.8, CN 106085982 A, CN 106085982A, CN 201610697616, CN-A-106085982, CN106085982 A, CN106085982A, CN201610697616, CN201610697616.8
【發(fā)明人】鞠守勇, 陳其國(guó), 朱虹翼, 徐順高, 王超
【申請(qǐng)人】武漢職業(yè)技術(shù)學(xué)院