專利名稱：α－淀粉酶家族酶的變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶的變異體，其中該變異體具有改變的水解活性和尤其是改變的內(nèi)/外淀粉酶活性。
一方面，本發(fā)明涉及酶的變異體，其中該變異體具有減弱的內(nèi)淀粉酶活性和可選的增強(qiáng)的水解活性。
另一方面，本發(fā)明涉及變異的酶-尤其是環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶(cyclodextringlycosyltrasferases)-其與參照和/或親代酶相比，具有增強(qiáng)的水解活性和減弱的內(nèi)淀粉酶活性，其中所述參照和/或親代是α-淀粉酶家族的成員。在此，環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶有時(shí)表示為CGTases。
更加特別的，本發(fā)明涉及變異的酶(尤其是CGTases)，其與參照和/或親代酶相比，具有增強(qiáng)的水解活性和減弱的內(nèi)淀粉酶活性，其中所述參照和/或親代是α-淀粉酶家族13的成員。
背景技術(shù)：
α-淀粉酶家族，或糖苷水解酶家族13(Henrissat，B.and Davies，G(1997)Curr.Opin.Struct.Biol.7，637-644)是一個(gè)大的淀粉加工酶(starchprocessing enzymes)家族。該家族中催化區(qū)域的(β/α)8((β/α)8-barrel)桶折疊、催化位點(diǎn)殘基以及α保留鍵分解機(jī)制是保守的(McCarter，J.D.and Withers，S.G.(1994)Curr.Opin.Struct.Biol.4，885-892；Uitdehaag，J.C.M.，et al.，(1999)Nature Struct.Biol.6，432-436)，但是產(chǎn)物和反應(yīng)特異性差異顯著(Kuriki，T.和Imanaka，T.(1999)J.Biosci.Bioeng.87，557-565)。
α-淀粉酶家族13包括酶例如環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶和α-淀粉酶(EC 3.2.1)，其中環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶也表示為環(huán)麥芽糖糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(cyclomaltodextrin glucanotransferase)或環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(cyclodextringlucanotransferase)(CGTase EC 2.4.1.19)。CGTase和α-淀粉酶是兩種類型的糖基化酶，其通過水解α-(1，4)-糖苷鍵降解淀粉，但是CGTase的初始分解產(chǎn)物主要是環(huán)狀寡糖(也稱為環(huán)糊精)，α-淀粉酶的是線性寡糖。
CGTases可以通過分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)催化淀粉及其類似物降解為環(huán)糊精，從而形成不同大小的環(huán)α-(1，4)連接的寡糖，其被稱為環(huán)狀糊精(也表示為CDs)。環(huán)α-(1，4)連接的寡糖(環(huán)狀糊精)由線性α-(1，4)連接的寡糖底物組成。
CGTases酶由五個(gè)結(jié)構(gòu)域(A-Z)組成；結(jié)構(gòu)域A和B組成催化結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域E涉及原始淀粉結(jié)合(Penninga，D.，et al.，(1996)J.Biol.Chem.271，32777-32784；Ohdan，K.，et al.(2000)Appl.Environ.Microbiol.66，3058-3064)，但是結(jié)構(gòu)域C和D的功能還不知道。結(jié)合于跨過幾個(gè)糖結(jié)合亞位點(diǎn)(標(biāo)記為-7到+2，

圖1)底物后，亞位點(diǎn)-1和+1之間的α-(1，4)糖苷鍵裂解以產(chǎn)生共價(jià)的糖基-酶中間產(chǎn)物，所述中間產(chǎn)物結(jié)合于供體亞位點(diǎn)(-1、-2、-3等)(Uitdehaag，J.C.et al.，(1999)Nature Struct.Biol.6，432-436)。在反應(yīng)的下一步中，受體分子結(jié)合到受體亞位點(diǎn)+1并且裂解糖基-酶鍵。
在環(huán)化反應(yīng)中，共價(jià)結(jié)合的糖的非還原末端被用作受體以產(chǎn)生環(huán)狀糊精。CGTase也可以以非常低的比例使用水或第二糖分子作為受體，其分別導(dǎo)致水解或歧化反應(yīng)，從而形成線性寡糖。
雖然α-淀粉酶是一種強(qiáng)水解酶，CGTase首先是一種轉(zhuǎn)糖基酶。CGTase的水解活性通常遠(yuǎn)低于其轉(zhuǎn)糖基活性。有報(bào)導(dǎo)顯示來自熱厭氧桿菌(Thernoanaerobacter)和熱產(chǎn)硫磺熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacteriumthermosulfurigenes)菌株EM1(Tubium)的CGTases具有相對(duì)高的水解活性，雖然其與α-淀粉酶相比仍然低很多(Norman and Jorgensen，1992，DenpunKagaku，39101-108；Wind et al.，1995，Apl Environm Microbiol.611257-1265)。
有人認(rèn)為CGTase酶的水解與轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)的相對(duì)效率取決于在反應(yīng)后一半時(shí)所使用的受體的性質(zhì)，并且從而取決于受體亞位點(diǎn)的性質(zhì)。在這方面，van der Veen及其同事報(bào)導(dǎo)了CGTase對(duì)葡萄糖基受體具有明顯的偏好，正如其轉(zhuǎn)糖基活性遠(yuǎn)高于水解活性(van der Veen，B.A.，et al.，(2000)Eur.J.Biochem.267，658-665)。在這方面，Nakamura等報(bào)導(dǎo)了含有保守的Phe184和Phe260殘基的+2底物結(jié)合亞位點(diǎn)對(duì)于轉(zhuǎn)糖基活性是重要的(Nakamura etal.，1994，biochemistry，339926-9936)。此外，Leemhuis等報(bào)導(dǎo)了位于位置260的氨基酸支鏈也調(diào)節(jié)CGTases的水解活性(Leemhius et al.，2002，F(xiàn)EBSletters 514189-192)。而且，他們報(bào)導(dǎo)了對(duì)Phe260進(jìn)行突變可以將CGTase從轉(zhuǎn)糖基酶改變?yōu)榈矸鬯饷浮?br> US-A-6482622公開了可根據(jù)商品名Novamyl購得的，來自芽孢桿菌屬(Bacillus)的麥芽(maltogenic)α淀粉酶，其與CGTases具有幾個(gè)相同的特征，包括序列同源性和轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)產(chǎn)物的構(gòu)成。CGTase變異體被描述為當(dāng)作用于淀粉時(shí)能夠形成線性寡糖。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了屬于α-淀粉酶家族的酶的新的酶變異體，及其核苷酸序列和含有或使用它的實(shí)施例。該變異體具有有用的活性。
CGTase編號(hào)在本發(fā)明中使用一種特殊的編號(hào)CGTase酶中氨基酸殘基位置的方式。
在這方面，通過比過不同已知CGTases的氨基酸序列，可以明確的分配CGTase氨基酸位置號(hào)給任意CGTase酶中的任意氨基酸殘基位置，CGT酶的氨基酸序列是已知的。
使用該編號(hào)系統(tǒng)，其起始于例如從環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)菌株251中獲得的CGTase的氨基酸序列，與大量其它已知CGTases的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，可以明確的指出CGTase中氨基酸殘基的位置。
該CGTase編號(hào)系統(tǒng)已經(jīng)記載于WO 96/33267，表1，第8-31頁中(環(huán)狀芽孢桿菌菌株251表示為a)。WO 96/33267的表1還顯示了大量相關(guān)CGTases的蛋白序列并在此引入作為參考。
在描述本發(fā)明產(chǎn)生或預(yù)期包括的不同CGTase變異體時(shí)，下述命名法將被使用以便于參考[原始氨基酸/依照編號(hào)系統(tǒng)的位置/取代的氨基酸]據(jù)此，位置230中丙氨酸替換為纈氨酸表示為A230V。
多個(gè)突變通過正斜杠標(biāo)志“/”分隔，如A230V/T514A表示在位置230和514上分別替換丙氨酸為纈氨酸和蘇氨酸為丙氨酸的突變。
本申請(qǐng)中通過CGTase編號(hào)表示的所有位置參考本文描述的環(huán)狀芽孢桿菌的CGTase編號(hào)。
即使其使用一個(gè)特殊序列作為基本參考點(diǎn)，該編號(hào)系統(tǒng)也可應(yīng)用于所有相關(guān)同源序列。蛋白間序列同源性可以使用已知的比對(duì)程序和本文中記載的雜交技術(shù)進(jìn)行確定。
在本發(fā)明的一些方面，僅有一個(gè)突變。在本發(fā)明的其它方面，存在兩個(gè)突變。在本發(fā)明的其它方面，存在三個(gè)突變。在本發(fā)明的其它方面，存在超過三個(gè)突變。
本發(fā)明的主要方面雖然外淀粉酶如淀粉葡糖苷酶和β-淀粉酶是完全外特異的，即它們實(shí)際上總是從非還原末端切割底物(如淀粉)，因而不具有內(nèi)活性(endo-activity)，其它淀粉酶-如麥芽α-淀粉酶-能夠從內(nèi)部切割淀粉，因而具有可變水平的外特異性(exo-specificity)。
在一個(gè)廣泛的方面，本發(fā)明涉及具有增強(qiáng)的外特異性的變異酶。
外特異性計(jì)量為總水解活性對(duì)內(nèi)活性的比率。由此得出結(jié)論具有增強(qiáng)的外特異性的變異體具有增強(qiáng)的總水解活性和/或減弱的內(nèi)活性。
在另一廣泛的方面，本發(fā)明提供變異的α-淀粉酶家族的酶，其在與相同條件下的參照和/或親代酶相比時(shí)，顯示增強(qiáng)的水解酶活性和/或減弱的內(nèi)活性。
在更進(jìn)一步的廣泛方面，本發(fā)明提供變異的α-淀粉酶家族成員-例如變異的CGTases或變異的麥芽α-淀粉酶-其在與參照和/或親代酶相比時(shí)具有增強(qiáng)的外特異性。
本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明多肽的核酸序列。
還提供含有本發(fā)明核酸序列的載體，其可操作的連接于能夠在合適宿主細(xì)胞中調(diào)控所述核苷酸序列表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。
還提供含有本發(fā)明核酸或載體的宿主細(xì)胞。
在另一方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包含用編碼目的多肽的核酸轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，表達(dá)所述多肽，可選的純化和/或分離所述多肽和可選的測(cè)試多肽的預(yù)期活性。
我們的結(jié)果顯示這些變體的多肽具有改進(jìn)的性質(zhì)，其使得它們適合于多種應(yīng)用例如烘烤。
還提供本發(fā)明的變體多肽在烘烤方面的應(yīng)用。
還提供處理淀粉的方法，其包括用本發(fā)明的變體酶接觸淀粉，使酶從淀粉中產(chǎn)生一種或多種線性底物和可選的對(duì)底物進(jìn)行分離和/或純化。
本發(fā)明的特別方面本發(fā)明的一些特別方面顯示于附隨的權(quán)利要求中。
例如，依照本發(fā)明的一個(gè)方面提供分離和/或純化的酶變異體，所述酶變異體在相對(duì)于參照酶的一個(gè)或多個(gè)下述位置(使用環(huán)狀芽孢桿菌CGTase編號(hào))或在α-淀粉酶家族其它同源成員的等同位置包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾位置230位置8位置21位置47位置94位置215位置232位置245位置259位置263位置299位置320位置357位置514位置633位置655位置660位置672；其中所述酶變異體與相同條件下的參照酶相比，在與淀粉一起孵育時(shí)具有較高的水解酶活性；其中所述參照酶是α-淀粉酶家族成員。
參照酶不具有一個(gè)或多個(gè)相應(yīng)的氨基酸修飾。優(yōu)選的，參照酶不具有所有的相應(yīng)氨基酸修飾(即變異體的所有修飾)。
可選的加以表達(dá)，依照本發(fā)明的一個(gè)方面提供分離和/或純化的酶變異體，所述酶變異體在一個(gè)或多個(gè)下述位置(使用環(huán)狀芽孢桿菌CGTase編號(hào))或在α-淀粉酶家族其它同源成員的等同位置通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾而與參照酶有所不同
位置230位置8位置21位置47位置94位置215位置232位置245位置259位置263位置299位置320位置357位置514位置633位置655位置660位置672；并且其中所述酶變異體與相同條件下的參照酶相比，在與淀粉一起孵育時(shí)具有較高的水解酶活性；其中所述參照酶是α-淀粉酶家族成員。
參照酶不具有一個(gè)或多個(gè)相應(yīng)的氨基酸修飾。優(yōu)選的，參照酶不具有所有的相應(yīng)氨基酸修飾(即變異體的所有修飾)。
酶變異體可以自然出現(xiàn)?？蛇x的，酶變異體可以重新制備或可以通過修飾參照和/或親代酶進(jìn)行制備。
如此，依照本發(fā)明的更進(jìn)一步的方面提供來源于親代酶的分離和/或純化的酶變異體，其親代酶是α-淀粉酶家族成員，其中所述酶變異體于一個(gè)或多個(gè)下述相對(duì)于親代酶的位置(使用環(huán)狀芽孢桿菌CGTase編號(hào))或在α-淀粉酶家族其它同源成員中的等同位置包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾
位置230位置8位置21位置47位置94位置215位置232位置245位置259位置263位置299位置320位置357位置514位置633位置655位置660位置672；并且和其中所述酶變異體與相同條件下的親代酶相比，在與淀粉一起孵育時(shí)具有較高的水解酶活性；本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及制備酶變異體的方法；其中所述方法包含表達(dá)編碼所述酶變異體的變異核苷酸序列；其中所述酶變異體在相對(duì)于參照酶的一個(gè)或多個(gè)下述位置(使用環(huán)狀芽孢桿菌CGTase編號(hào))或在α-淀粉酶家族其它同源成員的等同位置包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾位置230位置8位置21位置47位置94位置215
位置232位置245位置259位置263位置299位置320位置357位置514位置633位置655位置660位置672；其中所述酶變異體與相同條件下的參照酶相比，在與淀粉一起孵育時(shí)具有較高的水解酶活性；其中所述參照酶是α-淀粉酶家族成員。
參照酶不具有一個(gè)或多個(gè)相應(yīng)的氨基酸修飾。優(yōu)選的，參照酶不具有所有的相應(yīng)氨基酸修飾(即變異體的所有修飾)。
可選的進(jìn)行表達(dá)，依照本發(fā)明的一個(gè)方面提供制備酶變異體的方法，其中所述方法包括表達(dá)編碼所述酶變異體的變體核苷酸序列；其中所述酶變異體在一個(gè)或多個(gè)下述位置(使用環(huán)狀芽孢桿菌CGTase編號(hào))或在α-淀粉酶家族其它同源成員的等同位置通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾而與參照酶有所不同位置230位置8位置21位置47位置94位置215位置232位置245位置259
位置263位置299位置320位置357位置514位置633位置655位置660位置672；并且其中所述酶變異體與相同條件下的參照酶相比，在與淀粉一起孵育時(shí)具有較高的水解酶活性；其中所述參照酶是α-淀粉酶家族成員。
參照酶不具有一個(gè)或多個(gè)相應(yīng)的氨基酸修飾。優(yōu)選的，參照酶不具有所有的相應(yīng)氨基酸修飾(即變異體的所有修飾)。
變體核苷酸序列可以自然出現(xiàn)?？蛇x的，變體核苷酸序列可以重新制備或可以通過修飾親代核苷酸序列酶進(jìn)行制備。
如此，依照本發(fā)明的更進(jìn)一步的方面提供制備酶變異體的方法；其中所述方法包含表達(dá)編碼所述酶變異體的變體核苷酸序列；其中所述變體核苷酸序列可通過對(duì)親代核苷酸序列進(jìn)行突變獲得，其中所述親代核苷酸序列編碼親代酶；其中親代酶是α-淀粉酶家族成員；其中所述酶變異體與相同條件下的親代酶相比，在與淀粉一起孵育時(shí)具有較高的水解酶活性；其中所述酶變異體于一個(gè)或多個(gè)下述相對(duì)于親代酶的位置(使用環(huán)狀芽孢桿菌CGTase編號(hào))或在α-淀粉酶家族其它同源成員中的等同位置包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾位置230位置8位置21位置47位置94位置215位置232
位置245位置259位置263位置299位置320位置357位置514位置633位置655位置660位置672；依照本發(fā)明的更進(jìn)一步的方面提供制備酶變異體的方法；所述方法包含表達(dá)編碼所述酶變異體的變體核苷酸序列；其中所述變體核苷酸序列通過對(duì)參照核苷酸序列進(jìn)行突變獲得，其中所述參照核苷酸序列編碼參照酶；其中參照酶是α-淀粉酶家族成員；其中所述酶變異體與相同條件下的參照酶相比，在與淀粉一起孵育時(shí)具有較低的水解酶活性；其中所述酶變異體于一個(gè)或多個(gè)下述相對(duì)于親代酶的位置(使用環(huán)狀芽孢桿菌CGTase編號(hào))或在α-淀粉酶家族其它同源成員中的等同位置包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾位置230位置8位置21位置47位置94位置215位置232位置245位置259位置263位置299位置320
位置357位置514位置633位置655位置660位置672；并且其中所述酶變異體與相同條件下的參照酶相比，在與淀粉一起孵育時(shí)具有更高的水解酶活性；其中所述參照酶是α-淀粉酶家族成員。
參照酶不具有一個(gè)或多個(gè)相應(yīng)的氨基酸修飾。優(yōu)選的，參照酶不具有所有的相應(yīng)氨基酸修飾(即變異體的所有修飾)。
可選的加以表達(dá)，依照本發(fā)明的一個(gè)方面提供制備酶變異體的方法；所述方法包含表達(dá)編碼所述酶變異體的變體核苷酸序列；其中所述變體核苷酸序列通過對(duì)參照核苷酸序列進(jìn)行突變獲得，其中所述參照核苷酸序列編碼參照酶；其中參照酶是α-淀粉酶家族成員；其中所述酶變異體與相同條件下的參照酶相比，在與淀粉一起培養(yǎng)時(shí)具有更低的水解酶活性；并且其中所述酶變異體在一個(gè)或多個(gè)下述位置(使用環(huán)狀芽孢桿菌CGTase編號(hào))或在α-淀粉酶家族其它同源成員的等同位置通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾而與參照酶有所不同位置230位置8位置21位置47位置94位置215位置232位置245位置259位置263位置299位置320
位置357位置514位置633位置655位置660位置672；其中所述酶變異體與相同條件下的參照酶相比，在與淀粉一起培養(yǎng)時(shí)具有較高的水解酶活性；其中所述參照酶是α-淀粉酶家族成員。
參照酶不具有一個(gè)或多個(gè)相應(yīng)的氨基酸修飾。優(yōu)選的，參照酶不具有所有的相應(yīng)氨基酸修飾(即變異體的所有修飾)。
變體核苷酸序列可以自然出現(xiàn)?？蛇x的，變體核苷酸序列可以重新制備或可以通過修飾親代核苷酸序列酶進(jìn)行制備。
如此，依照本發(fā)明的更進(jìn)一步的方面提供制備酶變異體的方法；所述方法包含表達(dá)編碼所述酶變異體的變體核苷酸序列；其中所述變體核苷酸序列通過對(duì)親代核苷酸序列進(jìn)行突變獲得，其中所述親代核苷酸序列編碼親代酶；其中親代酶是α-淀粉酶家族成員；其中所述酶變異體與相同條件下的親代酶相比，在與淀粉培養(yǎng)方面具有更低的水解酶活性；其中所述酶變異體于一個(gè)或多個(gè)下述相對(duì)于親代酶的位置(使用環(huán)狀芽孢桿菌CGTase編號(hào))或在α-淀粉酶家族其它同源成員中的等同位置包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾位置230位置8位置21位置47位置94位置215位置232位置245位置259位置263
位置299位置320位置357位置514位置633位置655位置660位置672。
參照酶本文中所使用的術(shù)語“參照酶”表示具有與所得到的變異體相近，優(yōu)選最相近化學(xué)結(jié)構(gòu)的酶。參照酶可以是前體酶(即實(shí)際上被突變的酶)或其可重新制備。參照酶可以是野生型酶。
本文中所使用的術(shù)語“前體”表示根據(jù)本發(fā)明方法進(jìn)行修飾之前的酶。如此，前體可以是通過本發(fā)明的誘變進(jìn)行修飾的酶。同樣的，前體可以是野生型酶、變體野生型酶或已經(jīng)被突變的酶。
術(shù)語“野生型”是本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的專業(yè)術(shù)語，表示物種大部分天然存在的成員所特有的表型(phenotype)，其與突變體的表型相對(duì)。如此，在本文中，野生型酶是天然存在于相關(guān)物種大部分成員中的酶的形式。通常，涉及本發(fā)明變體多肽的相關(guān)野生型酶在序列同源性方面是最相關(guān)的對(duì)應(yīng)的野生型酶。
然而，特別的野生型序列被用作產(chǎn)生本發(fā)明變體多肽的基礎(chǔ)時(shí)，其將是對(duì)應(yīng)的野生型序列，無論是否存在其它在氨基酸序列同源性方面更加相近的野生型序列。
在本發(fā)明特殊方面的上下文中，參照酶的例子包括野生型環(huán)狀芽孢桿菌菌株251、熱產(chǎn)硫磺熱厭氧桿菌菌株(Tabium或Novamyl序列，其如SEQID 4、SEQ ID 5或SED ID 6或圖5所示。
參照核苷酸序列本文中使用的術(shù)語“參照核苷酸序列”表示編碼參照酶的序列。
親代酶本文中所使用的術(shù)語“親代酶”表示具有與所得到的變異體相近，優(yōu)選最相近化學(xué)結(jié)構(gòu)的酶。親代酶一般是前體酶(即實(shí)際上被突變的酶)或其可重新制備。親代酶可以是野生型酶。
本文中所使用的術(shù)語“前體”表示根據(jù)本發(fā)明方法進(jìn)行修飾之前的酶。如此，前體可以是通過本發(fā)明的誘變進(jìn)行修飾的酶。同樣的，前體可以是野生型酶、變體野生型酶或已經(jīng)突變的酶。
術(shù)語“野生型”是本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的專業(yè)術(shù)語，表示物種大部分天然存在的成員特有的表型，其與突變體的表型相對(duì)。如此，在本文中，野生型酶是天然存在于相關(guān)物種大部分成員中的酶的形式。通常，涉及本發(fā)明變體多肽的相關(guān)野生型酶在序列同源性方面是最相關(guān)的對(duì)應(yīng)的野生型酶。
然而，特別的野生型序列被用作產(chǎn)生本發(fā)明變體多肽的基礎(chǔ)時(shí)，其將是對(duì)應(yīng)的野生型序列，無論是否存在其它的氨基酸序列同源性方面更加相近的野生型序列。
在本發(fā)明特殊方面的上下文中，親代酶的例子包括野生型環(huán)狀芽孢桿菌菌株251、熱產(chǎn)硫磺熱厭氧桿菌菌株(Tabium或Novamyl序列，其如SEQID 4、SEQ ID 5或SEQ ID 6或圖5所示。
親代核苷酸序列本文中所使用的術(shù)語“親代核苷酸序列”表示編碼親代酶的序列。
本發(fā)明的優(yōu)選方面本發(fā)明的優(yōu)選方面記載于此處和權(quán)利要求中。
本發(fā)明特別優(yōu)選的方面在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明提供與參照和/或親代酶相比，具有增強(qiáng)的水解酶活性和減弱的內(nèi)淀粉酶活性的變體CGTase多肽，其與參照和/或親代酶比較(即相對(duì)于參照和/或親代酶)時(shí)，含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾。
在另一特殊的優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明提供具有增強(qiáng)的水解酶活性和/或減弱的內(nèi)淀粉酶活性的變體CGTase多肽，其來源于參照和/或親代CGTase，因而該變體CGTase在如本文所列或環(huán)狀芽孢桿菌菌株251的SEQ ID No 4所示的任意一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基編號(hào)或它們?cè)谄渌碈GTase多肽中的相當(dāng)位置摻入(見圖5)。
在又另一優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明提供與參照和/或親代酶相比，具有改變的淀粉水解酶活性和改變的內(nèi)淀粉酶活性的變體麥芽α-淀粉酶Novamyl，其在如本文所列或Novamyl酶的SEQ ID No 6所示的任意一個(gè)氨基酸殘基編號(hào)或它們?cè)谄渌贷溠喀?淀粉酶多肽的相當(dāng)位置含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾。參照和/或親代麥芽α-淀粉酶Novamyl分離自芽孢桿菌任意的種(EP 120 693)，并且是Novo Nordisk A/S，Denmark的可商購產(chǎn)品。
優(yōu)選的，該修飾是氨基酸取代。
優(yōu)選的，這些取代選自氨基酸A230V、F21L、R47L、R47W、N94S、K232L、A245T、F259E、F259I、E264A、A357T、Y633A，其使用環(huán)狀芽孢桿菌CGTase編號(hào)和它們?cè)谄渌炊嚯闹械南喈?dāng)位置。
優(yōu)選的，這些取代是多重取代，包含氨基酸A230V以及F21L、R47L、R47W、N94S、K232L、A245T、F259E、F259I、E264A、A357T、Y633A中的一個(gè)或多個(gè)，其使用環(huán)狀芽孢桿菌CGTase編號(hào)和它們?cè)谄渌炊嚯闹械南喈?dāng)位置。
優(yōu)選的，該取代包括氨基酸A230V和F259I的結(jié)合(即A230V/F259I)，其使用環(huán)狀芽孢桿菌CGTase編號(hào)和它們?cè)谄渌炊嚯闹械南喈?dāng)位置。
本發(fā)明的一般方面我們通過誘變技術(shù)如隨機(jī)誘變技術(shù)設(shè)計(jì)和測(cè)試不同的α-淀粉酶家族成員以證明可以產(chǎn)生具有增強(qiáng)的淀粉水解酶活性和減弱的內(nèi)淀粉酶活性的酶。
因此，在本發(fā)明的特殊方面，通過使用誘變技術(shù)我們?cè)O(shè)法將α-淀粉酶家族成員從內(nèi)淀粉酶轉(zhuǎn)化為外作用的酶。
特別的，我們鑒定了家族13α-淀粉酶(Family 13α-amylases)中許多特異的氨基酸殘基，其能夠影響內(nèi)特異性轉(zhuǎn)化(endospecificity conversion)的程度。
通過術(shù)語“內(nèi)特異性轉(zhuǎn)化”，我們指家族13α-淀粉酶變異體的生物化學(xué)性質(zhì)完全或部分改變，例如參照和/或親代酶的主要內(nèi)淀粉酶活性被完全或部分誘導(dǎo)以作為外作用的酶。測(cè)試本發(fā)明變異體的生物化學(xué)性質(zhì)可以如實(shí)施例中記載的進(jìn)行。
作為高優(yōu)選方面，本發(fā)明提供α-淀粉酶家族的酶變異體，其于一個(gè)或多個(gè)下述位置含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾(使用環(huán)狀芽孢桿菌CGTase編號(hào))230和可選的21、47、94、232、245、259、264、357或633中的一個(gè)或多個(gè)或它們?cè)讦?淀粉酶家族其它同源的成員中的相當(dāng)位置。本發(fā)明還提供編碼同一變異體的多核苷酸序列。
在另一更加高優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供源自參照和/或親代麥芽α-淀粉酶(Novamyl)的麥芽α-淀粉酶變異體，其于一個(gè)或多個(gè)下述位置含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾(使用環(huán)狀芽孢桿菌CGTase編號(hào))230和可選的在21、47、94、232、245、259、264、357或633中的一個(gè)或多個(gè)或它們?cè)谄渌疵钢械南喈?dāng)位置。本發(fā)明還提供編碼同一變異體的多核苷酸序列。
在另一更加優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供源自參照和/或親代麥芽α-淀粉酶(Novamyl)的麥芽α-淀粉酶變異體，其含有修飾，所述修飾位于使用環(huán)狀芽孢桿菌菌株251編號(hào)的氨基酸230與21、47、94、232、245、259、264、357或633中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的組合，或它們?cè)谄渌炊嚯闹械牡葍r(jià)物。本發(fā)明還提供編碼同一變異體的多核苷酸序列。
在另一更加優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供源自參照和/或親代麥芽α-淀粉酶(Novamyl，SEQ ID 6)的麥芽α-淀粉酶變異體，其含有修飾，所述修飾位于使用環(huán)狀芽孢桿菌CGTase編號(hào)的氨基酸230與氨基酸259的組合(即230/259)或它們?cè)谄渌炊嚯闹械牡葍r(jià)物。本發(fā)明還提供編碼同一變異體的多核苷酸序列。
α-淀粉酶家族α-淀粉酶家族包括超過27種不同的酶特異性，包括水解酶(EC 3)、轉(zhuǎn)移酶(EC 2)和異構(gòu)酶(EC 5)。它們屬于三個(gè)糖苷水解酶家族13、70和77，基于總體氨基酸序列同源性和特別是催化位點(diǎn)、三維結(jié)構(gòu)相似性和催化位點(diǎn)的幾何學(xué)，形成GH-H族(McCarter，J.D.and Withers，S.G.(1994)Curr.Opin.Struct.Biol.4，885-892；Uitdehaag，J.C.M.，et al.，(1999)Nature Struct.Biol.6，432-436)。從接近100種不同生物體中已報(bào)導(dǎo)有α-淀粉酶家族成員，其中包括真菌和細(xì)菌以及其它生物體。
本文中所使用的術(shù)語“α-淀粉酶家族”意圖表示α-淀粉酶蛋白家族，其如本文所描述的包括不同類型的酶如水解酶、轉(zhuǎn)移酶、異構(gòu)酶以及蛋白(見表和本文)。上述術(shù)語應(yīng)區(qū)別于術(shù)語“α-淀粉酶”，其表示屬于α-淀粉酶家族的特別的酶類，即水解酶類。
在本發(fā)明方面特別感興趣的是分類于家族13(Family 13)的酶。除了別的酶以外，該酶的家族還包括轉(zhuǎn)移酶的酶類，例如環(huán)式糊精糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)和水解酶類例如麥芽α-淀粉酶(見表A)。
表A.α-淀粉酶蛋白家族



CGTase在高優(yōu)選的方面，本發(fā)明所使用的參照和/或親代CGTase是分類在EC2.4.1.19的酶。它可以從任何來源中獲得，例如從細(xì)菌來源中，其包括但不限于芽孢桿菌(Bacillus)、熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter)、克雷伯桿菌(Klebsiella)、棒狀桿菌(Corynebacterium)、短桿菌(Brevibacterium)、梭狀芽孢桿菌(Clostridium)、微球菌Micrococcus和熱厭氧桿菌Thermoanaerobacterium。
參照和/或親代CGTase優(yōu)選具有一個(gè)或多個(gè)下述特征。
i)氨基酸與SEQ ID No 4或5有至少50％，優(yōu)選至少60％，優(yōu)選至少70％，優(yōu)選至少80％，優(yōu)選至少90％，優(yōu)選至少95％，優(yōu)選至少98％，優(yōu)選至少99％的序列同源性。
ii)其由可在本文所述條件下與如SEQ ID 4或5所示的分別編碼環(huán)狀芽孢桿菌菌株251或熱產(chǎn)硫磺熱厭氧桿菌菌株(Tabium)的CGTases的核苷酸序列雜交的核苷酸序列編碼。
iii)其明顯偏愛葡萄糖基受體且其轉(zhuǎn)糖基酶活性遠(yuǎn)高于其水解酶活性。
iv)其內(nèi)淀粉酶活性遠(yuǎn)高于其外淀粉酶活性。
麥芽α-淀粉酶本發(fā)明中所使用的參照和/或親代麥芽α-淀粉酶是分類在EC 3.2.1.133的酶。該酶的催化活性需要底物的非還原末端，并且主要酶活性導(dǎo)致支鏈淀粉和直鏈淀粉降解為麥芽糖和其它線性麥芽糖糊精。該酶也能夠?qū)⒅辨湹矸酆椭ф湹矸鬯鉃棣翗?gòu)型的麥芽糖。此外，該酶也能夠以低水平水解麥芽三糖以及環(huán)糊精。
本發(fā)明中所使用的優(yōu)選的參照和/或親代麥芽α-淀粉酶是如EP 120 693中所述的克隆自芽孢桿菌種的淀粉酶(商品名為Novamyl)。Novamyl具有SEQ ID 6所顯示的氨基酸序列，并且由芽孢桿菌種菌株NCIB 11837編碼。
內(nèi)淀粉酶通過術(shù)語“內(nèi)淀粉酶”，我們表示具有顯著的從還原末端即內(nèi)部分解淀粉的能力的酶。然而，該酶不必只具有該活性，其可以具有其它活性。一般，其它活性包括顯著的糖基轉(zhuǎn)移酶活性和/或水解酶活性和/或外淀粉酶活性。如果存在外淀粉酶活性，優(yōu)選其低于-優(yōu)選遠(yuǎn)低于-糖基轉(zhuǎn)移酶活性和/或水解酶活性。
外淀粉酶通過術(shù)語“外淀粉酶”，我們表示具有顯著的從非還原末端即分子末端分解淀粉的能力的酶。然而，該酶不必只具有該活性，其可以具有其它活性。一般，其它活性包括顯著的糖基轉(zhuǎn)移酶活性和/或水解和/或內(nèi)淀粉酶活性。如果存在內(nèi)淀粉酶活性，優(yōu)選其低于-優(yōu)選遠(yuǎn)低于-糖基轉(zhuǎn)移酶活性和/或水解酶活性。
水解酶通過術(shù)語“水解酶”，我們表示具有顯著的淀粉水解酶活性的酶。然而，該酶不必只具有該活性，其可以具有其它活性。一般，其它活性不包括顯著的糖基轉(zhuǎn)移酶活性。如果存在糖基轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選其低于-優(yōu)選遠(yuǎn)低于-水解酶活性。
糖基轉(zhuǎn)移酶活性通過術(shù)語“糖基轉(zhuǎn)移酶”，我們表示具有顯著的淀粉糖基轉(zhuǎn)移酶活性的酶。然而，該酶不必只具有該活性，其可以具有其它活性。一般，其它活性不包括顯著的水解酶活性。如果存在水解酶活性，優(yōu)選其低于-優(yōu)選遠(yuǎn)低于-糖基轉(zhuǎn)移酶活性。
氨基酸在本發(fā)明的上下文中，使用下列氨基酸殘基的符號(hào)和縮寫。
A Ala丙氨酸B Ast天冬氨酸(Aspartate)C Cys半胱氨酸
D Asp天冬氨酸(Aspartin acid)E Glu谷氨酸F Phe苯丙氨酸G Gly甘氨酸H His組氨酸I Ile異亮氨酸K Lys賴氨酸L Leu亮氨酸M Met甲硫氨酸N Asn天冬酰胺P Pro脯氨酸Q Gln谷氨酰胺(Glutamine)R Arg精氨酸S Ser絲氨酸T Thr蘇氨酸V Val纈氨酸W Trp色氨酸Y Tyr酪氨酸Z Gln谷氨酸(Glutamate)X是任意非芳香族氨基酸即非Y、F或W，(除非另外說明)。
序列表(也可在圖后找到)在說明書和權(quán)利要求書中至少參考以下序列SEQ ID 11CDG環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶變體(E.C.2.4.1.19)(CGTase)——環(huán)狀芽孢桿菌菌株251
APDTSVSNKQNFSTDVIYQIFTDRFSDGNPANNPTGAAFDGTCTNLRLYCGGDWQGIINKINDGYLTGMGVTAIWISQPVENIYSIINYSGVNNTAYHGYWARDFKKTNPAYGTIADFQNLIAAAHAKNIKVIIDFAPNHTSPASSDQPSFAENGRLYDNGTLLGGYTNDTQNLFHHNGGTDFSTTENGIYKNLYDLADLNHNNSTVDVYLKDAIKMWLDLGIDGIRMDVVKHMPFGWQKSFMAAVNNYKPVFTFGEWFLGVNEVSPENHKFANESGMSLLDFRFAQKVRQVFRDNTDNMYGLKAMLEGSAADYAQVDDQVTFIDNHDMERFHASNANRRKLEQALAFTLTSRGVPAIYYGTEQYMSGGTDPDNRARIPSFSTSTTAYQVIQKLAPLRKCNPAIAYGSTQERWINNDVLIYERKFGSNVAVVAVNRNLNAPASISGLVTSLPQGSYNDVLGGLLNGNTLSVGSGGAASNFTLAAGGTAVWQYTAATATPTIGHVGPMMAKPGVTITIDGRGFGSSKGTVYFGTTAVSGADITSWEDTQIKVKIPAVAGGNYNIKVANAAGTASNVYDNFEVLSGDQVSVRFVVNNATTALGQNVYLTGSVSELGNWDPAKAIGPMYNQVVYQYPNWYYDVSVPAGKTIEFKFLKKQGSTVTWEGGSNHTFTAPSSGTATINVNWQPSEQ ID 21CIU環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶變體(Tabium)ASDTAVSNVVNYSTDVIYQIVTDRFVDGNTSNNPTGDLYDPTHTSLKKYFGGDWQGIINKINDGYLTGMGVTAIWISQPVENIYAVLPDSTFGGSTSYHGYWARDFKRTNPYFGSFTDFQNLINTAHAHNIKVIIDFAPNHTSPASETDPTYAENGRLYDNGTLLGGYTNDTNGYFHHYGGTDFSSYEDGIYRNLFDLADLNQQNSTIDSYLKSAIKVWLDMGIDGIRLDVVKHMPFGWQKNFMDSILSYRPVFTFGEWFLGTNEIDVNNTYFANESGMSLLDFRFSQKVRQVFRDNTDTMYGLDSMIQSTASDYNFINDMVTFIDNHDMDRFYNGGSTRPVEQALAFTLTSRGVPAIYYGTEQYMTGNGDPYNRAMMTSFNTSTTAYNVIKKLAPLRKSNPAIAYGTTQQRWINNDVYIYERKFGNNVALVAINRNLSTSYNITGLYTALPAGTYTDVLGGLLNGNSISVASDGSVTPFTLSAGEVAVWQYVSSSNSPLIGHVGPTMTKAGQTITIDGRGFGTTSGQVLFGSTAGTIVSWDDTEVKVKVPSVTPGKYNISLKTSSGATSNTYNNINILTGNQICVRFVVNNASTVYGENVYLTGNVAELGNWDTSKAIGPMFNQVVYQYPTWYYDVSVPAGTTIQFKFIKKNGNTITWEGGSNHTYTVPSSSTGTVIVNWQQSEQ ID 31QHO麥芽α-淀粉酶變體SSSASVKGDVIYQIIIDRFYDGDTTNNNPAKSYGLYDPTKSKWKMYWGGDLEGVRQKLPYLKQLGVTTIWLSPVLDNLDTLAGTDNTGYHGYWTRDFKQIEEHFGNWTTFDTLVNDAHQNGIKVIVDFVPNHSTPFKANDSTFAEGGALYNNGTYMGNYFDDATKGYFHHNGDISNWDDRYEAQWKNFTDPAGFSLADLSQENGTIAQYLTDAAVQLVAHGADGLRIDVVKHFNSGFSKSLADKLYQKKDIFLVGEWYGDDPGTANHLEKVRYANNSGVNVLDFDLNTVIRNVFGTFTQTMYDLNNMVNQTGNEYKYKENLITFIDNHDMSRFLSVNSNKANLHQALAFILTSRGTPSIYYGTEQYMAGGNDPYNRGMMPAFDTTTTAFKEVSTLAGLRRNNAAIQYGTTTQRWINNDVYIYERKFFNDVVLVAINRNTQSSYSISGLQTALPNGSYADYLSGLLGGNGISVSNGSVASFTLAPGAVSVWQYSTSASAPQIGSVAPNMGIPGNVVTIDGKGFGTTQGTVTFGGVTATVKSWTSNRIEVYVPNMAAGLTDVKVTAGGVSSNLYSYNILSGTQTSVVFTVKSAPPTNLGDKIYLTGNIPELGNWSTDTSGAVNNAQGPLLAPNYPDWFYVFSVPAGKTIQFKFFIKRADGTIQWENGSNHVATTPTGATGNITVTWQNSEQ ID 41CDG環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶變體(E.C.2.4.1.19)(CGTase)——環(huán)狀芽孢桿菌菌株251
APDTSVSNKQNFSTDVIYQIFTDRFSDGNPANNPTGAAFDGTCTNLRLYCGGDWQGIINKINDGYLTGMGVTAIWISQPVENIYSIINYSGVNNTAYHGYWARDFKKTNPAYGTIADFQNLIAAAHAKNIKVIIDFAPNHTSPASSDQPSFAENGRLYDNGTLLGGYTNDTQNLFHHNGGTDFSTTENGIYKNLYDLADLNHNNSTVDVYLKDAIKMWLDLGIDGIRMDAVKHMPFGWQKSFMAAVNNYKPVFTFGEWFLGVNEVSPENHKFANESGMSLLDFRFAQKVRQVFRDNTDNMYGLKAMLEGSAADYAQVDDQVTFIDNHDMERFHASNANRRKLEQALAFTLTSRGVPAIYYGTEQYMSGGTDPDNRARIPSFSTSTTAYQVIQKLAPLRKCNPAIAYGSTQERWINNDVLIYERKFGSNVAVVAVNRNLNAPASISGLVTSLPQGSYNDVLGGLLNGNTLSVGSGGAASNFTLAAGGTAVWQYTAATATPTIGHVGPMMAKPGVTITIDGRGFGSSKGTVYFGTTAVSGADITSWEDTQIKVKIPAVAGGNYNIKVANAAGTASNVYDNFEVLSGDQVSVRFVVNNATTALGQNVYLTGSVSELGNWDPAKAIGPMYNQVVYQYPNWYYDVSVPAGKTIEFKFLKKQGSTVTWEGGSNHTFTAPSSGTATINVNWQPSEQ ID 51CIU環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶(Tabium)ASDTAVSNVVNYSTDVIYQIVTDRFVDGNTSNNPTGDLYDPTHTSLKKYFGGDWQGIINKINDGYLTGMGVTAIWISQPVENIYAVLPDSTFGGSTSYHGYWARDFKRTNPYFGSFTDFQNLINTAHAHNIKVIIDFAPNHTSPASETDPTYAENGRLYDNGTLLGGYTNDTNGYFHHYGGTDFSSYEDGIYRNLFDLADLNQQNSTIDSYLKSAIKVWLDMGIDGIRLDAVKHMPFGWQKNFMDSILSYRPVFTFGEWFLGTNEIDVNNTYFANESGMSLLDFRFSQKVRQVFRDNTDTMYGLDSMIQSTASDYNFINDMVTFIDNHDMDRFYNGGSTRPVEQALAFTLTSRGVPAIYYGTEQYMTGNGDPYNRAMMTSFNTSTTAYNVIKKLAPLRKSNPAIAYGTTQQRWINNDVYIYERKFGNNVALVAINRNLSTSYNITGLYTALPAGTYTDVLGGLLNGNSISVASDGSVTPFTLSAGEVAVWQYVSSSNSPLIGHVGPTMTKAGQTITIDGRGFGTTSGQVLFGSTAGTIVSWDDTEVKVKVPSVTPGKYNISLKTSSGATSNTYNNINILTGNQICVRFVVNNASTVYGENVYLTGNVAELGNWDTSKAIGPMFNQVVYQYPTWYYDVSVPAGTTIQFKFIKKNGNTITWEGGSNHTYTVPSSSTGTVIVNWQQSEQ ID 61QHO麥芽α-淀粉酶SSSASVKGDVIYQIIIDRFYDGDTTNNNPAKSYGLYDPTKSKWKMYWGGDLEGVRQKLPYLKQLGVTTIWLSPVLDNLDTLAGTDNTGYHGYWTRDFKQIEEHFGNWTTFDTLVNDAHQNGIKVIVDFVPNHSTPFKANDSTFAEGGALYNNGTYMGNYFDDATKGYFHHNGDISNWDDRYEAQWKNFTDPAGFSLADLSQENGTIAQYLTDAAVQLVAHGADGLRIDAVKHFNSGFSKSLADKLYQKKDIFLVGEWYGDDPGTANHLEKVRYANNSGVNVLDFDLNTVIRNVFGTFTQTMYDLNNMVNQTGNEYKYKENLITFIDNHDMSRFLSVNSNKANLHQALAFILTSRGTPSIYYGTEQYMAGGNDPYNRGMMPAFDTTTTAFKEVSTLAGLRRNNAAIQYGTTTQRWINNDVYIYERKFFNDVVLVAINRNTQSSYSISGLQTALPNGSYADYLSGLLGGNGISVSNGSVASFTLAPGAVSVWQYSTSASAPQIGSVAPNMGIPGNVVTIDGKGFGTTQGTVTFGGVTATVKSWTSNRIEVYVPNMAAGLTDVKVTAGGVSSNLYSYNILSGTQTSVVFTVKSAPPTNLGDKIYLTGNIPELGNWSTDTSGAVNNAQGPLLAPNYPDWFYVFSVPAGKTIQFKFFIKRADGTIQWENGSNHVATTPTGATGNITVTWQNSEQ ID 7F1(XhoI)引物
GCGCCGGATACCTCGAGTTCCAACAAGCAAAATTTCSEQ ID 8R1(KpnI)引物CCAATTCACGTTAATGGTACCGGTGCCGCTGGACGGSEQ ID 9F21L引物ATCTATCAAATTTTGACCGACAGGTTTSEQ ID 10R47W引物ACGAACCTCTGGCTGTATTGCSEQ ID 11N94S引物TCCGGCGTGAACAGCACGGCCTATSEQ ID 12A245T引物TTTATGGCTACCGTCAACAACSEQ ID 13Q320L引物GTGGATGACCTGGTGACGTTCSEQ ID 14A357T引物GGCGTCCCCACCATTTATTACSEQ ID 15V660A引物
GGATCCACCGCCACGTGGGAASEQ ID 16A231V引物ATACGTCTAGATGTTGTAAAACATATGSEQ ID 17A230X引物ATCCGCATGGATNNSGTGAAGCATATGN為A+G+C+T，S為G+C，并且X是任何氨基酸殘基。
氨基酸序列本發(fā)明還包括具有如本文所述的特殊性質(zhì)的變體酶的氨基酸序列。
如本文所應(yīng)用的，術(shù)語“氨基酸序列”是術(shù)語“多肽”和/或術(shù)語“蛋白質(zhì)”的同義詞。在某些情況下，術(shù)語“氨基酸序列”是術(shù)語“肽”的同義詞。在某些情況下，術(shù)語“氨基酸序列”是術(shù)語“酶”的同義詞。
本發(fā)明的氨基酸序列可以從合適的來源中制備和/或分離得到，或者可以通過合成制得或者可以通過采用重組DNA技術(shù)制備。
本發(fā)明的變體酶可以與其它的酶聯(lián)合使用。因此本發(fā)明還包括酶的組合，其中所述組合包括本發(fā)明的變體酶和另外一種酶，其可以是本發(fā)明的另外一種酶。這方面將在后面的部分中討論。
優(yōu)選變體酶不是天然酶。在這點(diǎn)上，術(shù)語“天然酶”是指在自然環(huán)境下的全酶并且其由其天然核苷酸序列表達(dá)。
變體本發(fā)明提供新的α-淀粉酶家族變體多肽，即具有在自然中未發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列的α-淀粉酶家族變體。正式地來說，本發(fā)明地α-淀粉酶變異體可以被看作是參照和/或親代α-淀粉酶家族酶(如本文所定義的)的功能性衍生物，其通過參照和/或親代酶的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、插入和/或缺失獲得。多肽序列的修飾可以采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實(shí)施，諸如定點(diǎn)突變和易錯(cuò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)誘變。
在本發(fā)明的上下文中，具有增高的水解活性和降低的內(nèi)淀粉酶活性的α-淀粉酶家族變體當(dāng)與參照和/或親代酶相比時(shí)，是能夠制備增高水平的直鏈寡糖的α-淀粉酶家族變體。
在本發(fā)明的α-淀粉酶家族變體中，對(duì)應(yīng)下述位置(環(huán)狀芽孢桿菌CGTase編號(hào))的一種或幾種氨基酸殘基通過取代和/或插入導(dǎo)入位置8，其中所述突變發(fā)生至下述中任意8C；8D；8F；8I；8N；8P；8S；8W或8Y位置21，其中所述突變發(fā)生至下述中任意21A；21D；21F；21L；21T；21V；21W或21Y位置47，其中所述突變發(fā)生至下述中任意47A；47C；47D；47E；47F；47G；47I；47K；47Q，47L，47N；47P；47R；47S；47T；47V或47W位置94，其中所述突變發(fā)生至下述中任意94N；或94S位置215，其中所述突變發(fā)生至下述中任意215I；或215V位置230，其中所述突變發(fā)生至下述中任意230A；230C；230D；230E；230F；230G；230H；230I；230K；230L；230M；230N；230P；230Q；230R；230S；230T；230V；230W或230Y位置232，其中所述突變發(fā)生至下述中任意232L位置245，其中所述突變發(fā)生至下述中任意245A；或245T位置259，其中所述突變發(fā)生至下述中任意259A；259E；259F；259I；或259S位置263，其中所述突變發(fā)生至下述中任意264A位置299，其中所述突變發(fā)生至下述中任意299D位置320，其中所述突變發(fā)生至下述中任意320Q；或320L位置357，其中所述突變發(fā)生至下述中任意357A；或357T位置514，其中所述突變發(fā)生至下述中任意514A位置633，其中所述突變發(fā)生至下述中任意633A位置655，其中所述突變發(fā)生至下述中任意655K；或655E位置660，其中所述突變發(fā)生至下述中任意660A；或660V和/或位置672，其中所述突變發(fā)生至下述中任意672A；或672G。
在更優(yōu)選的本發(fā)明α-淀粉酶家族變體中，對(duì)應(yīng)下述位置(環(huán)狀芽孢桿菌GTase編號(hào))的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基通過取代和/或插入導(dǎo)入位置8，其中所述的突變發(fā)生于8S位置21，其中所述的突變發(fā)生于21L位置47，其中所述的突變發(fā)生至下述中任意47Q，47L或47W位置94，其中所述的突變發(fā)生于94S位置215，其中所述的突變發(fā)生于215V位置230，其中所述的突變發(fā)生于230V位置232，其中所述的突變發(fā)生于232L位置245，其中所述的突變發(fā)生于245T位置259，其中所述的突變發(fā)生至下述中任意259E；259I；或259S位置263，其中所述的突變發(fā)生于264A位置299，其中所述的突變發(fā)生于299D位置320，其中所述的突變發(fā)生于320L位置357，其中所述的突變發(fā)生于357T位置514，其中所述的突變發(fā)生于514A位置633，其中所述的突變發(fā)生于633A位置655，其中所述的突變發(fā)生于655E位置660，其中所述的突變發(fā)生于660A位置672，其中所述的突變發(fā)生于672G。
在優(yōu)選的實(shí)施例中，變體α-淀粉酶家族酶為變體麥芽α-淀粉酶。因此，本發(fā)明提供與參照和/或親代的酶相比具有增高的淀粉水解酶活性和/或降低的內(nèi)-淀粉酶活性的變體麥芽α-淀粉酶多肽，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾通過取代和/或插入導(dǎo)入。
優(yōu)選麥芽α-淀粉酶變體從芽孢桿菌菌株NCIB 11837中得來，如SEQID6或者其同源物所示。
本發(fā)明的α-淀粉酶家族變體可以從天然發(fā)現(xiàn)的任何α-淀粉酶家族成員酶中得來。
優(yōu)選將被修飾的α-淀粉酶序列為家族13α-淀粉酶序列，更優(yōu)選芽孢桿菌菌株、熱厭氧桿菌菌株、克雷伯氏菌株、棒狀桿菌菌株、短桿菌菌株、梭狀芽孢桿菌菌株、微球菌菌株或者熱厭氧桿菌菌株的家族13a-淀粉酶序列。
在更優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的α-淀粉酶變異體從Bacillus autolyticus菌株、臘狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)菌株、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)菌株、環(huán)狀芽孢桿菌嗜堿變種(Bacillus circulans var.alkalophilus)菌株、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)菌株、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus)菌株、嗜鹽芽孢桿菌(Bacillus halophilus)菌株、浸麻芽孢桿菌(Bacillus macerans)菌株、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)菌株、Bacillus ohbensis菌株、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)菌株、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)菌株、肺炎克雷白(Klebsiella pneumonia)菌株、產(chǎn)乙醇熱厭氧桿菌(Thermoanearobacter ethanolicus)菌株、鰭棲熱厭氧桿菌(Thermoanearobacterfinni)菌株、Clostridium thermoanylolyticum菌株、熱解糖梭菌(Clostridiumthermosaccharolyticul)菌株或熱產(chǎn)硫磺熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacteriumthermosulfuigenes)菌株中得來。
如果本發(fā)明的CGTase變體從環(huán)狀芽孢桿菌菌株得來，一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾可以通過取代和/或插入引入。
優(yōu)選本發(fā)明的CGTase變體從環(huán)狀芽孢桿菌菌株251得來，如SEQ ID 1或者其同源物所示。
實(shí)施例描述了環(huán)狀芽孢桿菌菌株251 CGTase變異體的構(gòu)建，其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾已經(jīng)通過取代和/或插入被引入，所述修飾例如A230V、A230V/F21L、A230V/A245T/A357T、A230V/F21L/N94S、A230V/F21L/R47W。
優(yōu)選CGTase變異體從熱產(chǎn)硫磺熱厭氧桿菌菌株EM1(Tabium)中得來，其如SEQ ID 2或其同源物所示。實(shí)施例描述了熱產(chǎn)硫磺熱厭氧桿菌菌株EM1(Tabium)的CGTase變體的構(gòu)建，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾已經(jīng)通過取代和/或插入被引入，所述修飾例如A231V、F260E和/或A231V/F260E。
應(yīng)當(dāng)注意的是，熱產(chǎn)硫磺熱厭氧桿菌菌株EM1(Tabium)CGTase的氨基酸231和260分別對(duì)應(yīng)于環(huán)狀芽孢桿菌菌株251的氨基酸230和259(見US-6,483,622，其顯示Novamyl與從熱產(chǎn)硫磺熱厭氧桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌和熱厭氧桿菌中得來的CGTAse的序列比對(duì)，為了易于參考，該比對(duì)在此復(fù)制為圖5。
相應(yīng)地，當(dāng)與參照和/或親代CGTase相比時(shí)，包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的變體CGTases顯示出增高的水解活性和降低的內(nèi)淀粉酶活性，其中隨機(jī)誘變導(dǎo)致直鏈寡糖生產(chǎn)相對(duì)于CD的水平增加。
優(yōu)選麥芽α-淀粉酶變異體從芽孢桿菌種(Novamyl)中得來，如SEQ ID3或其同源物所示。實(shí)施例描述了Novamyl變體的構(gòu)建，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾已經(jīng)通過取代和/或插入引入，例如A229V、A229V/F16L、A229V/K244T和/或A229V/Y258X(其中X為任意的非芳香氨基酸，即非Y、F或W)(編號(hào)方式按照Novamyl)。
更優(yōu)選麥芽α-淀粉酶變異體從芽孢桿菌種(Novamyl)中得來并且包含雙取代A229V/Y258X(其中X為任意的非芳香氨基酸，即非Y、F或W)(編號(hào)方式按照Novamyl)。
應(yīng)當(dāng)注意的是，Novamyl的氨基酸16、229、244和258分別對(duì)應(yīng)于環(huán)狀芽孢桿菌菌株251的氨基酸21、230、245、259(見US-6,483,622，其顯示Novamyl與從熱產(chǎn)硫磺熱厭氧桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌和熱厭氧桿菌中得來的CGTAse的Novamyl的序列比對(duì)，為了易于參考，該比對(duì)在此復(fù)制為圖5。
相應(yīng)地，當(dāng)與參照和/或親代Novamyl相比時(shí)，包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的變體Novamyl顯示出改變的轉(zhuǎn)糖基酶活性和改變的水解酶活性，其中誘變已經(jīng)導(dǎo)致改變的CD和直鏈產(chǎn)物水平。
同一性和同源性本發(fā)明包括本發(fā)明變體酶的任何氨基酸序列或者編碼該變體酶的任何核苷酸序列的同源物和衍生物的用途。在此，術(shù)語“同源物”指的是與變體的氨基酸序列和變體的核苷酸序列具有一定的同源性的實(shí)體。在此，術(shù)語“同源性”可以等同于“同一性”。
在本文的上下文中，同源序列包括與相關(guān)的比較序列-諸如參照和/或親代序列至少50％、60％、75％、80％、85％或90％相同，優(yōu)選至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。通常，同源物包含與變體氨基酸序列相同的活性位點(diǎn)等。盡管同源性可以用相似性考慮(即具有相似化學(xué)性質(zhì)/功能的氨基酸殘基)，在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選用序列同一性表示同源性。
同源性比較可以通過肉眼，或者更普遍的，是借助于容易獲得的序列比較程序進(jìn)行。這些商業(yè)上可得到的計(jì)算機(jī)程序可以計(jì)算兩個(gè)或多個(gè)序列之間的百分同源性(％homology)。
百分同源性可以在連續(xù)序列上進(jìn)行計(jì)算，即將一個(gè)序列與另一序列比對(duì)，并將一個(gè)序列上的每個(gè)氨基酸與另一序列中相應(yīng)的氨基酸進(jìn)行直接比較，每次比較一個(gè)殘基。這稱為“無缺口(ungapped)”比對(duì)。通常，這種無缺口比對(duì)只能用于較短數(shù)量的殘基。
盡管這是非常簡單和可靠的方法，但是它未能考慮到，例如，在一對(duì)在其它方面相同的序列上，一個(gè)插入或缺失將導(dǎo)致隨后的氨基酸被擠出比對(duì)之外。因此，在進(jìn)行總體排比時(shí)，很有可能導(dǎo)致百分同源性的大規(guī)模降低。因此，大多數(shù)序列比較方法被設(shè)計(jì)成能產(chǎn)生兼顧到可能的插入和缺失的最佳排比，而不會(huì)過分的破壞總的同源性評(píng)分。這是通過在序列比對(duì)中插入“缺口(gaps)”以便使局部同源性最大化而實(shí)現(xiàn)的。
不過，這些更復(fù)雜的方法為出現(xiàn)在所述比對(duì)中的每一個(gè)缺口規(guī)定了“缺口處罰(gap penalties)”，以便對(duì)于相同數(shù)量的相同氨基酸而言，一種具有盡可能少的缺口的序列排比-反映在兩個(gè)被比較的序列之間具有較高的相關(guān)性-可以比具有多個(gè)缺口的序列比對(duì)獲得更高的得分。通常使用“親緣缺口代價(jià)(Affinify gap costs)”，它讓缺口的存在承擔(dān)相對(duì)高的代價(jià)，而讓該缺口中每一個(gè)隨后的殘基承擔(dān)較小的處罰。這是最常用的缺口評(píng)分系統(tǒng)。高缺口處罰理所當(dāng)然的會(huì)產(chǎn)生具有較少缺口的優(yōu)化比對(duì)。大多數(shù)排比程序允許對(duì)缺口處罰進(jìn)行改變。不過，在將這種軟件用于序列比較時(shí)優(yōu)選使用缺省值。例如，在使用GCG威斯康星最佳配適軟件包(GCG Wisconsin Bestfit package)時(shí)，氨基酸序列的缺省缺口處罰為每個(gè)缺口-12和每個(gè)延長-4。
最大百分同源性的計(jì)算因此首先要求產(chǎn)生考慮到缺口處罰的最佳比對(duì)。
優(yōu)選地，為了本發(fā)明的目的，同一性程度可以按照Needleman S.B.andWunch，C.D.，(1970)，(Journal of Molecular Biology，48443-445)中描述的方法用下面對(duì)多肽序列比較的設(shè)置進(jìn)行測(cè)定GAP產(chǎn)生處罰為3.0和GAP延伸處罰為0.1。測(cè)定可以通過已知的計(jì)算機(jī)程序諸如在GCG程序軟件包中提供的GAP(Progaram Manual of the Wisconsin Package，Version 8，August1994，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wis.，USA 53711)來進(jìn)行。
其它可以進(jìn)行序列比較的軟件的例子包括，但不限于，BLAST軟件包(見Ausubel et al.，1999 Short Protocol in Molecular Biology，第4版第18章)、FASTA(Altschul et al.，1990 J.Mol.Biol.403-410)以及比較工具的GENEWORKS組件。BLAST和FASTA都可以用于脫機(jī)和聯(lián)機(jī)檢索(見Ausubel et al.，1999 Short Protocols in Molecular Biology，第7-58至7-60頁)。然而，對(duì)于一些應(yīng)用，優(yōu)選使用GCG Bestfit程序。一個(gè)新的工具，稱為BLAST 2 Sequences也可以用于比較蛋白質(zhì)和核苷酸序列(見FEMSMicrobiol Lett 1999 174(2)247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1)187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)。
雖然最終百分同源性能夠用同一性衡量，比對(duì)過程本身通常不基于有或無的成對(duì)比較(all-or-nothing pair comparison)。相反的，通常使用標(biāo)度的相似性分值矩陣(similarity score matrix)，根據(jù)化學(xué)相似性或進(jìn)化距離為每個(gè)成對(duì)比較設(shè)定分值。常見使用的該矩陣的例子是BLOSUM62矩陣-BLAST系列程序的缺省矩陣。GCG Wisconsin程序通常使用公開的缺省值或習(xí)慣的符號(hào)對(duì)比表，如果提供的話(具體細(xì)節(jié)見用戶手冊(cè))。對(duì)于一些應(yīng)用，優(yōu)選使用GCG包公開的缺省值，或在其它軟件中，使用缺省矩陣，如BLOSUM62。
可選的，百分比同源性可以使用DNASISTM(Hitachi Software)中的多重比對(duì)機(jī)制進(jìn)行計(jì)算，其基于類似于CLUSTAL(Higgins DG&Sharp PM(1998)，Gene 73(1)，237-244)的算法。
一旦軟件產(chǎn)生了最佳比對(duì)，可以計(jì)算出百分同源性，優(yōu)選百分序列同一性。軟件通常將其作為序列比對(duì)的一部分進(jìn)行并且產(chǎn)生數(shù)字結(jié)果。
序列也可以具有氨基酸殘基的缺失、插入或取代，其產(chǎn)生無癥狀的改變(silent change)并產(chǎn)生功能等同的變體酶。有意進(jìn)行的氨基酸取代可以根據(jù)殘基的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩歧性性質(zhì)的相似性進(jìn)行，只要保留有物質(zhì)的第二結(jié)合活性。例如，帶負(fù)電荷氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；具有類似親水性值的不帶電極性頭部的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
特別的，變體具有在包含活性位點(diǎn)在內(nèi)的至少50或100個(gè)氨基酸殘基上與源自環(huán)狀芽孢桿菌菌株251、熱產(chǎn)硫磺熱厭氧桿菌菌株EM1(Tabium)或Novamyl序列的參照和/或親代酶具有至少50、60、70％，優(yōu)選至少80％如至少90％優(yōu)選至少95％或至少98或99％的同源性的氨基酸同一性。
核酸序列的制備編碼本文所述具有特別性質(zhì)的酶或適于修飾的酶的核苷酸序列可以從產(chǎn)生所述酶的任何細(xì)胞或生物體中鑒別和/或分離和/或純化出來。本領(lǐng)域公知各種用于鑒別和/或分離和/或純化核苷酸序列的方法。作為實(shí)例，只要鑒定和/或分離和/或純化出合適的序列，可以使用PCR擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)生更多的序列。
作為進(jìn)一步的實(shí)施例，可以使用從產(chǎn)生該酶的生物體中獲得的染色體DNA或信使RNA構(gòu)建基因組DNA和/或cDNA文庫。如果酶的氨基酸序列已知，可以合成標(biāo)記的寡核苷酸探針并用于從制備自生物體的基因組文庫中鑒定編碼酶的克隆?？蛇x的，含有與另一已知酶基因同源的序列的標(biāo)記寡核苷酸探針可用于鑒定編碼酶的克隆。在后一例子中，使用低嚴(yán)格的雜交和洗脫條件。
可選的，編碼酶的克隆的鑒定可以通過插入基因組DNA片段到表達(dá)載體，如質(zhì)粒，用獲得的基因組DNA文庫轉(zhuǎn)化酶-陰性細(xì)菌，而后將轉(zhuǎn)化細(xì)菌平板培養(yǎng)于含有酶底物的瓊脂平板，從而鑒定表達(dá)該酶的克隆。
又進(jìn)一步可選的，編碼該酶的核苷酸序列可以通過已確立的標(biāo)準(zhǔn)方法，如Beucage S.L.et al.，(1981)Tetrahedron Letters 22，1859-1869頁記載的氨基磷酸鹽(phosphoroamidite)方法，或Matthes et al.(1984)EMBO J.3，801-805頁記載的方法合成制備。在氨基磷酸鹽方法中，寡核苷酸通過如自動(dòng)DNA合成儀合成、純化、退火、連接和克隆于合適的載體中。
核苷酸序列可以是基因組和合成混合來源，合成和cDNA混合來源，合成基因組和cDNA混合來源，其通過根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)連接合成、基因組或cDNA來源的片段(合適的)進(jìn)行制備。每個(gè)連接的片段對(duì)應(yīng)整個(gè)核苷酸序列的不同部位。DNA序列也可以通過使用特異引物的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)制備，例如US 4,683,202或Saiki R K et al.，(Science(1988)239，487-491頁)中所記載的。
誘變一種修飾蛋白和酶的常用方法是基于隨機(jī)誘變。例如進(jìn)行隨機(jī)誘變可以通過使用合適的物理或化學(xué)誘變因素，通過使用合適的寡核苷酸或通過對(duì)前體DNA序列進(jìn)行PCR從而產(chǎn)生突變，例如易錯(cuò)PCR。此外，可以通過使用這些誘變因素的組合進(jìn)行隨機(jī)誘變。該誘變因素可以是例如誘導(dǎo)插入、缺失、轉(zhuǎn)換、顛換、倒置和/或混雜(scrambling)的誘變因素。適合本發(fā)明的物理或化學(xué)誘變因素的例子除了別的以外包括紫外線(UV)輻射、羥胺和核苷酸類似物。當(dāng)使用這些因素時(shí)，誘變的實(shí)施通常通過在存在所選擇的誘變因素時(shí)在合適的條件下培養(yǎng)將要誘變的編碼參照和/或親代酶的DNA序列以產(chǎn)生誘變，選擇具有預(yù)期性質(zhì)的突變DNA。
當(dāng)使用寡核苷酸進(jìn)行誘變時(shí)，可以設(shè)計(jì)寡核苷酸以在寡核苷酸合成過程中摻入一個(gè)或多個(gè)非參照和/或非親代核苷酸。其目的在于最大化特異性核苷酸的摻入，從而保證目的氨基酸的表達(dá)。這些寡核苷酸可以通過任何已公開的技術(shù)，如PCR、LCR或任何認(rèn)為合適的DNA聚合酶和連接酶摻入到編碼本發(fā)明α-淀粉酶家族成員的DNA中。
在進(jìn)一步的實(shí)施例中，本發(fā)明的變體多肽可以為純化和分離的自然發(fā)生的突變?chǔ)?淀粉酶家族成員?？蛇x的，突變的α-淀粉酶家族成員的產(chǎn)生可以通過將生物體置于本文所述的物理和/或化學(xué)誘變因素下，而后篩選在它們的α-淀粉酶基因中含有突變的生物體。自然發(fā)生的突變體和隨機(jī)誘變產(chǎn)生的突變體可以通過多種技術(shù)識(shí)別/篩選，例如PCR篩選，其使用合適的核酸引物擴(kuò)增α-淀粉酶家族基因并對(duì)獲得的片段進(jìn)行測(cè)序。
如此本發(fā)明的變體多肽包括自然發(fā)生的突變?chǔ)?淀粉酶家族成員(從其存在或重組獲得的生物體中純化和分離)、由隨機(jī)誘變產(chǎn)生的突變?chǔ)?淀粉酶家族成員和由定點(diǎn)突變產(chǎn)生的突變酶。
本發(fā)明的各種多肽也可以進(jìn)行進(jìn)一步的修飾，其不是必須影響α-淀粉酶家族成員作為外淀粉酶發(fā)揮作用的能力。
可以例如根據(jù)下表進(jìn)行保守取代。第二欄同一區(qū)的和優(yōu)選第三欄同一行的氨基酸可以互相取代

本發(fā)明的多肽也包括具有增強(qiáng)的水解酶活性和可選減弱的內(nèi)淀粉酶活性的α-淀粉酶家族成員的全長序列的片斷。
本發(fā)明的多肽可進(jìn)一步通常在N端或C端，優(yōu)選在N端包括異源氨基酸序列。異源序列可以包括影響胞內(nèi)或胞外蛋白靶向的序列(如前導(dǎo)序列)。
本發(fā)明的多肽通常通過例如如本文所述的重組方法制備。然而它們也可以通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的合成方法，如固相合成進(jìn)行制備。本發(fā)明的多肽也可以作為融合蛋白進(jìn)行制備以例如幫助提取和純化。為方便去除融合蛋白序列，在融合蛋白配偶體和目的蛋白序列間含有蛋白水解切割位點(diǎn)，如凝血酶酶切位點(diǎn)也是方便的。優(yōu)選融合蛋白不妨礙目的序列蛋白的功能。
期望使用合適的宿主細(xì)胞以提供賦予本發(fā)明重組表達(dá)產(chǎn)物最佳生物學(xué)活性所需的翻譯后修飾。
定點(diǎn)突變一旦分離了編碼酶的核苷酸序列，或鑒定了假定的編碼酶的核苷酸序列，可能希望對(duì)該序列進(jìn)行突變以制備本發(fā)明的酶。
突變可以通過使用合成的寡核苷酸導(dǎo)入。這些寡核苷酸包含所需突變位點(diǎn)側(cè)翼的核苷酸序列。
合適的方法公開于Morinaga et al.，(Biotechnology(1984)2，p646-649)中。另一向編碼酶的核苷酸序列中導(dǎo)入突變的方法公開于Nelson和Long(Analytical Biochemistry(1989)，180，147-151頁)中。
合成在一個(gè)方面，本發(fā)明所使用的序列是合成序列-即通過體外化學(xué)或酶合成制備的序列。其包括，但不限于，由宿主生物體-如甲基營養(yǎng)型(methylotrophic)酵母畢赤(Pichia)和漢遜(Hansenula)酵母的最優(yōu)密碼子用法構(gòu)成的序列。
多核苷酸本發(fā)明的多核苷酸包含編碼本發(fā)明變體多肽序列的核酸序列。
本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，由于遺傳密碼的簡并性大量不同的多核苷酸可以編碼同樣的多肽。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，使用常規(guī)技術(shù)可以獲得不影響本發(fā)明多核苷酸編碼的多肽序列的核苷酸取代，用以反映表達(dá)本發(fā)明多肽的任何特殊宿主生物體的密碼子偏好。
本發(fā)明的多核苷酸可包含DNA或RNA。它們可以是單鏈或雙鏈。它們也可以是包含合成或修飾核苷酸的多核苷酸。本領(lǐng)域公知大量不同類型的寡核苷酸修飾。其包括甲基膦酸酯和硫代磷酸骨架，此外還有位于分子3′和/或5′端的吖啶或聚賴氨酸鏈。為了本發(fā)明的目的，可以理解本文所述的多核苷酸可以通過本領(lǐng)域任何已知方法進(jìn)行修飾?？梢赃M(jìn)行這樣的修飾以增強(qiáng)本發(fā)明多核苷酸的體內(nèi)活性或生命周期。
酶的表達(dá)本發(fā)明所使用的核苷酸序列可以摻入到可復(fù)制的重組載體。該載體可以用于在和/或從相容的宿主細(xì)胞中復(fù)制和以酶的形式表達(dá)核苷酸序列。
可以使用控制序列，如調(diào)控序列控制表達(dá)。
由宿主重組細(xì)胞通過表達(dá)核苷酸序列產(chǎn)生的酶，根據(jù)所使用的序列和/或載體可以被分泌或包含在細(xì)胞內(nèi)。編碼序列可以設(shè)計(jì)含有信號(hào)序列，其指導(dǎo)序列編碼產(chǎn)物穿過特異的原核或真核細(xì)胞膜進(jìn)行分泌。
調(diào)控序列在一些應(yīng)用中，本發(fā)明所使用的核苷酸序列可操作的連接在調(diào)控序列上，該調(diào)控序列能夠提供核苷酸序列的表達(dá)，例如通過選擇的宿主細(xì)胞表達(dá)。舉例來說，本發(fā)明包括含有可操作的與所述調(diào)控序列連接的本發(fā)明的核苷酸序列，即該載體是表達(dá)載體。
術(shù)語“可操作的連接”表示并列，其中所述成份的連接關(guān)系使得它們能夠以預(yù)期的方式起作用。“可操作的連接”在編碼序列上的調(diào)控序列是以這種方式連接的，該編碼序列的表達(dá)是在與調(diào)控序列相容的條件下實(shí)現(xiàn)的。
術(shù)語“調(diào)控序列”包括啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，以及其他表達(dá)調(diào)控信號(hào)。
術(shù)語“啟動(dòng)子”使用的是本領(lǐng)域的普通含義，例如，RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。
還可以通過篩選異源調(diào)控區(qū)，例如，啟動(dòng)子、分泌前導(dǎo)和終止區(qū)實(shí)現(xiàn)編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列的增強(qiáng)表達(dá)。
優(yōu)選的，本發(fā)明的核苷酸序列可操作地與至少一個(gè)啟動(dòng)子連接。
在細(xì)菌、真菌或酵母宿主中指導(dǎo)核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的例子是本領(lǐng)域公知的。
構(gòu)建體(CONSTRUCTS)術(shù)語“構(gòu)建體”-是術(shù)語諸如“接合體”、“基因盒”和“雜合體”的同義詞-包括用于根據(jù)本發(fā)明直接或間接與啟動(dòng)子連接的核苷酸序列。
間接連接的例子是提供一個(gè)合適的間隔基團(tuán)，如內(nèi)含子序列，如Sh1-內(nèi)含子或ADH內(nèi)含子，使其介于啟動(dòng)子和本發(fā)明的核苷酸序列之間。與本發(fā)明相關(guān)的術(shù)語“融合”的情況也是如此，其包括直接或間接連接。在一些情況下，該術(shù)語不包括編碼蛋白的核苷酸序列在正常情況下與野生型基因啟動(dòng)子結(jié)合，并且它們是處在其天然環(huán)境中的天然組合。
所述構(gòu)建體甚至可以含有或表達(dá)一種標(biāo)記物，該標(biāo)記物可用于篩選遺傳構(gòu)建體。
為了一些應(yīng)用，優(yōu)選本發(fā)明的構(gòu)建體包含至少可操作地連接在啟動(dòng)子上的本發(fā)明的核苷酸序列。
表達(dá)載體術(shù)語“表達(dá)載體”表示能在體內(nèi)或體外進(jìn)行表達(dá)的構(gòu)建體。
優(yōu)選的，表達(dá)載體被摻入到合適的宿主生物體的基因組中。術(shù)語“摻入”優(yōu)選包括穩(wěn)定的摻入到基因組中。
本發(fā)明的核苷酸序列可以存在與載體中，該載體中核苷酸序列可操作的連接與調(diào)控序列，該調(diào)控序列能夠通過合適的宿主生物體提供核苷酸序列的表達(dá)。
本發(fā)明中所使用的載體可以轉(zhuǎn)化如本文所述的合適的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)本發(fā)明的多肽。
載體，如質(zhì)粒、粘?；蚴删w載體的選擇通常取決于其將導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的載體可以包括一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，例如賦予抗生素抗性，如氨比西林、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性的基因。可選的，該選擇可以通過共轉(zhuǎn)化完成(如WO91/17243所記載)。
載體可以體外使用，例如用于生產(chǎn)RNA，或用于轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染宿主細(xì)胞。
如此，在進(jìn)一步的實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種制備本發(fā)明核苷酸序列的方法，其通過將本發(fā)明的核苷酸序列導(dǎo)入復(fù)制型載體，將該載體導(dǎo)入相容的宿主細(xì)胞，并在允許該載體復(fù)制的條件下生長該宿主細(xì)胞。
載體可以進(jìn)一步含有能夠使載體在目的宿主細(xì)胞中復(fù)制的核苷酸序列。該序列的例子是質(zhì)粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的復(fù)制起點(diǎn)。
宿主細(xì)胞與本發(fā)明相關(guān)的術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括含有本文所述的核苷酸序列或表達(dá)載體的任何細(xì)胞，其用于重組產(chǎn)生具有本文所述特別性質(zhì)的酶。
如此，本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案提供了用表達(dá)本發(fā)明酶的核苷酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)選擇與所述載體相容的細(xì)胞，并且，舉例來說可以是原核(例如，細(xì)菌)、真菌、酵母或植物細(xì)胞。優(yōu)選的，宿主細(xì)胞是非人細(xì)胞。
合適的細(xì)菌宿主生物體的例子是革蘭氏陽性或革蘭氏陰性菌種。
根據(jù)編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列的性質(zhì)，和/或?qū)M(jìn)一步加工表達(dá)蛋白的需要，真核宿主如酵母或其它真菌可以是優(yōu)選的。通常，酵母細(xì)胞優(yōu)于真核細(xì)胞，因?yàn)樗鼈兏子诓僮?。然而，某些蛋白要么很少從酵母?xì)胞中分泌，要么在某些情況下不能正確加工(例如，在酵母中高糖基化)。在這些情況下，應(yīng)當(dāng)選擇不同的真菌宿主生物體。
合適宿主細(xì)胞如酵母、真菌和植物宿主細(xì)胞的使用可以進(jìn)行賦予本發(fā)明的重組表達(dá)產(chǎn)物最佳生物學(xué)活性所需的翻譯后修飾(例如，豆蔻酰化(myristoylation)、糖基化、截短、lapidation和酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸磷酸化)。
宿主細(xì)胞可以是蛋白酶缺陷或蛋白酶負(fù)型的菌株。
生物體本發(fā)明涉及的術(shù)語“生物體”包括能夠含有編碼本發(fā)明酶和/或由此獲得的產(chǎn)物的核苷酸序列的任何生物體，和/或其中啟動(dòng)子在存在于生物體中時(shí)能夠使得本發(fā)明的核苷酸序列表達(dá)。
也可以選擇異源宿主，其中本發(fā)明的多肽以完全不同于其它α-淀粉酶家族成員的形式產(chǎn)生。這可以通過選擇通常不產(chǎn)生該酶的宿主來實(shí)現(xiàn)。
合適的生物體可以包括原核生物、真菌、酵母或植物。
本發(fā)明涉及的術(shù)語“轉(zhuǎn)化的生物體”包括含有編碼本發(fā)明酶和/或由此獲得的產(chǎn)物的核苷酸序列的任何生物體，和/或其中啟動(dòng)子在生物體中能夠使得本發(fā)明的核苷酸序列表達(dá)。優(yōu)選的，核苷酸序列摻入到生物體基因組中。
術(shù)語“轉(zhuǎn)化的生物體”不包括也處于其天然環(huán)境下的天然啟動(dòng)子的控制下時(shí)的其天然環(huán)境中的天然核苷酸編碼序列。
因此，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化生物體包括含有編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列、本發(fā)明的構(gòu)建體、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的質(zhì)粒、本發(fā)明的細(xì)胞、本發(fā)明的組織、或其產(chǎn)物中任何一個(gè)或組合的生物體。
例如轉(zhuǎn)化生物體也可以含有在異源啟動(dòng)子調(diào)控下的編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列。
宿主細(xì)胞/生物體的轉(zhuǎn)化如上文所述，宿主生物體可以是原核或真核生物體。
合適的原核宿主的例子包括大腸桿菌和枯草芽孢桿菌。來自芽孢桿菌屬的細(xì)菌可作為合適的異源宿主，因?yàn)樗鼈兡軌蚍置诘鞍椎脚囵B(yǎng)基中。其它合適作宿主的細(xì)菌是來自鏈霉菌和假單胞菌屬的細(xì)胞。合適的原核宿主的例子包括革蘭氏陽性菌如Bacillus autolyticus，臘狀芽孢桿菌(bacilluscereus)，環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)，環(huán)狀芽孢桿菌嗜堿變種(Bacilluscirculans var.alkalophilus)，凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)，堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus)，嗜鹽芽孢桿菌(Bacillus halophilus)，浸麻芽孢桿菌(Bacillus macerans)，巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)，Bacillus ohbensis，嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，鼠灰鏈霉菌(Strepromyces murinus)，淺青紫鏈霉菌(Strepromyceslividans)或革蘭氏陰性菌如大腸桿菌?，F(xiàn)有技術(shù)對(duì)原核宿主轉(zhuǎn)化的介紹非常充分，例如見Sambrook et al(Molecular CloningA Laboratory Manual，2ndedition，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press)和Ausubel et al.，ShortProtocols in Molecular Biology(1999)，4thEd.，John Wiley&Sons，Inc。
如果使用原核宿主，可能需要在轉(zhuǎn)化之前對(duì)核苷酸序列進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎?如除去內(nèi)含子。在一些例子中，優(yōu)選生物體是芽孢桿菌屬任何一種或熱厭氧桿菌屬的細(xì)菌，更優(yōu)選環(huán)狀芽孢桿菌或熱產(chǎn)硫磺熱厭氧桿菌。
絲狀真菌細(xì)胞可以使用本領(lǐng)域各種已知的方法轉(zhuǎn)化-如一種方法，其涉及原生質(zhì)形成和原生質(zhì)轉(zhuǎn)化后以公知方法重建細(xì)胞壁。曲霉屬(Aspergillus)作為宿主微生物的用途記載于EP 0 238 023中。
本發(fā)明范圍內(nèi)的真菌表達(dá)宿主的例子是曲霉屬(Aspergillus)的種和木霉屬(Trichoderma)的種；細(xì)菌如芽孢桿菌屬(Bacillus)的種、鏈霉菌(Streptomyces)的種和假單孢菌(Pesudomonas)的種；和酵母如克魯維氏酵母菌(Kluyveromyces)的種和酵母菌(Saccharomyces)的種。特別優(yōu)選的表達(dá)宿主可以選自黑曲霉(Aspergillus niger)、Aspergillus niger var.tubigenis、Aspergillusniger var.awamori、Aspergillus aculeatis、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、米曲霉(Aspergillus orvzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、乳克魯維氏酵母(Kluyveromyces lactis)和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
真菌和酵母轉(zhuǎn)化的總體介紹見以下部分中。
另一種宿主生物體可以是植物。用于轉(zhuǎn)染植物的常規(guī)方法的綜述可以參見Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 42205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)的文章。植物轉(zhuǎn)染的進(jìn)一步介紹可以見EP-A-0449375。
轉(zhuǎn)化的真菌宿主生物體可以是真菌-例如絲狀真菌。該宿主合適的例子包括任何屬于嗜熱絲孢菌(Thermomyces)，支頂孢屬(Acremonium)，曲霉屬(Aspergillus)，青霉菌(Penicillium)，毛霉(Mucor)，鏈孢霉(Neurospora)，木霉屬(Trichoderma)等屬的成員。
轉(zhuǎn)化絲狀真菌的介紹綜述于US-A-5741665中，其記載了本領(lǐng)域公知的絲狀真菌轉(zhuǎn)化和真菌培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。用于粗糙鏈孢霉(N.crassa)的技術(shù)的擴(kuò)展綜述記載于例如Davis and Serres，Methods Enzymol(1971)17A79-143。
轉(zhuǎn)化絲狀真菌的進(jìn)一步介紹綜述于US-A-5674707中。
在一方面，宿主生物體可以是曲霉(Aspergillus)屬，例如黑曲霉(Aspergillus niger)。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的曲霉屬(Aspergillus)也可以根據(jù)下述，例如，Turner G.1994(Vectors for genetic manipulation.InMartinelli S.D.，KinghornJ.R.(Editors)Aspergillus50 years on.Progress in industrial microbiology vol29.Elsevier Amsterdam 1994.pp.641-666)的教導(dǎo)進(jìn)行制備。
絲狀真菌中的基因表達(dá)綜述于Punt et al.(2002)Trends Biotechnol 2002May；20(5)200-6，Archer&Peberdy Crit Rev Biotechnol(1997)17(4)273-306。
轉(zhuǎn)化的酵母在另一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)化的生物體可以是酵母。
酵母中異源基因表達(dá)原理的綜述記載于，例如Methods Mol biol(1995)，49341-54，和Curr Opin Biotechnol(1997)Oct；8(5)554-60。
在這點(diǎn)上，酵母-如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisi)或畢赤酵母(Pichiapastoris)(見FEMS Microbiol Rev(2000 24(1)45-66)，可以用作異源基因表達(dá)的載體。
釀酒酵母中異源基因表達(dá)原理和基因產(chǎn)物分泌的綜述披露于EHinchcliffe E Kenny(1993，“Yeast as a vehicle for the expression of heterologousgenes”，Yeasts，Vol 5，Anthony H Rose and J Stuart Harrison，eds，2nd edition，Academic Press Ltd)。
為了轉(zhuǎn)化酵母，業(yè)已開發(fā)了若干種轉(zhuǎn)化方法。例如本發(fā)明的轉(zhuǎn)化酵母可以按照Hinnen et al.，(1978，Proceedings of the National Academy of Sciencesof the USA 75，1929)；Beggs，J D(1978，Nature，London，275，104)；和Ito，H etal(1983，J Bacteriology 153，163-168)的教導(dǎo)進(jìn)行制備。
轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞可以通過使用各種選擇標(biāo)記-如營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記顯性抗生素抗性標(biāo)記進(jìn)行篩選。
培養(yǎng)和生產(chǎn)用本發(fā)明核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可以在利于產(chǎn)生編碼的酶，并便于從細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中回收酶的條件下培養(yǎng)。
用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是任何適合目的宿主細(xì)胞生長并獲得酶表達(dá)的常規(guī)培養(yǎng)基。
在又進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生本發(fā)明變異體的方法，該方法包含在適合產(chǎn)生變異體的條件下培養(yǎng)本文所述的宿主細(xì)胞，以及從細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中回收該變異體。
重組細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白可以展示于細(xì)胞的表面。
酶可以從宿主細(xì)胞分泌，并且可以使用公知方法方便的從培養(yǎng)基中回收。
分泌通常，希望酶能從表達(dá)宿主中分泌到培養(yǎng)基中，從培養(yǎng)基中更有利于回收該酶。根據(jù)本發(fā)明，可以根據(jù)預(yù)期的表達(dá)宿主選擇分泌前導(dǎo)序列。對(duì)于本發(fā)明來說還可以使用雜種信號(hào)序列。
異源分泌前導(dǎo)序列的典型例子是源于真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(glaA，有18和24個(gè)氨基酸兩種形式，例如，來自曲霉屬)、α因子基因(酵母，例如，酵母(Saccharomyces)，克魯維氏酵母和漢遜酵母)或α-淀粉酶基因(芽孢桿菌屬)的分泌前導(dǎo)序列。
舉例來說，大腸桿菌中異源蛋白的分泌綜述于MethodsEnzymol(1990)182132-43。
變異體的分離從宿主細(xì)胞中分泌的α-淀粉酶家族變異體可以通過公知方法方便的從培養(yǎng)基中回收，其包括通過離心或過濾從培養(yǎng)基中分離細(xì)胞，通過鹽如硫酸銨沉淀蛋白級(jí)分，而后使用層析程序如離子交換層析，親合層析等。
檢測(cè)本領(lǐng)域公知多種檢測(cè)和測(cè)量氨基酸序列表達(dá)的方法。例子包括酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)、放射性免疫測(cè)定(RIA)和熒光激活細(xì)胞分選(FACS)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員公知多種標(biāo)記和偶聯(lián)技術(shù)，其能夠用于各種核酸和氨基酸檢測(cè)中。
許多公司如Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)、Promega(Madison，WI)和US Biochemical Corp(Cleveland，OH)提供這些程序的商售試劑盒和方法。
合適的報(bào)導(dǎo)分子或標(biāo)記包括放射性核素、酶、熒光的、化學(xué)熒光的或發(fā)色團(tuán)試劑和底物、輔助因子、抑制劑、磁性粒子等。介紹這些標(biāo)記的專利包括US-A-3,817,837；US-A-3,850,752；US-A-3,939,350；US-A-3,996,345；US-A-4,277,437；US-A-4,275,149和US-A-4,366,241。
還有，重組免疫球蛋白可以如US-A-4,816,567所示的制備。
檢測(cè)α-淀粉酶家族變異體通過本文所描述的任何一種方法制備的變異體可以或者在純化之前或者之后進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)其與參照和/或親代酶相比，內(nèi)淀粉酶活性降低且水解活性增強(qiáng)。
因此，能夠表達(dá)目標(biāo)變異體的微生物被在合適的培養(yǎng)物和在合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)以選擇變異體。
試驗(yàn)還可以測(cè)定本發(fā)明的變異體的水解活性，該活性根據(jù)(Penninga等，(1995)Biochemistry，343368-3376)通過測(cè)定還原能力的增加來確定。
內(nèi)活性用PHADEBAS測(cè)試(PHARMACIA)來測(cè)定，其為僅可由內(nèi)活性裂解的交聯(lián)淀粉底物。底物(1片于4ml檸檬酸鈉緩沖液，pH6.0和10mM氯化鈣中)與0.1-1mg/ml酶孵育，并在有規(guī)律的時(shí)間間隔提取100微升試樣，加入到0.9ml 0.2M氫氧化鈉以停止反應(yīng)。在旋轉(zhuǎn)(5分鐘)之后，在620nm測(cè)定吸光度。內(nèi)活性表示為每分鐘吸光度上的改變。野生型CGTase的活性被定義為100％。
融合蛋白本發(fā)明所使用的氨基酸序列可以作為融合蛋白進(jìn)行制備，以例如便于提取和純化。優(yōu)選地，融合蛋白將不會(huì)妨礙蛋白質(zhì)序列的活性。
分離的在一方面，優(yōu)選酶或者其核苷酸序列或通過使用其任一獲得的產(chǎn)物是分離形式的。術(shù)語“分離的”是指酶或其核苷酸序列或通過使用其任一獲得的產(chǎn)物至少實(shí)質(zhì)上游離于至少一種其它成分，該酶或其核苷酸序列與其在自然中自然結(jié)合并在自然中存在?？梢岳斫獾鞍卓梢耘c不妨礙蛋白質(zhì)預(yù)期目的的載體或者稀釋劑混合，并且還是認(rèn)為其是實(shí)質(zhì)上分離的。
純化的在一方面，優(yōu)選酶或者其核苷酸序列或者通過使用其任一獲得的產(chǎn)物是純化形式的。術(shù)語“純化的”是指酶或其核苷酸序列或者通過使用其任一獲得的產(chǎn)物為相對(duì)純的狀態(tài)-例如至少大約90％純化，或者至少約95％純化或者至少約98％純化。
雜交本發(fā)明還包括與本發(fā)明的核酸序列互補(bǔ)的序列，或者能夠雜交至本發(fā)明的序列或其互補(bǔ)序列的序列。
本文所使用的術(shù)語“雜交”包括“核酸鏈通過堿基配對(duì)結(jié)合互補(bǔ)鏈的過程”還有在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)中所進(jìn)行的擴(kuò)增過程。
本文中涉及的雜交表示類似的DNA序列在至少如本文所述的低嚴(yán)格性條件下，與對(duì)應(yīng)SEQ ID 1、SEQ ID 2或SEQ ID 3所示核酸序列的蛋白編碼部分的核苷酸序列雜交。
用于測(cè)定核苷酸探針和同源的DNA或RNA序列在低嚴(yán)格條件下雜交的合適試驗(yàn)條件涉及將含有要雜交的DNA片段或者RNA的濾膜在5xSSC(氯化鈉/檸檬酸鈉，Sambrook等，(1989)Molecular cloning，a laboratorymanual，Cold Spring Laboratory press，New York)中預(yù)浸泡10分鐘，在5xSSC、5xDenhardt′s溶液、0.5％SDS和100μg/ml變性的超聲處理的鮭精DNA的溶液中進(jìn)行濾膜的預(yù)雜交，而后在含有隨機(jī)的32P-dCTP標(biāo)記(特異性活性＞1×109cmp/μg)探針的相同的溶液中45℃雜交12個(gè)小時(shí)。濾膜隨后在2xSSC、0.5％SDS中在至少55℃(低嚴(yán)格)，在至少60℃(中等嚴(yán)格)，更優(yōu)選在至少65℃(中等/高嚴(yán)格)，更優(yōu)選在至少70℃(高嚴(yán)格)，并且甚至更優(yōu)選在至少75℃(非常高嚴(yán)格)30分鐘清洗兩次。
在上述條件下與寡核苷酸探針雜交的分子可以例如通過X-射線膠片曝光進(jìn)行檢測(cè)。
應(yīng)用本發(fā)明的α-淀粉酶家族變異體具有可以有利地用于各種工業(yè)應(yīng)用的有價(jià)值的性質(zhì)。特別地，該酶發(fā)現(xiàn)具有延緩或預(yù)防烘焙工業(yè)常用以淀粉為基礎(chǔ)食品的退化，從而變味的潛在應(yīng)用。
在更進(jìn)一步的方面，本發(fā)明的變異體用于焙烤產(chǎn)品或者食品的制備。對(duì)某些方面，優(yōu)選食品為焙烤產(chǎn)品-諸如面包，或者其它以生面團(tuán)為基礎(chǔ)的產(chǎn)品諸如根據(jù)本領(lǐng)域公知的常規(guī)技術(shù)制備的油酥點(diǎn)心。
α-淀粉酶變異體可以作為單獨(dú)的酶或者與一種或幾種附加的酶，諸如木聚糖酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶和其它氧化還原酶或者淀粉分解酶聯(lián)合使用。
一些變異體在制備直鏈寡糖的方法，或者在從淀粉中制備甜味劑和乙醇，和/或織物脫漿中特別有用。常規(guī)淀粉轉(zhuǎn)換方法的條件，包括淀粉液化和/或糖化過程為公知的。
因此，在另一方面，本發(fā)明提供用于制備直鏈寡糖，特別是2至12個(gè)葡萄糖單元的直鏈寡糖，優(yōu)選2至9個(gè)葡萄糖單元的直鏈寡糖的CGTase變異體。
大規(guī)模應(yīng)用在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)例中，氨基酸序列用于大規(guī)模應(yīng)用。
優(yōu)選氨基酸序列在宿主有機(jī)體的培養(yǎng)后以總細(xì)胞培養(yǎng)物體積每升1g至每升約2g的量制備。
優(yōu)選氨基酸序列在宿主有機(jī)體的培養(yǎng)后以總細(xì)胞培養(yǎng)物體積每升100mg至每升約900mg的量制備。
優(yōu)選氨基酸序列在宿主有機(jī)體的培養(yǎng)后以總細(xì)胞培養(yǎng)物體積每升250mg至每升約500mg的量制備。
食品本發(fā)明的組合物可以用作-或者用于制備-食品。在此處，術(shù)語“食品”被廣義使用-并且包括人類食品和動(dòng)物食品(即，飼料)。在優(yōu)選的方面，食品用于人類消費(fèi)。
食品可以為溶液或者固體的形式-依照用途和/或應(yīng)用的形式和/或服用的形式。
食品成分本發(fā)明的組合物可以用作食品成分。
如本文所應(yīng)用的，術(shù)語“食品成分”包括制劑，其為或可以被加入功能性食物或者食品中并且包括其可以以低水平在各種各樣需要例如，酸化(acidfying)或乳化的產(chǎn)品中使用的制劑。
食品成分可以為溶液或者固體的形式-取決于用途和/或應(yīng)用的模式和/或服用的模式。
食品添加物本發(fā)明的組合物可以是-或者可以被加入-食品添加物。
功能性食品本發(fā)明的組合物可以是-或者可以被加入-功能性食品。
如本文所應(yīng)用的，術(shù)語“功能性食品”意指不僅能夠提供營養(yǎng)作用和/或味覺滿足，還能夠?qū)οM(fèi)者傳送更進(jìn)一步的有益作用的食品。
盡管功能性食品沒有法定的定義，但是在這一領(lǐng)域存在利益的大部分的團(tuán)體同意它們?yōu)橐跃哂刑貏e的健康作用進(jìn)行銷售的食品。
食物產(chǎn)品本發(fā)明的組合物可以用于諸如一種或幾種糖果產(chǎn)品、乳制品和/或焙烤食品的食物產(chǎn)品的制備。
在某些方面，優(yōu)選所述食品為焙烤產(chǎn)品-諸如面包、油酥點(diǎn)心、小點(diǎn)心或餅干。
本發(fā)明還提供制備食品或食品成分的方法，該方法包括將酶或者通過所述酶制備的產(chǎn)品與另一種食品成分混合。制備的方法或者食品成分也是本發(fā)明的另一方面。
重組DNA技術(shù)盡管總的來說本文提到的任一分子技術(shù)為本領(lǐng)域公知的，但是特別是Sambrooks等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(1989)和Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology(1999)4thEd，John Wiley&Son，Inc.可以作為參考。
實(shí)施例本發(fā)明引用下面的試驗(yàn)步驟和實(shí)例進(jìn)一步舉例說明，其在任何方面不意欲限制所要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍。
圖和表圖1.maltononaose底物和環(huán)狀芽孢桿菌CGTase底物結(jié)合間隙(substratebinding cleft)的相互作用的概略描繪。
圖2.通過CGTase催化的反應(yīng)的示意圖。
圖3.表達(dá)活性的降解淀粉的CGTase的克隆百分比。
圖4.從近處觀察到的A230V突變體結(jié)構(gòu)。
圖5.序列比對(duì)。
表I.BC251和Tabium CGTase變異體在50℃的水解和內(nèi)活性。
圖的詳細(xì)描述圖1.
maltononaose底物和環(huán)狀芽孢桿菌CGTase底物結(jié)合間隙相互作用的概略描繪。箭頭顯示在亞位點(diǎn)-1和+1之間的易斷裂的鍵；氫鍵用虛線顯示。Arg 47和Asn 94不與未斷裂的底物相互作用，但是它們分別與反應(yīng)中間體和產(chǎn)物γ-環(huán)糊精相互作用(16；41)。Phe 183和Phe 259與糖環(huán)具有疏水性的堆積作用。為清楚起見，并非所有在-2、-1和+1亞位點(diǎn)的相互作用均被顯示。該圖從(5)改編。
圖2.
通過CGTase催化的反應(yīng)的示意圖。在鍵裂之后形成共價(jià)結(jié)合的反應(yīng)酶-葡糖基中間體。在反應(yīng)的第二步驟反應(yīng)中間體被轉(zhuǎn)移至受體分子。在成環(huán)反應(yīng)中采用共價(jià)連接的寡糖的末端OH-4基團(tuán)作為受體，同時(shí)采用水或者第二種糖分別作為水解作用和歧化反應(yīng)的受體。該圖改編自參考文獻(xiàn)(23)。
圖3.
表達(dá)了活性的降解淀粉的CGTase(在LB淀粉培養(yǎng)皿上)的克隆百分比作為BC251cgt基因PCR擴(kuò)增期間使用的MnCl2濃度的函數(shù)。
圖4
A230V突變體結(jié)構(gòu)(黑色)的特寫鏡頭，其疊加在結(jié)合有maltononaose(灰色)的環(huán)狀芽孢桿菌D229N/E257Q CGTase的結(jié)構(gòu)上(5)。為清楚起見，僅僅顯示底物結(jié)合亞位點(diǎn)-2至+2。突變體A230V的纈氨酸側(cè)鏈將和在maltononaose結(jié)構(gòu)的受體亞位點(diǎn)+1中的葡萄糖的O3原子形成近距離接觸(1.9A)(丙氨酸側(cè)鏈在3.2A)。
圖5.
該圖顯示了在US-A-6482622中圖4所示的序列比對(duì)。
試驗(yàn)步驟結(jié)構(gòu)測(cè)定BC251 CGTase突變體A230V的晶體從60％v/v的2-甲基-2，4-戊二醇、100mM HEPES緩沖液，pH7.5和5％w/v麥芽糖中生長得來(17)。以165mm直徑在100K在內(nèi)部MARCCD(MarUSA Inc.，Evanston，USA)系統(tǒng)中并采用CuKa輻射從裝備了Osmic鏡的BrukerNonius FR591旋轉(zhuǎn)陽極發(fā)生器中收集數(shù)據(jù)。用DENZO和SCALEPACK(18)進(jìn)行處理。移除所有水和糖的連接maltotetrasose(PDB編碼1CXF)的CGTase的結(jié)構(gòu)作為起始模型使用。用CNS精加工(19)。配體基采用程序O被放置入σA-加權(quán)的(weighted)2Fo-Fc和Fo-Fc電子密度圖(20)。突變體A230V的原子坐標(biāo)和結(jié)構(gòu)因子已經(jīng)存入蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank)中(www.rcsb.org)。
細(xì)菌菌株和質(zhì)粒-大腸桿菌MC1061(21)用于DNA操作，枯草芽孢桿菌DB104A(22)用于蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。分別帶有BC251和熱產(chǎn)硫磺熱厭氧桿菌菌株EM1(Tabium)的cgt基因的質(zhì)粒pDP66k-(7)和pCScgt-tt(23)用于誘變和蛋白質(zhì)產(chǎn)生。攜帶質(zhì)粒的菌株在LB培養(yǎng)基(24)中在37℃卡那霉素存在的條件下生長，其中對(duì)大腸桿菌或枯草芽孢桿菌分別為50μg/ml或者6μg/ml。在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候，馬鈴薯淀粉(1.5％w/v)被加入到LB-瓊脂平皿中以識(shí)別表達(dá)降解淀粉的CGTase的克隆?？莶菅挎邨U菌的轉(zhuǎn)化根據(jù)Bron(25)進(jìn)行。
定點(diǎn)誘變-突變和限制性位點(diǎn)如(7；11)所描述被引入至pDP66k和pCScgt-tt并通過DNA測(cè)序證實(shí)。XhoI和KpnI限制性位點(diǎn)引入pDP66k-產(chǎn)生V6S和A678G突變(分別接近N-和C-末端)，其對(duì)BC251 CGTase的成環(huán)、歧化和水解活性無可見影響(數(shù)據(jù)未顯示)。
使用的引物如下所示F1(XhoI)，5′-GCGCCGGATACCTCGAGTTCCAACAAGCAAAATTTC-’3R1(KpnI)，5′-CCAATTCACGTTAATGGTACCGGTGCCGCTGGACGG-’3；F21L，5′-ATCTATCAAATTTTGACCGACAGGTTT-’3；R47W，5′-ACGAACCTCTGGCTGTATTGC-’3；N94S，5′-TCCGGCGTGAACAGCACGGCCTAT-’3；A245T，5′-TTTATGGCTACCGTCAACAAC-’3；Q320L，5′-GTGGATGACCTGGTGACGTTC-’3；A357T，5′-GGCGTCCCCACCATTTATTAC-’3；V660A，5′-GGATCCACCGCCACGTGGGAA-’3；A231V，5′-ATACGTCTAGATGTTGTAAAACATATG-’3。
下劃線表示突變的核苷酸和限制性位點(diǎn)。
飽和誘變(Saturation mutagenesis)-BC251 CGTase的Ala230用所有19個(gè)其它氨基酸殘基替換。突變采用定點(diǎn)誘變方法引入，如本文所描述的，采用引物5′-ATCCGCATGGATNNSGTGAAGCATATG-3′(A230X)。
N為A+G+C+T，S為G+C以及X為任一氨基酸殘基。
易錯(cuò)PCR誘變-BC251 cgt基因用引物F1和R1從pDP66k擴(kuò)增。PCR混合物(50μl)包含1×TaqDNA聚合酶緩沖液，1mM MgSO4，0-1mM MnCl2，0.6mM每種dNTP，0.07μM每種引物，20ng模板和2.5單位TaqDNA聚合酶(Roche)。PCR反應(yīng)進(jìn)行25個(gè)循環(huán)30秒94℃，40秒54℃，以及2分鐘72℃。PCR產(chǎn)物用XhoI和KpnI限制酶切，并且獲得的片段(2016bp)從瓊脂糖凝膠(QIAquick Gel Extraction Kit；Qiagen)中提取出并且克隆到pDP66k-，取代野生型cgt基因。XhoI位點(diǎn)為編碼CGTase(CGTase為胞外酶)輸出信號(hào)的序列之外的12個(gè)核苷酸，KpnI位點(diǎn)為基因終止密碼子前的30個(gè)核苷酸。
DNA測(cè)序-循環(huán)測(cè)序(26)采用Thermo序列熒光引物循環(huán)序列試劑盒(AmershamPharmacia Biotech AB)在雙鏈DNA上進(jìn)行，并且反應(yīng)在BMTC(Groningen，The Netherlands)的Pharmacia ALF-Express測(cè)序儀上運(yùn)行。對(duì)易錯(cuò)PCR突變體進(jìn)行雙鏈測(cè)序(每個(gè)突變體六個(gè)測(cè)序反應(yīng))。
具有增高的水解活性的CGTase變異體的篩選-用易錯(cuò)PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pDP66K-的連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061，在LB-瓊脂平皿上平板鋪板并且所得的菌落采用Q-pix(Genetix，New MiltonHamsphire，UK)轉(zhuǎn)移至96孔微滴定板中的200μl LB培養(yǎng)基中。在隔夜培養(yǎng)(750rpm)后，25μl的每個(gè)培養(yǎng)物被轉(zhuǎn)移至每孔含有25μl細(xì)菌蛋白質(zhì)提取物試劑(Pierce，Rockford，Illinois)的第二微滴定板以溶解細(xì)胞。隨后，加入200μl在10mM檸檬酸鈉緩沖液(pH6.0)中的1％(w/v)可溶性淀粉(Lamers andPleuger，Wijnegen，Belgium)并且微量板在50℃在烘箱中培養(yǎng)2小時(shí)。形成的還原糖的數(shù)量采用Nelson-Somogyi試驗(yàn)(27；28)的改編版本進(jìn)行測(cè)定。40μl的反應(yīng)物被加入到聚丙烯微滴定平板中的40μl溶液D中。在用聚丙烯蓋封閉了微滴定板后，它們?cè)诤嫦渲性?00℃培養(yǎng)30分鐘。在冷卻至室溫后，加入160μl的溶液E以使在幾分鐘內(nèi)顯色。微滴定板或者肉眼篩選或者在測(cè)量525nm處吸光度。溶液D由25ml的溶液A(25g Na2CO3、25g酒石酸鈉鉀和200g Na2SO4在1L除鹽水(demi-water)中)和1ml的溶液B(30g CuSO4·5H2O和0.2ml硫酸在200ml除鹽水)組成。溶液E由在950ml除鹽水中的15.6g(NH4)6Mo7O24·4H2O和13.1ml硫酸加上溶解于50ml除鹽水中的1.9gNa2HAsO4·7H2O組成。
酶試驗(yàn)-CGTase蛋白質(zhì)如(29)所描述的制備和純化。所有的酶試驗(yàn)均在10mM檸檬酸鈉緩沖液(pH6.0)中進(jìn)行，其對(duì)于BC251和Tabium CGTase分別在50℃或者60℃。環(huán)化作用活性通過用2.5％(w/v)部分水解的馬鈴薯淀粉(Paselli SA2；Avebe，F(xiàn)oxhol，The Netherlands)與0.1-0.5μg酶/ml一起孵育來確定。形成的β-環(huán)糊精的量用酚酞測(cè)定(30)。歧化活性如(13；31)所描述的確定，采用0.1μg酶/ml，1mM4-硝基苯基-α-D-maltoheptaoside-4-6-O亞乙基(EPS；Megazyme，County Wicklow，Ireland)和10mM麥芽糖分別作為供體和受體底物。水解活性通過測(cè)定在用1％(w/v)可溶性淀粉培養(yǎng)0.5-5μg酶/ml后還原能力的增加來確定(Lamers&Pleuger，Wijnegen，Belgium)(29)。
結(jié)構(gòu)比較-
采用Swiss-PdbViewer 3.7版(b2)(32)和程序O(20)顯示和比較三維結(jié)構(gòu)。用Swiss-PdbViewer和Pov-Ray為Windows 3.1g版做圖。采用的BC251CGTase結(jié)構(gòu)為蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)率(33)中的記錄1CDG(17)和1CXK(5)。
實(shí)施例1易錯(cuò)PCR條件-最佳易錯(cuò)PCR誘變條件通過在10個(gè)不同MnCl2濃度下擴(kuò)增BC251cgt基因(SEQ ID 4)測(cè)定。PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒pDP66k-中，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌和在用淀粉補(bǔ)充的LB平皿上平板培養(yǎng)。只有表達(dá)降解淀粉的CGTase的克隆形成菌叢周圍暈環(huán)。形成暈環(huán)的克隆百分比隨著MnCl2濃度的增加而降低(圖3)，表明了MnCl2濃度越高滅活突變的數(shù)量越多。選擇0.2-0.3mM的MnCl2濃度作為最佳易錯(cuò)PCR條件，在該MnCl2濃度獲得的大約90％的(突變體)CGTase克隆保持淀粉降解活性(圖3)。
實(shí)施例2設(shè)計(jì)變異體以使水解活性增加為了選擇具有增高的水解作用活性的CGTase變異體，在第一輪的誘變和篩選中分析大約12,000個(gè)克隆的水解活性。用于PCR中的MnCl2濃度為0.2mM(6,000個(gè)克隆)和0.3mM(6,000個(gè)克隆)。22個(gè)克隆具有顯著增加的水解活性。質(zhì)粒DNA從每個(gè)陽性克隆中分離并且隨后用于制備和純化編碼的突變蛋白質(zhì)。所有的22個(gè)突變CGTase比野生型的CGTase具有更高的水解活性和更低的環(huán)化作用活性。一些突變體甚至具有比環(huán)化活性更高的水解活性。
在PCR擴(kuò)增中采用0.25mM MnCl2，CGTase的水解作用活性在第二和第三輪誘變中進(jìn)一步增強(qiáng)。突變體6和6-2分別作為在第二和第三輪誘變中PCR模板作用；這些變異體在它們那輪誘變之后具有最高水解作用活性。在第二和第三輪誘變中每輪分析大約10,000個(gè)克隆的水解作用活性，其分別導(dǎo)致4個(gè)和8個(gè)具有增高的水解作用活性的克隆。陽性克隆的質(zhì)粒DNA被分離并且制備和純化所編碼的蛋白質(zhì)。在第二輪中識(shí)別的突變體CGTases比親代突變體6具有更高的水解活性。令人驚奇地，成環(huán)活性也增加了，盡管我們是篩選增加的水解活性。水解活性在第三輪誘變后進(jìn)一步增加，而成環(huán)作用活性未受影響或者與親代突變體6-2相比降低。因此，僅僅在三輪誘變和選擇中就獲得具有幾乎10倍降低的成環(huán)活性和90倍增加的水解活性的突變體CGTase。
顯示增加的水解酶活性的變異體的DNA測(cè)序34個(gè)選出的具有增強(qiáng)的水解活性的CGTase變異體中，22個(gè)用于核苷酸測(cè)序(2016bp)。其顯示41個(gè)核苷酸取代和31個(gè)氨基酸突變，其中的15個(gè)氨基酸突變是不同的。沒有發(fā)現(xiàn)額外的終止密碼子，其與所有選出的突變蛋白質(zhì)在SDS-PAGE上的野生型大小一致(數(shù)據(jù)未顯示)。突變體每輪誘變具有一個(gè)至三個(gè)核苷酸突變(平均1.9)，其導(dǎo)致一個(gè)或兩個(gè)氨基酸突變(平均1.4)。對(duì)每輪誘變和使用的不同MnCl2濃度(0.2、0.25和0.3mM)而言在突變頻率中的差異是小的(在DNA和氨基酸水平上＜10％)。最頻繁地觀察到A對(duì)G、T對(duì)C、C對(duì)T和G對(duì)A的取代，而A對(duì)C、T對(duì)A或G、C對(duì)G和G對(duì)T的突變則沒有找到。頻繁觀測(cè)到T對(duì)C和C對(duì)T突變的是由于進(jìn)行的篩選，因?yàn)檫@些改變是獲得引起水解活性增加的氨基酸突變所需要的。
實(shí)施例3增強(qiáng)水解作用活性的突變?cè)诘谝惠喌恼T變之后顯示最高水解作用活性的12個(gè)突變體或者具有F259S(4次)或者具有A230V(SEQ ID 1)(8次)突變，無論有或沒有第二突變。第二輪誘變產(chǎn)生F21L突變(3次)和一次A245T/A357T的組合，此外還有A230V/V660A突變。在第三輪誘變之后，突變N8S、R47W、N94S和Q320L被識(shí)別，盡管N8S僅僅被識(shí)別與N94S結(jié)合。在具有明顯增強(qiáng)的水解活性的突變中，三個(gè)突變位于在亞位點(diǎn)-3(Arg47)、亞位點(diǎn)+1(Ala230)和亞位點(diǎn)+2(Phe259)的底物結(jié)合間隙中的殘基上(圖1)，一個(gè)突變發(fā)生于沒有與底物有直接相互作用的殘基上(Phe21)。
令人驚奇的，具有增高的水解率的變異體被發(fā)現(xiàn)其水解作用與內(nèi)淀粉酶活性的比例明顯降低，這顯示這些變異體的外特異性顯著增強(qiáng)(表I)。
定點(diǎn)突變體-在識(shí)別的15個(gè)不同氨基酸突變中，7個(gè)突變(N8S、I215V、N299D、T514A、K655E、V660A和A672G)僅僅在與第二突變結(jié)合(A230V、F259S或者N94S)時(shí)被發(fā)現(xiàn)。單一A230V、F259S和N94S突變體與雙突變體的比較顯示出這七個(gè)突變對(duì)水解活性沒有額外的貢獻(xiàn)。對(duì)突變體V660A這個(gè)已經(jīng)被證實(shí)；它與野生型CGTase具有相似的活性。
為了分析其它八種突變F21L、R47W、N94S、A230V、A245T、F259S、Q320L和A357T的各自作用，它們作為單獨(dú)突變被導(dǎo)入野生型CGTase中。N94S、A245T、Q320L和A357T似乎幾乎不改變水解活性，而F21L、R47W、A230V和F259S與野生型CGTase相比清楚地引起水解活性增加。此外，除了突變體R47W之外，這八種突變降低環(huán)化作用和歧化作用活性，突變體R47W具有較高歧化作用活性。特別的，突變體A230V顯著降低環(huán)化作用和歧化作用活性。因此，識(shí)別了對(duì)CGTase的低水解作用活性重要的幾個(gè)殘基(Phe21、Arg47、Ala230和Phe259)。
飽和誘變-由于易錯(cuò)PCR誘變不能在單一的位置引起所有可能的突變(34)，Ala230的位置也用飽和誘變分析。分析五百個(gè)克隆的水解作用和環(huán)化作用活性。大部分克隆(70％)具有最多5％的野生型環(huán)化活性，而它們中沒有一個(gè)具有增加的環(huán)化作用活性，顯示出該殘基對(duì)環(huán)化反應(yīng)的重要性。四十個(gè)克隆(8％)具有強(qiáng)烈增加的水解活性。它們中的八個(gè)被隨機(jī)選擇用于測(cè)序；它們中的所有均包含A230V突變(SEQ ID 1)。因此，位置230上丙氨酸至纈氨酸側(cè)鏈的簡單改變足以顯著增強(qiáng)CGTase的水解作用活性并降低環(huán)化作用活性。
實(shí)施例4Tabium CGTase-(SEQ ID 5)突變A230V也被引入至Tabium CGTase(A231V，Tabium，環(huán)狀芽孢桿菌CGTase編號(hào)，SEQ ID 2)中，因?yàn)樵揅GTase與大部分其它CGTases相比具有相對(duì)高的水解作用活性(35)。與在BC251 CGTase中的效果相類似，A231V突變顯著降低Tabium CGTase的環(huán)化作用和增加水解活性。為了進(jìn)一步增強(qiáng)該CGTase的水解活性，雙突變體A231V/F260E被構(gòu)建，因?yàn)槠駷橹筎abium突變體F260E仍具有CGTase所記載的最高水解作用活性(11)。然而，雙突變體具有甚至比野生型Tabium CGTase低的水解活性，顯示了兩種單獨(dú)突變?yōu)橄嗷ヅ懦獾牟⒉皇钳B加的。
實(shí)施例5突變A230V已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)實(shí)質(zhì)上改變環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)的產(chǎn)物和底物特異性；即，CGTase從轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)變至水解酶，并且在一種CGTase(TABIUM)中外特異性增加＞14倍，在另一種(BC251)中＞100倍(見表1)。
由于Novamyl在結(jié)構(gòu)上與CGTases非常相關(guān)并且在相同位置含有相應(yīng)的殘基A229并且同等突變A229V的確認(rèn)將最大可能顯著增加Novamyl的外特性，并且因此明顯改善其保鮮功能性(見US-6,482,622，其顯示Novamyl和從熱產(chǎn)硫磺熱厭氧桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌和熱厭氧桿菌中獲得的CGTase的序列比對(duì)(見圖5)。
Novamyl具有內(nèi)和外淀粉酶活性，其導(dǎo)致通過多糖分子的隨機(jī)裂解加工淀粉，這削弱了它的結(jié)構(gòu)和因此削弱它的水吸收性質(zhì)。
因此，本發(fā)明提供開發(fā)具有增強(qiáng)的外淀粉酶活性和任選的降低的內(nèi)淀粉酶活性的Novamyl變異體(或者可選的類似SAS)的可能性，其將發(fā)現(xiàn)巨大商業(yè)應(yīng)用，因其將提供能夠從末端加工淀粉并且不削弱它的結(jié)構(gòu)和因此不削弱它的水吸收能力的變體酶。
實(shí)施例6麥芽α-淀粉酶Novamyl(SEQ ID 6)-突變A230V也被引入到麥芽α-淀粉酶Novamyl(A229V，Novamyl，SEQ ID 3)中。該酶記載于EP120 693(可從Novo Nordisk A/S，Denmark獲得)中。
發(fā)現(xiàn)A229V突變導(dǎo)致水解作用與內(nèi)活性的比例的顯著降低以及由此導(dǎo)致外特異性的顯著增加。
更進(jìn)一步的，通過飽和誘變轉(zhuǎn)變將A229轉(zhuǎn)變成除了G或者A之外的所有其它殘基也可以見到相似的效果。
發(fā)現(xiàn)A229V和Y258X突變的結(jié)合(X為非芳香族殘基)在增加變異體的外特異性方面更有效。
在以上說明中所提到的所有文獻(xiàn)被收作本文參考。在不脫離本發(fā)明范圍和構(gòu)思的前提下，對(duì)所述本發(fā)明方法和系統(tǒng)所做的各種改進(jìn)和改變對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。盡管業(yè)已結(jié)合特定的優(yōu)選實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了說明，應(yīng)當(dāng)理解的是，要求保護(hù)的本發(fā)明不受所述特定實(shí)施方案的限定。實(shí)際上，對(duì)所述實(shí)施本發(fā)明的方案所做的在生物化學(xué)和生物技術(shù)或相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員看來顯而易見的各種改進(jìn)都包括在以下權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
表1
BC251和Tabium CGTase變異體在50℃的水解和內(nèi)活性。

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權(quán)利要求
1.分離和/或純化的酶變異體，所述酶變異體在相對(duì)于參照酶的一個(gè)或多個(gè)下述位置(使用環(huán)狀芽孢桿菌CGTase編號(hào))或在α-淀粉酶家族其它同源成員的等同位置包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾位置230位置8位置21位置47位置94位置215位置232位置245位置259位置263位置299位置320位置357位置514位置633位置655位置660位置672；并且其中所述酶變異體與相同條件下的參照酶相比，在與淀粉一起孵育時(shí)具有較高的水解酶活性；其中所述參照酶是α-淀粉酶家族成員。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的酶變異體，其中所述酶變異體在相對(duì)于參照酶的位置230(使用環(huán)狀芽孢桿菌CGTase編號(hào))，或在α-淀粉酶家族其它同源成員的等同位置包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾；并且可選的其中所述酶變異體進(jìn)一步在相對(duì)于參照酶的一個(gè)或多個(gè)下述位置(使用環(huán)狀芽孢桿菌CGTase編號(hào))或在α-淀粉酶家族其它同源成員的等同位置包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾位置8位置21位置47位置94位置215位置232位置245位置259位置263位置299位置320位置357位置514位置633位置655位置660位置672。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的酶變異體，其中所述酶變異體在相對(duì)于參照酶的一個(gè)或多個(gè)下述位置(使用環(huán)狀芽孢桿菌CGTase編號(hào))或在α-淀粉酶家族其它同源成員的等同位置包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾位置230，其中所述突變發(fā)生至如下中任意230A；230C；230D；230E；230F；230G；230H；230I；230K；230L；230M；230N；230P；230Q；230R；230S；230T；230V；230W或230Y位置8，其中所述突變發(fā)生至如下中任意8C；8D；8F；8I；8N；8P；8S；8W或8Y位置21，其中所述突變發(fā)生至如下中任意21A；21D；21F；21L；21T；21V；21W或21Y位置47，其中所述突變發(fā)生至如下中任意47A；47C；47D；47E；47F；47G；47I；47K；47Q，47L，47N；47P；47R；47S；47T；47V或47W位置94，其中所述突變發(fā)生至如下中任意94N；或94S位置215，其中所述突變發(fā)生至如下中任意215I；或215V位置232，其中所述突變發(fā)生至如下中任意232L位置245，其中所述突變發(fā)生至如下中任意245A；或245T位置259，其中所述突變發(fā)生至如下中任意259A；259E；259F；259I；或259S位置263，其中所述突變發(fā)生至如下中任意263A位置299，其中所述突變發(fā)生至如下中任意299D位置320，其中所述突變發(fā)生至如下中任意320Q；或320L位置357，其中所述突變發(fā)生至如下中任意357A；或357T位置514，其中所述突變發(fā)生至如下中任意514A位置633，其中所述突變發(fā)生至如下中任意633A位置655，其中所述突變發(fā)生至如下中任意655K；或655E位置660，其中所述突變發(fā)生至如下中任意660A；或660V和/或位置672，其中所述突變發(fā)生至如下中任意672A；或672G。
4.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的酶變異體，其中所述參照酶是α-淀粉酶家族13的成員。
5.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的酶變異體，其中所述酶變異體與相同條件下的參照酶相比，在與淀粉一起孵育時(shí)具有較低的內(nèi)淀粉酶活性。
6.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的酶變異體，其中所述參照酶是前體酶。
7.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的酶變異體，其中所述參照酶是野生型酶。
8.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的酶變異體，其中所述參照酶可源自(優(yōu)選源自)環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)或麥芽α-淀粉酶。
9.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的酶變異體，其中所述變體酶由已被突變的DNA制備，使得獲得的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是或包含所述酶變異體。
10.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的酶變異體，其中所述參照酶是麥芽α-淀粉酶。
11.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的酶變異體，其中所述參照酶是或可源自芽孢桿菌、熱厭氧桿菌、克雷伯桿菌、棒狀桿菌、短桿菌、梭狀芽孢桿菌、微球菌或熱厭氧桿菌的菌株。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11任一的酶變異體，其中所述參照是或可源自環(huán)狀芽孢桿菌菌株251，或其同源物、突變體或變異體。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的酶變異體，其中氨基酸修飾為至少根據(jù)SEQ ID1的A230的修飾，優(yōu)選A230V(使用環(huán)狀芽孢桿菌CGTase編號(hào))。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一的酶變異體，其中所述參照酶是或可源自熱產(chǎn)硫磺熱厭氧桿菌。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至11任一的酶變異體，其中所述參照酶是或可源自芽孢桿菌任何種。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的酶變異體，其中所述參照酶是或可源自從芽孢桿菌任何種而來源的麥芽α-淀粉酶，或其同源物、突變體或變異體。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的酶變異體，其中酶變異體源自前體酶Novamyl，或其同源物、突變體或變異體。
18.根據(jù)權(quán)利要求15至17任一的酶變異體，其中氨基酸修飾為至少根據(jù)SEQ ID 3的至少A230的修飾，優(yōu)選A230V(使用環(huán)狀芽孢桿菌CGTase編號(hào))。
19.制備酶變異體的方法；其中所述方法包含表達(dá)編碼所述酶變異體的變體核苷酸序列；其中所述酶變異體在相對(duì)于參照酶的一個(gè)或多個(gè)下述位置(使用環(huán)狀芽孢桿菌CGTase編號(hào))或α淀粉酶家族的其它同源成員的等同位置包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾位置230位置8位置21位置47位置94位置215位置232位置245位置259位置263位置299位置320位置357位置514位置633位置655位置660位置672；其中所述酶變異體與相同條件下的參照酶相比，在與淀粉一起孵育時(shí)具有較高的水解酶活性；其中所述參照酶是α-淀粉酶家族成員。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述變體核苷酸序列通過對(duì)參照核苷酸序列進(jìn)行突變來制備。
21.根據(jù)權(quán)利要求19至20任一的方法，其中所述方法包含制備所述變體核苷酸序列的步驟。
22.根據(jù)權(quán)利要求19至21任一的方法，其中所述參照為CGTase。
23.根據(jù)權(quán)利要求19至22任一的方法，其中所述參照為SEQ ID 4或SEQ ID 5。
24.根據(jù)權(quán)利要求19至21任一的方法，其中所述參照為麥芽α-淀粉酶。
25.根據(jù)權(quán)利要求19至21任一或權(quán)利要求26的方法，其中所述參照為SEQ ID 6。
26.根據(jù)權(quán)利要求19至25任一的方法，其中所述變體酶是分離的和/或純化的。
27.制備酶變異體的方法，所述方法包含表達(dá)編碼所述酶變異體的變體核苷酸序列；其中所述變體核苷酸序列通過對(duì)參照核苷酸序列進(jìn)行突變獲得，其中所述參照核苷酸編碼參照酶；其中參照酶是α-淀粉酶家族成員；且其中所述酶變體與相同條件下的參照酶相比，在與淀粉一起孵育時(shí)具有較低的水解酶活性；且其中所述酶變異體在相對(duì)于參照酶的一個(gè)或多個(gè)下述位置(使用環(huán)狀芽孢桿菌CGTase編號(hào))或在α-淀粉酶家族其它同源成員的等同位置包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾位置230位置8位置21位置47位置94位置215位置232位置245位置259位置263位置299位置320位置357位置514位置633位置655位置660位置672；其中所述酶變異體與相同條件下的參照酶相比，在與淀粉一起孵育時(shí)具有較高的水解酶活性；其中所述參照酶是α-淀粉酶家族成員。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述參照為α-淀粉酶家族13的成員。
29.根據(jù)權(quán)利要求27或28任一的方法，其中所述變體酶是分離的和/或純化的。
30.根據(jù)權(quán)利要求19至29任一的方法可獲得的酶變異體。
31.根據(jù)權(quán)利要求19至29任一的方法獲得的酶變異體。
32.根據(jù)權(quán)利要求30或31的酶變異體，其中所述酶變異體是在權(quán)利要求2至18任何一個(gè)中所定義的酶變異體。
33.權(quán)利要求1至18中任一的酶變異體或權(quán)利要求30至32中任一的酶變異體在制備食物產(chǎn)品中的應(yīng)用。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的用途，其中食物產(chǎn)品是焙烤產(chǎn)品。
35.制備食物產(chǎn)品的方法，包含將權(quán)利要求1至18任一的酶變異體或權(quán)利要求30至32任一的酶變異體與至少一種附加的食物成分或食品成分混合。
36.制備食物產(chǎn)品的方法，包含將權(quán)利要求1至18任一的酶變異體或權(quán)利要求30至32任一的酶變異體與至少一種附加的食物成分或食品成分混合；而后包裝所述食物產(chǎn)品。
37.制備食物產(chǎn)品的方法，包含將權(quán)利要求1至18任一的酶變異體或權(quán)利要求30至32任一的酶變異體與至少一種附加的食物成分或食品成分混合；包裝所述食物產(chǎn)品；而后將所述經(jīng)包裝的食物產(chǎn)品標(biāo)記為食物產(chǎn)品。
38.根據(jù)權(quán)利要求35至37任一的方法，其中食物產(chǎn)品是焙烤產(chǎn)品。
39.處理淀粉的方法，包含將淀粉與變體酶接觸并使酶從淀粉產(chǎn)生一種或多種直鏈產(chǎn)物，并且其中酶變異體是權(quán)利要求1至18中任一的酶變異體或權(quán)利要求30至32中任一的酶變異體。
40.核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼權(quán)利要求1至18任一的酶變異體或權(quán)利要求30至32任一的酶變異體。
41.含有權(quán)利要求40的核苷酸序列的構(gòu)建體。
42.包含權(quán)利要求40的核苷酸序列或權(quán)利要求41的構(gòu)建體的載體。
43.宿主細(xì)胞，其中已摻入權(quán)利要求40的核苷酸序列或權(quán)利要求41的構(gòu)建體或權(quán)利要求42的載體。
44.制備權(quán)利要求1至18任一的酶變異體或權(quán)利要求30至32任一的酶變異體的方法，其中所述方法包含表達(dá)權(quán)利要求40的核苷酸序列或權(quán)利要求41的構(gòu)建體或權(quán)利要求42的載體或權(quán)利要求43的宿主細(xì)胞中的核苷酸序列，并且可選的分離和/或純化上述的表達(dá)產(chǎn)物。
45.根據(jù)權(quán)利要求44的方法可獲得的酶變異體。
46.根據(jù)權(quán)利要求44的方法獲得的酶變異體。
47.根據(jù)權(quán)利要求45或權(quán)利要求46的酶變異體在制備食物產(chǎn)品中的用途。
48.權(quán)利要求47的用途，其中食物產(chǎn)品是焙烤產(chǎn)品。
49.制備食物產(chǎn)品的方法，其包括將權(quán)利要求45或權(quán)利要求46的酶變異體與至少一種附加的食物成分或食品成分混合。
50.制備食物產(chǎn)品的方法，包含將權(quán)利要求45或權(quán)利要求46的酶變異體與至少一種附加的食物成分或食品成分混合；而后包裝所述食物產(chǎn)品。
51.制備食物產(chǎn)品的方法，包含將權(quán)利要求45或權(quán)利要求46的酶變異體與至少一種附加的食物成分或食品成分混合；包裝所述食物產(chǎn)品；而后將所述經(jīng)包裝的食物產(chǎn)品標(biāo)記為食物產(chǎn)品。
52.根據(jù)權(quán)利要求49至51任一的方法，其中食物或食品是焙烤產(chǎn)品。
53.處理淀粉的方法，包含將淀粉與變體酶接觸并使酶從淀粉產(chǎn)生一種或多種環(huán)狀產(chǎn)物，并且其中酶變異體是權(quán)利要求45或權(quán)利要求46的酶變異體。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種酶，所述酶源自α淀粉酶家族13。通過修飾CGTase或麥芽α淀粉酶可獲得酶變異體。酶可用于制備食品或食品產(chǎn)品例如焙烤產(chǎn)品。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1759178SQ200480006411
公開日2006年4月12日 申請(qǐng)日期2004年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月12日
發(fā)明者M·卡斯滕·克拉格, 漢斯·利繆斯, 柳伯特·迪杰凱延, W·鮑克·迪杰克斯特拉 申請(qǐng)人:丹尼斯科公司