轉基因煙草tmv-cp定性標準樣品及其制備、定值方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種轉基因煙草TMV-CP定性標準樣品及其制備、定值方法，其屬于煙草檢測用實物標準樣品及其制備方法【技術領域】，具體包括轉基因煙草TMV-CP品系的原料選取、標準樣品的制備、均勻性和穩(wěn)定性檢查、定性檢定、定值等過程，其中樣品的制備方法包括：將原料粉碎、混勻，經(jīng)凍干機冷凍干燥后分裝、定值、輻照、標識、0-4℃溫度條件下貯存的步驟，此外，標準樣品的最小取樣量、均勻性檢驗使用相對G-S指數(shù)檢驗法，保證了標準樣品的均勻性、穩(wěn)定性、定值結果等技術指標達到國家標準樣品的要求，對積極開展我國轉基因產(chǎn)品檢測定性標準樣品的研制，添補該測量領域的空白，具有很重要的現(xiàn)實意義。
【專利說明】轉基因煙草TMV-CP定性標準樣品及其制備、定值方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于植物檢測用實物標準樣品及其制備方法【技術領域】，具體涉及轉基因煙草TMV-CP定性標準樣品及其制備方法。
【背景技術】 [0002]1983年，世界上第一例轉基因植物誕生。1984年，英、美、法等國開始以煙草為材料進行轉基因研究。Horsh等人首創(chuàng)葉盤轉化法，用根癌農桿菌感染煙草葉片外植體，在培養(yǎng)基上獲得轉基因煙草，開創(chuàng)了用煙草外植體為材料進行轉基因的新途徑。1986年，美國的Powell-Abel首次將煙草花葉病毒(TMV)的外殼蛋白基因導入煙草并獲得抗TMV的轉基因煙草植株。從此，煙草轉基因研究得到了快速的發(fā)展，并取得了很大成就。目前，國際上已報道有45例以上的成功轉基因抗病毒煙草，近百例轉基因煙草進入大田試驗。轉基因煙草所用基因有:外殼蛋白基因、反義RNA基因、衛(wèi)星RNA基因、復制酶基因、運動蛋白基因、抗毒素基因、胰蛋白酶抑制劑基因、幾丁質酶基因、神經(jīng)肽基因、動物干擾素基因、玉米醇溶蛋白基因等。成功的轉基因煙草有:抗病毒病煙草；抗真菌、細菌病害煙草；抗除草劑煙草；抗根線蟲病煙草；抗煙青蟲害煙草；抗蚜蟲煙草、單克隆抗體煙草等。首例批準商業(yè)化種植的轉基因煙草是被歐盟1994年批準的SEITA公司的轉bxn基因的抗除草劑溴苯腈煙草。該轉基因煙草能抗高出常用濃度16倍的溴苯腈，且其農藝性狀、品質、評吸品質又與對照無明顯差異。但由于遭到一些國家的反對而未大面積推廣種植。1988年，北京大學首次用TMV外殼蛋白基因轉成抗TMV的香料煙品種，并在丹東農科所田間試驗。同年，中科院微生物所與河南農科院植保所合作用衛(wèi)星RNA的互補DNA轉化煙草也獲得了抗TMV、CMV(黃瓜花葉病毒)的雙抗病毒烤煙品種煙草。隨后許多單位開展了用不同來源的目的基因向煙草轉移的研究。國內曾立項開展煙草轉基因研究的有10項之多，涉及受體品種有10多個，涉及的研究單位有20多個。
[0003]然而，人們對轉基因食品的安全性問題存在著很多的爭論。轉基因作物的生態(tài)風險、可能帶來的環(huán)境問題、作為食品對人體健康影響的問題、產(chǎn)品加貼標簽問題、運輸問題、國際貿易問題、知識產(chǎn)權問題等已引起世界廣泛性的關注。轉基因產(chǎn)品的安全性問題已由學術觀點分歧，發(fā)展到知識產(chǎn)權、環(huán)境問題、經(jīng)濟問題甚至政治問題。歐盟和一些國家相繼出臺了轉基因產(chǎn)品管理法規(guī)，我國于2002年3月開始實施《農業(yè)轉基因生物安全管理條例》及其三個配套管理辦法。2001年，歐盟要求對轉基因食品進行標識管理，并提出對非轉基因食品只要不是有意污染，允許含有1%的轉基因產(chǎn)品(閾值)，而不用標識。日本、韓國、澳大利亞等不同國家的限量閾值不同，從1% -5%不等。
[0004]轉基因食品的檢測是旨在保護生物和生態(tài)安全、維護消費者權益、促進貿易和經(jīng)濟健康發(fā)展的法規(guī)和政策的基本依據(jù)，其標準化將為制訂、實施和改進相關法規(guī)和政策提供有力保證。國內外轉基因食品的檢測研究剛剛起步，許多問題都有待解決，標準樣品則是該領域尚未解決的重要問題。開展轉基因成分檢驗標準樣品的研制在保證測試結果的可比性和溯源性、保障食品安全、解決貿易爭端，促進經(jīng)濟發(fā)展等方面均具有重要的意義。更為嚴峻的問題是目前國外僅有轉基因大豆粉、轉基因玉米粉M0N810等少數(shù)幾個品種的標準物質，價格非常昂貴，手續(xù)繁多，周轉時間長，不能適時地滿足檢驗檢疫工作的需要；日本正在加緊研制轉基因產(chǎn)品檢測的分子DNA參考標準物質，用于轉基因產(chǎn)品的定量檢測；2005年，國內研制成功了轉基因大豆粉國家二級標準物質，填補了我國在轉基因成分檢測標準樣品方面的空白，之后研制成功了轉基因油菜籽、轉基因玉米、轉基因棉花籽等標準樣品，但轉基因煙草標準樣品的研制還是空白，并且對于定性標準樣品的均勻性評價一直是一個難點，至今未有科學的統(tǒng)計學方法引入，鑒于國內轉基因煙草標準樣品緊缺和均勻性評價困難的狀況，本項標準樣品的制備完成，為轉基因煙草定性標準樣品研究提供了制備技術、均勻性評價和穩(wěn)定性保證技術，對積極開展我國轉基因產(chǎn)品檢測定性標準樣品的研制，添補該測量領域的空白，具有很重要的現(xiàn)實意義。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明為了完成本項標準樣品的制備工作，遼寧出入境檢驗檢疫局成立了研制工作小組，進行了轉基因煙草TMV-CP品系的原料檢測引物確定、原料選取、定性檢定、資料查詢、標準樣品的制備、均勻性和穩(wěn)定性檢查、定值等多項工作，具體的:
[0006]本發(fā)明的一方面涉及轉基因煙草TMV-CP定性標準樣品，是將轉基因檢測工作中收集的烤煙葉陽性樣品(TMV-CP品系)原料粉碎、混勻，經(jīng)凍干機冷凍干燥后分裝、定值、最后經(jīng)fwCJkGy輻照，樣品加貼唯一性標識，0-4°C溫度條件下貯存。其制備工藝流程見圖1，具體的制備步驟包括:
[0007]a.取500g轉基因煙草TMV-CP原料粉碎后過100目標準篩；
[0008]b.將步驟a中獲得的轉基因煙草粉加水(質量比1:1)混勻后放置于中試凍干機中低溫真空冷凍干燥，冷凍速度TC /min，早期冷凍點-rc、15min，冷凍溫度_40°C，共熔點_26°C，加熱溫度20°C 120min制備成混合凍干粉；
[0009]c.將步驟b中獲得的混合凍干粉分裝于經(jīng)160°C干熱處理2h的潔凈的7mL棕色玻璃瓶中封蓋密封，每瓶內裝混合凍干粉樣品lg，再將分裝好的樣品經(jīng)fwCJkGy輻照Ih后，放置于干燥處O~4°C貯存；
[0010]d.使用相對G-S指數(shù)檢驗法檢驗步驟c中獲得的樣品的均勻性。
[0011]本發(fā)明上述技術方案中，所述的使用相對G-S指數(shù)檢驗法檢驗步驟d中獲得的樣品的均勻性是指利用G-S指數(shù)法統(tǒng)計評價樣品的均勻性。此為本申請的創(chuàng)新之處，在現(xiàn)有的技術文獻中未見報道，其相比傳統(tǒng)方法有顯著的進步，有益之處體現(xiàn)在將G-S指數(shù)法引入定性標準樣品的均勻性評價，使定性標準樣品的均勻性評價更具科學性，可靠性；
[0012]相對Gin1-Simpson指數(shù)檢驗法:對于定性屬性值僅能取“是”、“否”兩個值等的二態(tài)屬性情況，采用Gin1-Simpson指數(shù)計算物品間的定性屬性值分散程度以及在均勻分布時屬性值的分散程度，兩個指數(shù)的比值可表示相對分散程度，即相對均勻度。由于一般使用不均勻程度來表示均勻性，因此，用I減去相對均勻度得到不均勻度。
[0013]有時，標準樣品在當前水平下的不均勻性可能并不能被現(xiàn)有測量方法檢出，例如，所有測量結果均為“陽性”，這時，將標準樣品稀釋或縮小子樣量直至出現(xiàn)二態(tài)屬性兩個值的出現(xiàn)概率均不為I (在部分測量領域所謂的“Cutoff”值附近)的范圍，在該范圍內采用相對Gin1-Simpson指數(shù)評估其不均勻性，然后根據(jù)不均勻度與水平之間的關系得到標準樣品的不均勻度。很多情況下，被稀釋的標準樣品的不均勻度與標準樣品的不均勻度的比值約為稀釋比的平方根倍。
[0014]計算方式為:
[0015]對m個樣品中的每個進行η次測量，使用“ I ”和“O”分別表示待測屬性“存在”和“不存在”的情況，設第i個能力驗證物品取得結果“I”的比例為Pi，按下式計算Gin1-Simpson指數(shù)(縮寫為GS指數(shù)):
【權利要求】
1.一種轉基因煙草TMV-CP定性標準樣品，其特征在于，制備步驟包括: a.取轉基因煙草TMV-CP原料粉碎后過100目標準篩； b.將步驟a中獲得的轉基因煙草粉加水，以質量比1:1混勻后放置于中試凍干機中低溫真空冷凍干燥，冷凍速度1°C /min，早期冷凍點_rC、15min，冷凍溫度-40°C，共熔點_26°C，加熱溫度20°C、120min制備成混合凍干粉； c.將步驟b中獲得的混合凍干粉分裝于經(jīng)160°C干熱處理2h的潔凈的棕色玻璃瓶中封蓋密封，再將分裝好的樣品經(jīng)fwCJkGy輻照Ih后，于干燥處O~4°C貯存； d.使用相對G-S指數(shù)檢驗法檢驗步驟c中獲得的樣品的均勻性。
2.—種轉基因煙草TMV-CP檢測試劑盒，其特征在于，包括檢測引物:SEQ ID N0.1~4和權利要求1所述的TMV-CP標準樣品。
【文檔編號】C12Q1/68GK103937905SQ201410198144
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年5月12日 優(yōu)先權日:2014年5月12日
【發(fā)明者】蔣丹, 曹際娟, 丁健, 孫曉飛 申請人:蔣丹, 曹際娟, 丁健, 孫曉飛