專利名稱：二苯并二氮雜酮類似物，它們的生產(chǎn)方法和它們作為藥物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有改善性能的dibenzodiazepinone(二苯并二氮雜酮)類似物，它們是化合物1的化學(xué)衍生物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及它們的藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物和前藥，和涉及獲得所述化合物的方法。一種獲得所述衍生物的方法涉及化合物1的生物合成后化學(xué)修飾。本發(fā)明進(jìn)一步涉及二苯并二氮雜酮類似物、它們藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物和前藥作為藥物的用途，特別是涉及它們作為癌細(xì)胞生長抑制劑、哺乳動物脂氧合酶和用于治療急性和慢性炎癥的用途，并且涉及含有二苯并二氮雜酮類似物或者其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或者前藥的藥物組合物。

背景技術(shù)：
真放線菌是通稱為放線菌屬的龐大和復(fù)雜革蘭氏陽性菌組的亞型。在過去的數(shù)十年間，由于可以形成作為次級代謝產(chǎn)物的大量治療有效化合物，特別是抗生素，因此人們對這些在土壤中富集的有機體產(chǎn)生了顯著的商業(yè)和科學(xué)研究興趣。可以產(chǎn)生新抗生素的菌株深入研究引起了對數(shù)百種新物質(zhì)的鑒定。
已經(jīng)對多種真放線菌，特別鏈霉菌屬和密切相關(guān)的糖多孢菌屬進(jìn)行了廣泛研究。這兩種菌種都能產(chǎn)生顯著多樣性的生物學(xué)活性代謝產(chǎn)物。因為這些化合物的商業(yè)重要性，人們非常熟知這些有機體的遺傳學(xué)和生理學(xué)。真放線菌的另一代表性的種屬，小單孢菌屬同樣具有商業(yè)利益。例如，美國專利No.5,541,181(Ohkuma et al.)公開了由已知的真放線菌株——小單孢菌屬M990-6(ATCC 55378)形成的二苯并二氮雜酮化合物，其中明確公開了5-法呢基-4，7，9-三羥基-二苯并二氮雜-11-酮(名稱為“BU-4664L”)。ECO-4601(化合物1)和小單孢菌屬株046-ECO11以及[S01]046公開于CA 2,466,340中。其治療癌癥的用途公開于PCT/CA2005/000751中。

ECO-4601(化合物1) 具有抗組胺性能的合成二苯并二氮雜酮類似物公開于公開的加拿大專利申請2,248,820中。
雖然多種生物學(xué)活性化合物已經(jīng)從細(xì)菌中得到了鑒定，但是仍然需要獲得具有增強性能的新穎化合物。由此，非常需要以高經(jīng)濟(jì)效益的方式和高產(chǎn)率獲得藥學(xué)活性化合物。本發(fā)明通過提供新的治療學(xué)化合物和經(jīng)過生物合成后化學(xué)修飾從而形成這些新穎化合物的方法，解決了上述這些問題。
發(fā)明概述 在本發(fā)明的一方面中，二苯并二氮雜酮類似物由如下所定義的式I化合物或者氫化或者氫化烷氧基化法呢基衍生物表示，或者式I化合物的藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或者前藥表示。在另一實施方案中，二苯并二氮雜酮類似物由如下所定義的化合物2～27中的任意一種或者藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或者前藥表示，或者化合物2～25的任意一種的前藥的鹽表示。在另一實施方案中，二苯并二氮雜酮類似物由化合物2～5、7、13、14、15、18、21和22中的任何一種表示，或者由化合物2～5、7、13、14、15、18、21和22中任何一種的藥學(xué)上可接受的溶劑化物或者前藥表示。
在本發(fā)明的另一方面，二苯并二氮雜酮類似物由如下所定義的化合物23～25中的任何一種表示，或者由化合物23～25中任何一種的藥學(xué)上可接受的溶劑化物或者前藥表示。
本發(fā)明進(jìn)一步包括通過以下方法獲得的二苯并二氮雜酮類似物，所述方法包括以下步驟(a)提供ECO-4601的分離形式，(b)化學(xué)改性化合物1。在另一實施方案中，二苯并二氮雜酮類似物是式I化合物，或者其氫化或者氫化烷氧基化法呢基衍生物，或者其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或者前藥。在另一實施方案中，化學(xué)修飾步驟(b)是選自N-烷基化、O-三酰基化、芳基溴化和法呢基氫化或者氫化烷氧基化的一個或者多個步驟。在另一實施方案中，二苯并二氮雜酮類似物選自化合物2～27。在另一實施方案中，二苯并二氮雜酮類似物選自化合物2～5、7、13、14、15、18、21和22。在另一實施方案中，二苯并二氮雜酮類似物選自化合物23～25。
本發(fā)明進(jìn)一步包括制備二苯并二氮雜酮化合物的方法，包括化學(xué)修飾法呢基二苯并二氮雜酮化合物1，和任選分離與純化由此產(chǎn)生的二苯并二氮雜酮化合物。在一種實施方案中，所述化學(xué)修飾步驟包括選自N-烷基化、O-?；⒎蓟寤托揎椃鼗鶄?cè)鏈雙鍵(包括氫化和氫化烷氧基化)的至少一個步驟。在該實施方案的亞類中，法呢基側(cè)鏈修飾反應(yīng)是部分(修飾一個或者兩個雙鍵)或者完全(修飾所有三個雙鍵)修飾。
本發(fā)明進(jìn)一步包括式I化合物或者其氫化或氫化烷氧基化法呢基衍生物或者藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或者前藥作為抗癌劑用于治療哺乳動物癌癥前期或者癌癥癥狀的用途。在一種實施方案中，所述化合物選自化合物2～27。在另一實施方案中，所述化合物選自化合物2～5、7、13、14、15、18、21和22。在另一實施方案中，所述化合物選自化合物23～25。
本發(fā)明進(jìn)一步包括式I化合物或者其氫化或氫化烷氧基化法呢基衍生物或者藥學(xué)上可接受的鹽或前藥作為抗癌劑用于治療哺乳動物增殖疾病的用途。在一種實施方案中，所述化合物選自化合物2～27。在另一實施方案中，所述化合物選自化合物2～5、7、13、14、15、18、21和22。在另一實施方案中，所述化合物選自化合物23～25。
本發(fā)明進(jìn)一步包括式I化合物或者其氫化或氫化烷氧基化法呢基衍生物或者藥學(xué)上可接受的鹽或前藥在制備用于治療哺乳動物癌癥前期或者癌癥癥狀的藥物中用途。在一種實施方案中，所述化合物選自化合物2～27。在另一實施方案中，所述化合物選自化合物2～5、7、13、14、15、18、21和22。在另一實施方案中，所述化合物選自化合物23～25。
本發(fā)明進(jìn)一步包括含有式I化合物或者氫化或氫化烷氧基化法呢基衍生物或者其藥學(xué)上可接受的鹽或前藥連同說明書的商業(yè)包裝，其用于治療瘤或癌癥前期或者癌癥癥狀。在一種實施方案中，所述化合物選自化合物2～27。在另一實施方案中，所述化合物選自化合物2～5、7、13、14、15、18、21和22。在另一實施方案中，所述化合物選自化合物23～25。
在一種實施方案中，上述用途中的癌細(xì)胞、瘤、癌癥前期或者癌癥癥狀選自血癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、腎癌、結(jié)腸或者結(jié)腸直腸癌、前列腺癌或者CNS癌癥。在另一實施方案中，上述方法和用途中的癌癥前期或者癌癥癥狀選自血癌、乳腺癌、前列腺癌和CNS癌癥。
附圖簡述

圖1表示由丸劑(bolus)給藥腫瘤細(xì)胞接種一天之后的帶有C6惡性膠質(zhì)瘤的鼠10～30mg/kg化合物1后產(chǎn)生的腫瘤生長抑制作用。
圖2表示由丸劑給藥腫瘤細(xì)胞接種十天之后的帶有惡性膠質(zhì)瘤的鼠20～30mg/kg化合物1后產(chǎn)生的腫瘤生長抑制作用。
圖3表示帶有惡性膠質(zhì)瘤并且用鹽水或者化合物1處理的鼠腫瘤部分的顯微照片。用化合物1處理的腫瘤細(xì)胞密度表現(xiàn)出下降趨勢和由腫瘤細(xì)胞得到的細(xì)胞核較大，并且呈現(xiàn)表明細(xì)胞毒素作用的固縮。
圖4表示由丸劑給藥腫瘤細(xì)胞接種11～20天的帶有C6惡性膠質(zhì)瘤的鼠20～75mg/kg化合物2后產(chǎn)生的腫瘤生長抑制作用。
圖5表示以30mg/kg靜脈內(nèi)(iv)、腹膜內(nèi)(ip)、皮下(sc)和口服(po)丸劑(bolus)給藥之后，在瑞士鼠中的化合物1的平均(±SD)血漿濃度。
圖6表示以30mg/kg靜脈內(nèi)(iv)和腹膜內(nèi)(ip)丸劑(bolus)給藥之后，在CD-1鼠中的化合物1和2的平均(±SD)血漿濃度。
圖7表示在以30mg/kg靜脈內(nèi)(iv)、腹膜內(nèi)(ip)和皮下(sc)丸劑給藥之后，化合物1在多種組織中的平均濃度。
發(fā)明詳述 本發(fā)明涉及具有改良性能的新穎二苯并二氮雜酮類似物，在此是指式I化合物和氫化或者氫化烷氧基化法呢基衍生物以及化合物2～27。本發(fā)明進(jìn)一步涉及二苯并二氮雜酮化合物的藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物和前藥。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過化學(xué)修飾化合物1獲得所述類似物的方法。化合物1從放線菌屬株，小單孢菌屬種046-ECO11(也稱為046(ECO11))或者[S01]046中進(jìn)行分離，如PCT/CA04/000069中所述。
本發(fā)明還涉及通過化學(xué)修飾由發(fā)酵和分離獲得的法呢基二苯并二氮雜酮而形成新穎的二苯并二氮雜酮類似物的方法。在該實施方案的亞類中，形成的化合物為式I化合物或者其氫化或氫化烷氧基化法呢基衍生物，或者選自化合物23～27的化合物。
本發(fā)明還涉及含有選自式I化合物、化合物2～27和它們藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物和衍生物的化合物的藥物組合物。所述化合物可以用作藥物，特別是可以用作贅生性細(xì)胞生長抑制劑。
以下詳細(xì)說明公開了如何制備和應(yīng)用二苯并二氮雜酮類似物和含有這些化合物的組合物抑制腫瘤生長。
據(jù)此，本發(fā)明的某些方面涉及含有本發(fā)明二苯并二氮雜酮化合物連同藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，和應(yīng)用該藥物組合物治療癌癥前期或者癌癥癥狀的方法。
I.定義 所有在本文中使用的技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。為方便起見，將用于說明書、實施例和附屬權(quán)利要求中的某些術(shù)語和短語的含義提供如下。
在此使用的術(shù)語“法呢基二苯并二氮雜酮”是指化合物1，即10-法呢基-4，6，8-三羥基-5，10-二氫二苯并[b，e][1，4]二氮雜-11-酮，還稱為ECO-4601。
在此使用的術(shù)語“本發(fā)明化合物”、“二苯并二氮雜酮類似物”、“二苯并二氮雜酮化合物”及其等價表達(dá)是指含有法呢基部分或者由法呢基部分衍生的一類二苯并二氮雜酮化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物和前藥。該術(shù)語包括式I化合物，選自化合物2～27的化合物，或者本發(fā)明例證的化合物，化合物2～5、7、13、14、15、18和21～25，或者任意上述化合物的藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或者前藥。在此使用的術(shù)語“二苯并二氮雜酮類似物”包括在化學(xué)合成中可以用作中間體的該類化合物或者含有不同于最豐同位素原子的同位素的變體(例如，替換H的D，替換12C的13C等等)。有時還將本發(fā)明化合物稱為“活性成分”。
在此使用的術(shù)語“化學(xué)修飾”是指通過化學(xué)合成修飾稱為“原料”的二苯并二氮雜酮化合物的一種或者多種步驟。優(yōu)選在化學(xué)修飾方法中用作原料的化合物為化合物1?；瘜W(xué)修飾步驟的實例包括N-烷基化、O-酰基化、芳香溴化和修飾法呢基側(cè)鏈的雙鍵(包括氫化和氫化烷氧基化)。法呢基側(cè)鏈修飾反應(yīng)可以是部分(修飾一個或者兩個雙鍵)或者完全(修飾三個雙鍵)修飾?；瘜W(xué)修飾步驟還在部分IIIB的方案中進(jìn)行了限定并且在實施例4～8中進(jìn)行了例證說明。
術(shù)語“酯”是指根據(jù)以下方案1(b)中所定義的O-?；磻?yīng)，通過C(O)R”替換基團(tuán)替換醇中的氫原子獲得的二苯并二氮雜酮類似物，其中C(O)R”還可以為C-偶聯(lián)的氨基酸。術(shù)語酯還包括酯的等價物，包括但不限于碳酸酯、氨基甲酸酯等等。更具體而言，術(shù)語“酯”包括在4、6和8位上醇的酯(原子編號參見實施例3～8)。
術(shù)語“N-烷基化衍生物”是指根據(jù)如以下方案2(a)所定義的N-烷基化反應(yīng)，通過R替換基團(tuán)替換N原子上的氫原子獲得的二苯并二氮雜酮類似物。更具體而言，術(shù)語“N-烷基化衍生物”包括在5位氮原子上的取代衍生物(原子編號參見實施例3～8)。
在此使用的術(shù)語“氫化或者氫化烷氧基化法呢基衍生物”是指分別根據(jù)部分IHB方案3(a)和(b)中所定義的一般方法，并且更明確而言在實施例4和7中所定義的方法產(chǎn)生的在一至三個位置上具有通過飽和化(加入兩個氫原子)或者通過加入醇分子(H和OC1-6烷基)而得到修飾的法呢基側(cè)鏈的化合物。
在此使用的縮略語具有它們的一般含義。除非另有說明，縮略語“Ac”、“Me”、“Et”、“Pr”、“i-Pr”、“Bu”、“Bz”、“Bn”和“Ph”分別是指乙酰基、甲基、乙基、丙基(正丙基或者異丙基)、異丙基、丁基(正丁基、異丁基、仲丁基或者叔丁基)、苯甲?；?、芐基和苯基。說明書中的縮略語對應(yīng)于以下測量、工藝、性能或者化合物“RT”和“Rt”是指保留時間，“min”是指分鐘，“h”是指小時，“μL”是指微升，“mL”是指毫升，“mM”是指毫摩爾，“M”是指摩爾，“mmole”是指毫摩爾，“eq”是指摩爾當(dāng)量?！案邏阂合嗌V”或者“高效液相色譜”簡寫為HPLC。
術(shù)語“烷基”是指直鏈、支鏈或者環(huán)狀飽和烴基。烷基的實例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、戊基、己基、庚基、環(huán)戊基、環(huán)己基和環(huán)己基甲基等等。烷基可以任選被選自以下的取代基取代?；?、氨基、酰胺基、酰氧基、烷氧基羰基、羧基、羧酰胺基、氰基、鹵素、羥基、硝基、硫基、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、烷氧基、芳氧基、亞硫?；?、磺酰基、氧代、胍基和甲酰基。
其中n為2～12的整數(shù)的術(shù)語“C1-n烷基”是指具有1至所表明的“n”個碳原子的烷基。所述C1-n烷基可以為環(huán)狀或者直鏈或支鏈烷基。
其中n為2～10的整數(shù)的術(shù)語“直鏈C1-n烷基”是指具有1至所表明的“n”個碳原子并且為直鏈的烷基，即在連接的原子(在此為氮原子)附近不是環(huán)狀或者支鏈。所述C1-n烷基可以任選被比如氨基、氰基、鹵素、羥基、硝基、硫基和烷氧基的基團(tuán)取代。
術(shù)語“烯基”是指含有1～6個碳-碳雙鍵的直鏈、支鏈或者環(huán)狀不飽和烴基。烯基的實例包括但不限于乙烯基、1-丙烯-2-基、1-丁烯-4-基、2-丁烯-4-基和1-戊烯-5-基等等。烯基可以任選被選自以下的取代基取代酰基、氨基、酰胺基、酰氧基、烷氧基羰基、羧基、羧酰胺基、氰基、鹵素、羥基、硝基、硫基、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、烷氧基、芳氧基、亞硫?；⒒酋；?、甲?；?、氧代和胍基。不飽和烴鏈的雙鍵部分可以為順式或者反式構(gòu)型。
其中n為3～12的整數(shù)的術(shù)語“C2-n烯基”是指具有2至所表明數(shù)目“n”個碳原子的烯基。所述C2-n烯基可以為環(huán)狀或者直鏈或支鏈烯基。
術(shù)語“炔基”是指含有至少一個碳-碳三鍵的直鏈、支鏈或者環(huán)狀不飽和烴基。炔基的實例包括但不限于乙炔基、1-丙炔-3-基、1-丁炔-4-基、2-丁炔-4-基和1-戊炔-5-基等等。炔基可以任選被選自以下的取代基取代?；?、氨基、酰胺基、酰氧基、烷氧基羰基、羧基、羧酰胺基、氰基、鹵素、羥基、硝基、硫基、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、烷氧基、芳氧基、亞硫?；⒒酋；?、甲?；⒀醮碗一?。
其中n為3～12的整數(shù)的術(shù)語“C2-n炔基”是指具有2至所表明數(shù)目“n”個碳原子的炔基。所述C2-n炔基可以為環(huán)狀或者直鏈或支鏈炔基。
術(shù)語“環(huán)烷基”或者“環(huán)烷基環(huán)”是指在具有3～15個環(huán)原子的單或者稠合碳環(huán)系統(tǒng)中，進(jìn)一步包括飽和或者部分不飽和碳環(huán)的如上所定義的烷基。環(huán)烷基的實例包括但不限于環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)戊烯-1-基、環(huán)戊烯-2-基、環(huán)戊烯-3-基、環(huán)己基、環(huán)己烯-1-基、環(huán)己烯-2-基、環(huán)己烯-3-基、環(huán)庚基、二環(huán)[4，3，0]壬基和降莰烷基等等。環(huán)烷基可以任選被選自以下的取代基取代酰基、氨基、酰胺基、酰氧基、烷氧基羰基、羧基、羧酰胺基、氰基、鹵素、羥基、硝基、硫基、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、烷氧基、芳氧基、亞硫?；?、磺?；图柞；?。
其中n為4～15的整數(shù)的術(shù)語“C3-n環(huán)烷基”是指具有3至所表明的“n”個碳原子的環(huán)烷基環(huán)或者環(huán)狀系統(tǒng)。
術(shù)語“雜環(huán)烷基”、“雜環(huán)”或者“雜環(huán)烷基環(huán)”是指進(jìn)一步在具有3～15個環(huán)原子的單或者稠合雜環(huán)(例如四氫呋喃基具有五個環(huán)原子，包括一個氧原子)中包括1～4個雜原子(例如N、O、S、P)或者雜基團(tuán)(例如NH、NRX、PO2、SO、SO2)的如上所定義的環(huán)烷基。雜環(huán)烷基、雜環(huán)或者雜環(huán)烷基環(huán)的實例包括但不限于吡咯烷基、四氫呋喃基、四氫二噻吩基、四氫吡喃基、四氫噻喃基、哌啶基、嗎啉代、硫代嗎啉代、噻烷基、哌嗪基、氮雜環(huán)丁烷基、oxetanyl(氧環(huán)丁基)、thietanyl、高哌啶基、oxepanyl、thiepanyl、氧氮雜?；?、二氮雜草基、硫氮雜?；?，2，3，6-四氫吡啶基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、二氫吲哚基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、二烷基、1，3-二氧戊環(huán)基、吡唑啉基、二噻烷基、二四氫噻吩基、二氫吡喃基、二氫噻吩基、二氫呋喃基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、3-氮雜雙環(huán)[3，1，0]己基、3-氮雜雙環(huán)[4，1，0]庚基、3H-吲哚基和喹嗪基。可能時，由上述所列化合物衍生得到的上述雜環(huán)烷基可以為C-連接或者N-連接。雜環(huán)烷基、雜環(huán)或者雜環(huán)烷基環(huán)可以任選被選自以下的取代基取代?；被?、酰胺基、酰氧基、氧代、硫代羰基、亞氨基、烷氧基羰基、羧基、羧酰胺基、氰基、鹵素、羥基、硝基、硫基、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、烷氧基、芳氧基、亞硫?；?、磺?；图柞；?。
其中n為4～15的整數(shù)的術(shù)語“C3-n雜環(huán)烷基”是指在環(huán)中具有3至所表明的數(shù)字“n”個原子并且具有至少一個如上所定義的雜基團(tuán)的雜環(huán)烷基。
術(shù)語“鹵素”是指溴、氯、氟或者碘取代基。
術(shù)語“芳基”或者“芳環(huán)”是指在共軛單環(huán)或者多環(huán)系統(tǒng)中具有“4n+2”個π(pi)電子并且具有5～14個環(huán)原子的一般芳香基團(tuán)，其中n為1～3的整數(shù)。芳基可以直接進(jìn)行連接或者經(jīng)C1-3烷基進(jìn)行連接(還稱為芳烷基)。芳基的實例包括但不限于苯基、芐基、苯乙基、1-苯乙基、甲苯基、萘基、聯(lián)苯基和三聯(lián)苯基等等。芳基可以任選被一個或者多個選自以下的取代基取代酰基、氨基、酰胺基、酰氧基、疊氮基、烷硫基、烷氧基羰基、羧基、羧酰胺基、氰基、鹵素、羥基、硝基、硫基、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基、烷氧基、芳氧基、亞硫酰基、磺?；图柞；?。
其中n為5～14的整數(shù)的術(shù)語“C5-n芳基”是指具有5至所表明的數(shù)字“n”個原子(包括碳、氮、氧和硫)的芳基。所述C5-n芳基可以為單環(huán)或者多環(huán)芳基。
術(shù)語“雜芳基”或者“雜芳基環(huán)”是指進(jìn)一步含有1～4個選自氧、氮、硫或者磷的雜原子的如上所定義的芳環(huán)。雜芳基的實例包括但不限于吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、四唑基、呋喃基、噻吩基、異唑基、噻唑基、唑基、異噻唑基、吡咯基、喹啉基、異喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、噌啉基、吲唑基、中氮茚基、酞嗪基、噠嗪基、三嗪基、異氮雜茚基、蛛吮基、嘌呤基、二唑基、噻二唑基、呋咱基、苯并呋咱基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基和呋喃并吡啶基。雜芳基可以任選被一個或者多個選自以下的取代基取代酰基、氨基、酰胺基、酰氧基、疊氮基、烷硫基、烷氧基羰基、羧基、羧酰胺基、氰基、鹵素、羥基、硝基、硫基、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基、烷氧基、芳氧基、亞硫酰基、磺?；图柞；?。雜芳基可以直接進(jìn)行連接或者經(jīng)C1-3烷基進(jìn)行連接(還稱為雜芳烷基)。可能時，由上述所列化合物所衍生的上述雜芳基可以進(jìn)行C-連接或者N-連接。
其中n為5～14的整數(shù)的術(shù)語“C5-n雜芳基”是指具有5至所表明的數(shù)字“n”個原子(包括碳、氮、氧和硫原子)的雜芳基。所述C5-n雜芳基可以為單環(huán)或者多環(huán)雜芳基。
術(shù)語“氨基酸”是指含有氨基的有機酸。該術(shù)語包括天然存在和合成氨基酸；因此，所述氨基可以但非需要連接在與酸相鄰的碳原子上。C-偶聯(lián)的氨基酸取代基經(jīng)它的羧酸官能連接在母體分子的雜原子(氮或者氧)上。當(dāng)雜原子是氧時，C-偶聯(lián)的氨基酸與母體分子形成酯，當(dāng)雜原子是氮時，形成酰胺。氨基酸的實例包括但不限于丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、鎖鏈賴氨素、鳥氨酸、2-氨基丁酸、環(huán)己基丙氨酸、二甲基甘氨酸、苯基甘氨酸、正纈氨酸、正亮氨酸、羥基賴氨酸、別-羥基賴氨酸、羥基脯氨酸、異鎖鏈賴氨素、別-異亮氨酸、乙基甘氨酸、β-丙氨酸、氨基已二酸、氨基丁酸、乙基天冬酰胺和N-甲基氨基酸。氨基酸可以為純L或者D異構(gòu)體或者L和D異構(gòu)體的混合物。
本發(fā)明化合物可以具有一個或多個不對稱碳原子并且可以作為形成外消旋或者非外消旋化合物的混合物的旋光異構(gòu)體存在。本發(fā)明化合物可以以單個異構(gòu)體使用或者以立體化學(xué)異構(gòu)形式的混合物使用。非對映異構(gòu)體，即非重疊立體化學(xué)異構(gòu)體可以通過傳統(tǒng)方法進(jìn)行分離，比如色譜法、蒸餾、結(jié)晶或者升華。所述旋光異構(gòu)體可以通過根據(jù)常規(guī)方法拆分外消旋混合物得到制備，所述方法包括手性色譜法(例如HPLC)、免疫測定方法或者使用共價(例如Mosher’s酯)或者非共價(例如手性鹽)結(jié)合手性試劑以形成對對映酯或者鹽，隨后可以通過常規(guī)方法(比如色譜法、蒸餾、結(jié)晶或者升華)對其進(jìn)行進(jìn)一步分離。然后，通過常規(guī)方法對所得手性酯或者鹽進(jìn)行裂解或者交換，從而回收期望的異構(gòu)體。
本發(fā)明包括得到分離或者純化的化合物。得到“分離”或者“純化”的化合物是指表示按重量計為混合物至少10％、20％、50％、80％或者90％的化合物，條件是當(dāng)在本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知的常規(guī)生物測定法中進(jìn)行測試時，含有本發(fā)明化合物的混合物具有明顯的(即，統(tǒng)計上顯著的)生物活性，包括抑制細(xì)胞、細(xì)胞毒素、酶抑制或者受體結(jié)合作用。
術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”是指由含有堿性或者酸性部分的本發(fā)明化合物通過常規(guī)化學(xué)方法合成的無毒鹽類。通常，所述鹽類可以通過在水或者有機溶劑或者二者的混合物中，使這些化合物的游離酸或者堿形式與化學(xué)計量的適當(dāng)堿或者酸反應(yīng)得到制備；通常優(yōu)選比如醚、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、異丙醇或者乙腈的非水介質(zhì)。另一種制備鹽的方法是利用離子交換樹脂。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”包括母體化合物或者其前藥或溶劑化物的酸加成鹽和堿加成鹽。所述鹽的性質(zhì)并不是決定性的，條件是它是藥學(xué)上可接受的鹽即可。用于酸加成鹽中的例證性的酸包括但不限于氫氯酸、氫溴酸、氫碘酸、硝酸、碳酸、硫酸、磺酸、磷酸、甲酸、乙酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、草酸、蘋果酸、谷氨酸、丙酸、乙二酸、葡糖酸、馬來酸、embonic(帕莫酸)、甲磺酸、乙磺酸、2-羥基乙磺酸、泛酸、苯磺酸、甲苯磺酸、磺胺酸、甲磺酸、環(huán)己氨基磺酸、硬脂酸、藻酸、β-羥基丁酸、丙二酸、半乳糖二酸和半乳糖醛酸等等。適宜的藥學(xué)上可接受的堿加成鹽包括但不限于由鋁、鈣、鋰、鎂、鉀、鈉和鋅制備的金屬鹽類或者有機鹽，比如由N，N′-二芐基乙二胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡萄糖胺、賴氨酸和普魯卡因等等制備的有機鹽。藥學(xué)上可接受的鹽的其它實例列于Berge等人(1977)，Journal ofPharmaceutical Sciences，vol 66，no 1，pp 1-19中，其全部內(nèi)容在此引入作為參考。
術(shù)語“溶劑化物”是指本發(fā)明化合物與一種或者多種溶劑分子(不論是有機或者無機溶劑分子)的物理結(jié)合。所述物理結(jié)合包括氫鍵鍵合。在某些情形中所述溶劑化物可以進(jìn)行分離，例如，當(dāng)一個或者多個溶劑分子結(jié)合入結(jié)晶固體的晶格中時?！叭軇┗铩卑ㄈ芤合嗪涂煞蛛x的溶劑化物。示例性的溶劑化物包括水合物、乙醇化物、甲醇化物和半乙醇合物等等。
術(shù)語“藥學(xué)上可接受的前藥”是指本發(fā)明化合物的任何藥學(xué)上可接受的酯、酯的鹽或者任何其它衍生物，通過給藥至受者，能夠直接或者間接提供本發(fā)明化合物或者其生物學(xué)活性代謝產(chǎn)物或者殘基。特別優(yōu)選的鹽或者前藥是當(dāng)將所述化合物給藥至哺乳動物(例如，使得口服給藥的化合物更易于吸收到血液中)時，那些具有改良性能(比如本發(fā)明化合物的溶解性、效能或者生物利用度)鹽或者前藥，或者相對于母體物質(zhì)提高母體化合物向生物學(xué)部分(例如，腦或者淋巴系統(tǒng))的遞送的鹽或者前藥。在此使用的前藥是具有一個或者多個共價結(jié)合至載體的官能團(tuán)的藥物，其中當(dāng)將該藥物給藥至哺乳動物對象時，在體內(nèi)發(fā)生所述藥物的新陳代謝或者化學(xué)解除。本發(fā)明化合物的藥學(xué)上可接受的前藥包括其羥基衍生物，比如但不限于酰氧基甲基醚、酰氧基乙基醚和?；虼一选Ⅴ?、氨基酸酯、磷酸酯、磺酸鹽和硫酸酯以及它們的金屬鹽等等。
II.本發(fā)明化合物 在一方面，本發(fā)明涉及新穎的二苯并二氮雜酮類似物，在此稱為本發(fā)明化合物，并且涉及其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物和前藥。
本發(fā)明化合物，化合物2～5、7、13、14、15、18和21～25可以通過它們?nèi)我獾奈锢砘瘜W(xué)和光譜性能進(jìn)行表征，比如質(zhì)譜和NMR光譜，詳細(xì)描述在實施例4～8中。
在另一方面，本發(fā)明化合物由式I進(jìn)行表征

式I 其中， R1為直鏈C1-10烷基； 或者其法呢基衍生物，其中所述法呢基衍生物具有一個、兩個或者三個得到氫化或者氫化烷氧基化的雙鍵； 或者其藥學(xué)上可接受的鹽或者前藥。
在一種實施方案中，R1為直鏈C1-10烷基，和所有其它基團(tuán)如先前所公開。在該實施方案的亞類中，所述烷基任選被選自鹵素、氟、氨基和羧基的取代基取代，或者其藥學(xué)上可接受的鹽。在另一實施方案中，R1為甲基。在另一實施方案中，R1為乙基。在另一實施方案中，R1為正丙基。在另一實施方案中，R1為正丁基。在另一實施方案中，R1為正戊基。在另一實施方案中，R1為正己基。在另一實施方案中，R1為甲基，和法呢基得到了完全氫化(即飽和)。在另一實施方案中，R1為甲基，和法呢基的一個雙鍵得到了氫化。在另一實施方案中，R1為甲基，和法呢基的兩個雙鍵得到了氫化。在另一實施方案中，R1為直鏈C1-10烷基，和法呢基的一個雙鍵得到了氫化。在另一實施方案中，R1為直鏈C1-10烷基，和法呢基的兩個雙鍵得到了氫化。在另一實施方案中，R1為直鏈C1-10烷基，和法呢基得到了完全氫化(即飽和)。在另一實施方案中，R1為直鏈C1-10烷基，和法呢基的一個雙鍵得到了氫化甲氧基化。在另一實施方案中，R1為直鏈C1-10烷基，和法呢基的兩個雙鍵得到了氫化甲氧基化。在另一實施方案中，R1為甲基，和法呢基的一個雙鍵得到了氫化烷氧基化。在另一實施方案中，R1為甲基，和法呢基的兩個雙鍵得到了氫化烷氧基化。在另一實施方案中，R1為乙基，和法呢基的一個雙鍵得到了氫化烷氧基化。在另一實施方案中，R1為乙基，和法呢基的兩個雙鍵得到了氫化烷氧基化。本發(fā)明包括所有的酯或者N-烷基化衍生物和上述化合物的藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物及其前藥。
以下為本發(fā)明的例證性化合物，這些加以命名的化合物并不意圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍 A.N-烷基化產(chǎn)品
化合物2；化合物3；
化合物4； 化合物5；
化合物6； 化合物7；
化合物8； 化合物9；
化合物10； 化合物11；
化合物12；化合物13； B.N-烷基化產(chǎn)品的氫化衍生物
化合物14；化合物15；
化合物16； C.N-烷基化產(chǎn)品的氫化烷氧基化衍生物
化合物17； 化合物18；
化合物19；化合物20；
化合物21；化合物22； D.其它選擇
化合物23； 化合物24；
化合物25； 化合物26；和
化合物27； 或者化合物2～27中任何一種化合物的前藥的藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供任何一種上述化合物的酯和N-烷基化衍生物。某些實施方案明確排除了一種或者多種式I化合物。
本發(fā)明化合物的前藥包括，其中4、6和8-羥基中的一個或多個羥基或者分子上的任意其它羥基與任何給藥至哺乳動物對象時裂解從而形成游離羥基的基團(tuán)鍵接的化合物。前藥的實例包括但不限于羥基官能團(tuán)的乙酸酯、甲酸酯、半琥珀酸酯、苯甲酸酯、二甲基氨基乙酸酯和磷酰氧基羰基衍生物；羥基官能團(tuán)的二甲基甘氨酸酯、氨基烷基苯基酯、氨基烷基酯或者羧烷基酯。還包括羥基的氨基甲酸酯和碳酸酯衍生物。還包括的羥基衍生化為(酰氧基)甲基和(酰氧基)乙基醚，其中所述?；腥芜x被包括但不限于醚、氨基和羧酸官能的基團(tuán)取代的烷基，或者其中所述?；鶠榘被狨?。還包括磷酸酯和膦酸酯、硫酸酯、磺酸酯，它們?yōu)橥榛问?比如，二-新戊酰氧基甲基(POM)磷酸三酯或者-P(O)O2Et2)或者鹽形式(比如磷酸酯鈉(-P(O)O-2Na+2))。關(guān)于其它用于抗癌療法中的前藥和它們的代謝作用的其它實例，參見Rooseboom等人(2004)，Phamacol.Rev.，vol 56，53-102，其在此引入作為參考。當(dāng)所述前藥含有酸性或者堿性部分時，還可以將所述前藥制備成它的藥學(xué)上可接受的鹽。
可以將本發(fā)明化合物配制成包括本發(fā)明化合物連同藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，如以下部分IV所述。
III.生產(chǎn)二苯并二氮雜酮類似物的方法 A.發(fā)酵 在此使用的術(shù)語“生產(chǎn)法呢基二苯并二氮雜酮的微生物”和“法呢基二苯并二氮雜酮生產(chǎn)者”是指帶有生產(chǎn)法呢基二苯并二氮雜酮所需的遺傳信息的微生物，不論該有機體是否天然形成該化合物。該術(shù)語同樣應(yīng)用于當(dāng)有機體在其自然環(huán)境中存在時，在其中發(fā)現(xiàn)形成法呢基二苯并二氮雜酮化合物的遺傳信息的有機體，和適用于其中遺傳信息通過重組工藝得到引入的有機體。
化合物通過分離小單孢菌屬株046-ECO11和[S01]046的發(fā)酵肉湯得到形成，如USSN 10/762,107中所述，其全文在此引入作為參考。應(yīng)當(dāng)理解，化合物1的形成并不限于使用特定菌株046-ECO11和[S01]046。而是可以使用其它形成ECO-4601的有機體，比如可以通過已知方法由該有機體衍生得到的046-ECO11和[S01]046的變種或者變體，所述方法比如X-射線輻照、紫外線照射、氮芥子氣處理、噬菌體曝置和抗生素抗性選擇等等；或者通過利用重組細(xì)胞遺傳工程工藝。例如，參見Manual of Industrial Microbiology and biotechnology，Demain和Solomon，American Society for Microbiology，WashingtonD.C.，1986；Hesketh等人(1997)，J.Antibiotics，vol 50，no 6，532-535；和Hosoya等人(1998)，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，vol42，no 8，2041-2047，其全部內(nèi)容在此引入作為參考。
所述法呢基二苯并二氮雜酮化合物可以通過多種微生物進(jìn)行生物合成?？梢院铣煞鼗讲⒍s酮化合物的微生物包括但不限于放線菌目細(xì)菌(也稱為放線菌)。屬于放線菌屬成員的非限制性實例包括諾卡氏菌屬、地嗜皮菌屬、游動放線菌屬、小單孢菌屬、類諾卡氏菌屬、糖絲菌屬、擬無枝菌酸菌、Kutzneria、糖單孢菌屬、糖多孢菌、Kitasatospora、鏈霉菌屬、小雙孢菌屬、鏈孢子囊菌屬和馬杜拉放線菌屬。放線菌的分類非常復(fù)雜以及可以合成本發(fā)明化合物的屬參見Goodfellow，Suprageneric Classification of Actinomycetes(1989)；Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology，Vol.4(Williams和Wilkins，Baltimore，pp.2322-2339)；和Embley和Stackebrandt，“Themolecular phylogeny and systematics of the actinomycetes”，Annu.Rev.Microbiol.(1994)48257-289。所述參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容都在此引入作為參考。
將形成法呢基二苯并二氮雜酮的微生物培養(yǎng)在含有已知的放線菌營養(yǎng)源的培養(yǎng)介質(zhì)中。該介質(zhì)具有可吸收的碳源、氮源加上任意的無機鹽和其它已知的生長因子，pH值為約6～約9。適宜的介質(zhì)包括但不限于提供于表1中的生長介質(zhì)。在約18℃～約40℃的培養(yǎng)溫度下將微生物培養(yǎng)約3～40天。 表1 用于化合物1生產(chǎn)的發(fā)酵介質(zhì)的實例 除非另有說明，所有成分的單位都是g/L。
*1在加入CaCO3之前對所標(biāo)記的pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)。
*2痕量元素溶液含有每升中含有ZnCl240mg；FeCl3·6H2O(200mg)；CuCl2·2H2O(10mg)；MnCl2·4H2O；Na2B4O7·10H2O(10mg)；(NH4)6MO7O24·4H2O(10mg)。
可以通過利用攪拌培養(yǎng)接種的培養(yǎng)介質(zhì)，對用法呢基二苯并二氮雜酮-形成微生物接種的培養(yǎng)介質(zhì)進(jìn)行通氣，例如，在旋轉(zhuǎn)搖瓶機上振搖、振搖水浴或者在發(fā)酵器中。通風(fēng)還可以通過在培養(yǎng)期間，將空氣、氧或者適當(dāng)?shù)臍怏w混合物注入到受接種的培養(yǎng)介質(zhì)中得到實現(xiàn)。在培養(yǎng)之后，可以通過本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員和/或在此公開的工藝將法呢基二苯并二氮雜酮化合物從受培養(yǎng)的培養(yǎng)介質(zhì)中提取和分離出來，所述工藝包括例如離心、色譜法、吸附、過濾。例如，所述受培養(yǎng)的培養(yǎng)介質(zhì)可以任選進(jìn)行酸化和用適宜的有機溶劑混合，所述有機溶劑比如甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、乙酸正丁酯或者4-甲基-2-戊酮。所述有機層可以通過例如離心和傾濾或者過濾從菌絲體濾餅中得到分離。任選進(jìn)一步用有機溶劑對菌絲體濾餅進(jìn)行提取，和將有機提取物合并。任選進(jìn)一步對有機層進(jìn)行處理，例如通過水洗滌、沉淀和過濾等等進(jìn)行處理，隨后例如通過真空下蒸干除去溶劑?？梢匀芜x用例如水、乙醚、乙醇、乙酸乙酯、甲醇或者其混合物對所得殘余物進(jìn)行重構(gòu)，和在二相系統(tǒng)中用適宜的有機溶劑對其進(jìn)行再提取，所述有機溶劑比如己烷、四氯化碳、二氯甲烷或者其混合物。在除去溶劑之后，可以通過使用標(biāo)準(zhǔn)工藝對所得化合物進(jìn)行進(jìn)一步純化，所述標(biāo)準(zhǔn)工藝比如正相和反相液相色譜法、結(jié)晶、升華、吸附、質(zhì)量排阻色譜法等等。
B.化學(xué)修飾 如本文所述和加拿大專利2,466,340(和PCT/CA04/000069)中所述，對法呢基二苯并二氮雜酮化合物1進(jìn)行微生物生物合成和分離。對化合物1進(jìn)行任意和/或直接化學(xué)修飾，從而形成為衍生物或者結(jié)構(gòu)類似物的化合物。具有類似官能活性的上述衍生物或者結(jié)構(gòu)類似物都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)?？梢岳帽绢I(lǐng)域已知的方法和在此所述的方法，通過一個或者多個化學(xué)修飾步驟對法呢基二苯并二氮雜酮進(jìn)行修飾?；瘜W(xué)修飾方法的實例還提供于實施例4～8中。
為化合物1衍生物的二苯并二氮雜酮類似物，例如那些在此確定為式I化合物和它們的衍生物的類似物，和化合物2～27通過標(biāo)準(zhǔn)有機化學(xué)方法得到形成。制備和處理在此所述化合物(包括官能部分、反應(yīng)性和一般記錄)所需的有機化學(xué)一般原則描述在例如“AdvancedOrganic Chemistry”，第四版，Jerry March(1992)，Wiley-Interscience，USA中，其全部內(nèi)容在此引入作為參考。此外，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在此所述的合成方法可以利用多種保護(hù)基，不論是否對它們進(jìn)行了明確描述。在此使用的“保護(hù)基”是指用于阻斷一個或者多個官能部分(比如包括氧、硫或者氮的活性基團(tuán))，從而使得反應(yīng)可以選擇性地在多官能化合物的另一活性位置進(jìn)行的部分。使用保護(hù)基團(tuán)、它們適用的具體官能團(tuán)和它們的應(yīng)用的一般原則，例如，描述在T.H.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups in OrganicSynthesis，第三版，John Wiley & Sons，New York(1999)中，其全部內(nèi)容在此引入作為參考。
如果必要，醇和酚用例如以下基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)甲硅烷基醚(TMS三甲代甲硅烷基，TIPS三異丙基甲硅烷基)、縮醛(MOM甲氧基甲基，BOM芐氧基甲基)、酯(乙酸酯，苯甲?；?和醚(Bn芐基)。醇在以下條件下進(jìn)行去保護(hù)，比如對于甲硅烷基醚使用TBAF(四丁基氟化銨)，對于縮醛和酯進(jìn)行酸性水溶液催化作用，對于酯進(jìn)行皂化反應(yīng)，和對于Bn和BOM進(jìn)行氫解。如果必要，使用標(biāo)準(zhǔn)氨基酸保護(hù)基團(tuán)對胺進(jìn)行保護(hù)，例如，氨基甲酸酯(比如叔丁基(BOC)和芐基(CBZ))、芴衍生物(比如FMOCN-(9-芴甲氧基羰基)-)等等。對胺進(jìn)行去保護(hù)的條件為，比如對于BOC進(jìn)行酸性水解，對于CBZ進(jìn)行氫解，或者對于FMOC進(jìn)行堿處理。所有的保護(hù)和去保護(hù)條件都表明在以上Greene等人的參考文獻(xiàn)中。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將輕易理解，可以使用多種合成化學(xué)方法生產(chǎn)化合物1的衍生物。以下方案是用于形成本發(fā)明化合物的常規(guī)化學(xué)修飾的例證性方案。提供在此所述結(jié)構(gòu)的領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員已知的任何化學(xué)合成方法都可以使用，由此它們都包括在本發(fā)明中。
方案1醇修飾(O-?；?
其中，R”為醋酸根。
在方案1中，當(dāng)酚醇與活化羧酸(R”C(O)X)(比如酰基鹵、酸酐、N-羥基琥珀酰亞胺酯或者通過偶聯(lián)劑(例如EDC(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-二異丙基乙基碳二亞胺鹽酸鹽)；或者HATU(O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸鹽))用堿(例如，吡啶或者N，N-二異丙基乙胺(DIPEA))以及比如HOBt(1-羥基苯并三唑水合物)和/或DMAP(4-(二甲基氨基)吡啶)的任選催化劑進(jìn)行活化的羧酸反應(yīng)時，酚醇轉(zhuǎn)化為酯。相同的反應(yīng)可以在通過法呢基修飾反應(yīng)形成的醇上實現(xiàn)(方案3)。
方案1用于，例如，由化合物1獲得化合物25；和用于形成本發(fā)明化合物的酯。
方案2胺修飾(N-烷基化)
其中，R選自任選取代的直鏈C1-10烷基。
在方案2中，對5位(關(guān)于位置，參見實施例3)上的胺基進(jìn)行烷基化。在方案2(a)中，利用RX烷基化試劑(比如二烴基硫酸鹽和鹵代烴)，優(yōu)選在堿(例如，碳酸氫鈉和吡啶等等)存在下對胺進(jìn)行烷基化。
方案2用于，例如，由化合物1制備化合物2～13，和由化合物23制備化合物14；和用于制備含有N-烷基的任意式I化合物。
方案3雙鍵修飾
其中Rz為OC1-6烷基。
在方案3中，雙鍵通過以下方式進(jìn)行修飾(a)氫化；和(b)氫化烷氧基化。在(a)中，使用氫源(例如氫氣、甲酸)和催化劑(比如銠、鉑或者鈀)進(jìn)行氫化。在(b)中，對雙鍵的親電加成通過以下方法實現(xiàn)通過在酸性條件(例如，對甲苯磺酸和烷基硫酸鹽/NaHCO3/MeOH等等)下加入質(zhì)子形成碳正離子，和用醇(C1-6烷醇，氫化烷氧基化)捕獲碳正離子。
方案3用于獲得，例如在(a)中，由化合物1獲得化合物23，和由化合物2獲得化合物14～16；在(b)中，由化合物2獲得化合物17～19，和由化合物3獲得化合物20～22。方案3(a)和(b)還用于形成式I化合物的任何氫化和氫化烷氧基化法呢基衍生物。
方案4芳香取代
其中，X為Br。
在方案4中，通過芳香取代(溴化)對芳基進(jìn)行修飾。溴化劑包括溴、N-鹵代酰胺(例如，N-溴琥珀酰亞胺(NBS)、四烷基多鹵代銨)。
方案4用于由化合物1制備化合物24，由化合物2制備化合物26和由化合物14制備化合物27。
前藥通過比如描述在Jerry March，supra中的常規(guī)的化學(xué)修飾進(jìn)行制備，包括通過酯化(方案1)和烷基化反應(yīng)，即，利用活化的酸或者混合酸酐(酰基鹵化物，使用偶聯(lián)試劑等等)，和通過使用烷基化試劑(R-X，其中X為離去基團(tuán)，比如重氮基，和R為期望的基團(tuán))進(jìn)行制備。磷酸鹽前藥通過磷酸化作用進(jìn)行制備，例如，使用二烷基亞磷酸酯，利用比如Silverberg等人(1996)，Tet.Lett，Vol.37，711-774，美國專利5,561,122(Pettit等人)和Hwang和Cole(2004)，Org.Lett，vol 6，no 10，1555-1556(得自于(POM)2磷酰氯的(POM)2磷酸三酯)中所述的方法進(jìn)行制備，其全部內(nèi)容在此引入作為參考。
IV.含有本發(fā)明化合物的藥物組合物 本發(fā)明提供含有結(jié)合藥學(xué)上可接受的載體的本發(fā)明化合物或者其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或者前藥的藥物組合物。含有二苯并二氮雜酮類似物的藥物組合物可以用于治療與無控細(xì)胞生長和增殖相關(guān)的疾病和病癥(比如，瘤形成癥狀)。所述藥物組合物還可以用于治療其它疾病和病癥，包括炎癥、自身免疫疾病、感染、神經(jīng)變性疾病和緊張?？梢詫⒑卸讲⒍s酮類似物的藥物組合物包裝入適宜的商業(yè)包裝中，該商業(yè)包裝在適宜的容器中提供必要的物質(zhì)，比如藥物組合物和它用于治療瘤形成癥狀的書面說明。
可以對本發(fā)明化合物或者其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或者前藥進(jìn)行配制，以用于治療或者預(yù)防性治療瘤形成和增殖疾病或者病癥的口服、舌下、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、直腸、透皮、粘膜、局部或者胃腸外給藥方式。胃腸外給藥模式包括但不限于真皮內(nèi)、皮下(s.c.s.q.，sub-Q，Hypo)、肌內(nèi)(i.m.)、靜脈內(nèi)(i.v.)、腹膜內(nèi)(i.p.)、動脈內(nèi)、髓內(nèi)、心內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)(關(guān)節(jié))、滑膜內(nèi)(滑液區(qū)域)、腦內(nèi)或者顱內(nèi)、脊柱內(nèi)、腦池內(nèi)和鞘內(nèi)(脊髓液)給藥模式。任何可用于藥物制劑胃腸外注射或者輸液的已知設(shè)備都可以用于實現(xiàn)所述給藥。對于口服和/或胃腸外給藥，可以將本發(fā)明化合物與常規(guī)的藥物載體和賦形劑混合，并且可以以液劑、乳劑、片劑、膠囊、軟凝膠劑、酏劑、混懸劑、糖漿劑和板片劑等等的形式使用。含有本發(fā)明化合物的組合物將含有按重量計約0.1％～約99.9％，約1％～約98％，約5％～約95％，約10％～約80％或者約15％～約60％的活性化合物。
在此公開的藥物制劑根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行制備，并且選擇以降低、預(yù)防或者消除癌癥的劑量給藥。(對于用于人類治療的多種試劑的給藥方法的一般說明，參見，例如，Remington’s PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Company，Easton，PA；和Goodman和Gilman，Pharmaceutical Basis of Therapeutics，Pergamon Press，NewYork，NY，其全部內(nèi)容在此引入作為參考。) 在此使用的術(shù)語“單位劑量”是指適于作為人類對象和其它哺乳動物的單位劑量的物理分離單位，每個單位含有經(jīng)計算能產(chǎn)生期望的治療作用的預(yù)定量二苯并二氮雜酮類似物以及適宜的藥學(xué)上可接受的載體。在一種實施方案中，單位劑量含有10～3000mg活性成分。在另一種實施方案中，單位劑量含有20～1000mg活性成分。本發(fā)明組合物可以利用控釋遞送系統(tǒng)(例如，膠囊)或者緩釋遞送系統(tǒng)(例如，可生物侵蝕基體)進(jìn)行遞送。用于藥物遞送的適用于給藥本發(fā)明組合物的例證性緩釋遞送系統(tǒng)描述于美國專利Nos 4,452,775(授于Kent)、5,039,660(授于Leonard)和3,854,480(授于Zaffaroni)中，其全部內(nèi)容在此引入作為參考。
本發(fā)明藥學(xué)上可接受的組合物包含與一種或者多種無毒、藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑和/或助劑和/或賦形劑(它們在此都稱為“載體”物質(zhì))聯(lián)用的一種或者多種本發(fā)明化合物，并且如果期望，可以含有其它活性成分。藥學(xué)上可接受的載體包括，例如溶劑、賦形劑或者介質(zhì)，比如鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇、丙二醇、聚山梨酸酯80(Tween-80TM)、聚(亞乙基)二醇300和400(PEG 300和400)、PEG化的蓖麻油(E.g.Cremophor EL)、泊洛沙姆407和188、疏水載體及其組合。疏水載體包括，例如，脂肪乳劑、脂肪、PEG化的phopholids、聚合物基體、生物相容聚合物、脂球、水泡、顆粒和脂質(zhì)體。該術(shù)語明確排除細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)。
取決于例如藥物的性質(zhì)和給藥模式，包含在制劑中的賦形劑或者添加劑具有不同的目的。通常使用的賦形劑的實例包括但不限于穩(wěn)定劑、增溶劑和表面活性劑、緩沖液、抗氧化劑和防腐劑、強壯劑、填充劑、潤滑劑、乳化劑、懸浮或者粘稠劑、惰性稀釋劑、填料、崩解劑、粘合劑、潤濕劑、潤滑劑、抗菌劑、螯合劑、甜味料、香料、增香劑、著色劑、給藥助劑及其組合。
所述組合物可以含有一般載體和賦形劑，比如玉米淀粉或者凝膠、乳糖、蔗糖、微晶纖維素、高嶺土、甘露醇、磷酸氫鈣、氯化鈉和藻酸。所述組合物可以含有crosarmellose鈉、微晶纖維素、羥基乙酸淀粉鈉和藻酸。
用于胃腸外給藥的制劑可以為水或者非水等滲無菌注射液劑、混懸劑或者脂肪乳劑的形式，其中含有本發(fā)明化合物或者其藥學(xué)上可接受的鹽或者前藥。用于注射的胃腸外形式必須是易于注射存在的流體。這些液劑或者混懸劑可以由無菌濃縮液體、粉劑或者粒劑進(jìn)行制備。可以將所述化合物溶于比如溶劑或者賦形劑的載體中，例如聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、芐醇、四氫呋喃聚乙二醇醚、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、甘油、鹽水、葡萄糖、水、甘油、疏水載體及其組合。
用于胃腸外制劑的賦形劑還包括但不限于穩(wěn)定劑(例如碳水化合物、氨基酸和聚山梨酸酯)、增溶劑(例如溴化十六烷基三甲銨、多庫酯鈉、甘油單油酸酯、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚乙二醇(PEG))和表面活性劑(例如聚山梨酸酯、生育酚PEG琥珀酸鹽泊洛沙姆和CremophorTM)、緩沖液(例如乙酸酯、檸檬酸鹽、磷酸鹽、酒石酸鹽、乳酸鹽、琥珀酸鹽、氨基酸等等)、抗氧化劑和防腐劑(例如BHA、BHT、龍膽酸、維生素E、抗壞血酸、和含硫試劑(比如亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、偏亞硫酸氫鹽、硫代甘油、巰基乙酸鹽等等))、強壯劑(用于調(diào)節(jié)生理相容性)、懸浮或者粘稠劑、抗菌劑(例如硫汞撒、氯化芐乙氧銨、苯扎氯銨、苯酚、甲酚和氯代丁醇)、螯合劑和給藥助劑(例如局部麻醉藥、消炎藥、抗凝結(jié)劑、用于延長時間的血管收縮劑和增強組織滲透性的試劑)及其組合。
使用疏水載體的胃腸外制劑包括，例如，脂肪乳劑和含有脂肪、脂球、水泡、顆粒和脂質(zhì)體的制劑。除了上述賦形劑之外，脂肪乳劑還包括脂肪和水相，以及添加劑，比如乳化劑(例如磷脂、泊洛沙姆、聚山梨酸酯和聚氧乙烯蓖麻油)和滲透劑(例如氯化鈉、甘油、山梨醇、木糖醇和葡萄糖)。脂質(zhì)體包括天然脂質(zhì)體或者源于磷脂的脂質(zhì)體，并且任選含有比如膽固醇的穩(wěn)定劑。
在另一實施方案中，所述化合物的胃腸外單元劑型可以為在無菌、密封安瓿或者在無菌預(yù)負(fù)載注射器中的適宜載體中的即時使用化合物溶液。所述適宜的載體任選含有任何上述賦形劑。
另外地，本發(fā)明化合物的單元劑型可以為濃縮液體、粉劑或者顆粒形式，用于在遞送時在適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可接受的載體中進(jìn)行即時重構(gòu)。除了上述賦形劑之外，粉劑形式任選含有膨脹劑(例如甘露醇、甘氨酸、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖酐、羥乙基淀粉、聚蔗糖和凝膠)和低溫或者溶解(lyo)保護(hù)劑。
例如，在靜脈內(nèi)(IV)使用中，可以將式I化合物和任選一種或者多種添加劑(包括增溶劑或者表面活性劑)的無菌制劑溶解或者懸浮在任何通常應(yīng)用的靜脈內(nèi)流體中，和通過輸注進(jìn)行給藥。靜脈內(nèi)流體包括但不限于生理鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、5％葡萄糖或者Ringer’sTM溶液。
在另一實例中，在肌內(nèi)注射制劑中，可以將本發(fā)明化合物或者適宜的可溶性鹽或者形成所述化合物的前藥的無菌制劑溶解在藥物稀釋劑(比如注射用水(WFI)、生理鹽水或者5％葡萄糖)中并進(jìn)行給藥?？梢詫⒒衔锏倪m宜的不溶性形式制備成水基或者藥學(xué)上可接受的油基(例如長鏈脂肪酸酯，比如油酸乙酯)的混懸劑進(jìn)行用藥。
對于口服應(yīng)用，固體劑型(比如片劑和膠囊)是特別有效的。還可以設(shè)計緩釋或者全部包衣制劑。對于兒科和老年人應(yīng)用，混懸劑、糖漿劑和咀嚼片劑是特別適宜的。對于口服給藥，所述藥物組合物為，例如片劑、膠囊、混懸劑或者液體糖漿劑或者酏劑、板片劑等等的形式。對于通?？诜o藥，賦形劑或者添加劑包括但不限于惰性稀釋劑、填料、崩解劑、粘合劑、潤濕劑、潤滑劑、甜味料、增香劑、著色劑和防腐劑。
優(yōu)選將口服藥物組合物制備成含有治療有效量的活性成分的單元劑型的形式。所述劑量單元的實例為片劑和膠囊。對于治療學(xué)目的，除了活性成分之外，片劑和膠囊可以含有常規(guī)載體，比如惰性稀釋劑(例如，碳酸鈉和碳酸鈣、磷酸鈉和磷酸鈣以及乳糖)、粘合劑(例如，金合歡膠、淀粉、凝膠、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮(Providone)、山梨醇或者西黃蓍膠甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素和乙基纖維素)、填料(例如，磷酸鈣、甘氨酸、乳糖、玉米淀粉、山梨醇或者蔗糖)、潤滑劑(例如，硬脂酸鎂或者其它金屬的硬脂酸鹽、硬脂酸、聚乙二醇、石蠟、油、二氧化硅和膠狀二氧化硅、硅流體或者滑石)、崩解劑(例如，馬鈴薯淀粉、玉米淀粉和藻酸)、食用香料、著色劑或者可接受的潤濕劑。載體還可以包括包衣賦形劑，比如單硬脂酸甘油酯或者二硬脂酸甘油酯，從而延遲在胃腸道中的吸收。
通常為水或者油液劑、混懸劑、乳劑、糖漿劑或者酏劑形式的口服液體制劑可以含有常規(guī)的添加劑，比如助懸劑、乳化劑、非水試劑、防腐劑、著色劑和增香劑。用于流體制劑的添加劑的實例包括阿拉伯膠、杏仁油、乙醇、分餾椰子油、凝膠、葡萄糖漿、甘油、氫化可食用脂肪、卵磷脂、甲基纖維素、甲基或者丙基對羥基苯甲酸酯、丙二醇、山梨醇或者山梨酸。
對于液體和固體口服制劑，還可以使用增香劑，比如胡椒薄荷、冬青油、櫻桃、葡萄、水果調(diào)味劑等等。還可以合意地加入著色劑，從而使得劑型在外觀上更為美觀或者有助于區(qū)分產(chǎn)品。對于局部應(yīng)用，還可以將本發(fā)明化合物制備成適宜的形式以應(yīng)用到五官的皮膚或者粘膜上，并且可以采取乳膏劑、膏劑、液體噴霧劑或者吸入劑、錠劑或者噴口涂劑的形式。
這種局部制劑可以進(jìn)一步包括比如二甲亞砜(DMSO)的化合物以促進(jìn)活性成分的表面滲透。對于眼部或者耳部應(yīng)用，本發(fā)明化合物可以以液體或者半液體的形式存在，在疏水或者親水基中配制成膏劑、乳膏劑、洗劑、涂劑或者粉劑。對于直腸給藥，可以將本發(fā)明化合物以與常規(guī)載體(比如可可脂、石蠟或者其它甘油酯)混合的栓劑形式進(jìn)行給藥。
V.在治療瘤形成中的醫(yī)藥用途 在一方面，本發(fā)明涉及抑制哺乳動物中癌細(xì)胞生長和/或增殖的方法。在另一方面中，本發(fā)明提供了治療哺乳動物瘤形成的方法。哺乳動物包括有蹄類(例如綿羊、山羊、牛、馬、豬)和非有蹄類(包括嚙齒類、貓科、犬科和靈長類動物(即人類和非人類靈長類動物))。在優(yōu)選的實施方案中，所述哺乳動物是人類。
本發(fā)明的二苯并二氮雜酮類似物可以與其它與癌癥相關(guān)的蛋白質(zhì)和多肽結(jié)合或者相互作用，所述蛋白質(zhì)和多肽包括但不限于致癌基因編碼的多肽、誘發(fā)血管形成的多肽、涉及轉(zhuǎn)移和/或侵入過程的蛋白質(zhì)和調(diào)節(jié)細(xì)胞程序死亡和細(xì)胞周期的蛋白酶。不論作用機制如何，本發(fā)明的二苯并二氮雜酮類似物都已經(jīng)證實在體外和體內(nèi)具有抗癌活性?；谶@些發(fā)現(xiàn)，本申請申請人開發(fā)了治療瘤形成的方法。
在此使用的術(shù)語“瘤形成”、“瘤形成疾病”、“腫瘤形成”、“癌癥”、“腫瘤”和“增殖疾病”是指具有自發(fā)增長能力的細(xì)胞，即，特征在于迅速增殖通常形成顯著量的表現(xiàn)出部分或者完全缺少結(jié)構(gòu)組織和與正常組織的官能配合的細(xì)胞生長的反常癥狀狀態(tài)。該術(shù)語意指包括生血瘤形成(例如淋巴瘤或者血癌)以及固體瘤形成(例如肉瘤或者癌)，包括所有類型的癌前期和癌生長或者致癌過程，轉(zhuǎn)移性組織或者惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或者器官，不論組織病理學(xué)的類型或者侵入階段如何。生血瘤形成是影響免疫系統(tǒng)的生血結(jié)構(gòu)(預(yù)形成血細(xì)胞相關(guān)的結(jié)構(gòu))和組分的惡性腫瘤，包括在骨髓、淋巴樣或者紅血球原生細(xì)胞系統(tǒng)的血癌(與血液和骨髓中的白細(xì)胞(白血球)和它們的前體相關(guān))和淋巴瘤(涉及胸腺依賴性細(xì)胞)。固體瘤形成包括肉瘤，它是源于結(jié)締組織(比如肌肉、軟骨、血管、纖維組織、脂肪或者骨骼)的惡性瘤形成。固體瘤形成還包括癌，它是源于上皮結(jié)構(gòu)(包括外部上皮(例如，胃腸道、肺和宮頸的表皮和內(nèi)層)和排齊多種腺(例如，乳房、胰腺、甲狀腺)的內(nèi)部上皮的惡性瘤形成。對于本發(fā)明方法進(jìn)行的治療特別敏感的瘤形成的實例包括血癌和肝細(xì)胞癌、肉瘤、血管內(nèi)皮癌、乳房癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥(例如星形細(xì)胞瘤、膠質(zhì)肉瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、少枝膠質(zhì)瘤和惡性膠質(zhì)瘤)、前列腺癌、肺和支氣管癌、喉癌、食道癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、胃腸癌、黑素瘤、卵巢和子宮內(nèi)膜癌、腎和膀胱癌、肝癌、內(nèi)分泌腺癌(例如甲狀腺)和胰腺癌。
使二苯并二氮雜酮類似物與癌細(xì)胞或者組織接觸或者將其引入到癌細(xì)胞或者組織中。通常，本發(fā)明用于體內(nèi)遞送本發(fā)明組合物的方法使用本領(lǐng)域認(rèn)可的遞送治療劑的方案，唯一的實質(zhì)性程序變型是使用本發(fā)明二苯并二氮雜酮類似物替換本領(lǐng)域認(rèn)可的方案中的治療劑。二苯并二氮雜酮類似物以及制劑、載體或者賦形劑的給藥途徑將取決于瘤形成的位置以及類型?？梢允褂枚喾N給藥途徑。二苯并二氮雜酮類似物可以通過靜脈內(nèi)或者腹膜內(nèi)輸液或者注射進(jìn)行給藥。例如，對于可以進(jìn)入的固體瘤，可以通過注射直接將本發(fā)明化合物給藥到瘤中。對于生血瘤，可以靜脈內(nèi)或者血管內(nèi)給藥所述組合物。對于不易于體內(nèi)進(jìn)入的瘤，比如轉(zhuǎn)移或者腦腫瘤，可以以一定方式給藥所述化合物，使得它可以經(jīng)哺乳動物體內(nèi)進(jìn)行系統(tǒng)運送并且從而達(dá)到瘤和遙遠(yuǎn)的轉(zhuǎn)移位置，例如鞘內(nèi)、靜脈內(nèi)或者肌內(nèi)或者口服給藥。另外地，可以直接將所述化合物給藥至腫瘤。所述化合物還可以進(jìn)行皮下、腹膜內(nèi)、局部(例如對于黑素瘤)、直腸(例如結(jié)腸直腸瘤形成)、陰道(例如對于子宮頸或者陰道瘤)、經(jīng)鼻或者通過吸入噴霧劑(例如對于肺瘤形成)給藥。
二苯并二氮雜酮類似物以足以抑制瘤形成細(xì)胞生長或者增殖的量或者足以治療瘤形成疾病的量進(jìn)行給藥。術(shù)語“抑制”是指壓制、殺死、停滯或者破壞癌細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明方法對哺乳動物癌細(xì)胞進(jìn)行的抑制可以通過數(shù)種方式進(jìn)行監(jiān)控?？梢韵鄬τ诓淮嬖谒龌衔镞M(jìn)行培養(yǎng)的相同細(xì)胞，用所述化合物對體外癌細(xì)胞生長進(jìn)行處理，和監(jiān)控其生長或者死亡。停止生長或者放慢生長率(即，兩倍速率)(例如在100微摩爾時降低50％或更多)即表現(xiàn)出癌細(xì)胞抑制作用(參見Anticancer Drug Anticancer Drug Development Guidepreclinicalscreening，clinical trials and approval；B.A.Teicher和P.A.Andrews主編，2004，Humana Press，Totowa，NJ)。另外地，癌細(xì)胞抑制作用可以通過將化合物給藥至具有關(guān)心的癌癥的動物模型進(jìn)行監(jiān)控。非人類動物癌癥模型的試驗實例是本領(lǐng)域所熟知的，在以下和本文的實施例中將進(jìn)行描述。相對于沒有用化合物處理的對照動物，在用化合物處理的動物中腫瘤停止生長(即，在大小上不會進(jìn)一步增加)或者腫瘤大小降低(即，腫瘤大小降低58％)即表現(xiàn)出顯著的腫瘤生長抑制作用(參見Anticancer Drug Development Guidepreclinical screening，clinical trials and approval；B.A.Teicher和P.A.Andrews主編，2004，Humana Press，Totowa，NJ)。
術(shù)語“治療”是指將二苯并二氮雜酮類似物應(yīng)用或者給藥至患有瘤形成疾病、瘤形成疾病癥狀或者傾向于患有瘤形成疾病的哺乳動物，或者將二苯并二氮雜酮類似物應(yīng)用或者給藥至患有瘤形成疾病、瘤形成疾病癥狀或者傾向于患有瘤形成疾病的哺乳動物的分離組織或者細(xì)胞系，目的是醫(yī)治、治愈、緩和、減輕、改變、改善、改良或者控制疾病、疾病癥狀或者患有疾病的傾向。術(shù)語“治療”的定義是給藥哺乳動物足以導(dǎo)致預(yù)防、降低或者消除哺乳動物中瘤形成細(xì)胞的作用的量(“治療有效量”)的二苯并二氮雜酮類似物。所述治療有效量和劑量定時將基于個體基礎(chǔ)進(jìn)行確定，并且可以至少部分基于考慮受體對象的年齡、體重、性別、飲食和通常健康狀況，基于疾病癥狀的性質(zhì)和嚴(yán)重程度以及基于先前治療和存在的其它疾病進(jìn)行確定。其它因素還包括給藥的途徑和頻率、給藥化合物的活性、新陳代謝穩(wěn)定性、化合物的作用和代謝時間長度、藥物聯(lián)用、患者經(jīng)受化合物的耐受性和瘤或者增殖疾病的類型。在一種實施方案中，治療有效量的化合物為約0.01～約750mg/千克哺乳動物體重。在另一種實施方案中，治療有效量為約0.01～約300mg/千克體重/天。在另一種實施方案中，治療有效量為10～約50mg/千克體重/天。在人類患者的情形中，上述實施方案中的治療有效劑量還可以表示為毫克每平方米(mg/m2)。不同哺乳動物種類之間的換算系數(shù)可以發(fā)現(xiàn)于Freireich等人，Quantitative comparison of toxicity of anticancer agents in mouse，rat，dog，monkey and man，Cancer Chemoth.Report，1966，50(4)219-244，其全部內(nèi)容在此引入作為參考。在可能要求特定需求(例如，對于兒童患者)時，如上所述的治療有效劑量可以在在此所述的范圍之外。這種較高或者較低劑量都包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
為了監(jiān)控人類中進(jìn)行腫瘤治療的效果，在開始治療之前和之后的腫瘤尺寸和/或腫瘤形態(tài)進(jìn)行測量，如果腫瘤尺寸停止進(jìn)一步生長或者如果腫瘤尺寸得到降低，則認(rèn)為治療有效，例如，降低至少10％或更多(例如，20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或者甚至100％，即不存在腫瘤)。生存延期、疾病隨時間的發(fā)展、部分響應(yīng)和目標(biāo)響應(yīng)率都是研究試劑的臨床活性的替代測量。認(rèn)為腫瘤皺縮是一種特殊的治療響應(yīng)。該系統(tǒng)受患者具有經(jīng)得起精確測量的內(nèi)臟質(zhì)量的要求所限制。確定體內(nèi)腫瘤尺寸的方法隨腫瘤類型的變化而變化，并且包括多種醫(yī)學(xué)成象或者腫瘤學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的成像工藝(MRI、CAT、PET等等)，以及組織學(xué)方法和流式細(xì)胞計。對于某些癌癥類型，還利用對血清腫瘤標(biāo)記物的評價評估響應(yīng)(例如，用于前列腺癌的前列腺具體抗原(PSA)，和用于結(jié)腸癌的癌胚抗原(CEA))。其它監(jiān)控癌癥生長的方法包括血液中細(xì)胞計數(shù)(例如，血癌中)或者緩解骨骼疼痛(例如，前列腺癌)。
所述二苯并二氮雜酮化合物可以每日給藥一次，或者所述化合物可以在一天之中以適當(dāng)?shù)臅r間間隔給藥兩個、三個、四個或者更多個亞劑量。在那種情形中，為了獲得總每日劑量，必須將包含在各個亞劑量中的二苯并二氮雜酮化合物相應(yīng)縮小。為了在數(shù)天進(jìn)行遞送，還可以對劑量單元進(jìn)行復(fù)合，例如，利用常規(guī)的提供二苯并二氮雜酮化合物在數(shù)天時間內(nèi)緩釋的緩釋制劑。緩釋制劑是本領(lǐng)域所熟知的。在該實施方案中，劑量單元含有相應(yīng)日劑量的倍數(shù)。所述有效劑量可以作為單個給藥事件(例如，彈丸注射)進(jìn)行給藥，或者以緩慢注射或者輸注進(jìn)行給藥(例如，在30分鐘至約24小時的時間內(nèi))。作為一個療程，所述化合物可以給藥高達(dá)30天。此外，用治療有效量組合物對對象進(jìn)行的治療可以包括單次治療或者系列治療(例如，四周療程重復(fù)三次，各個療程之間間隔兩個月)。本發(fā)明包括的二苯并二氮雜酮化合物的有效劑量、毒性和體內(nèi)半衰期的測定可以根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行確定，或者基于利用適當(dāng)動物模型的體內(nèi)試驗進(jìn)行確定。
所述二苯并二氮雜酮化合物可以結(jié)合已知的其它抗癌療法(比如放射療法)或者其它已知的抗癌化合物或者化學(xué)治療劑一起給藥。所述治療劑包括但不限于5-氟脲嘧啶、絲裂霉素C、甲氨蝶呤、羥基脲、環(huán)磷酰胺、氮烯唑胺、米托蒽醌、對氨茴環(huán)霉素(表柔比星和Doxurubicin)、依托泊甙、pregnasome、鉑化合物(比如碳鉑和順氯氨鉑)、紫杉醇(比如PaclitaxelTM和DocetaxelTM)；激素療法，比如他莫昔芬和抗雌激素；受體抗體，比如赫賽汀和易瑞沙；芳香化酶抑制劑、妊娠前試劑和LHRH類似物；生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物，比如IL2和干擾素；多藥轉(zhuǎn)化試劑，比如環(huán)胞霉素類似物PSC 833。
二苯并二氮雜酮化合物的毒性和治療效果可以通過標(biāo)準(zhǔn)藥物方法在細(xì)胞培養(yǎng)或者試驗動物中進(jìn)行確定。治療效果在如上所述的動物模型和本文所述的實施例中進(jìn)行確定。進(jìn)行毒性研究，以確定致死10％試驗動物的劑量(LD10)。對動物進(jìn)行治療的最高耐藥劑量(MTD)不會導(dǎo)致死亡或者大于20％體重下降的最高劑量。在給定的腫瘤模型中，有效劑量(ED)與MTD的關(guān)系確定化合物的治療指數(shù)。認(rèn)為接近1.0的治療指數(shù)(MTD/ED)對于一些化學(xué)治療藥物是可以接受的，對于傳統(tǒng)的化學(xué)治療藥物，優(yōu)選治療指數(shù)為1.25或者更高。
由細(xì)胞培養(yǎng)測定法和動物研究獲得的數(shù)據(jù)可以用于擬定用于人類的劑量范圍。本發(fā)明組合物的劑量通常將位于包括MTD的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。取決于所使用的劑型和所利用的給藥途徑，所述劑量可以在此范圍內(nèi)變化。對于任何用于本發(fā)明方法中的化合物，其治療有效劑量可以首先根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)測定法進(jìn)行確定?？梢詫┝颗渲圃趧游锬Ｐ椭校瑥亩@得所述化合物的循環(huán)血漿濃度范圍。這些信息可以用于更精確地確定用于人類的有效劑量。在血漿中的水平可以通過例如HPLC進(jìn)行測量。
確定化合物抗癌效果的動物模型通常在鼠中進(jìn)行。或者將鼠腫瘤細(xì)胞皮下接種到相同種類的鼠的后肋中(同源模型)，或者將人類腫瘤細(xì)胞皮下接種到嚴(yán)重聯(lián)合的免疫缺陷(SCID)鼠或者其它免疫缺陷鼠(裸鼠)中(異種移植模型)。
鼠遺傳學(xué)的進(jìn)展已經(jīng)形成了許多用于研究各種人類疾病(包括癌癥)的鼠模型。由國家癌癥學(xué)會資助的MMHCC(人類癌癥的鼠模型聯(lián)合會)網(wǎng)頁(emice.nci.nih.gov)提供了已知癌癥模型的疾病特異位置概略，并且具有可搜索的癌癥模型數(shù)據(jù)庫(cancermodels.nci.nih.gov)的鏈接，以及NCI-MMHCC鼠貯藏室。鼠貯藏室還可以發(fā)現(xiàn)于The Jackson Laboratory，Charles RiverLaboratories，Taconic，Harlan，Mutant Mouse Regional ResourceCenters(MMRRC)National Network和European Mouse MutantArchive。這些模型都可以用來進(jìn)行二苯并二氮雜酮化合物的體內(nèi)試驗以及確定治療有效劑量。
除了本發(fā)明化合物之外，所述化合物藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或者前藥也可以用于組合物中治療或者預(yù)防以上確定的疾病。
實施例 除非另作說明，所有試劑都購自于Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)，Aldrich。
所有的NMR光譜都在氘化溶劑中，在Varian 500TM光譜儀(1HNMR在500MHz，13C NMR在125MHz)上采集。UV和質(zhì)譜利用連接在Waters MicromassTM ZQTM質(zhì)量檢測器上的光二極管矩陣檢測器(PDA，210-400nm)，由Waters 2690TM HPLC進(jìn)行采集。
除非另有說明，所用在說明書和權(quán)利要求中用于表達(dá)成分、性能的量的數(shù)字(比如分子量、反應(yīng)條件、摩爾當(dāng)量(eq)、結(jié)合和/或抑制百分?jǐn)?shù)、GI50、IC50等等)都應(yīng)當(dāng)理解為，在所有情形中，都由術(shù)語“約”進(jìn)行修飾。據(jù)此，除非相反說明，在本發(fā)明說明書以及附屬權(quán)利要求中所述的數(shù)值參數(shù)都是近似值。最低限度，而不是意圖限制權(quán)利要求范圍的等價物原則的應(yīng)用，各個數(shù)值參數(shù)至少應(yīng)當(dāng)根據(jù)其有效數(shù)字和應(yīng)用的一般整數(shù)方法進(jìn)行推斷。盡管在本發(fā)明寬泛范圍內(nèi)所列的數(shù)值范圍和參數(shù)都是近似值，但是列于實施例、表和圖中的數(shù)值都盡可能精確地進(jìn)行了記錄。任何數(shù)值都可能固有地含有某些源于試驗變化、試驗測定和統(tǒng)計分析等等地誤差。
在以下部分中，實施例詳細(xì)描述了本發(fā)明代表性化合物的化學(xué)合成。所述方法為例證性說明，不應(yīng)當(dāng)認(rèn)為本發(fā)明限于它們所述的化學(xué)反應(yīng)和條件。并沒有試圖最優(yōu)化在這些反應(yīng)中獲得的產(chǎn)率，對于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員很顯然反應(yīng)時間、溫度、溶劑和/或試劑的變化可以升高產(chǎn)率。
此外，所述物質(zhì)、方法和實施例(包括體外和體內(nèi)效果、生物利用度、毒性和藥理學(xué)性能)僅僅是例證性說明，并不意圖對其進(jìn)行限制。雖然與本文中所述相似或者等價的方法和物質(zhì)可以用于本發(fā)明實踐或者試驗中，但是適宜的方法和物質(zhì)描述如下。所有在此提及的出版物、專利申請、專利和其它參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容都在此引入作為參考。發(fā)生沖突時，由本發(fā)明說明書(包括定義)控制準(zhǔn)確度。
實施例1通過發(fā)酵進(jìn)行的化合物1的生產(chǎn) 例證性的發(fā)酵方法 a)發(fā)酵方法 將小單孢菌屬種(貯藏登記號IDAC 070303-01)(參見保藏存活證明保藏日2003年3月7日；微生物分類3005-3P；加拿大國際微生物保藏中心)保持在ISP2瓊脂的瓊脂板(Difco Laboratories，Detroit，Ml)上。通過將表面生長的小單孢菌屬種從瓊脂板轉(zhuǎn)移到含有25mL用一升自來水(pH值7.0)制備的包括葡萄糖10g、馬鈴薯糊精類IV(Sigma)20g、酵母提取物5g、N Z Amine-A 5g、1g CaCO3的無菌介質(zhì)的125mL燒瓶中，對用于生產(chǎn)階段的接種體進(jìn)行制備。在大約28℃下，在設(shè)置為250rpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器上培養(yǎng)大約70～72小時。在培養(yǎng)之后，將10mL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入含有600mL包含20g/L馬鈴薯糊精類IV(sigma)、30g/L甘油、2.5g/L Bacto-蛋白胨、8.34g/L酵母提取物、3g/L CaCO3、pH 7.0的無菌生產(chǎn)介質(zhì)的2L擋板燒瓶中。通過在設(shè)置為250rpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器上在28℃下將培養(yǎng)物培養(yǎng)5天，對發(fā)酵肉湯進(jìn)行制備。
b)替代方法 利用提交于2004年1月21日的CA專利申請2,466,340中所述的改良方法，發(fā)酵作用可以在14.5L發(fā)酵器(BioFlo 110TM發(fā)酵器，NewBrunswick Scientific，Edison，NJ，USA)中實現(xiàn)，為1×10L批次。
將小單孢菌屬種(貯藏登記號IDAC 070303-01)保持在ISP2瓊脂的瓊脂板(Difco Laboratories，Detroit，Ml)上。通過將表面生長的小單孢菌屬種從瓊脂板轉(zhuǎn)移到含有500mL用一升自來水(pH值7.0)制備的包括10g葡萄糖、20g馬鈴薯糊精、5g酵母提取物、5g N ZAmine-A和1g CaCO3的無菌介質(zhì)的2L燒瓶中，對用于生產(chǎn)階段的接種體進(jìn)行制備。在大約28℃下，在設(shè)置為250rpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器上將培養(yǎng)物培養(yǎng)大約70小時。在培養(yǎng)之后，將300mL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入含有10L無菌生產(chǎn)介質(zhì)的14.5L發(fā)酵器中。每升生產(chǎn)介質(zhì)都包括20g馬鈴薯糊精、30g甘油、2.5g Bacto-蛋白胨、8.34g酵母提取物、0.3mL硅氧烷消泡劑油(Chem Service)、0.05ml Proflo oilTM(Traders protein)和3g CaCO3，用蒸餾水制備成一升并且調(diào)節(jié)pH值為7.0。在28℃下，控制溶解氧氣(dO2)為25％，在320-600RPM之間變化的攪拌串級回路下和設(shè)置為0.5v/v/m固定速率的通風(fēng)條件下，對培養(yǎng)物進(jìn)行培養(yǎng)。
除了上述介質(zhì)之外，其它用于通過發(fā)酵生產(chǎn)化合物1的優(yōu)選介質(zhì)提供于表1中(QB、MA、KH、RM、JA、FA、CL)。小單孢菌屬種046-ECO11或者[S01]046的任何一種都可以用于這些例證性的方法中。
實施例2化合物1的分離 例證性的分離方法 a)分離方法1 將500mL乙酸乙酯加入到如以上實施例1所制備的500mL發(fā)酵肉湯中。在定軌振蕩器上在200rpm下將上述混合物攪拌30分鐘，從而形成乳液。通過離心和傾析將各相分離。將4～5g無水MgSO4加入到有機相中，然后將其過濾并且在真空中將溶劑除去。
在水(300mL)中，將2L發(fā)酵物的乙酸乙酯提取物與HP-20樹脂(100mL；Mitsubishi Casei Corp.，Tokyo，Japan)混合。在真空中將乙酸乙酯除去，在布氏漏斗上對樹脂進(jìn)行過濾并且將濾液除去。然后對吸附的HP-20樹脂順序用2×125mL 50％乙腈水溶液、2×125mL 75％乙腈水溶液和2×125mL乙腈進(jìn)行洗滌。
將含有化合物1的組分蒸干，并且將其中100mg溶解在5mL由氯仿、環(huán)己烷、甲醇和水按體積比例為5∶2∶10∶5的比例制備的混合物的上相中。利用裝配有200mL柱體和預(yù)裝有該二相系統(tǒng)上相的高速逆流色譜法(HSCC)系統(tǒng)(Kromaton Technologies，Angers，F(xiàn)rance)對該樣品進(jìn)行離心分配色譜分離。HSCC按較低相移動方式運行，和化合物1在大約一半柱體積時得到洗脫。對餾分進(jìn)行收集，在市售Kieselgel 6OF254板上通過小份餾分的TLC對化合物1進(jìn)行檢測?？梢酝ㄟ^以下方式對化合物進(jìn)行顯像觀察在UV光線下對干片進(jìn)行檢查，或者用含有香草醛(0.75％)和濃硫酸(1.5％，v/v)的乙醇溶液的噴霧劑對板進(jìn)行噴霧，和隨后加熱該板。該餾分含有基本上純的化合物1，不過是高度有顏色的。暗黃色樣品可以通過色譜法在HPLC上按照如下方式獲得。
將6mg樣品溶于乙腈中并且將其注射入制備HPLC柱(XterraTMODS(10μm)，19×150mm，Waters Co.，Milford，MA)中，流速為9mL/min和在300nm下進(jìn)行UV峰值檢測。該柱用乙腈/緩沖液(5mMNH4HCO3)根據(jù)下表2中所示梯度進(jìn)行洗脫。 表2 制備HPLC梯度 對含有化合物1的組分進(jìn)行合并、濃縮和冷凍干燥，從而得到3.8mg化合物的收率。
b)分離方法2 化合物1還可以利用以下替代方案進(jìn)行分離。在培養(yǎng)期結(jié)束時，對得自于實施例1的擋板燒瓶的發(fā)酵肉湯進(jìn)行離心分離，將上清液從含有細(xì)菌菌絲體的丸粒中傾倒出來。將100mL 100％MeOH加入到菌絲體丸粒中，將所得樣品攪拌10分鐘并且將其離心15分鐘。將甲醇上清液傾倒出并且對其進(jìn)行儲存。然后，將100mL丙酮MeOH加入到菌絲體丸粒中，攪拌10分鐘然后將其離心15分鐘。將丙酮上清液傾倒出，并且將其與甲醇上清液合并。最后，將100mL 20％MeOH/H2O加入到菌絲體丸粒中，攪拌10分鐘并且將其離心15分鐘。將所得上清液與丙酮和甲醇上清液合并。
將合并的上清液加入到在1000mL水中的400ml HP-20樹脂中并且在真空中將有機物除去。將所得漿液濾過布氏漏斗并且將所得濾液除去。先后用2×500mL 50％MeOH/H2O、2×500mL 75％MeOH/H2O和2×500mL MeOH對HP-20樹脂進(jìn)行洗滌。
分別對每次洗滌進(jìn)行收集，并且通過如上所述的TLC對其進(jìn)行分析。將這些含有化合物1的餾分蒸發(fā)至接近干燥，并且對其進(jìn)行冷凍干燥。將凍干物溶于甲醇中并且將其注射入制備HPLC柱(XterraTMODS(10μm)，19×150mm，Waters Co.，Milford，MA)中，流速為9mL/min和在300nm下進(jìn)行峰值檢測。
該柱用乙腈/緩沖液(5mM NH4HCO3)根據(jù)下表3中所示梯度進(jìn)行洗脫。 表3 制備HPLC梯度 對含有化合物1的組分進(jìn)行合并、濃縮和冷凍干燥，從而得到約33.7mg化合物。
c)分離方法3 用等體積乙酸乙酯對由實施例1得到的10升全肉湯進(jìn)行兩次提取，將兩次提取物合并并且將其濃縮至干燥。對干燥的提取物稱重，對于每克干燥提取物，加入100mL MeOH-H2O(2∶1v/v)和100mL己烷。對上述混合物進(jìn)行溫和地渦旋，使其充分實現(xiàn)溶解。將兩層分離，所得水層用100mL己烷進(jìn)行洗滌。將兩個己烷層合并，合并的己烷溶液用100mL甲醇∶水(2∶1，v/v)進(jìn)行洗滌。將兩個甲醇水層合并并且用200mL EtOAc和400mL水進(jìn)行處理。將各層分離，所得水層進(jìn)一步用200mL份的EtOAc提取兩次。將EtOAc層合并并且對其進(jìn)行濃縮。由此獲得的殘余物(220mg)適于通過如上所述的HSCC或者通過HPLC進(jìn)行最后純化。當(dāng)與用于(a)或者(b)中的提取記錄進(jìn)行比較時，該提取工藝的純度高十倍。
實施例3化合物1結(jié)構(gòu)的說明
化合物1的主要同位素的計算分子量(462.25)和分子式(C28H34N2O4)通過質(zhì)譜分析進(jìn)行確認(rèn)負(fù)離子化得到461.2的(M-H)-分子離子和正離子化得到463.3的(M+H)+分子離子。UVmax確定為230nm，同時在290nm處存在肩峰。
NMR氫和碳光譜分析示于表4中。溶于含有質(zhì)子、碳和多元脈沖序列g(shù)DQCOSY、gHSQC、gHMBC和NOESY的MeOH-d4中，對NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行收集。在結(jié)構(gòu)確定中，在化合物1的2D光譜中的多個交叉峰是關(guān)鍵。例如，在gHMBC試驗中，法呢基鏈被置于酰胺氮上的情況由該鏈位于4.52ppm的末端亞甲基的質(zhì)子信號與位于170ppm的酰胺羰基碳之間的強交叉峰所引起。在NOESY光譜中，該結(jié)論由位于4.52ppm的相同亞甲基信號和四取代苯環(huán)的兩個質(zhì)子中的一個質(zhì)子的位于6.25ppm的芳香質(zhì)子信號之間的交叉峰證實。質(zhì)子和碳信號的歸屬示于表4中。
表4 化合物1在MeOH-D4中的1H和13C NMR(δH，ppm)數(shù)據(jù) 基于質(zhì)譜、UV和NMR光譜學(xué)數(shù)據(jù)，可以確定該化合物的結(jié)構(gòu)為以上所示的化合物1的結(jié)構(gòu)。
實施例4二烷基硫酸酯化反應(yīng) a)化合物2和18的合成和結(jié)構(gòu)說明
化合物2，即10-法呢基-4，6，8-三羥基-5-甲基-5，10-二氫-二苯并[b，e][1，4]二氮雜-11-酮，和
化合物18，即10-(7-甲氧基-3，7，11-三甲基十二-2，10-二烯基)-4，6，8-三羥基-5-甲基-5，10-二氫-二苯并[b，e][1，4]二氮雜-11-酮，被制備和確認(rèn)如下 制備 將化合物1(500.0mg)溶于甲醇(MeOH，20mL)中，并且在室溫下將其與硫酸二甲酯(0.5mL)和NaHCO3(250mg)一起攪拌48小時。通過加入水將上述反應(yīng)混合物稀釋至200mL并且用乙酸乙酯(EtOAc，300mL×3)對其進(jìn)行提取。將有機層分離并且在真空下對其進(jìn)行干燥，將其再溶于甲醇中并且濾過0.45μm 13mm AcrodiscTMGHP針筒式濾器。在連接在光二極管矩陣檢測器的Waters HPLC上對所得濾液進(jìn)行分離。通過在Nova-PackTM HR C18 6μm25×200mm柱上進(jìn)行多重注射(20mL/min，H2O/CH3CN梯度80∶20-30∶70，0-8min；30∶70-0∶100，8-18min)，化合物18(12.1mg)和化合物2(308.5mg)得到分離，分別在14.5和16.8min時得到洗脫。
化合物2和18的結(jié)構(gòu)說明 化合物2的主要同位素的計算分子量(476.27)和分子式(C29H36N2O4)通過質(zhì)譜分析進(jìn)行確認(rèn)負(fù)離子化得到475.6的(M-H)-分子離子和正離子化得到499.4的(M+Na)+分子離子。NMR氫和碳光譜分析示于表5中。基于化合物1的結(jié)構(gòu)知識，可以很容易地確定信號的歸屬。化合物18的主要同位素的計算分子(508.29)和分子式(C30H40N2O5)量通過質(zhì)譜分析進(jìn)行確認(rèn)負(fù)離子化得到507.3的(M-H)-分子離子和正離子化得到509.3的(M+H)+分子離子。如表5中所示，通過將甲醇加入到法呢基鏈上得到的特征N-甲基(信號5)、甲氧基(信號7’-OMe)和亞甲基(6’)易于明確歸屬。
表5 化合物2和18在MeOH-D4中的NMR(δ，ppm)數(shù)據(jù) N/A不適用，在分子中不存在該基團(tuán) a.化合物2中的CH，化合物18中的CH2 b.4’、5’、8’和9’的信號非常接近；基于化合物1確定歸屬 b)化合物3、21和22的合成和結(jié)構(gòu)說明
化合物310-法呢基-4，6，8-三羥基-5-乙基-5，10-二氫-二苯并[b，e]1，4]二氮雜-11-酮；
化合物2110-(11-甲氧基-3，7，11-三甲基-2，6-十二烷二烯基)-4，6，8-三羥基-5-乙基-5，10-二氫-二苯并[b，e][1，4]二氮雜-11-酮；
化合物2210-(7，11-二甲氧基-3，7，11-三甲基-2-十二烯基)-4，6，8-三羥基-5-乙基-5，10-二氫-二苯并[b，e][1，4]二氮雜-11-酮； 制備 在室溫下，在硫酸二乙酯(2.0mL)和NaHCO3(99.9mg)的甲醇(2mL)混合物中，將化合物1(85.3mg)攪拌72小時。將所得混合物濾過0.45μm13mm AcrodiscTM GHP針筒式濾器。通過制備HPLC，在NovaPackTM HR C-18 25×200mm柱(20mL/min，H2O/CH3CN梯度80∶20-30∶70，0-8min；30∶70-0∶100，8-18min)上進(jìn)行多重注射，對上述溶液進(jìn)行純化，從而得到四個主峰化合物3(20.0mg，含有一些雜質(zhì)，RT16.6min)，化合物21(17.54mg，RT14.3min)和化合物22(7.82mg，RT12.6min)。含有化合物21和22的非乙基化類似物的餾分還分別得到了分離，其量分別為5.65mg(RT11.6min)和2.20mg(RT10.3min)。使用相同柱(20mL/min，H2O/CH3CN梯度80∶20-30∶70，0-8min；30∶70-0∶100，8-18min，曲線7)對含有化合物3的餾分進(jìn)行進(jìn)一步純化，從而得到基本上純的化合物3(13.85mg，RT17.9min)。
化合物3、21和22的結(jié)構(gòu)說明 化合物3的主要同位素的計算分子量(490.28)和分子式(C30H38N2O4)通過質(zhì)譜分析進(jìn)行確認(rèn)負(fù)離子化得到489.3的(M-H)-分子離子和正離子化得到491.3的(M+H)+分子離子?；诨衔?和2的結(jié)構(gòu)知識，可以很容易地確定質(zhì)子NMR信號的歸屬。特征N-乙基(5-N-Et)很容易確定歸屬，如表6中所示。
化合物21的主要同位素的計算分子量(522.31)和分子式(C31H42N2O5)通過質(zhì)譜分析進(jìn)行確認(rèn)負(fù)離子化得到521.3的(M-H)-分子離子和正離子化得到523.5的(M+H)+分子離子，和491.3的(M+H-HOCH3)+分子離子的片段。通過將甲醇加入到法呢基鏈上得到的特征N-乙基(5-N-Et)和甲氧基(11’-OMe)以及亞甲基(10’)基團(tuán)很容易確認(rèn)歸屬，如表6中所示。
化合物22的主要同位素的計算分子量(554.34)和分子式(C32H46N2O6)通過質(zhì)譜分析進(jìn)行確認(rèn)負(fù)離子化得到553.4的(M-H)-分子離子和正離子化得到555.4的(M+H)+分子離子，和分別具有523.5和491.3的(M+H-HOCH3)+和(M+H-HOCH3-HOCH3)+分子離子的片段。通過將兩個甲醇分子加入到法呢基鏈上得到的特征N-乙基(5-N-Et)和甲氧基(7’-OMe和11’-OMe)基團(tuán)很容易確認(rèn)歸屬，如表6中所示。發(fā)現(xiàn)亞甲基基團(tuán)(5’、6’、8’、9’和10’)全部具有類似的化學(xué)位移，這與飽和烷基一致。
表6 化合物3，21和22在MeOH-D4中的1H NMR(δH，ppm)數(shù)據(jù) N/A不適用，在分子中不存在該基團(tuán) **信號1.22-1.49ppm，10個質(zhì)子 a.化合物3和21中的CH，化合物22中的CH2 b.化合物3的CH，化合物21和22中的CH2 c)化合物4的合成和結(jié)構(gòu)說明
化合物4，即10-法呢基-4，6，8-三羥基-5-正丙基-5，10-二氫-二苯并[b，e][1，4]二氮雜-11-酮，被制備和確認(rèn)如下 制備 在室溫下，在硫酸二丙酯(0.5mL)和NaHCO3(46.3mg)的甲醇(3mL)混合物中，將化合物1(46.7mg)攪拌72小時。將所得混合物濾過0.45μm13mm AcrodiscTM GHP針筒式濾器。通過制備HPLC(在NovaPackTM HR C-18 25×200mm柱上進(jìn)行多重注射20mL/min，H2O/CH3CN梯度80∶20-30∶70，0-8min；30∶70-0∶100，8-18min)對所得溶液進(jìn)行純化，從而得到基本上純的化合物4(18.0mg，RT17.3min)。
化合物4的結(jié)構(gòu)說明 化合物4的主要同位素的計算分子量(504.30)和分子式(C31H40N2O4)通過質(zhì)譜分析進(jìn)行確認(rèn)負(fù)離子化得到503.4的(M-H)-分子離子和正離子化得到505.5的(M+H)+分子離子?；诨衔?和2的結(jié)構(gòu)知識，可以很容易地確定質(zhì)子NMR信號的歸屬。特征N-丙基(5-N-Pr(C1～C3))很容易確定歸屬，如表7中所示。
d)化合物13的合成和說明
化合物1310-法呢基-4，6，8-三羥基-5-(三氘代甲基)-5，10-二氫-二苯并[b，e][1，4]二氮雜-11-酮，根據(jù)以下方法進(jìn)行制備和確認(rèn) 制備 將化合物1(121.3mg)溶于甲醇(3.0mL)中，將硫酸二甲酯-d6(150μL，CDN isotopes Inc.)和NaHCO3(58.1mg)加入其中，并且在室溫下將該反應(yīng)攪拌過夜。對上述反應(yīng)混合物進(jìn)行過濾，并且使所得濾液經(jīng)受Waters HPLC純化(在Nova PackTM HR C-18 25×200mm柱上進(jìn)行多重注射20mL/min，H2O/CH3CN梯度70∶30-20∶80，0-4min；20∶80-0∶100，4-9min，100％CH3CN，9-12min)，從而得到化合物13(82.7mg，RT 9.4min)。
結(jié)構(gòu)說明 化合物13的主要同位素的計算分子量(479.29)和分子式(C29H33D3N2O4)通過質(zhì)譜分析進(jìn)行確認(rèn)負(fù)離子化得到478.5的(M-H)-分子離子和正離子化得到480.6的(M+H)+分子離子。通過質(zhì)子核磁共振譜對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)，如下表7所示。 表7 化合物4和13在MeOH-D4中的1H NMR(δH，ppm)數(shù)據(jù) N/A不適用，在分子中不存在該基團(tuán) a.化合物4中的CH2，化合物13中的CD3。
實施例5烷鹵化反應(yīng) a)化合物5的合成和結(jié)構(gòu)說明
化合物5，即10-法呢基-4，6，8-三羥基-5-正丁基-5，10-二氫-二苯并[b，e][1，4]二氮雜-11-酮，制備和確認(rèn)如下 制備 在1-溴丁烷(2.0mL)中，將化合物1(43.5mg)與吡啶(50μL)在80℃下攪拌過夜。所得反應(yīng)混合物用甲醇(1.0mL)進(jìn)行稀釋、過濾并且進(jìn)行如上所述(實施例4(c)中)的Waters HPLC分離，從而得到半純化的化合物5(RT18.1min)。利用相同條件(除曲線7之外(except with curre 7))對半純化的化合物進(jìn)行進(jìn)一步純化，從而得到基本上純的化合物5(10.5mg，RT17.9min)。
結(jié)構(gòu)說明 化合物5的主要同位素的計算分子量(518.31)和分子式(C32H42N2O4)通過質(zhì)譜分析進(jìn)行確認(rèn)負(fù)離子化得到517.4的(M-H)-分子離子和正離子化得到519.5的(M+H)+分子離子。特征N-正丁基(5-N-烷基(C1-C4))很容易確認(rèn)歸屬，如下表8中所示。
b)化合物7的合成和結(jié)構(gòu)說明
化合物7，即10-法呢基-4，6，8-三羥基-5-正己基-5，10-二氫-二苯并[b，e][1，4]二氮雜-11-酮，制備和確認(rèn)如下 制備 在1-溴己烷(2.0mL)中，將化合物1(39.2mg)與吡啶(50μL)在80℃下攪拌過夜。所得反應(yīng)混合物用甲醇(1.0mL)進(jìn)行稀釋，對其進(jìn)行過濾，并且使其經(jīng)受Waters HPLC(在NovaPackTM HR C-1825×200mm柱上進(jìn)行多重注射20mL/min，H2O/CH3CN梯度80∶20-30∶70，0-8min；30∶70-0∶100，8-18min；等濃度CH3CN 18-24min)對所得溶液進(jìn)行純化，從而得到基本上純的化合物7(14.0mg，RT20.1min)。
結(jié)構(gòu)說明 化合物7的計算分子量(546.35)和分子式(C34H46N2O4)通過質(zhì)譜分析進(jìn)行確認(rèn)負(fù)離子化得到545.6的(M-H)-分子離子和正離子化得到547.6的(M+H)+分子離子?；诨衔?的結(jié)構(gòu)知識，可以很容易地確定質(zhì)子NMR信號的歸屬。特征N-正己基(5-N-烷基(C1-C6))很容易確認(rèn)歸屬，如下表8中所示。
c)化合物2～4、6和8～12的合成 化合物2～4、6和8～12通過a)和b)中所述方法形成，分別將這些方法中的烷基化試劑替換為以下烷基化試劑碘代甲烷、溴乙烷、1-溴丙烷、1-溴戊烷、1-溴庚烷、1-氯辛烷、三氟甲基碘、六氟-1-碘丙烷和2-碘-1，1，1-三氟乙烷。
表8 化合物5和7在MeOH-D4中的1H NMR(δH，ppm)數(shù)據(jù) N/A不適用，在分子中不存在該基團(tuán) a.4’、5’、8’和9’的信號非常接近；基于化合物1確定歸屬 b.化合物5中的CH3，化合物7中的CH2 實施例6O-酰基化 化合物25(O-乙?；?的合成和結(jié)構(gòu)說明
化合物254，6，8-三乙酰氧基-10-法呢基-5，10-二氫-二苯并[b，e][1，4]二氮雜-11-酮，根據(jù)以下方法進(jìn)行制備和確認(rèn) 制備 在6滴吡啶(Aldrich)存在下，將化合物1(120.5mg)與乙酸酐(720μL，29eq，Aldrich)攪拌過夜。對上述反應(yīng)混合物進(jìn)行HPLC分離。通過在WatersTM RCM Nova-Pak HRTM C18，6μm，6OA 25×200mm柱(20mL/min H2O/CH3CN 80∶30-70∶75，0-8min；30∶70-0∶100，8-18min，100％CH3CN，18-20min)上進(jìn)行多重注射進(jìn)行純化，從而得到化合物25(91.2mg)，保留時間為18.5min。4，8-二乙酰氧基(11.4mg)、4，6-二乙酰氧基(9.2mg)和6，8-二乙酰氧基(11.4mg)化合物還分別在保留時間為16.2、17.6和18.0時得到分離。
結(jié)構(gòu)說明 化合物25的主要同位素的計算分子量(588.28)和分子式(C34H40N2O7)通過質(zhì)譜分析進(jìn)行確認(rèn)。化合物25的MS通過負(fù)離子化得到587.6的(M-H)-分子離子和通過正離子化得到611.5的(M+Na)+分子離子?；衔?5的質(zhì)子NMR光譜分析示于表9中?；谂c化合物1的光譜進(jìn)行對比，可以很容易確定信號歸屬。 表9 化合物25在CDCl3中的1H NMR(δH，ppm)數(shù)據(jù) N/A不適用，在分子中不存在該基團(tuán) a.4’、5’、8’和9’的信號非常接近；基于化合物1確定歸屬 實施例7法呢基側(cè)鏈修飾 a)化合物14的合成和結(jié)構(gòu)說明
化合物14，即10-(3，7，11-三甲基十二烷基)-4，6，8-三羥基-5-甲基-5，10-二氫-二苯并[b，e][1，4]二氮雜-11-酮，制備和確認(rèn)如下 制備 在氧化鉑(PtO2，10mg，催化劑)作為催化劑存在下，將化合物2(23.7mg)的甲醇(2.0mL)溶液在氫氣下攪拌過夜。對所得反應(yīng)混合物進(jìn)行過濾并且在真空中對其進(jìn)行濃縮，從而得到21.6mg化合物14。
結(jié)構(gòu)說明 化合物14的計算分子量(482.31)和分子式(C29H42N2O4)通過質(zhì)譜分析進(jìn)行確認(rèn)負(fù)離子化得到481.3的(M-H)-分子離子和正離子化得到483.3的(M+H)+分子離子。在NMR光譜中，法呢基烯烴質(zhì)子被替換為0.76-1.86ppm附近的脂族烴基質(zhì)子信號，是17個質(zhì)子(3CH，7CH2)的總和。特征N-甲基(5-N-Me)很容易確定歸屬，如下表10中所示。
b)化合物15的合成和結(jié)構(gòu)說明
化合物15，即10-(3，7，11-三甲基-2-十二烯基)-4，6，8-三羥基-5-甲基-5，10-二氫-二苯并[b，e][1，4]二氮雜-11-酮，制備和確認(rèn)如下 制備 在氧化鉑(PtO2，10mg，催化劑)作為催化劑存在下，將化合物2(308.5mg)的甲醇(220mL)溶液在氫氣下攪拌過夜。對所得反應(yīng)混合物進(jìn)行過濾并且根據(jù)實施例4(c)中所述的方法通過HPLC對其進(jìn)行純化，從而得到純化合物15(82.3mg，RT17.0min)。
結(jié)構(gòu)說明 化合物15的計算分子量(480.30)和分子式(C29H40N2O4)通過質(zhì)譜分析進(jìn)行確認(rèn)負(fù)離子化得到479.3的(M-H)-分子離子和正離子化得到481.6的(M+H)+分子離子。其NMR光譜分析基于化合物2和14的結(jié)構(gòu)說明，所得結(jié)果存在于表10中。在NMR光譜上，6’-7’和10’-11’位的法呢基烯烴質(zhì)子被替換為脂族質(zhì)子信號，并且與5’、8’和9’位上的脂族質(zhì)子一起在約1.07～1.51ppm處得到觀察，它們是12個質(zhì)子(2CH，5CH2)的總和。在NMR上，2’(CH)位上的法呢基烯烴質(zhì)子的化學(xué)位移為5.41ppm。4’位上的亞甲基顯示在2.03ppm。特征5-N-甲基也很容易確定歸屬為化學(xué)位移2.93ppm。
c)化合物23的合成和說明
化合物2310-(3，7，11-三甲基十二烷基)-4，6，8-三羥基-5，10-二氫-二苯并[b，e][1，4]二氮雜-11-酮，根據(jù)以下方法進(jìn)行制備和確認(rèn) 制備 在氧化鉑(PtO2，10mg，0.4eq)作為催化劑存在下，將化合物1(51.1mg的3.0mL甲醇溶液)溶液在氫氣下攪拌過夜。對所得反應(yīng)混合物進(jìn)行過濾，并且通過直接制備HPLC，利用PhenomenexSynergiTM MAX RP 21.2×200mm柱(20mL/min，H2O/CH3CN梯度30∶70-30∶70，0-2min；30∶70-0∶100，2-20min)對其進(jìn)行純化。將保留時間為12.8min的餾分合并，從而得到45.2mg化合物23。
結(jié)構(gòu)說明 通過質(zhì)譜分析對主要同位素的計算分子量(468.30)和分子式(C28H40N2O4)進(jìn)行確認(rèn)?；衔?3的質(zhì)譜通過負(fù)離子化得到467.4的(M-H)-分子離子和通過正離子化得到469.4的(M+H)+分子離子?；衔?3的質(zhì)子NMR光譜分析示于下表10中。基于化合物1的結(jié)構(gòu)知識，可以很容易地確定信號的歸屬。正如所料，2’-11’位的脂族質(zhì)子信號在約1～1.75ppm處具有非常接近的化學(xué)位移(17個質(zhì)子的總和)，12’位和1”-3”位的甲基質(zhì)子的化學(xué)位移也非常接近(0.8-0.95ppm，12個質(zhì)子的總和)?；?’和7’位的非對映異構(gòu)體存在于混合物中并且以不同比例存在的事實，這些信號也是復(fù)雜的。因為NMR在氘化甲醇中進(jìn)行，因此沒有觀察到不穩(wěn)定的質(zhì)子。
表10 化合物14，15和23在CD3OD中的1H NMR(δH，ppm)數(shù)據(jù) N/A不適用，在分子中不存在該基團(tuán) a.信號非常接近。
b.異構(gòu)體混合物。
c.化合物14和233CH，7CH2(17H)；化合物152’(CH)在5.41ppm，4’(CH2)在2.03ppm，5’-11’(12H)在1.07-1.51ppm。
d.化合物14和234CH3(12H)；化合物151”(CH3)在1.75ppm，2”、3”和12’(9H)在0.88-0.80ppm。
實施例8芳族取代反應(yīng) a)通過溴化進(jìn)行的化合物24的合成和結(jié)構(gòu)說明
化合物2410-(法呢基)-7-溴-4，6，8-三羥基-5，10-二氫-二苯并[b，e][1，4]二氮雜-11-酮，根據(jù)以下方法進(jìn)行制備和確認(rèn) 制備 將化合物1(116.0mg)和N-溴琥珀酰亞胺(NBS，45.5mg)溶于四氫呋喃(THF，3.0mL)中，并且在室溫下將其攪拌4天。對所得反應(yīng)混合物進(jìn)行過濾并且對其進(jìn)行Waters HPLC純化(NovaPackTMHR C-18 25×200mm柱20mL/min，H2O/CH3CN梯度80∶20-30∶70，0-8min；30∶70-0∶100，8-18min)，從而化合物24(13.6min)，帶有一些雜質(zhì)。通過HPLC(SymmetryTM C-18 25×100mm柱20mL/min，H2O/CH3CN梯度70∶30-30∶70，0-15min)對上述所得半純化樣品進(jìn)行進(jìn)一步純化，從而得到純化合物24(9.5mg，RT 13.0min)。
結(jié)構(gòu)說明 化合物24的主要同位素的計算分子量(540.16和542.16)和分子式(C28H33BrN2O4)通過質(zhì)譜分析進(jìn)行確認(rèn)負(fù)離子化得到539.2和541.1的(M-H)-分子離子，和正離子化得到541.3和543.2的(M+H)+分子離子。在各個質(zhì)譜中兩種分子的存在證實了分子中溴基團(tuán)的存在。在質(zhì)子核磁共振譜中不存在芳香(7位)信號，進(jìn)一步證實了該結(jié)構(gòu)，如下表11所示。 表11 化合物24在CD3OD中的1H NMR(δH，ppm)數(shù)據(jù) b)化合物26的合成 將化合物2和N-溴琥珀酰亞胺溶于四氫呋喃中并且在室溫下將其攪拌4天(條件如(a)所述)。對所得反應(yīng)混合物進(jìn)行過濾并且對其進(jìn)行HPLC純化，從而得到純化合物26。
c)化合物27的合成 將化合物14和N-溴琥珀酰亞胺溶于四氫呋喃中并且在室溫下將其攪拌4天(條件如(a)所述)。對所得反應(yīng)混合物進(jìn)行過濾并且對其進(jìn)行HPLC純化，從而得到純化合物27。
實施例9.本發(fā)明化合物的體外測驗圖 (a)式I化合物對四種細(xì)胞系的體外抗癌活性 例證性化合物的體外細(xì)胞毒素活性以及各種化合物的溶血活性示于表12中。在四種細(xì)胞系中對化合物進(jìn)行測試HT-29(結(jié)腸癌)、SF268(CNS)、MDA-MB-231(乳腺癌)和PC-3(前列腺癌)。用于各系列測試中的方法如下所述。
表12體外細(xì)胞毒素活性 a.通過以下方法(a)獲得的結(jié)果 b.通過以下方法(b)獲得的結(jié)果 c.平均GI50值，單位為μM。
表12中所述的所有化合物都比化合物1具有更好的抗癌活性。這些化合物包括化合物2～5、7、13、14、15、18和21～25?；衔?～5、7、13、14、15、18、21和22是化合物1的N-直鏈烷基衍生物(被式I包括)和它們的氫化和氫化甲氧基化法呢基衍生物。還發(fā)現(xiàn)氫化法呢基衍生物化合物23、溴化芳基衍生物化合物24和三乙酰化化合物25一般比化合物1更有活性。
方法(a) 對于化合物1、23和25，在體外對其細(xì)胞毒素活性進(jìn)行確定，從而確定各種化合物獲得50％細(xì)胞增殖抑制作用所需的濃度(GI50)。GI50值強調(diào)了零時細(xì)胞計數(shù)的校正值并且利用七個吸光度測定值[零時，(Tz)，控制生長，(C)和在五種濃度水平(Ti)的藥物存在下的測試生長]，GI50計算為[(Ti-Tz)/(C-Tz)]×100＝-50，它是在藥物培養(yǎng)期間，導(dǎo)致網(wǎng)狀DNA含量相對于對照細(xì)胞降低50％的藥物濃度。
將化合物溶解于10mM DMSO中。在測定之前，即時在賦形劑中將濃度稀釋至30、10、3、1和0.3μM。取決于細(xì)胞系的生長特性，將4000-10000個細(xì)胞置于兩個96孔板中(0天)并且將其培養(yǎng)16小時。第二天，將碘化丙啶加入到兩個板中的一個板中并且對其進(jìn)行熒光測量(Tz)。將測試化合物以及賦形劑對照加入到第二板中，并且將細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)96小時。在各個濃度下對各種化合物進(jìn)行測試，進(jìn)行三次。在加入碘化丙啶之后，通過熒光(對照為C)測量信號對等同的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行確定。GI50結(jié)果利用上式進(jìn)行計算并且示于表12中。方法(b) 利用碘化丙啶(PI)和通過利用以下方法對化合物1、2～5、7、13、14、15、18、21、22和24的體外細(xì)胞毒素活性(GI50)進(jìn)行確定，為導(dǎo)致產(chǎn)生50％生長抑制作用的藥物濃度。
在適當(dāng)?shù)慕臃N密度(HT293,000；SF2683,000；PC-33,000；和MDA-MB-2317,500個細(xì)胞)下和根據(jù)各種細(xì)胞系的技術(shù)數(shù)據(jù)表(行A-G，75μL介質(zhì)/孔)，對兩個96孔板重復(fù)播種各種細(xì)胞系。H行僅僅填充介質(zhì)(150μL，陰性對照介質(zhì))。在適當(dāng)?shù)臏囟群虲O2濃度下將兩個板培養(yǎng)24小時。
在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中將測試化合物制備成15X母液和相應(yīng)的450、45、0.45、0.045和0.0045μM(試驗當(dāng)日制備)。在適當(dāng)?shù)脑囼灲橘|(zhì)中將各試樣稀釋7.5倍，從而得到一組六個2X濃度溶液(60、6、0.6、0.06、0.006和0.0006μM)。將75μL各種濃度的試樣加入到第二個板的各個相應(yīng)的孔(行A～F)中。行G中充滿75μL介質(zhì)/0.6％DMSO(陰性對照細(xì)胞)。在適當(dāng)?shù)臏囟群虲O2濃度下將第二個板培養(yǎng)96小時。
第一個板在不除去培養(yǎng)介質(zhì)下，將PI(30μL，50μg/mL)加入到第一個板的各個孔中。在3500rpm下將該板離心10分鐘(Sorvall Legend-RT，擺動葉片)。進(jìn)行熒光強度(Thermo，Varioskan，λex530nm；λem620nm)測量，從而得到第一測量值，死亡細(xì)胞(T0時的DC；冷凍之前)。進(jìn)行兩回合冷凍(-80℃)/融化(37℃)。對熒光強度進(jìn)行確定，從而得到第二測量值，全部細(xì)胞(T0時的TC；冷凍/融化之后)。
如對第一個板所述對第二個板進(jìn)行處理，但是進(jìn)行三回合冷凍/融化而不是兩次。第一測量值給出處理的死亡細(xì)胞值(TDC)，和第二測量值給出處理的全部細(xì)胞值(TTC)。對于各個處理孔和對照(CTC和CDC)收集上述兩種數(shù)值。
通過減去背景值(僅僅介質(zhì))對各個數(shù)值(DC、TC、TDC、TTC、CTC和CDC)進(jìn)行校正，從而得到用于各種濃度T/C(％)(處理/對照)計算的值 (FUDC(T＝0)，F(xiàn)UTC(T＝0)，F(xiàn)UTDC，F(xiàn)UTTC，F(xiàn)UCTC和FUCDC) 各種濃度的T/C(％)利用下式進(jìn)行計算 該GI50值強調(diào)了零時存活細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目的校正。在圖中對T/C值進(jìn)行交叉，從而確定GI50值，T/C為50％的濃度值。
(b)化合物2對36種細(xì)胞系的抗癌活性測驗圖(IC50) 培養(yǎng)條件和化合物2對36種癌細(xì)胞系的活性評價如實施例9(a)的方法(a)中所述實施，但是將結(jié)果表示為抑制50％細(xì)胞生長的藥物濃度(IC50，利用式[Ti/C]×100＝-50進(jìn)行計算)。示于表13中的低微摩爾至納摩爾水平的IC50值表明了化合物2對多種腫瘤類型的藥理學(xué)相關(guān)細(xì)胞毒素活性，所述腫瘤包括黑素瘤、胰癌、肺癌、結(jié)腸癌、胃癌、膀胱癌、腎癌、CNS癌、頭和頸癌、前列腺癌、子宮癌、卵巢癌和乳腺癌。
表13化合物2的體外特性測驗圖(IC50) 所有細(xì)胞系的平均值0.407 ca＝癌；pd＝異化不良；pap＝乳突狀；md＝中等異化；wd＝充分異化；mm＝惡性黑色素瘤；nd＝未確定 實施例10化合物1和2的體內(nèi)效果 化合物1和2在膠質(zhì)瘤模型中的體內(nèi)效果 該研究的目的是測試化合物1和2是否可以預(yù)防或者延遲帶有C6惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的鼠中的腫瘤生長，從而確定有效劑量方案。
動物在處理之前，將60只六周大的體重為18～25g的雌性鼠(Musmusculus裸鼠)觀察7天。根據(jù)動物試驗道德準(zhǔn)則(Charte du comited’ethique du CNRS，juillet 2003)和對于試驗瘤形成中動物福利的English準(zhǔn)則(WORKMAN，P.，TWENTYMAN，P.，BALKWILL，F(xiàn).等人(1998)，United Kingdom Coordinating Committee on CancerResearch(UKCCCR)Guidelines for the welfare of animals inexperimental neoplasia(Second Edition，July 1997；British Journal ofCancer，771-10)進(jìn)行動物試驗。將任何死亡或者看起來有病的鼠即時除去和替換為健康的鼠。將有病的鼠從籠中除去，實施安樂死。在溫度(23±2℃)、濕度(45±5％)、光照周期(12小時光/12小時黑暗)和換氣的控制條件下，將動物保持在室中。將動物罩在裝配有食物和水源的聚碳酸酯籠中(5只/籠)。由無菌木屑組成的動物墊層每隔一天替換一次。食品不限量提供，位于籠上的金屬蓋中。熱壓處理的自來水不限量提供。水瓶裝配有橡皮塞和滑塊管。每周將水瓶凈化、滅菌和替換一次。通過刻在兩只耳朵上的不同數(shù)字區(qū)分動物。每個籠標(biāo)記一個具體代碼。
腫瘤細(xì)胞系根據(jù)Premont等人(Premont J，Benda P，Jard S.，[3H]norepinephrine binding by rat glial cells in culture.Lack ofcorrelation between binding and adenylate cyclase activation.BiochimBiophys Acta.1975 Feb 13；381(2)368-76.)所述，在系列替代培養(yǎng)和動物傳代之后，由通過N-硝基甲基脲(NMU)誘發(fā)的大鼠神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤對C6細(xì)胞系進(jìn)行克隆。)在濕潤的大氣環(huán)境下(5％CO2，95％空氣)，在37℃下使細(xì)胞生長為粘合單層。培養(yǎng)介質(zhì)是補充有2mM L-谷氨酰胺和10％胎牛血清的DMEM。為了試驗使用，通過用胰蛋白酶-versen處理10分鐘，將腫瘤細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中除去。在血球計中對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)并且通過0.25％錐蟲藍(lán)排斥對它們的生存能力進(jìn)行評價。
測試制品的制備對于測試制品，進(jìn)行以下方法以進(jìn)行重構(gòu)(在注射之前即時進(jìn)行)。賦形劑由芐醇(1.5％)、乙醇(8.5％)、丙二醇(27％)、PEG 400(27％)、二甲基乙酰胺(6％)和水(30％)的混合物組成。為了獲得均相液體，首先對賦形劑溶液進(jìn)行渦旋。將0.6mL經(jīng)受渦旋的賦形劑溶液加入到含有測試制品(化合物1)的各個管形瓶中。通過渦旋1分鐘和翻轉(zhuǎn)以及用力振搖，對管形瓶進(jìn)行充分混合。在注射入各只動物之前，再次對管形瓶進(jìn)行混合。
動物腫瘤細(xì)胞接種試驗在0天(D0)時開始。在D0時，使鼠接受在0.1mL DMEM完全培養(yǎng)基中的C6腫瘤細(xì)胞(5×105個細(xì)胞)的表面肌肉注射，注射入右后腿的上方中。
治療方案和結(jié)果 第一系列試驗 在第一系列試驗中，在接種C6細(xì)胞24小時后開始處理。在處理當(dāng)天，通過i.p途徑向各只鼠緩慢注射100μL測試或者對照制品。對于所有組，治療進(jìn)行至用鹽水治療的鼠(組1)的腫瘤體積達(dá)到大約3cm3(大約16天)時為止。組1的鼠每天用鹽水等滲溶液進(jìn)行處理，處理16天。組2的鼠每天用賦形劑溶液液進(jìn)行處理，處理16天。組3的鼠每天用10mg/kg化合物1進(jìn)行處理，處理16天。組4的鼠用30mg/kg化合物1每兩天處理一次，接受8次處理。組5的鼠用30mg/kg化合物1每三天處理一次，接受6次處理。一旦腫瘤變得明顯(＞100mm3；接種后11天)后即開始利用卡尺對腫瘤體積進(jìn)行測量，每隔一天測量一次，直至處理結(jié)束為止。如表14和圖1中所示，正如單向方差分析(Anova)測試隨后進(jìn)行處理組同鹽水組相比的非參數(shù)Dunnett’s多次對比測試所表明，所有化合物1處理組(6只鼠/組)的腫瘤體積的平均值都得到了顯著降低。表14P值欄中的星號表示統(tǒng)計學(xué)上的顯著值，而“ns”表示不顯著。表14 化合物1對C6惡性膠質(zhì)瘤的體內(nèi)抗癌效果 第二系列試驗 在第二系列試驗中，在接種C6細(xì)胞10天時腫瘤變得明顯時(大約100～200mm3)開始處理。在5個連續(xù)作業(yè)日內(nèi)每天都重復(fù)進(jìn)行處理。在處理當(dāng)天，通過i.p途徑向各只鼠緩慢注射100μL化合物1。組1的鼠每天用鹽水等滲溶液進(jìn)行處理。組2的鼠每天用賦形劑溶液液進(jìn)行處理。組3的鼠每天用20mg/kg化合物1進(jìn)行處理。組4的鼠每天用30mg/kg化合物1進(jìn)行處理。對鼠進(jìn)行處理，直至用鹽水處理的對照鼠(組1)的腫瘤體積達(dá)到大約4cm3時為止。每隔一天用卡尺測量腫瘤體積一次，直至處理結(jié)束為止。如表15和圖2中所示，正如單向方差分析(Anova)測試隨后進(jìn)行處理組同鹽水組相比的非參數(shù)Dunnett’s多次對比測試所表明，所有化合物1處理組(6只鼠/組)的腫瘤體積的平均值都得到了顯著降低。表15P值欄中的星號表示統(tǒng)計學(xué)上的顯著值，而“ns”表示不顯著。
腫瘤部分的組織學(xué)分析表明，用化合物1處理的鼠和對照組中的鼠的腫瘤之間存在顯著的形態(tài)變化。用化合物1(20-30mg/kg)處理的鼠的腫瘤中，細(xì)胞密度得到了降低和剩余腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核看起來較大和呈現(xiàn)固縮，然而用賦形劑處理的鼠的腫瘤沒有觀察到這種變化(圖3)。
表15 化合物1對C6惡性膠質(zhì)瘤的體內(nèi)抗癌效果 化合物2的體內(nèi)抗癌效果 化合物2對雌性瑞士裸鼠中鼠惡性膠質(zhì)瘤(C6)異種移植的抗癌效果通過如上所述進(jìn)行。所得結(jié)果和給藥方案概括在圖4中。在給藥方案為75mg/kg(qd5/2/qd5)下，靜脈內(nèi)給藥之后，顯示出了顯著的效果。
實施例11藥物動力學(xué)測驗圖 將化合物1和2單獨溶于乙醇(5％)、聚山梨酸酯80(15％)、PEG400(5％)和葡萄糖(5％)中，最終濃度為6mg/ml(對于所有胃腸外給藥途徑)。對于口服給藥，在CremophorEL/乙醇(50％∶50％)中對化合物1進(jìn)行溶液化，最終濃度為6mg/ml。在劑量給藥之前，對動物(雌性CrICD1鼠；6周大，22-24g)進(jìn)行稱重，對它們進(jìn)行隨機選擇并且分配成不同的處理組。通過靜脈內(nèi)(iv)、皮下(sc)、腹膜內(nèi)(ip)或者口服(po)途徑將化合物1給藥至指定的動物。通過靜脈內(nèi)(iv)或者腹膜內(nèi)(ip)途徑將化合物2給藥至指定的動物?；衔?和2的劑量給藥體積為5mL/kg體重。在采血之前，用5％異氟烷對動物進(jìn)行麻醉。通過每次采血時點(2min、5min、15min、30min、1h、2h、4h和8h)心臟刺穿四只動物，將血液收集入含有抗凝血劑K2EDTA的microtainer管中。在采集之后，對樣品進(jìn)行離心并且對由各個樣品獲得的血漿進(jìn)行回收和冷凍貯存(在大約-80℃下)，等待進(jìn)行分析。在5min和30min時點，從各只動物采集以下器官腦、肺、骨骼肌、脂肪組織、腎、脾臟、胸腺和肝。對組織進(jìn)行冷凍(在大約-80℃下)，等待分析。通過LC/MS/MS對各樣品進(jìn)行分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線從25延伸至2000ng/mL，定量限(LOQ)＜25ng/mL和檢測極限(LOD)為10ng/mL。
將降低至定量限(LOQ)以下的化合物1和2的血漿值設(shè)定為零。在藥物動力學(xué)研究的各個時點對平均濃度值和標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)進(jìn)行計算(n＝4只動物/時點)。對以下藥物動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行計算從零時至最后可測量濃度時點的血漿濃度與時間的曲線面積(AUC0-t)，延伸到無窮大時血漿濃度與時間的曲線的面積(AUCinf)，觀察的血漿濃度的最大值(Cmax)，最大血漿濃度的時間(tmax)、表觀一階末端消除速度常數(shù)(kel)，表觀一階末端消除半衰期計算為0.693/kel(t1/2)。利用劑量/AUCinf，對靜脈內(nèi)給藥后化合物1的系統(tǒng)清除率(CL)進(jìn)行計算。利用KineticaTM 4.1.1(InnaPhase Corporation，Philadelphia，PA)對藥物動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行計算。
結(jié)果 在靜脈內(nèi)(iv)、腹膜內(nèi)(ip)、皮下(sc)和口服(po)給藥30mg/kg化合物1后，化合物1的平均血漿濃度存在于圖5中。在iv和ip給藥30mg/kg化合物2后，與化合物1經(jīng)相同給藥途徑相比較的化合物2的平均血漿濃度存在于圖6中。當(dāng)iv給藥時，化合物2的AUC為92.08μM.h和觀察到的Cmax為105μg/mL，化合物1的AUC為40.4μM.h和觀察到的Cmax為130μg/mL。當(dāng)ip給藥時，化合物2的AUC為58.75μM.h和觀察到的Cmax為5.8μg/mL，化合物1的AUC為9.5μM.h和觀察到的Cmax為2.25μg/mL。
在I.V.給藥30mg/kg劑量化合物1后，化合物1的平均(±SD)血漿濃度以雙指數(shù)方式迅速下降，產(chǎn)生非常短的半衰期(t1/2α和β分別為4.6min和2.56h)。在腹膜內(nèi)和皮下給藥之后化合物1和在腹膜內(nèi)和靜脈內(nèi)給藥之后化合物2的藥物動力學(xué)表現(xiàn)出了緩慢釋放的PK分布。利用這些給藥途徑，化合物的血漿濃度得到了緩釋并且在8小時時間內(nèi)都保持在治療適當(dāng)水平上。在IP和IV給藥之后，化合物2表現(xiàn)的半衰期(t1/2)大于40小時。化合物1的口服給藥產(chǎn)生中等但是緩釋的藥物水平。這些數(shù)據(jù)表明化合物1的口服生物利用度為5-8％的水平。
在靜脈內(nèi)(iv)、腹膜內(nèi)(ip)或者皮下(sc)給藥30mg/kg化合物130分鐘后，化合物1的平均組織濃度存在于圖7中。選擇30分鐘的時點，是因為此時三種給藥途徑的血漿濃度類似。在iv和ip劑量給藥之后，化合物1得到了良好分布。驚人地發(fā)現(xiàn)，雖然ip和sc給藥產(chǎn)生相似的PK分布，但是在sc劑量給藥之后的組織水平顯著更低。這可以由同iv和ip給藥相比，sc給藥之后不存在峰值水平得到解釋。
利用相同的制劑，在CD-1 nu/nu鼠中對化合物進(jìn)行急性毒性研究，得到MTD≥50mg/kg(ip，NOAEL30mg/kg)和≥100mg/kg(iv，NOAEL75mg/kg)，在注射后數(shù)天時體重?fù)p失為約7％。當(dāng)iv給藥時，化合物1的MTD為150mg/kg?；衔?6的急性毒性研究的MTD為30mg/kg(ip)。
所有在此引用的專利、專利申請和出版物的全部內(nèi)容都在此引入作為參考。雖然本發(fā)明已經(jīng)參考其優(yōu)選實施方案進(jìn)行了特別說明和描述，但是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對其中的形式和細(xì)節(jié)進(jìn)行多種變型，這并不背離附屬權(quán)利要求所包括的本發(fā)明范圍。
權(quán)利要求
1.式I化合物
式I
其中
R1為直鏈C1-10烷基；
或者其法呢基衍生物，其中所述法呢基衍生物具有一個、兩個或者三個氫化或者氫化烷氧基化的雙鍵；
或者其藥學(xué)上可接受的鹽或者前藥。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中R1為直鏈C1-10烷基，或者其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或者前藥。
3.權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物為單氫化的法呢基衍生物，或者其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或者前藥。
4.權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物為二氫化的法呢基衍生物，或者其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或者前藥。
5.權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物為完全氫化的法呢基衍生物，或者其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或者前藥。
6.權(quán)利要求1的化合物，其中R1為直鏈C1-10烷基和法呢基得到了完全氫化，或者其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或者前藥。
7.權(quán)利要求1的化合物，其中R1為直鏈C1-6烷基，或者其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或者前藥。
8.權(quán)利要求1的化合物，其中R1為直鏈C1-6烷基和法呢基得到了完全氫化，或者其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或者前藥。
9.權(quán)利要求1的化合物，其中R1為甲基，或者其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或者前藥。
10.權(quán)利要求1的化合物，其中R1為乙基，或者其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或者前藥。
11.權(quán)利要求1的化合物，其中R1為正丙基，或者其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或者前藥。
12.權(quán)利要求1的化合物，其中R1為正丁基，或者其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或者前藥。
13.權(quán)利要求1的化合物，其中R1為正己基，或者其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或者前藥。
14.權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物選自化合物2～22，或者其藥學(xué)上可接受的溶劑化物或者前藥
15.權(quán)利要求14的化合物，其中所述化合物選自化合物2～5、7、13、14、15、18、21和22，或者其藥學(xué)上可接受的溶劑化物或者前藥。
16.權(quán)利要求15的化合物，其中所述化合物選自化合物2～5和7，或者其藥學(xué)上可接受的溶劑化物或者前藥。
17.權(quán)利要求14的化合物，其中所述化合物選自化合物2～13，或者其藥學(xué)上可接受的溶劑化物或者前藥。
18.權(quán)利要求14的化合物，其中所述化合物選自化合物14～22，或者其藥學(xué)上可接受的溶劑化物或者前藥。
19.選自化合物23～27的化合物，或者其藥學(xué)上可接受的溶劑化物或者前藥
20.權(quán)利要求19的化合物，其中所述化合物選自化合物23，或者其藥學(xué)上可接受的溶劑化物或者前藥。
21.權(quán)利要求19的化合物，其中所述化合物選自化合物24、26或者27，或者其藥學(xué)上可接受的溶劑化物或者前藥。
22.權(quán)利要求19的化合物，其中所述化合物選自化合物25，或者其藥學(xué)上可接受的溶劑化物或者前藥。
23.生產(chǎn)權(quán)利要求1～18中任一項所述化合物的方法，所述方法包括化學(xué)修飾化合物1
其中所述化學(xué)修飾包括N-烷基化化學(xué)步驟。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括選自法呢基氫化或者法呢基氫化烷氧基化中的一個步驟，其中所述法呢基氫化或者法呢基氫化烷氧基化步驟為部分或者完全氫化或者氫化烷氧基化。
25.權(quán)利要求23的方法，其中所述N-烷基化化學(xué)步驟包括使如權(quán)利要求23所述的化合物1與選自二烷基硫酸酯和烷基鹵化物的烷基化試劑反應(yīng)。
26.生產(chǎn)權(quán)利要求18～22中任一項所述化合物的方法，所述方法包括化學(xué)修飾化合物1
其中所述化學(xué)修飾包括選自以下的一種步驟O-?；⒎枷沱u化和法呢基氫化，其中所述法呢基氫化步驟為完全氫化步驟。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述化學(xué)修飾包括法呢基氫化步驟。
28.包括治療有效量的權(quán)利要求1化合物和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
29.包括治療有效量的權(quán)利要求2～14任一項所述的化合物和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
30.包括治療有效量的權(quán)利要求15～18任一項所述的化合物和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
31.包括治療有效量的權(quán)利要求19化合物和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
32.包括治療有效量的權(quán)利要求20～22任一項所述的化合物和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
33.權(quán)利要求1的任何一種化合物抑制瘤形成細(xì)胞生長的用途。
34.權(quán)利要求2～13的任一項化合物抑制瘤形成細(xì)胞生長的用途。
35.權(quán)利要求14～18的任一項化合物抑制瘤形成細(xì)胞生長的用途。
36.權(quán)利要求19～22的任一項化合物抑制瘤形成細(xì)胞生長的用途。
37.權(quán)利要求1的任何一種化合物抑制瘤形成細(xì)胞生長的用途。
38.權(quán)利要求2～13的任一項所述化合物在制備用于治療瘤形成癥狀的藥物中的用途。
39.權(quán)利要求14～18的任一項所述化合物在制備用于治療瘤形成癥狀的藥物中的用途。
40.權(quán)利要求19～22的任一項所述化合物在制備用于治療瘤形成癥狀的藥物中的用途。
41.權(quán)利要求37～40任一項的用途，其中所述瘤形成癥狀選自血癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、腎癌、結(jié)腸或者結(jié)腸直腸癌、前列腺癌和CNS癌癥。
42.一種商業(yè)包裝，包括權(quán)利要求1化合物或者其藥學(xué)上可接受的鹽或者前藥和描述使用化合物治療瘤形成癥狀的說明的書面文件。
43.一種商業(yè)包裝，包括權(quán)利要求2～13任一項所述的化合物或者其藥學(xué)上可接受的鹽或者前藥和描述使用化合物治療瘤形成癥狀的說明的書面文件。
44.一種商業(yè)包裝，包括權(quán)利要求14～18任一項所述的化合物或者其藥學(xué)上可接受的鹽或者前藥和描述使用化合物治療瘤形成癥狀的說明的書面文件。
45.一種商業(yè)包裝，包括權(quán)利要求19化合物或者其藥學(xué)上可接受的鹽或者前藥和描述使用化合物治療瘤形成癥狀的說明的書面文件。
46.一種商業(yè)包裝，包括權(quán)利要求19～22任一項所述的化合物或者其藥學(xué)上可接受的鹽或者前藥和描述使用化合物治療瘤形成癥狀的說明的書面文件。
全文摘要
本發(fā)明涉及式(I)所示的生物學(xué)活性二苯并二氮雜酮類似物，其中R1為直鏈C1－10烷基，和其中法呢基部分可以具有一個、兩個或者三個氫化或者氫化烷氧基化的雙鍵，或者其藥學(xué)上可接受的鹽或者前藥，還涉及包含這些化合物的藥物組合物、它們的生產(chǎn)方法和它們在制備用于治療瘤形成癥狀的藥物中的用途。
文檔編號C12N9/90GK101065365SQ20058004032
公開日2007年10月31日 申請日期2005年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月27日
發(fā)明者J·B·麥卡爾平, A·H·班斯科塔 申請人:伊科皮亞生物科學(xué)公司